CD47/SIRPα小分子抑制剂及其应用和抗肿瘤药物组合物

摘要

本发明涉及CD47/SIRPα小分子抑制剂及其应用和抗肿瘤药物组合物，属于抗肿瘤药物技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种新型的CD47/SIRPα小分子抑制剂。该CD47/SIRPα小分子抑制剂的结构式为式Ⅰ所示。本发明开发出了一种新型的CD47的小分子化合物，能够作为CD47/SIRPα小分子抑制剂，靶向于CD47‑SIRPα通路，阻断CD47/SIRPα结合，大大激活机体免疫能力，增强肿瘤免疫治疗效果，为研发新型的肿瘤免疫治疗的药物提供思路。(56)对比文件Tang Xi-Yang，等.The ProliferativeRole of Immune Checkpoints in Tumors:Double Regulation.Cancers.2022,第14卷(第21期),1-20.Alexandria V. Slayden，等.Discovery ofagonist-antagonist pairs for themodulation of Ca [2]+ and voltage-gated K+ channels of large conductance thatcontain beta1 subunits.Bioorganic &Medicinal Chemistry.2022,第 68卷1-9.AGOSTINHO G. ROCHA，等.MFN2 agonistsreverse mitochondrial defects inpreclinical models of Charcot-Marie-Toothdisease type 2A.Science.2018,第 360卷(第6386期),336-341.Li Chenglan，等.Targeting fungalvirulence factor by small molecules:Structure-based discovery of novelsecreted aspartic protease 2 (SAP2)inhibitors.European Journal of MedicinalChemistry.2020,第201卷1-12.杨琴，等.CD47-SIRPα阻断剂在实体癌和血液癌中的研究现状.动物医学进展.2020,第41卷(第02期),104-108.朱孔黎，等.CD47分子在抗肿瘤免疫中的应用.中国新药与临床杂志.2020,第38卷(第06期),335-341.ACS.RN：896700-07-5.STN Registry数据库.2006,

权利要求

1.CD47/SIRPα小分子抑制剂，其特征在于，其结构式为：。

2.权利要求1所述的CD47/SIRPα小分子抑制剂的可药用的盐。

3.权利要求1所述的CD47/SIRPα小分子抑制剂或其可药用的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：含有活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分包括权利要求1所述的CD47/SIRPα小分子抑制剂或其可药用的盐。

5.根据权利要求4所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述可药用的盐为三氟乙酸盐、硫酸盐、盐酸盐、醋酸盐或硝酸盐。

6.根据权利要求4所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述活性成分还包括PD‑1单抗或PD‑L1单抗。

7.根据权利要求6所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于：PD‑1单抗为纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗或卡瑞利珠单抗；PD‑L1单抗为阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、恩沃利单抗或舒格利单抗。

说明书

CD47/SIRPα小分子抑制剂及其应用和抗肿瘤药物组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及CD47/SIRPα小分子抑制剂及其应用和抗肿瘤药物组合物，属于抗肿瘤药物技术领域。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤已经严重威胁到人类的健康，据2018年WHO统计，目前恶性肿瘤的死亡人数已经达到960万人，预计到2040年新发病例将增加约60%，癌症的已成为全球最大的公共卫生问题。近年来，新兴的肿瘤免疫疗法如免疫检查点抑制剂疗法是临床上最为成功的肿瘤免疫疗法之一。免疫检查点抑制剂在临床治疗时抗体应答率较低（15～30%），需要同时监测生物标志物（如：PD‑L1阳性检测），免疫副作用明显（30～50%的患者表现副作用，甚至可能有致命性的危险），及耐药性等问题。至今，尚未有前瞻性研究明确如何规范化应对特定免疫相关不良事件及耐药性的策略，现有治疗方案在临床上显得非常局限。因此，临床上迫切需要寻找一种新颖靶点的免疫检查点治疗方案。

[0003] 先天性免疫系统中的巨噬细胞通过吞噬、抗原呈递、激活T细胞适应性免疫应答有重要的桥梁作用，是抵御细胞损害和恶性转化的第一道防线，其吞噬功能主要受CD47‑SIRPα复合物的调节。抑制CD47‑SIRPα复合物的形成，能够激活肿瘤相关性巨噬细胞（TAMs）吞噬功能，通过抗原呈递细胞（APCs）等激活免疫系统抑制免疫逃逸，从而阻止肿瘤的发生、发展。因此，开发靶向于CD47‑SIRPα通路新型的免疫检查点抗肿瘤药物是非常具有潜力的靶标之一。

