一种改善肠道健康状况的乳酸片球菌及其应用转让专利
申请号 : CN202311576192.6
文献号 : CN117305187B
文献日 : 2024-02-06
发明人 : 张旭朏 , 李璟欣 , 李鑫 , 王梦创
申请人 : 四川厌氧生物科技有限责任公司
摘要 :
本发明属于微生物领域，具体公开了一种改善肠道健康状况的乳酸片球菌及其应用。所述乳酸片球菌Pacid‑1不具有毒力因子、不溶血、对多种抗生素敏感，安全性良好。该菌株对人工胃液耐受性良好，并且能抑制多种致病菌、缓解屏障功能障碍、抑制促炎因子表达，以及可有效改善胃肠道症状。(56)对比文件朱翠;师子彪;蒋宗勇;王丽.乳酸杆菌在调节肠道屏障功能中的作用.中国畜牧兽医.2012,(第09期),全文.
权利要求 :
1.一种乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株，所述菌株为保藏号为CCTCC NO: M 20222030的乳酸片球菌Pacid‑1。
2.如权利要求1所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株的培养方法，其特征在于，将所述乳酸片球菌菌株接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的乳酸片球菌菌株。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养基每1 L蒸馏水含有BHI肉汤粉末15‑20 g，MRS肉汤粉末10‑15 g，改良GAM肉汤粉末12‑17 g。
4.一种食品或药物组合物，其活性成分含有权利要求1所述的乳酸片球菌
（Pediococcus acidilactici）菌株，或含有通过权利要求2或3所述的培养方法得到的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株。
5.一种保健食品组合物，其活性成分含有权利要求1所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株，或含有通过权利要求2或3所述的培养方法得到的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株。
6.权利要求4所述的药物组合物在制备改善肠道健康状况的产品中的应用，其特征在于，所述肠道健康状况为肠道炎症和/或肠道屏障损伤和/或化疗药物引起的腹泻。
7.权利要求4所述的药物组合物在制备改善肠道健康状况的产品中的应用，其特征在于，所述肠道健康状况为以下任意一种或其组合所引起的肠道病原菌感染：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）和艰难梭菌（Clostridioides difficile）。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述化疗药物是选自如下一种或其组合：
5‑氟尿嘧啶、替加氟、5'‑2'‑脱氧尿苷、卡培他滨、替吉奥、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀、伊立替康。
说明书 :
一种改善肠道健康状况的乳酸片球菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种改善肠道健康状况的乳酸片球菌及其应用。
背景技术
[0002] 肠道微生物与人体健康息息相关，且被形象的称为“微生物器官”。肠道菌群作为机体重要的组成部分，正常状况下肠道菌群保持动态稳定，在促进营养物质消化吸收、维持肠道正常生理功能、调节机体免疫等众多生命活动中发挥重要的作用。然而肠道菌群容易受到各种因素的影响，例如：环境因素、饮食和生活习惯、精神因素、疾病状态、肿瘤治疗、抗生素使用以及年龄等众多因素。
[0003] 人体肠道菌群在受到上述因素影响后发生紊乱，即肠道菌群失调，可表现为肠道有益菌的缺失、病原菌的过度繁殖、肠道屏障功能受损以及肠道炎症的发生，进一步引起宿主的胃肠道疾病，包括便秘、腹泻、腹痛、腹胀等情况，严重的可发展成炎症性肠病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征等疾病，极大地影响人体健康和生活质量。
[0004] 目前，利用肠道益生菌来改善肠道健康以及预防或治疗肠道疾病越来越受到关注。肠道益生菌可以增强肠道黏膜屏障功能、阻止病原菌的黏附和定植、增强系统的免疫反应，从而达到维护肠道健康的作用。例如，中国发明专利申请CN 102711778A公开了一株动物双歧杆菌乳亚种DN‑173010，并通过小鼠实验和组织学研究验证了其发酵乳能减轻溃疡性结肠炎。公开号为CN107312726A的专利申请文本公开了一种植物乳杆菌，此植物乳杆菌可抑制肠道内大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌以及金黄色葡萄球菌等有害菌的生长。
[0005] 益生菌也被用来预防或改善一些药物，如抗生素等引起的副作用。在临床上，与化疗相关的副作用也是很常见的。消化系统反应就是最常见的副作用之一，如恶心、呕吐、腹泻和便秘等。以5‑FU为例，5‑FU被磷酸化为5‑FdUMP或者5‑FUMP后，对增殖的小肠细胞较敏感，能导致小肠黏膜损伤并干扰肠细胞的分裂引起肠壁细胞坏死及肠壁的广泛炎症，造成吸收和分泌细胞数量失衡，进而导致腹泻。另外，化疗药物还会造成细胞DNA损伤和线粒体功能障碍，导致ROS产生和细胞凋亡。ROS可以诱导NF‑κB激活，进一步上调促炎因子的表达，导致上皮、内皮和结缔组织的损伤。在肠上皮发生损伤的情况下，有害细菌极易定植，肠道微生态遭到破坏，进而造成致病菌感染，促进腹泻发生发展。
[0006] 乳酸片球菌是肠道益生菌中的重要成员之一。Wentao Li等人（Microorganisms. 2022, 10(12):2350.）研究发现，乳酸片球菌对ETEC（产肠毒素性大肠杆菌）诱导的小鼠肠道炎症有较好改善作用。另外，专利CN113736695B公开了乳酸片球菌益生菌株能通过改善结肠粘膜损伤、抑制促炎因子表达、降低内毒素等改善结肠炎症状。但尚未有研究报道过乳酸片球菌在化疗药物引起的腹泻中的作用。
发明内容
[0007] 本发明首先提供了一种乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株，所述菌株选自保藏号为CCTCC NO: M 20222030的乳酸片球菌Pacid‑1或毒性、免疫原性与生物活性相对于保藏号为CCTCC NO: M 20222030的乳酸片球菌Pacid‑1菌株没有实质变化的传代菌株。
