一株卢氏发光杆菌及其在制备卡拉胶寡糖中的应用

摘要

本发明公开了一株卢氏发光杆菌及其在制备卡拉胶寡糖中的应用，属于生物工程技术领域。卢氏发光杆菌具体为卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的卢氏发光杆菌GDSX‑4能够降解κ‑卡拉胶得到κ‑卡拉胶寡糖。将卢氏发光杆菌GDSX‑4制备得到粗酶液，在含有κ‑卡拉胶的底物溶液中于40℃反应0.5~72h，制得κ‑新卡拉四糖、κ‑新卡拉六糖、κ‑新卡拉二糖。本发明为卡拉胶寡糖的制备提供一种反应温和、产物均一的方法。

权利要求

1.一株卢氏发光杆菌，其特征在于，所述卢氏发光杆菌为卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4，于2023年10月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO： 63878；

所述卢氏发光杆菌产生降解卡拉胶的酶。

2.根据权利要求1所述的卢氏发光杆菌，其特征在于，所述卢氏发光杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的卢氏发光杆菌，其特征在于，所述卡拉胶为κ‑卡拉胶；

所述卡拉胶的降解产物为κ‑卡拉胶寡糖。

4.根据权利要求3所述的卢氏发光杆菌，其特征在于，所述κ‑卡拉胶寡糖包括κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖。

5.权利要求1 4任一项所述的卢氏发光杆菌在制备卡拉胶寡糖中的应用。

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6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述卢氏发光杆菌降解κ‑卡拉胶得到κ‑卡拉胶寡糖；

所述卡拉胶寡糖包括κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述降解的温度为40℃，所述降解的时间为0.5 72h。

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8.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述的卢氏发光杆菌。

9.一种卡拉胶寡糖的制备方法，其特征在于，用权利要求1 4任一项所述的卢氏发光杆~菌制备卡拉胶寡糖，或用权利要求8所述的微生物菌剂制备卡拉胶寡糖；

所述制备卡拉胶寡糖的温度为40℃，所述制备卡拉胶寡糖的时间为0.5 72h；

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所述卡拉胶寡糖包括κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖。

说明书

一株卢氏发光杆菌及其在制备卡拉胶寡糖中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一株卢氏发光杆菌及其在制备卡拉胶寡糖中的应用。

背景技术

[0002] 卡拉胶（Carrageenan），又称角叉菜胶、鹿角菜胶，是自红藻中提取的一种酸性多糖，具有重复的α‑1,4‑D‑半乳呲喃糖‑β‑1,3‑D‑半乳毗喃糖二糖单元骨架结构。关于卡拉胶的使用安全性始终存在着争议，一方面卡拉胶是一种大分子硫酸多糖，在生物体内不易被消化吸收；另一方面，有研究表明卡拉胶在生物体内易引起胃肠道炎症和肠道免疫反应。此外，还有研究发现卡拉胶具有降血脂、抗凝血、抗血栓、免疫调节、刺激结缔组织生长等多种生物学活性，在生物医药领域表现出良好的应用前景。但由于卡拉胶分子量较大，溶解性和可吸收性较差，限制了其应用。

[0003] 卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，与卡拉胶相比，具有分子量更低、溶解性更高、易于吸收、稳定性和安全性更优的特点，同时因分子链上的活性基团充分暴露，使其活性较卡拉胶显著提高。目前卡拉胶的降解方式包括化学降解法，如氧化降解、酸降解等；物理降解法，如辐照降解、微波降解等；酶降解法等。由于化学水解反应过程往往过于剧烈，以至于在水解过程中会造成产物结构的破坏，因此其应用受到了极大的限制。而酶降解能够最大程度地保护反应底物的活性基团不会在降解过程中受到破坏，降解产物均一，反应条件温和，产物活性较高，被认为是一种具有发展潜力的制备方法。因此提供一株菌株，能够产降解卡拉胶的酶，丰富酶降解制备卡拉胶寡糖的微生物资源具有重要意义。

发明内容

[0004] 为提供一株能够降解卡拉胶制备卡拉胶寡糖的菌株，本发明提供一株卢氏发光杆菌及其在制备卡拉胶寡糖中的应用。所述卢氏发光杆菌具体为卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4，能够降解κ‑卡拉胶得到κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖。本发明为卡拉胶寡糖的制备提供一种反应温和、产物均一的方法。

[0005] 为实现本发明的技术目的，一方面，本发明提供一株卢氏发光杆菌，具体为卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4。

[0006] 本发明所述卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4采集于广东海洋大学提供的散房江蓠，保藏信息如下。

