先天性白内障表型CYP51酶缺陷病小鼠模型的构建方法

摘要

本发明提供先天性白内障表型CYP51酶缺陷病小鼠模型的构建方法。该构建包括：(1)获取CYP51p.Arg271Cys杂合子突变小鼠，所述杂合子突变小鼠的CYP51基因第271位的精氨酸密码子突变为半胱氨酸密码子；(2)将所述杂合子突变小鼠与野生型小鼠进行杂交，筛选F1代杂合子突变小鼠；(3)所述F1代杂合子突变小鼠自交，筛选F2代纯合子突变小鼠。该构建方法能够获得具有先天性白内障表型的模型小鼠。同时，除先天性白内障表型外，小鼠还具有小眼畸形、角膜浑浊等表型。该构建方法能够规避CYP51敲除小鼠的胚胎发育过程中的致死问题。本发明为眼球发育和白内障的研究提供良好的研究模型。

权利要求

1.一种先天性白内障表型CYP51酶缺陷病小鼠模型的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）获取CYP51 p.Arg271Cys杂合子突变小鼠，所述杂合子突变小鼠的CYP51基因第271位的精氨酸密码子突变为半胱氨酸密码子；所述CYP51 p.Arg271Cys杂合子突变小鼠源自C57BL/6品系小鼠；

（2）将所述杂合子突变小鼠与野生型小鼠进行杂交，筛选F1代杂合子突变小鼠；

（3）所述F1代杂合子突变小鼠自交，筛选F2代纯合子突变小鼠；

所述CYP51 p.Arg271Cys杂合子突变小鼠的构建方法包括：（1）针对小鼠CYP51基因设计sgRNA和点突变寡核苷酸模板ssDNA；

（2）将Cas9 mRNA和所述sgRNA及点突变ssDNA注射入小鼠受精卵，移植代孕；

所述sgRNA的序列如SEQ ID No.1所示；

所述点突变寡核苷酸模板ssDNA的序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，移植代孕所得首建鼠的CYP51 p.Arg271Cys杂合子点突变的鉴定采用PCR测序，所述PCR测序的引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述F1代突变小鼠的CYP51 p.Arg271Cys点突变的鉴定采用PCR测序，所述PCR测序的引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

说明书

先天性白内障表型CYP51酶缺陷病小鼠模型的构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于动物模型构建领域，涉及一种先天性白内障表型CYP51酶缺陷病小鼠模型的构建方法。

背景技术

[0002] 白内障是全球第一位致盲性眼病，全球盲人中因白内障致盲者约占46％。先天性白内障是一种常见的儿童眼病，是造成儿童失明和弱视的重要原因之一。先天性白内障的发生原因较为复杂，可能与遗传因素和环境因素有关，其中约一半先天性白内障的发生与遗传相关。胆固醇在维持晶状体结构和透明度中具有重要作用，晶状体不含血管，其胆固醇来源于自身合成。胆固醇代谢相关基因突变与白内障表型密切相关。在临床家系中CYP51(cytochrome P450,family 51)酶缺陷很可能是某些白内障患者的致病基因。

[0003] CYP51，作为哺乳动物甾醇合成过程中的关键酶，可以催化底物羊毛甾醇(lanosterol)的14α‑甲基进行羟基化反应。CYP51A1是CYP450蛋白质家族中唯一具有高度保守催化功能的蛋白质，且在所有哺乳动物组织中普遍表达，主要分布在内质网、微粒体和线粒体内膜上。研究表明在多种具有晶状体基因缺陷的小鼠突变体中，CYP51A1的转录表达水平均具有显著性异常，并表现出胆固醇合成代谢相关基因的调控异常。现有资料显示CYP51基因敲除后可致小鼠在胚胎期死亡。在其他类型的CYP51突变或条件性敲除小鼠中并未发现白内障表型。

[0004] 手术是白内障唯一有效治疗方式。虽然白内障手术技术成熟，但不可避免的存在后发障等术后并发症，手术也为广大病人带来沉重的经济负担，亟需研发新的治疗方法。而一个合适的疾病动物模型是研发新治疗方案及开展临床前治疗研究的基础。

发明内容

[0005] 基于此，本发明的主要目的是提供一种先天性白内障表型CYP51酶缺陷病小鼠模型的构建方法，通过以下步骤实现：

[0006] (1)获取CYP51 p.Arg271Cys杂合子突变小鼠，所述杂合子突变小鼠的CYP51基因第271位的精氨酸密码子突变为半胱氨酸密码子；

[0007] (2)将所述杂合子突变小鼠与野生型小鼠进行杂交，筛选F1代杂合子突变小鼠；

[0008] (3)所述F1代杂合子突变小鼠自交，筛选F2代纯合子突变小鼠。

[0009] 在其中一个实施例中，所述CYP51 p.Arg271Cys杂合子突变小鼠源自C57BL/6品系小鼠。

[0010] 在其中一个实施例中，所述CYP51 p.Arg271Cys杂合子突变小鼠的构建方法包括：

[0011] (1)针对小鼠CYP51基因设计gRNA和点突变寡核苷酸模板ssDNA；

[0012] (2)将Cas9 mRNA和所述sgRNA及点突变ssDNA注射入小鼠受精卵，移植代孕。

[0013] 在其中一个实施例中，所述sgRNA的序列如SEQ ID No.1所示。

[0014] 在其中一个实施例中，所述点突变寡核苷酸模板ssDNA的序列如SEQ ID No.2所示。

[0015] 在其中一个实施例中，移植代孕所得首建鼠的鉴定采用CYP51 p.Arg271Cys点突变的PCR测序，所述PCR测序的引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