[0004] 靶向于CD47‑SIRPα通路的药物研发主要分为抗体类和小分子抑制剂类等药物。目前单抗类药物如CD47单抗Hu5F9‑G4，SIRPα‑Fc融合蛋白ALX148等，抗体类药物分子量大，半衰期长，潜在的副作用大。相比于抗体类药，小分子药物分子量小，代谢半衰期较短，血药浓度容易监测，副作用可控。目前已经报道CD47‑SIRPα小分子抑制剂主要分为三类：1）抑制CD47/SIRPα结合，如NCG‑3，pep‑20等；2）通过转录、翻译抑制CD47/SIRPα表达，如RRx‑001；3）通过翻译后修饰CD47/SIRPα，如谷氨酰胺环化酶同工酶（QPCTL）抑制剂SEN177。但是现有的小分子类药物存在着一定的脱靶性，及潜在的血液毒性，大部分小分子药物仍处于早期研发阶段。所以，未来亟需开发一种新型靶向CD47/SIRPα信号通路的小分子药物。

发明内容

[0005] 针对以上缺陷，本发明解决的技术问题是提供一种新型的CD47/SIRPα小分子抑制剂。

[0006] 本发明CD47/SIRPα小分子抑制剂，其结构式为式Ⅰ所示：

[0007]

[0008] 其中，X1选自H或N；X2选自CH2或C2H4；

[0009] R1选自‑H、‑CH3、‑C2H5、

[0010] ；

[0011] R2选自‑OH、

[0012]

[0013]

[0014]

[0015] 。

[0016] 在本发明的一些实施方式中，R1选自‑CH3、

[0017] 或 ；R2选自

[0018] 或

[0019] 。

[0020] 本发明还提供本发明所述CD47/SIRPα小分子抑制剂的异构体、可药用的盐或水合物。

[0021] 其中，可药用的盐包括但不限于式Ⅰ化合物与无机酸如三氟乙酸盐、盐酸、硫酸、磷酸、亚磷酸、氢溴酸和硝酸所成的盐以及与各种有机酸，如苹果酸、马来酸、柠檬酸、延胡索酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、棕榈酸等所成的盐。

[0022] 本发明还提供本发明所述的CD47/SIRPα小分子抑制剂、异构体、可药用的盐或水合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0023] 本发明CD47/SIRPα小分子抑制剂，能够阻断CD47/SIRPα结合，在体内能够大大激活免疫能力，增强肿瘤免疫治疗效果，能够应用于制备抗肿瘤药物中。

[0024] 在本发明的一些实施方式中，所述抗肿瘤药物为靶向于CD47‑SIRPα通路的药物。

[0025] 本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物。

[0026] 本发明抗肿瘤药物组合物，含有活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分包括本发明所述的CD47/SIRPα小分子抑制剂或其异构体、可药用的盐或水合物。

[0027] 在一些具体实施例中，所述可药用的盐为三氟乙酸盐、硫酸盐、盐酸盐、醋酸盐或硝酸盐。

[0028] 在本发明的一个实施方式中，所述抗肿瘤药物组合物的活性成分还包括PD‑1单抗或PD‑L1单抗。

[0029] 在一些具体实施例中，PD‑1单抗为纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗或卡瑞利珠单抗；PD‑L1单抗为阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、恩沃利单抗或舒格利单抗。

[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0031] 本发明开发出了一种新型的CD47的小分子化合物，能够作为CD47/SIRPα小分子抑制剂，靶向于CD47‑SIRPα通路，阻断CD47/SIRPα结合，大大激活机体免疫能力，增强肿瘤免疫治疗效果，为研发新型的肿瘤免疫治疗的药物提供思路。

附图说明

[0032] 图1为实施例2中不同的化合物与CD47/SIRPα结合能力测试示意图。

[0033] 图2为实施例2中化合物R‑21与CD47/SIRPα对接模拟示意图。其中，A图为CD47蛋白与化合物R‑21作用模式图，B图为化合物R‑21分子位于CD47蛋白的口袋模式图，C图为化合物R‑21在CD47蛋白位置示意图，D图为化合物R‑21与CD47蛋白关键氨基酸作用模式图。

