一种B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白及其应用

摘要

本发明提供一种B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白及其应用。该fHBP重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该fHBP重组蛋白诱导抗fHBP的免疫学效果优于本发明中fHBP三个变体等质量比混合所带来的免疫学效果。应用本发明的fHBP重组蛋白制备疫苗，只需要制备单个蛋白分子，生产工艺更为简单，却能产生优于多个蛋白混合疫苗的免疫效果，同时其抗原谱比现有疫苗更广、能够覆盖更多类型的变体菌株。

权利要求

1. 一种fHBP重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

2. 编码如权利要求 1 所述的fHBP 重组蛋白的核酸。

3. 包含权利要求 2 所述核酸的载体。

4. 包含权利要求 2 所述的核酸或权利要求 3 所述的载体的宿主细胞。

5. 一种免疫组合物，其特征在于，包含权利要求 1 所述的fHBP重组蛋白和药学上可接受的载体。

6. 一种 B 群脑膜炎奈瑟菌疫苗，其特征在于，其包含权利要求 5 所述的免疫组合物和佐剂。

7. 根据权利要求 6 所述的疫苗，其特征在于，其中所述的佐剂选自：铝盐类佐剂、蜂胶佐剂、水油佐剂、细胞因子、CpGDNA、鞭毛蛋白、基因工程减毒素、免疫刺激复合物、脂质体、皂苷类、Poly(I:C)佐剂中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的疫苗，所述的水油佐剂为弗氏完全佐剂。

9. 权利要求 1 所述的 fHBP 重组蛋白、权利要求 5 所述的免疫组合物或权利要求

6‑8任一项所述的疫苗用于制备预防B群脑膜炎奈瑟菌引起的脑脊髓膜炎的药物的用途。

说明书

一种B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白及其应用。

背景技术

[0002] 流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）是一种由脑膜炎奈瑟菌 （Neisseria meningitidis）导致的以急性脑脊髓膜炎和败血症为主要症状的通过呼吸道传播的传染病。根据荚膜多糖的特征可将脑膜炎奈瑟菌分为 A、B、C、Y、W135等13个血清群。当前上市的四价脑膜炎球菌多糖或多糖蛋白结合疫苗可有效预防 A、C、Y和W135 致病血清群，减少侵袭性脑膜炎球菌疾病发生。

[0003] B群脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis group B，MenB）俗称B群脑膜炎球菌。与 A、C、Y、W135血清群荚膜多糖不同，MenB荚膜多糖的主要成分与人中枢神经系统抗原 N–乙酰神经氨酸聚合物结构相似，可导致人体对MenB荚膜多糖产生免疫耐受，且有诱发自身免疫疾病的危险，因此MenB荚膜多糖不适合用作候选疫苗抗原。

[0004] 目前对MenB疫苗的开发主要集中在非荚膜多糖免疫原，因子H结合蛋白（fHBP）是一种脂蛋白，它几乎在所有MenB菌株细胞膜上表达。fHBP的一个重要功能是与人补体调节因子Ｈ相结合，使脑膜炎奈瑟菌逃避宿主的杀菌作用，提高在血液中的存活能力。将fHBP作为MenB疫苗抗原，引发的抗fHBP抗体可以直接激活经典补体途径溶菌，也可以阻止fH与细菌表面结合。因此，fHBP是目前最有前景的一种疫苗抗原。

[0005] 目前国外已上市的MenB疫苗主要有两款，Bexsero和Trumenba。Bexsero包含国外流行株的外膜囊泡以及其他多种脑膜炎球菌抗原的制剂。Trumenba含有吸附在磷酸铝上的两个脂化MenB fHBP抗原。上述2款MenB蛋白疫苗中fHBP蛋白序列主要针对fHBP 变体1（fHBP V1）和fHBP 变体3（fHBP V3），无法覆盖fHBP类型以fHBP 变体2（fHBP V2）为主的流行毒株。研发具有广泛保护性、更加安全有效、降低生产成本的 MenB 疫苗具有十分重要的意义。

发明内容

[0006] 为了解决目前B群脑膜炎奈瑟菌疫苗技术和供应种类不足，本发明提供了一种B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白及其应用。

[0007] 本发明提供如下具体的技术方案。

[0008] 本发明提供一种fHBP重组蛋白，其包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述的fHBP重组蛋白能同时诱导抗fHBP 变体1（fHBP V1）、fHBP 变体2（fHBP V2）和fHBP变体3（fHBP V3）的抗体。