[0007] 分类命名：Photobacterium rosenbergii GDSX‑4；

[0008] 保藏时间：2023年10月13日；

[0009] 保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；

[0010] 保藏单位地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼；

[0011] 保藏编号：GDMCC NO： 63878。

[0012] 本发明所述卢氏发光杆菌产生降解卡拉胶的酶。

[0013] 本发明从散房江蓠（Gracilaria coronopifolia）中富集培养、初筛、复筛后得到菌株GDSX‑4，经过形态鉴定得知，菌株GDSX‑4为革兰氏阴性菌，杆状；经分子学鉴定得知，菌株GDSX‑4为卢氏发光杆菌。卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

[0014] 进一步，本发明提供的卢氏发光杆菌的培养条件为：富集培养基30℃，150r/min，摇床培养24h。富集培养基包括：牛肉膏10g/L，胰蛋白胨20g/L，NaCl 21.120g/L，KCl 0.5820g/L，CaCl2 0.820g/L，MgCl2·6H2O 3.620g/L，NaHCO3 0.0820g/L，MgSO4·7H2O 
2.62g/L，pH为7.3。

[0015] 进一步，本发明提供的卢氏发光杆菌能够降解卡拉胶，卡拉胶具体为κ‑卡拉胶，其降解产物为κ‑卡拉胶寡糖。κ‑卡拉胶寡糖包括κ‑新卡拉二糖（DP2）、κ‑新卡拉四糖（DP4）和κ‑新卡拉六糖（DP6）。

[0016] 另一方面，本发明请求保护上述卢氏发光杆菌在制备卡拉胶寡糖中的应用。卢氏发光杆菌能够降解κ‑卡拉胶得到κ‑卡拉胶寡糖，κ‑卡拉胶寡糖包括κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖。

[0017] 进一步，本发明将卢氏发光杆菌GDSX‑4在固体产酶培养基中30℃培养48h，将菌体重悬后超声破碎，离心取上清得到粗酶液。将粗酶液加入κ‑卡拉胶溶液中于40℃降解0.5~72h得到κ‑卡拉胶寡糖。优选地，降解的时间为1 48h。进一步优选地，降解的时间为48h。
~

[0018] 另一方面，本发明请求保护一种降解卡拉胶的酶，所述酶由卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4制备。

[0019] 另一方面，本发明请求保护一种微生物菌剂，微生物菌剂中含有上述的卢氏发光杆菌（Photobacterium  rosenbergii）GDSX‑4，卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4用于卡拉胶寡糖的制备，卡拉胶寡糖包括κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖。

[0020] 还有，本发明请求保护一种卡拉胶寡糖的制备方法，用卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4制备卡拉胶寡糖，或用降解卡拉胶的酶制备卡拉胶寡糖，或用微生物菌剂制备卡拉胶寡糖。制备卡拉胶寡糖的温度为40℃，时间为0.5 72h；卡~
拉胶寡糖包括κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖。

[0021] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具备下述的有益效果或优点：

[0022] 本发明为酶降解卡拉胶制备卡拉胶寡糖提供一种产物均一的菌种。本发明提供了一株能够降解卡拉胶的菌种，卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4，该菌株能够降解κ‑卡拉胶得到κ‑卡拉胶寡糖，κ‑卡拉胶寡糖包括κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖。

[0023] 本发明通过薄层色谱分析发现，降解反应超过30min后，体系中主要生成κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖、κ‑新卡拉六糖，此外还有部分聚合度大于六的寡糖组分。随着降解时间的延长，寡糖斑点浓度增强，尤其是反应48h后，聚合度大于六的寡糖大幅减少，可能是这部分寡糖被降解成了κ‑新卡拉二糖。

[0024] 本发明通过液相质谱分析发现，在降解反应45min前，产物以κ‑新卡拉二糖为主，能看到明显检测峰，同时有少部分κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖生成。降解反应1h时，能明显看到三个寡糖组分的响应峰，随着降解时间的增加，三个寡糖组分的生成量逐步增加，尤其是降解48h后，产物生成量达到峰值。降解反应结束后，终产物为κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖，完全生成的降解产物中，44%为κ‑新卡拉四糖，32%为κ‑新卡拉六糖，24%为κ‑新卡拉二糖。

附图说明

[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。

[0026] 图1为卢氏发光杆菌GDSX‑4的平板培养图和镜检图。图1中的a为卢氏发光杆菌GDSX‑4的平板划线培养图；图1中的b为卢氏发光杆菌GDSX‑4以卢戈氏碘液染色法复筛后的平板图；图1中的c为卢氏发光杆菌GDSX‑4的革兰氏染色结果图；图1中的d为卢氏发光杆菌GDSX‑4的扫描电镜图。