[0034] 图3为实施例3中化合物R‑21与NCG‑3对不同肿瘤细胞和正常肝细胞抑制活性图。

[0035] 图4为实施例3中化合物R‑21在Hela细胞中对CD47/SIRPα抑制作用的荧光标记图。其中，A图为标记的CD47蛋白；B图为加入SIRPα蛋白的结合图。

[0036] 图5为实施例4中来源于NOD小鼠的骨髓源性巨噬细胞BMDM（经anti‑F4/80染色标记）同羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的HeLa细胞在不同给药组共同孵育6h后流式检测结果图。

[0037] 图6为实施例5中化合物R‑21在HeLa移植瘤模型NOD/SCID小鼠体内抗肿瘤效果图。

具体实施方式

[0038] 本发明CD47/SIRPα小分子抑制剂，其结构式为式Ⅰ所示：

[0039]

[0040] 其中，X1选自H或N；X2选自CH2或C2H4；

[0041] R1选自‑H、‑CH3、‑C2H5、

[0042] ；

[0043] R2选自‑OH、

[0044]

[0045]

[0046] 或

[0047] 。

[0048] 在本发明的一些实施方式中，R1选自‑CH3、

[0049] 或 ；R2选自

[0050]

[0051] 或 。

[0052] 在一些具体实施例中，所述CD47/SIRPα小分子抑制剂的结构式如下：

[0053]

[0054]

[0055]

[0056]

[0057]

[0058]

[0059]

[0060] 。

[0061] 本发明还提供本发明所述CD47/SIRPα小分子抑制剂的异构体、可药用的盐或水合物。

[0062] 其中，可药用的盐包括但不限于式Ⅰ化合物与无机酸如三氟乙酸盐、盐酸、硫酸、磷酸、亚磷酸、氢溴酸和硝酸所成的盐以及与各种有机酸，如苹果酸、马来酸、柠檬酸、延胡索酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、棕榈酸等所成的盐。

[0063] 本发明还提供本发明所述的CD47/SIRPα小分子抑制剂、异构体、可药用的盐或水合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0064] 本发明CD47/SIRPα小分子抑制剂，能够阻断CD47/SIRPα结合，在体内能够大大激活免疫能力，增强肿瘤免疫治疗效果，能够应用于制备抗肿瘤药物中。

[0065] 在本发明的一些实施方式中，所述抗肿瘤药物为靶向于CD47‑SIRPα通路的药物。

[0066] 本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物。

[0067] 本发明抗肿瘤药物组合物，含有活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分包括本发明所述的CD47/SIRPα小分子抑制剂或其异构体、可药用的盐或水合物。

[0068] 本发明的CD47/SIRPα小分子抑制剂或其异构体、可药用的盐或水合物可以单独使用，也可与药学上可接受的辅料一起以药物组合物的形式使用，当以药物组合物的形式使用时，通常将治疗有效量的本发明CD47/SIRPα小分子抑制剂或其异构体、可药用的盐或水合物以及一种或多种可药用载体或稀释剂结合制成适当的施用形式或剂量形式。因此，本发明还提供抗肿瘤药物组合物，它包含治疗有效量的本发明所述的CD47/SIRPα小分子抑制剂或其异构体、可药用的盐或水合物，以及至少一种可药用的载体。

[0069] 本发明抗肿瘤药物组合物，可以以下方面的任意方式施与：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、阴道给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、销内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。

[0070] 在一些具体实施例中，所述可药用的盐为三氟乙酸盐、硫酸盐、盐酸盐、醋酸盐或硝酸盐。

[0071] 在本发明的一个实施方式中，所述抗肿瘤药物组合物的活性成分还包括还包括PD‑1单抗或PD‑L1单抗。

[0072] 在一些具体实施例中，PD‑1单抗为纳武利尤单抗（Nivolumab）、帕博利珠单抗（Pembrolizumab）、西米普利单抗（Cemiplimab）、特瑞普利单抗（Toripalimab）、信迪利单抗（Cindilimab）或卡瑞利珠单抗（Camrelizumab）；PD‑L1单抗为阿替利珠单抗（Atezolizumab）、阿维鲁单抗（Avelumab）、度伐鲁单抗（Durvalumab）、恩沃利单抗（Envolizumab）或舒格利单抗（Shuglizumab）。