[0009] 在一些实施方案中，本发明的fHBP重组蛋白还包含纯化标签，如组氨酸标签。

[0010] 在一些实施方案中，本发明提供一种fHBP重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0011] 本发明提供一种fHBP V1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

[0012] 本发明提供一种fHBP V2，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

[0013] 本发明提供一种fHBP V3，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

[0014] 本发明提供编码上述fHBP重组蛋白的核苷酸，具体的核苷酸序列是本领域技术人员通过密码子表等常规手段容易获得的。

[0015] 本发明提供包含编码上述fHBP重组蛋白的核苷酸的载体。

[0016] 在一些实施方案中，本发明提供的载体包括克隆载体和表达载体。

[0017] 本发明还提供包含上述核苷酸或载体的宿主细胞。

[0018] 在一些实施方案中，表达上述载体的宿主细胞为CHO或E.coli。

[0019] 本发明提供一种免疫组合物，其含有本发明所述的fHBP重组蛋白。

[0020] 优选地，本发明的免疫组合物还包含药学上可接受的载体。

[0021] 本发明提供一种B群脑膜炎奈瑟菌疫苗，其含有上述的免疫组合物和佐剂。

[0022] 在一些实施方案中，本发明的疫苗含有的佐剂选自：铝盐类佐剂、弗氏完全佐剂、蜂胶佐剂、水油佐剂、细胞因子、CpGDNA、鞭毛蛋白、基因工程减毒素、免疫刺激复合物、脂质体、皂苷类、Poly(I:C)佐剂中的至少一种。

[0023] 本发明提供上述B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白、免疫组合物或疫苗的药物制剂，所述药物用于预防或治疗B 群脑膜炎奈瑟菌相关疾病。

[0024] 本发明中的B群脑膜炎奈瑟菌相关疾病包括但不限于：脑脊髓膜炎、败血症、脓毒性休克、关节炎、心肌炎、心包炎、眼内炎、脑膜炎、出血性皮肤病、激活血纤蛋白溶解和血液凝结，器官功能失调，例如肾、肺和心力衰竭，肾上腺出血和肌肉梗死，毛细血管渗漏，水肿，外周肢体缺血，呼吸窘迫综合征。

[0025] 优选地，所述的B群脑膜炎奈瑟菌相关疾病为脑脊髓膜炎。

[0026] 基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

[0027] 本发明的fHBP重组蛋白诱导抗fHBP的免疫学效果优于本发明中fHBP三个变体(fHBP V1、fHBP V2 和fHBP V3)等质量比混合所带来的免疫学效果。同时，本发明fHBP重组蛋白诱导抗fHBP的免疫学效果优于本领域已知的其他fHBP重组蛋白（在实施例中作为对照分子）分子等质量比混合所带来的免疫学效果。使用本发明的fHBP重组蛋白制备疫苗，只需要制备单个蛋白分子，生产工艺更为简单，却能产生优于多个蛋白混合疫苗的免疫效果，同时其抗原谱比现有疫苗更广、能够覆盖更多类型的变体菌株。

附图说明

[0028] 图1为fHBP重组蛋白纯化后的SDS‑PAGE鉴定结果，箭头指示的条带为断裂条带。

[0029] 图2为fHBP重组蛋白和对照分子诱导抗fHBP抗体滴度图，其中A为诱导抗fHBP V1的抗体滴度图， B为诱导抗fHBP V2的抗体滴度图， C为诱导抗fHBP V3的抗体滴度图。

具体实施方式

[0030] 以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。下列实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂公司购买得到。

[0031] 实施例1 fHBP重组蛋白的表达和纯化

[0032] 1. 实验材料：

[0033] 囊式滤器（Bricap C01:180cm2）购自Cobetter，膜包购自Millipore，HisTrap excel购自Cytiva，分子筛（Superdex 200pg 10/300 GL）购自Cytiva。

[0034] 2. 实验方法：

[0035] 2.1、根据分子克隆的常规技术制备SEQ ID NO：1所示的fHBP重组蛋白。

[0036] 对照分子1：通过分子克隆的常规手段制备SEQ ID NO：2所示的fHBP V1、SEQ ID NO：3所示的fHBP V2、SEQ ID NO：4所示的fHBP V3，由fHBP V1、fHBP V2和fHBP V3等质量比混合得到对照分子1。