[0027] 图2为菌株GDSX‑4的系统发育树。

[0028] 图3为不同降解时间反应体系中还原糖与DNS显色剂的反应结果图。Ctrl为降解0h的样品。

[0029] 图4为薄层色谱分析卢氏发光杆菌GDSX‑4降解κ‑卡拉胶后的产物。Ctrl为降解0h的样品；二为标准品κ‑新卡拉二糖；四为标准品κ‑新卡拉四糖；六为标准品κ‑新卡拉六糖。

[0030] 图5为质谱检测κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖的结果图。DP2为κ‑新卡拉二糖；DP4为κ‑新卡拉四糖；DP6为κ‑新卡拉六糖。

[0031] 图6为质谱检测卢氏发光杆菌GDSX‑4降解κ‑卡拉胶过程产物的总离子色谱图。DP2为κ‑新卡拉二糖；DP4为κ‑新卡拉四糖；DP6为κ‑新卡拉六糖。

[0032] 图7为质谱检测卢氏发光杆菌GDSX‑4降解κ‑卡拉胶过程产物的峰面积统计图。DP2为κ‑新卡拉二糖；DP4为κ‑新卡拉四糖；DP6为κ‑新卡拉六糖。

具体实施方式

[0033] 下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。

[0034] 富集培养基：牛肉膏10g/L，胰蛋白胨20g/L，NaCl 21.120g/L，KCl 0.5820g/L，CaCl2 0.820g/L，MgCl2·6H2O 3.620g/L，NaHCO3 0.0820g/L，MgSO4·7H2O 2.62g/L，pH为7.3。

[0035] 固体筛选培养基：卡拉胶12g/L，NaCl 15g/L，NaNO3 20g/L，CaCl2 0.1,g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4 0.004g/L，K2HPO4 1g/L。

[0036] 固体产酶培养基：卡拉胶15g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，使用1L过滤灭菌陈海水溶解。

[0037] 散房江蓠由广东海洋大学提供。

[0038] κ‑卡拉胶购于青岛海大海洋寡糖科技有限公司。

[0039] 实施例1

[0040] 本实施例提供了卢氏发光杆菌GDSX‑4的筛选与鉴定。

[0041] 1、菌株的筛选

[0042] 将散房江蓠（Gracilaria coronopifolia）破碎匀浆，于富集培养基30℃，150r/min，摇床培养24h。取富集培养液100μL涂布于固体筛选培养基，30℃倒置培养48h，观察菌落生长状态，挑取明显凹坑的菌落，反复平板划线直至获取单一菌落（图1中的a）。挑取单菌落接种至固体产酶培养基中30℃培养48h，得到初筛后的菌种。取5μL初筛的菌液滴在卡拉胶作为唯一碳源的固体筛选培养基上，30℃倒置培养48h后，用5mL卢戈氏碘液染色（图1中的b），并用游标卡尺测量透明圈直径。

[0043] 由图1中的a和图1中的b可知，菌株GDSX‑4能在含卡拉胶的固体筛选培养基中生长，以卢戈碘液染色，可以明显看到水解透明圈，水解圈直径为3.0cm。观察菌落形态，单菌落呈圆形，边缘整齐，表面湿润有光泽，乳白色，大小适中，易挑起。

[0044] 2、菌株的形态鉴定

[0045] 对筛选得到的菌株进行革兰氏染色操作，通过显微镜观察菌株形态（图1中的c），观察菌体细胞革兰氏染色结果，紫色即为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。菌体形态采用扫描电镜显微镜观察（图1中的d）。

[0046] 由图1中的c和图1中的d可知，菌体呈现红色，为革兰氏阴性菌，杆状。

[0047] 3、菌株的分子学鉴定

[0048] 将得到的单菌落纯培养物采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（购于生工生物工程上海有限公司）提取DNA，将所得DNA进行16S rRNA全长扩增，具体扩增的实验条件和引物序列如下：

[0049] 通用引物序列：27F（5’‑AGTTTGATCMTGGCTCAG‑3’）和1492R（5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT3’）。

[0050] 扩增体系：反应体系25μL，DNA模板，引物各1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mix （10mM）0.5μL，Taq酶（5U/L）0.2μL，去离子水补足25μL。Taq酶购于MBI （Fermentas） 公司。

[0051] 扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃ 10min。PCR产物纯化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA测序，得到菌株GDSX‑4的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

[0052] 将测序结果提交EZbio数据库进行Blast比对。下载同源性较高的序列利用ClustalX进行多重序列比对，选择最接近的8个模式菌株，并利用MEGA构建系统发育树，如图2所示。