[0073] 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

[0074] 实施例1 化合物的合成

[0075] 合成表1中所列的化合物。

[0076]

[0077] 1、化合物R‑21的制备

[0078]

[0079]

[0080]

[0081]

[0082] 将化合物1，化合物2溶于乙醇中，加入适量脱水剂反应得到化合物3，化合物3，化合物4在NaOH甲醇水溶液中反应得到化合物5，化合物5经二氯亚砜回流反应制备得到酰氯中间体，在经化合物6缩合得到目标化合物R‑21。具体的合成方法如下：

[0083] 化合物3 [2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑硫醇]的制备：将2‑（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）乙酰酰肼（5 g，29.73 mmol），4‑硫代亚硝腈（5.36 g, 35.67 mmol），TiCl4（11.28 g, 59.45 mmol），加入50 mL乙醇中，在氩气环境下，搅拌回流反应12 h。通过TLC监测反应，反应完成后将反应混合物真空浓缩，加入500mL水，用乙酸乙酯（2×400mL）萃取两次，合并有机相，用盐水洗涤，用无水MgSO4干燥。 将有机层真空浓缩并通过硅胶色谱法纯化，得到7.87g淡黄色固体。产率1
84.99%。H NMR (400 MHz, DMSO‑ d6) δ 9.53‑9.50 (m,1H), 8.48 – 8.35 (m, 1H), 
7.45 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 4.02 (s, 2H), 1.96 (s, 6H). ESI‑MS: mass calcd for +
[M + H](C14H13N7S) 312.10; found m/z, 312.09.

[0084] 化合物5 [2‑（（2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑（1,2,4‑噁二唑‑5‑基）丙酸]的制备：将化合物3（2.00 g, 6.42 mmol），化合物2‑溴‑3‑（1,2,4‑噁二唑‑5‑基）丙酸（2.13 g, 9.63 mmol），溶解于NaOH（2N）甲醇水溶液中（甲醇：水=2：1），氩气置换后于120℃微波反应1 h，TLC监测反应。反应完毕后，将反应混合物真空浓缩，加入200mL水，用乙酸乙酯（2×200mL）萃取两次，合并有机相，用盐水洗涤，用无水MgSO4干燥。将有机层合并后，真空浓缩并通过硅胶色谱法纯化，得
1
到1.5 g类白色固体。产率51.72%。H NMR (400 MHz, DMSO‑ d6) δ 9.52‑9.50 (m, 1H), 
8.51– 8.38 (m, 1H), 7.45 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 6.92 (s, 1H), 4.48(t, J = 15.6 Hz, 1H),4.03 (s, 2H), 3.68 (dd, J = 24.8, 15.5 Hz, 1H), 3.05 (dd, J = 24.8, +
15.7 Hz, 1H), 1.95 (s, 6H). ESI‑MS: mass calcd for [M + H] (C19H17N9O3S) 
451.12; found m/z, 451.11.

[0085] 化合物R‑21 [6‑（3‑（2‑（（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑（1,2,4‑噁二唑‑5‑基）丙酰基）脲基）烟酸]的制备：将化合物5（300 mg, 0.66 mmol），SOCl2（158.1 mg, 1.33 mmol）溶解于无水DCM中，升温至回流反应3‑4 h，TLC监测反应完毕后，惰性气体保护下，真空减压蒸除溶剂后，将6‑脲基烟酸（180.56 mg, 0.996 mmol），三乙胺（80.69 mg, 0.80 mmol），溶于5 mL DMSO中室温下反应6 h，通过TLC监测反应完成。将反应液体加入100mL水，用乙酸乙酯（2×100mL）萃取两次，合并有机相，用盐水洗涤，用无水MgSO4干燥。将有机层真空浓缩并通过硅胶色谱法纯
1
化，得到122.90mg浅白色固体，产率30.3%。H NMR (400 MHz, DMSO‑ d6) δ 9.51– 9.43 (m, 2H), 8.23 (d, J = 3.2Hz, 1H), 7.97 (dd, J =14.9, 2.9 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 4.52 (t, J = 14.4 Hz, 1H), 4.19 (dd, J = 24.8, 14.4 Hz, 1H), 4.03 (s,2H), 3.11dd, J = 24.8, 
13
14.4 Hz, 1H), 1.92 (s, 6H). C NMR (100 MHz, DMSO‑ d6) δ 176.82 (s), 171.25 (s), 165.51 (s),162.06 (s), 159.02 (s), 156.68 (s), 152.98 (s), 151.99 (s), 
150.82 (s), 150.31 (s), 149.36 (s), 147.78 (s), 146.95 (s), 145.51 (s), 
137.90 (s), 137.03 (s),121.31 (s), 112.51 (s), 111.99 (s), 104.52 (s), 103.91 (s), 43.92 (s), 31.48 (s), 26.52(s), 13.41 (s), 10.31 (s). ESI‑MS: mass calcd +
for [M + H](C26H22N12O5S) 615.16; found m/z, 615.16.