[0016] 在其中一个实施例中，所述F1代突变小鼠的鉴定采用CYP51 p.Arg271Cys点突变的PCR测序，所述PCR测序的引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

[0017] 本发明的另一个目的是提供所述方法构建的小鼠模型在研究先天性白内障表型CYP51酶缺陷中的应用。

[0018] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过模拟在临床患儿中发现的点突变CYP51A1 p.Arg277Cys，将C57BL/6品系小鼠背景下的对应小鼠CYP51基因点突变p.Arg271Cys，从而构建了世界首个具白内障表型的CYP51酶缺陷小鼠模型。该构建方法能够规避CYP51酶缺陷的胚胎发育过程中的致死问题。同时，该模型小鼠不仅改变了胆固醇代谢通路，还影响了晶状体的发育，同时改变了眼球中甘油三酯代谢与氨基酸代谢。为研究胆固醇代谢在白内障中的作用机制提供了良好的动物模型，为白内障药物研发提供重要的动物模型。

附图说明

[0019] 图1为实施例1先天性白内障表型CYP51酶缺陷病小鼠模型的构建流程图。

[0020] 图2为实施例1所得F1代杂合子突变小鼠的鉴定结果图。

[0021] 图3为实施例1所得野生型小鼠、突变小鼠表型比较图。

具体实施方式

[0022] 为了便于理解本发明，下面将结合附图和实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

[0023] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

[0024] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0025] 实施例1

[0026] 本实施例提供一种先天性白内障表型CYP51酶缺陷病小鼠模型的构建方法，构建步骤见图1，具体包括以下步骤：

[0027] 1.通过CRISPR/Cas9技术基于经典的B6品系(C57BL/6)小鼠建立CYP51 p.Arg271Cys点突变杂合子小鼠

[0028] 1.1 CRISPR/Cas9打靶系统

[0029] CYP51 p.Arg271突变为半胱氨酸后将影响蛋白质结构稳定性，使CYP51更容易被降解。鼠CYP51 p.Arg 271高度保守。基于此，设计合成向导sgRNA(SEQ ID No.1)和用于同源重组修复的寡核苷酸供体ssDNA(SEQ ID No.2)。

[0030] sgRNA(SEQ ID No.1)：ATAAGGCCATCCAGAAGCGC

[0031] ssDNA(SEQ ID No.2)：ATAGGCGCAGGGATAGAGCCCATCGAGAGATCAAGAATATTTTCTATAAGGCCATTCAGAAGTGCAGGCTGTCAAAAGAACCAGCTGAGGACATTCTTCAAACTTTACTAGATTCTACAT。

[0032] 其中一个沉默突变(ATC to ATT)和p.Arg271Cys突变(CGC to TGC)一起引入了寡核苷酸供体，以阻止sgRNA与寡核苷酸供体的结合。

[0033] 1.2构建CYP51 p.Arg271Cys点突变小鼠

[0034] (1)获取受精卵

[0035] 1)按《实验动物安乐死标准操作规程》，用颈椎脱臼法处死供体雌鼠；

[0036] 2)把完整的输卵管剪下，置于装有M2培养基的皿中，加入透明质酸酶；

[0037] 3)在解剖镜下找出膨胀的壶腹部，并用镊子将其撕破，获取受精卵；

[0038] 4)将去除颗粒细胞的受精卵转至KSOM培养液37℃、5％CO 2中培养，用于显微注射备用。

[0039] (2)原核注射

[0040] 将Cas9 mRNA和上述sgRNA、寡核苷酸供体共同显微注射入C57BL/6受精卵中。具体步骤包括：

[0041] 1)在培养皿盖中部划一条M2培养基，并用石蜡油覆盖；

[0042] 2)将固定针固定到显微操作仪上，并使固定针针尖处于视野正中，令固定针前端填满M2培养基；

[0043] 3)用微量上样管吸取含上述sgRNA、寡核苷酸供体和Cas9 mRNA混合形成的DNA和RNA样品填充至注射针针尖；

[0044] 4)将注射针固定于显微操作仪，并使注射针针尖处于视野正中；

[0045] 5)挑选一组双原核且形态良好的受精卵，将其按直线排列于注射用皿的M2培养基中，并放于载物台上；

[0046] 6)将固定针调整到受精卵的位置，调节显微镜确定原核位置；

[0047] 7)调节注射针的方向，使注射针针尖与原核处于同一水平面上，持续推进注射针，使其穿透透明带并进入原核，当注射针尖端进入原核时，给予适当气压使注射液缓慢流入原核中；