[0053] 由图2可知，菌株GDSX‑4与卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）同源性为99.93%，根据16S rDNA对比，将菌株GDSX‑4鉴定为卢氏发光杆菌，命名为卢氏发光杆菌（Photobacterium rosenbergii）GDSX‑4。

[0054] 实施例2

[0055] 本实施例提供了卢氏发光杆菌GDSX‑4在卡拉胶寡糖制备中的应用。

[0056] 1、卢氏发光杆菌GDSX‑4的粗酶液收集

[0057] 将菌株在固体产酶培养基中30℃条件下培养48h，用pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液进行重悬，超声破碎20min，取破碎液于4℃、12000rpm/min离心15min，取上清，即为粗酶液。

[0058] 2、制备卡拉胶寡糖

[0059] 用Tris‑HCl缓冲液（pH8.0)配制0.5wt%的κ‑卡拉胶底物溶液，按反应总体积加入10%的粗酶液，于40℃分别反应0min，5min，10min，15min，30min，45min，1h，2h，3h，6h，12h，
24h，27h，30h，48h，72h，加热煮沸5min终止反应，冷却至室温。

[0060] 3、薄层色谱法分析κ‑卡拉胶寡糖

[0061] 取硅胶薄层板于100℃干燥箱活化1h，将上述反应得到的卡拉胶寡糖样品取3μL于硅胶板上点样，以反应0h的样品作为参照（Ctrl），标准品κ‑新卡拉二糖（DP2）、κ‑新卡拉四糖（DP4）、κ‑新卡拉六糖（DP6）为对照，置于正丁醇:乙醇:水（3:2:2）展开剂中展开后吹干，在显色剂（二苯胺2g，苯胺2mL，85%磷酸10mL，浓盐酸1mL，丙酮100mL）中浸润后吹干，110℃加热10min进行显色（图3），薄层色谱检测结果如图4所示。

[0062] 由图3可知，随着降解时间的增加，反应体系颜色逐渐变深，表明随着时间的变化，反应体系中还原糖的含量逐渐增加。

[0063] 由图4可知，卢氏发光杆菌GDSX‑4降解反应30min前，体系中只有少量的寡糖生成，反应超过30min后，体系中主要生成κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖、κ‑新卡拉六糖，此外还有部分聚合度大于六的寡糖组分。随着降解时间的延长，寡糖斑点浓度增强，尤其是反应48h后，聚合度大于六的寡糖大幅减少，可能是这部分寡糖被降解成了κ‑新卡拉二糖。

[0064] 4、液相质谱（Q‑TOF‑MS）分析降解产物结构

[0065] 取薄层色谱法分析后的反应液稀释至50μg/mL，过0.22μm微孔滤膜过滤，注入TOF‑MS系统分析，色谱条件为：进样量5μL；流动相：乙腈:1mM甲酸（1:1）；流速0.2mL/min；柱温35℃。质谱采用ESI点喷雾离子源，负离子电离模式；质量扫描范围：m/z 50 2000Da。~

[0066] 首先对κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖、κ‑新卡拉六糖混合标准品进行分离及一级质谱鉴定（图5），进一步检测了卢氏发光杆菌GDSX‑4降解反应0.5 72h之间的寡糖生成量变~化（图6和图7）。

[0067] 由图5可知，质荷比m/z为403.05的峰为二糖携带一个硫酸酯基的离子峰，该峰为κ‑新卡拉二糖[An‑G4S]‑的特征离子峰，质荷比m/z为394.05的峰为κ‑新卡拉四糖[(An‑G4S)2]‑的特征离子峰，质荷比m/z为391.05的峰为κ‑新卡拉六糖[(An‑G4S)3]‑的特征离子峰。

[0068] 由图6和图7可知，在降解反应45min前，产物以κ‑新卡拉二糖（DP2）为主，能看到明显检测峰，同时有少部分κ‑新卡拉四糖（DP4）和κ‑新卡拉六糖（DP6）生成，但是响应值极低，无法对峰面积进行积分。降解反应1h时，能明显看到三个寡糖组分的响应峰，随着降解时间的增加，三个寡糖组分的生成量逐步增加，尤其是降解48h后，产物生成量达到峰值，进一步增加降解时间也不会有更多的产物生成。降解反应结束后，终产物为κ‑新卡拉二糖、κ‑新卡拉四糖和κ‑新卡拉六糖，完全生成的降解产物中，44%为κ‑新卡拉四糖，32%为κ‑新卡拉六糖，24%为κ‑新卡拉二糖。

[0069] 以上所述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。