[0086] 2、化合物R‑6 [2‑（（2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）‑[1,2,4]三唑并[1,5‑c]喹唑啉‑5‑基）硫代）‑N‑（（5‑氟吡啶‑2‑基）氨基甲酰基）丁酰胺] 的制备[0087] 制备方法同化合物R‑21，将原料2‑（（2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）‑[1,2,4]三唑并[1,5‑c]喹唑啉‑5‑基）硫代）丁酸（200 mg, 0.504 mmol）与原料SOCl2反应得到中间体后，与5‑氟吡啶‑2‑胺（84.07 mg, 0.757 mmol）参与反应，并通过硅胶色谱法纯化，
1
得到99.86 mg类白色固体，产率37.1%。H NMR (400 MHz, DMSO ) δ 9.53 (br, 1H),
8.13‑8.06 (m, 2H), 7.87 (dd, J = 16.0, 2.8 Hz, 1H), 7.79 (m, 1H), 7.60 – 7.39 (m, 3H), 4.14 – 3.81 (m, 3H), 1.97– 1.83 (m, 8H), 0.97 (t, J = 13.4 Hz,3H). +
ESI‑MS: mass calcd for [M + H](C25H24FN9O2S) 534.17; found m/z, 534.18.

[0088] 3、化合物R‑8 [6‑（3‑（2‑（（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）‑[1,2,4]三唑并[1,5‑c]喹唑啉‑5‑基）硫代）丁酰基）脲基）烟酸] 的制备

[0089] 制备方法同化合物R‑21，将原料2‑（（2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）‑[1,2,4]三唑并[1,5‑c]喹唑啉‑5‑基）硫代）丁酸（200 mg, 0.504 mmol）与原料SOCl2反应得到中间体后，与6‑氨基烟酸（104.52 mg, 0.757 mmol）参与反应，并通过硅胶色谱法纯化，得
1
到79.3 mg浅白色固体，产率28.1%。H NMR (400 MHz, DMSO ) δ 9.51 (s, 1H),8.27 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 8.16‑8.02 (m, 2H), 7.94 (dd, J = 15.0, 3.0 Hz, 1H), 7.75 (td, J = 14.9, 3.1 Hz, 1H), 7.63‑7.42 (m, 2H), 4.13 – 3.81 (m, 3H), 2.15 – +
1.72(m, 8H), 0.99 (t, J = 13.4 Hz, 3H).ESI‑MS: mass calcd for [M + H]
(C26H25N9O4S) 560.17; found m/z, 560.18.

[0090] 4、化合物R‑13 [2‑（（2‑（2‑（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）乙基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑N‑（（5‑氟吡啶‑2‑基）氨基甲酰基）‑3‑（4H‑咪唑‑5‑基）丙酰胺]的制备

[0091] 制备方法同化合物R‑21，将原料2‑（（2‑（2‑（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）乙基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑（4H‑咪唑‑5‑基）丙酸（200 mg, 0.504 mmol）与原料SOCl2反应得到中间体后，与5‑氟吡啶‑2‑胺（72.56 mg, 0.757 mmol）
1
参与反应，并通过硅胶色谱法纯化，得到90.45 mg浅褐色固体，产率34.9%。H NMR (400 MHz, DMSO ) δ 9.59 – 9.47 (m, 2H), 8.46 – 8.37(m, 1H), 7.97 (dd, J = 16.0, 
2.8 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.52 – 7.28 (m, 3H), 4.21 (s, 2H), 3.82(t, J = 
13.8 Hz, 1H), 3.63– 3.38 (m, 3H), 3.20 (dd, J = 24.8, 13.9Hz, 1H), 2.89‑2.80 +
(m, 2H), 1.91 (s, 6H).ESI‑MS: mass calcd for [M + H] (C27H25FN12O2S) 601.19; found m/z, 600.19.