[0048] 8)所有受精卵注射完毕后，立即转移到KSOM培养基中培养，然后将新一批受精卵转移到注射室中进行注射直至所有的受精卵操作完成。

[0049] (3)受精卵移植代孕

[0050] 1)将麻醉状态的代孕母鼠平卧于载物台；

[0051] 2)碘伏消毒代孕鼠背部，沿背中线在最后肋骨处用眼科剪在皮肤剪开一个小口，用镊子夹住一侧开口，将眼科剪在右侧皮肤与肌肉层间插入，伸展剪刀以使黏膜撕裂，找到白色的脂肪垫或橙色的卵巢；

[0052] 3)用5号眼科镊夹起体壁，在卵巢上方剪一小口，用镊子或剪刀进行钝性分离。用镊子夹住脂肪垫拉出卵巢、输卵管和子宫，用脂肪夹夹住脂肪垫，暴露卵巢、输卵管和子宫；

[0053] 4)用移植管吸取原核注射后的受精卵(尽量少带M2培养基)；

[0054] 5)在显微镜下找到输卵管伞，在输卵管伞的上方用两把5号镊撕开卵巢囊膜，并将伞部暴露出卵巢囊膜；

[0055] 6)左手用5号眼科镊夹住伞口，右手拿吸有受精卵的移植管插入输卵管伞口，然后将胚胎及气泡吹入输卵管壶腹部(若在输卵管内看到气泡，则说明移植已经成功)；

[0056] 7)松开脂肪夹，用钝镊子夹住脂肪垫，将卵巢、输卵管和子宫等小心放回体腔；

[0057] 8)完成移植后，用伤口夹缝合皮肤。将代孕鼠放置于干净的鼠笼里，用红外取暧器保温直到苏醒为止。

[0058] (4)突变小鼠基因型分析

[0059] 携带预期突变的首建鼠通过尾样DNA PCR测序识别。尾样DNA通过鼠尾鉴定试剂盒获得。首建鼠的鉴定可以通过PCR测序鉴定的方式。

[0060] PCR扩增和测序的引物如下SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示：

[0061] mCYP51‑seq‑F(SEQ ID No.3)：5’‑CAGTGTGAGCCACATATGACAGGAC‑3’[0062] mCYP51‑seq‑R(SEQ ID No.4)：5’‑CCCAGTGCTTTATGCTGCAACAATT‑3’[0063] 测序结果参见图2，图示其中一只首建鼠测序序列，上图为野生鼠对照序列，下图为首建鼠DNA序列。可见红色标示的CGC>TGC突变(即p.R271C突变)和蓝色标示沉默突变。

[0064] 2.F1代杂合子突变小鼠

[0065] 将步骤1构建的C57BL/6品系背景下的CYP51错义突变杂合子小鼠与C57BL/6品系野生型小鼠进行杂交：B6.CYP51 KI/+×B6.CYP51+/+→B6.CYP51 KI/+、B6.CYP51+/+，筛选其中F1代CYP51错义突变杂合子B6.CYP51 KI/+小鼠。F1代杂合子突变小鼠的鉴定方法采用如上所述的PCR测序。筛选结果鉴定参见图2。

[0066] 3.F2代纯合子突变小鼠

[0067] 将步骤2中获得的F1代CYP51错义突变杂合公鼠与母鼠进行自交：B6.CYP51 KI/+×B6.CYP51 KI/+→B6.CYP51 KI/KI、B6.CYP51 KI/+、B6.CYP51+/+，筛选可用于实验研究的F2代纯合和杂合突变小鼠(B6.CYP51 KI/KI和B6.CYP51 KI/+)及其同窝对照。F2代纯合子突变小鼠的鉴定方法可以采用如上所述的PCR测序。结果参见图2。

[0068] 4.小鼠眼球表型评估

[0069] 小鼠眼表滴加散瞳药后通过裂隙灯评估晶状体浑浊程度。野生型小鼠晶状体无明显浑浊，CYP51 p.R271C错义突变小鼠晶状体明显浑浊(图3A)，部分CYP51 p.R271C错义突变小鼠还具有小眼畸形，角膜浑浊(图3A)以及皮肤毛发颜色变浅(图3B)等表型。对眼球冰冻切片进行油红染色(图3D)显示，CYP51 p.R271C错义突变小鼠晶状体与野生型小鼠相比，晶状体纤维从晶状体弓形区域到无细胞器区的去核过程未能完成，可以观察到大量浓缩到细胞核。小眼畸形CYP51 p.R271C错义突变小鼠具有浑浊的小晶状体(图3C)，晶状体细胞排列紊乱，视网膜排列紊乱并且甘油三酯在晶状体中积累(图3D)。

[0070] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0071] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。