[0037] 对照分子2：由两种现有技术的fHBP重组蛋白A和B等质量比混合得到，其中蛋白A的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，蛋白B的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，上述的蛋白A和蛋白B，本领域技术人员均容易通过分子克隆的常规手段制备得到。

[0038] 2.2、诱导表达条件：接种BL21（DE3）阳性单克隆菌种于800 mL LB（Amp+）培养基中， 37℃，220 rpm下培养4‑5 h，待培养液OD600约0.6‑0.8时，将菌液转移至18℃，加入IPTG 至终浓度为0.5 mM， 200 rpm下诱导蛋白表达16 h。

[0039] 2.3、离心收菌：将培养完毕的菌液室温下7000 g离心收集菌体，丢弃培养液，用8[0040] 0 mL 150 mM NaCl，20 mM Tris 7.4溶液重悬菌体。

[0041] 2.4、超声破碎：将重悬菌液置于冰水浴中进行超声破碎。变幅杆2号，50%功率，超声3 s，停7 s，超声总时长为12 min。

[0042] 2.5、离心收集目的蛋白：13000 g，4℃，30 min，收集细胞破碎上清。

[0043] 2.6、Histrap纯化目的蛋白：冲洗溶液为20mM Tris‑HCl，150mM NaCl，pH 7.4；洗脱溶液为20mM Tris‑HCl，150mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4。使用Histrap excel‑5ml NI柱纯化；冲洗溶液平衡Histrap excel‑5ml 10 CV后，上样；上样结束用冲洗溶液冲洗10CV层析柱；用 2% 洗脱溶液冲洗10CV，洗去杂蛋白；用2%‑100% 洗脱溶液线性洗脱目的蛋白15 CV；洗脱结束后SDS‑PAGE检测蛋白纯度。

[0044] 2.7、SEC纯化目的蛋白：收集镍柱纯化后的目的蛋白用浓缩管浓缩至1ml后进行分子筛（Superdex 200pg 10/300 GL）分离纯化，纯化buffer为20mM Tris‑HCl, 150mM NaCl，pH 7.4，洗脱结束后SDS‑PAGE检测蛋白纯度，SDS‑PAGE鉴定纯化后的fHBP重组蛋白如图1所示。BCA法测定蛋白浓度，适当温度保存用于后续结合反应。

[0045] 实施例2：动物免疫试验

[0046] （1） 实验材料

[0047] 小鼠：5‑6周龄的BALB/c品系的雌性小鼠（购自广东维通利华实验动物技术有限公司）

[0048] 佐剂：氢氧化铝佐剂，其他试剂耗材均为商品化常规试剂耗材。

[0049] （2）实验步骤

[0050] 如表1所示，在第0天和第14天分别免疫接种含有实施例1制备得到的fHBP重组蛋白的疫苗、包含对照分子1的疫苗和包含对照分子2的疫苗，接种方法为肌肉注射，接种剂量为9μg/剂/只，每剂疫苗并混合75μg的氢氧化铝佐剂。在第28天采血分离血清，用于抗体IgG的检测。

[0051] 表1. 动物免疫方案

[0052]

[0053] （3）结合抗体检测：

[0054] 先用fHBP三种变体蛋白包被ELISA板，将包被好的ELISA板在Blocker Casein in PBS封闭液（购自ThermoFisher）中封闭1‑4小时；将表1中由各实验组小鼠在免疫结束所采集的血清样本从1：300开始进行三倍梯度稀释至656100，将稀释液加入每个孔,阴性对照为样本稀释液，孵育2‑3小时，用HRP偶联的羊抗鼠二抗孵育1小时后，用TMB底物进行显色，显色完成后用1 M盐酸终止反应，用酶标仪测定吸光值（OD），主波长450nm，参考波长620nm，样品OD值=OD450‑OD620，终止后5分钟内完成测定。实验结果见图2。

[0055] 小鼠免疫试验结果发现，实验组的疫苗诱导抗fHBP变体V1、V2和V3的抗体滴度均高于对照分子1和对照分子2。可见，本发明的fHBP重组蛋白制备得到的疫苗能够诱导小鼠产生更高滴度的血清抗体，具有更优异的免疫原性。

[0056] 综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。