[0092] 5、化合物R‑15 [2‑（（2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑N‑（（5‑氟吡啶‑2‑基）氨基甲酰基）‑3‑（1,2,4‑噁二唑‑
5‑基）丙酰胺]的制备

[0093] 制备方法同化合物R‑21，将原料2‑（（2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑（1,2,4‑噁二唑‑5‑基）丙酸（200 mg, 0.443mmol）与原料SOCl2反应得到中间体后，与5‑氟吡啶‑2‑胺（74.5 mg, 0.664mmol）1
参与反应，并通过硅胶色谱法纯化，得到100.38 mg白褐色固体，产率38.5%。H NMR (400 MHz, DMSO ) δ 9.51‑9.47 (m,2H), 8.48 – 8.36 (m, 1H), 7.98 – 7.85 (m, 1H), 
7.51 – 7.38 (m, 3H), 6.84 (s, 1H), 4.65 (t, J = 13.8 Hz, 1H), 4.01 – 3.80 (m, 
3H), 3.52 (dd, J = 24.8, 13.8 Hz, 1H), 1.90 (s,6H).ESI‑MS: mass calcd for [M +
+ H](C25H21FN12O3S) 589.15; found m/z, 589.16.

[0094] 6、化合物R‑28 [(2‑（（2‑（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑（1,2,4‑噁二唑‑5‑基）丙酰基）氨基甲酰基）甘氨酸]的制备

[0095] 制备方法同化合物R‑21，将原料2‑（（2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑（1,2,4‑噁二唑‑5‑基）丙酸（200 mg, 0.443 mmol）与原料SOCl2反应得到中间体后，与甘氨酸（49.88 mg, 0.664 mmol）参与1
反应，并通过硅胶色谱法纯化，得到71.1 mg浅白色固体，产率29.1%。H NMR (400 MHz, DMSO ) δ 9.52 (br, 1H),8.53 – 8.38 (m, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.45 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 4.76 (t, J = 14.4 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 16.1 Hz,4H), 
3.93‑3.69 (m, 1H), 3.22‑3.09 (m, 1H), 1.92 (s, 6H). ESI‑MS: mass calcd for [M +
+ H](C22H21N11O5S) 552.14; found m/z, 552.15.

[0096] 7、化合物R‑30 [6‑（3‑（2‑（（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑苯基丙酰基）脲基）烟酸]的制备。

[0097] 制备方法同化合物R‑21，将原料2‑（（2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑苯基丙酸（200 mg, 0.653mmol）与原料SOCl2反应得到中间体后，与6‑氨基烟酸（90.17 mg, 0.664 mmol）参与反应，并通过硅1
胶色谱法纯化，得到95.1 mg浅白色固体，产率35.1%。H NMR (400 MHz, DMSO ) δ 9.56 –
9.48 (m, 2H), 8.50 – 8.36(m, 1H), 8.26 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.93 (dd, J =
14.9, 2.9 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 7.32 – 7.08(m, 5H), 5.26 ‑ 5.17 (m, 1H), 4.02 (s, 2H), 3.48 ‑ 3.25 (m, 1H), 3.20 – +
3.28 (m, 1H), 1.91 (s, 6H).ESI‑MS: mass calcd for [M + H] (C30H26N10O4S) 623.18; found m/z, 623.19.

[0098] 8、化合物R‑32 [6‑（3‑（2‑（（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑（吡啶‑4‑基）丙酰基）脲基）烟酸]的制备[0099] 制备方法同化合物R‑21，将原料2‑（（2‑（（3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑4‑基）甲基）吡啶并[3,4‑e][1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶‑5‑基）硫代）‑3‑（吡啶‑4‑基）丙酸（200 mg,0.434mmol）与原料SOCl2反应得到中间体后，与6‑氨基烟酸（90.0 mg, 0.652 mmol）参与反
1
应，并通过硅胶色谱法纯化，得到95.7 mg浅白色固体，产率35.3%。H NMR (400 MHz, DMSO ) δ 9.61 – 9.48 (m, 2H), 8.57 (d, J = 14.9 Hz, 2H), 8.45 – 8.36 (m, 1H), 8.23 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 7.92 (dd, J =14.9, 2.9 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 15.0 Hz,
1H), 7.42 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 15.1 Hz, 2H), 5.03 – 4.05 (m,
1H),4.28 – 3.98 (m, 3H), 3.73 – 3.60 (m, 1H), 1.93 (s, 6H).ESI‑MS: mass calcd +
for [M + H](C30H26N10O4S) 624.18; found m/z, 624.18.

[0100] 实施例2 荧光共振能量转移评估目的分子抑制CD47/SIPRα的结合能力

[0101] 将合成所得到的目的小分子分别用DMSO溶解并配制成浓度为20 mM的溶液，用CD47/SIRPα分析试剂盒进行测试，之后用Detection缓冲液分别将化合物进一步稀释，并以一定浓度梯度（0.5‑20 μM）2 μL/孔加入到500微孔的测试板中，阳性对照组为NCG‑3，空白组为DMSO。之后每孔分别加入4 μL的Tag1‑CD47和Tag2‑SIRPα，室温下孵育0.5 h后每孔分别加入5 μL 对应的抗体，室温下再孵育1.5‑2 h。使用VICTOR Nivo多功能酶标仪
（PerkinElmer,Inc., USA）在665 nm处测定其荧光吸收值，并由GraphPad Prism5软件计算出对应的IC50值，其结果见表2和图1。

[0102]

[0103] 其中，IC50为三次测量的平均值±标准差；NCG‑3为阳性药物NCGC00138783。

[0104] 图1为根据表2数据得到的小分子与CD47/SIRPα结合能力测试示意图，其中，*P<0.05 vs DMSO；**P<0.01 vs DMSO；***P<0.001 vs DMSO。从体外活性测试结果可以看到，当化合物取代基R1为噁二唑基团取代，R2为脲基苯甲酸取代时能够明显提升化合物分子的活性，其中最优分子化合物R‑21在体外活性测试中IC50达到了21.8 µM，对CD47/SIRPα抑制活性约为阳性分子NCG‑3的3倍（IC50= 63.6 µM），通过进一步的分子对接（Discovery Studio 3.5，USA）模拟发现化合物R‑21对CD47蛋白（PDB code：2JJS）的有关键作用模式，如图2所示。

[0105] 图2为化合物R‑21与CD47/SIRPα对接模拟示意图，其中，A图为CD47蛋白与化合物R‑21作用模式图，B图为化合物R‑21分子位于CD47蛋白的口袋模式图，C图为化合物R‑21在CD47蛋白位置示意图，D图为化合物R‑21与CD47蛋白关键氨基酸作用模式图。可以看出，化合物R‑21能紧密的结合于CD47蛋白，化合物R‑21分子中的6‑[(氨基羰基)氨基]吡啶‑3‑甲酸相连接的羰基能与Asn‑93形成关键的氢键作者用，羧基端能与Ser‑77和Arg‑59形成氢键作用，三唑并[1,5‑c]喹唑啉形成的三元环中的N原子能与Phe‑55形成π关键的氢键作用，二甲基吡唑环能与Lys‑6和Cys‑8形成π‑π相互作用，噁二唑基团中的N原子能与Thr‑62形成关键的氢键作用。相比阳性分子NCG‑3，化合物R‑21与CD47蛋白结合方式更加稳定，也映证了体外HTRF实验测试结果。根据体外生物活性测试及对接结果也证实了化合物R‑21与CD47蛋白具有稳定的作用。

[0106] 实施例3 化合物R‑21对细胞增殖能力的测试

[0107] 本实验所使用的肿瘤细胞株为NCI‑H1395，H3122，HT29，Hela，Jurkat，及人正常肝细胞LO2，以上细胞株购自于美国ATCC公司，或者中国科学院细胞库。细胞培养条件参照oATCC培养规则，培养基为Gibco公司提供RPMI 1640、L‑15、DMEM；37C，5%CO2，1%青霉素/链霉素（V/V），10% Gibco胎牛血清。采用MTT的方法测试其对不同细胞株增长的抑制活性。具体
3
方法如下，取对数生长期肿瘤细胞，以1.5‑3.5×10的密度接种于96孔板中，5%的CO2，37 ℃孵育24h，加入指定浓度的目标分子，阳性对照组为NCG‑3，空白组为DMSO。72h后加入MTT，并于37 ℃下再孵育2～4 h。使用Spectra MAX M5微孔板分光光度计（MolecμLar Devices, USA）在570 nm处测量96孔板的吸光度值（OD），并由GraphPad Prism5软件计算出对应的IC50值，其结果见表3和图3。

[0108]

[0109] 其中，IC50为三次测量的平均值±标准差； NCG‑3为阳性药物NCGC00138783。

[0110] MTT结果显示，化合物R‑21在体外对肿瘤细胞增殖抑制活性有限，说明目标化合物R‑21分子在体外对肿瘤细胞直接抑制能力较弱的，化合物R‑21分子可能是通过阻断CD47/SIRPα结合功能发挥抗肿瘤作用的，体外无直接抗肿瘤活性的作用。通过荧光标记实验进一步验证了化合物R‑21对CD47/SIRPα蛋白的作用机制，详见图4。图中，A图为标记的CD47蛋白；B图为加入SIRPα蛋白的结合图。

[0111] 实施列4 流式细胞术评估化合物R‑21对细胞吞噬能力的影响

[0112] 通过分离得到7‑10周龄NOD小鼠的骨髓源性巨噬细胞，以每孔1.0‑1.5×103密度3
接种于96孔板中，加入不含血清的培养基，5%的CO2，37 ℃过夜。每孔以3×10密度加入经羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的HeLa细胞株，加入CFSE细胞增殖追踪试剂，之后分别加入指定浓度的化合物R‑21分子，NCG‑3为阳性对照组，DMSO为空白对照组，37 ℃孵育6 h，收集细胞，用anti‑F4/80标记初始巨噬细胞，流式细胞仪分析处理实验结果，详见图
5。由图5可以看到，与阳性药在相同浓度下，化合物R‑21在能够明显诱导巨噬细胞生成，增加吞噬作用，从而激活细胞免疫活性。

[0113] 实施列5 化合物R‑21在小鼠体内抗肿瘤实验

[0114] 将对数期HeLa细胞（6×106）皮下注射到6‑7周龄的雌性NOD/SCID小鼠中。一旦平3
均肿瘤体积增长到大约100‑120 mm，每个小鼠细胞模型组随机分为7组（每组n = 8）。分别为空白组（5％DMSO，20%PEG，2% Tween‑80，生理盐水），分子给药组PD‑L1单抗
（Atezolizumab，5mg/kg）组，化合物R‑21（50mg / kg）+PD‑L1单抗（5mg / kg），化合物R‑21（100mg / kg）+PD‑L1单抗（5mg / kg），其中PD‑L1单抗（Atezolizumab）用生理盐水溶解后静脉注射给药，小分子采用配方（5％DMSO，20%PEG，2% Tween‑80，生理盐水）溶解后经灌胃给药。每隔两天测定一次肿瘤大小和体重，实验周期为21天。用游标卡尺测量肿瘤体积并计算为[0.5×最短直径2×最长直径]。使用以下公式计算肿瘤生长的抑制率：100×{1‑[治疗组最终肿瘤体积‑肿瘤体积初始]/ [媒介物治疗组最终肿瘤体积‑肿瘤体积初始]]}。其结果见图6。

[0115] 在NOD/SCID小鼠HeLa异种移植模型中，化合物R‑21与PD‑L1单抗5 mg/kg（Atezolizumab）联用大大增强了体内的抗肿瘤效果，并且化合物R‑21在以50 mg/kg，100 mg/kg分别联用时，观察到肿瘤生长抑制（TGI）为75.29%，90.57%，而PD‑L1单抗
Atezolizumab组肿瘤生长抑制率仅为54.6%。体内抗肿瘤实验证明了化合物R‑21能够大大增强肿瘤免疫治疗的效果。