[0008] 在一些具体实施方式中，本发明所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的16S rDNA序列与SEQ ID NO.1一致。
[0009] 在一些具体实施方式中，本发明所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）具有编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的产乙酸相关酶的基因。
[0010] 在一些具体实施方式中，本发明所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）具有编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的产乙酸相关酶的基因。
[0011] 在一些具体实施方式中，本发明所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）具有编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的产乙酸相关酶的基因。
[0012] 在一些具体实施方式中，本发明所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）具有编码氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的产乙酸相关酶的基因。
[0013] 在一些具体实施方式中，本发明所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）具有编码氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的产丙酸相关酶的基因。
[0014] 在一些具体实施方式中，本发明所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）具有编码氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的产CAT（过氧化氢酶）相关酶的基因。
[0015] 其次，本发明还提供了前述乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株的培养方法，所述方法包括将所述乳酸片球菌菌株接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的乳酸片球菌菌株。
[0016] 在一些具体实施方式中，所述培养基每1 L蒸馏水含有BHI肉汤粉末15‑20 g，MRS肉汤粉末10‑15 g，改良 GAM肉汤粉末12‑17 g。
[0017] 再次，本发明还提供了一种组合物，其活性成分含前述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株，或含有通过前述的培养方法培养得到的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株。
[0018] 在一些具体实施方式中，所述乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）菌株作为唯一活性成分。
[0019] 最后，本发明还提供了前述乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）或前述组合物在制备改善肠道健康状况的产品中的应用。
[0020] 在一些具体实施方式中，所述肠道健康状况是肠道炎症和/或肠道屏障损伤和/或肠道病原菌感染。
[0021] 在一些具体实施方式中，所述肠道健康状况是化疗药物引起的腹泻。
[0022] 在一些具体实施方式中，所述肠道病原菌选自以下任意一种或其组合：铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌和艰难梭菌。
[0023] 在一些具体实施方式中，所述化疗药物选自如下的一种或其组合：5‑氟尿嘧啶、替加氟、5'‑2'‑脱氧尿苷、卡培他滨、替吉奥、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀、伊立替康。
[0024] 在一些具体实施方式中，本发明所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）具有如下生化鉴别特征：
[0025] 1）在无氧三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）上的菌落形态为白色不透明状圆形、中间凸起、表面光滑湿润；
[0026] 2）基因组无毒力基因；
[0027] 3）体外不溶血（即γ溶血）；
[0028] 4）对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、头孢曲松、四环素、克林霉素、左氧氟沙星、呋喃妥因、高浓度庆大霉素、链霉素、利福平中的至少两种抗生素敏感；
[0029] 5）耐受人工胃液。
[0030] 在一些具体实施方式中，本发明所述的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）具有如下功能鉴别特征：
[0031] 1）具有肠道屏障修复功能；
[0032] 2）具有体外抗炎作用；
[0033] 3）能预防、改善、减轻或缓解化疗相关性腹泻；
[0034] 4）对铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌和艰难梭菌具有抑菌活性。
[0035] 本发明的乳酸片球菌具有如下特点：
[0036] 1、无毒力因子、不溶血、对多种抗生素敏感，具有良好的安全性；
[0037] 2、能耐受人工胃液，对多种致病菌具有抑制作用，能改善肠道屏障，抑制促炎因子的表达，能预防、改善、减轻或缓解化疗药物引起的腹泻；
[0038] 3、在改善化疗药物引起的腹泻的效果上与化药洛哌丁胺相当。
[0039] 本发明的菌株保藏信息如下：
[0040] 菌株名称：乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）Pacid‑1
[0041] 保藏日期：2022年12月23日
[0042] 保藏单位：中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC），地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027‑68754052。
[0043] 保藏编号：CCTCC NO: M 20222030。
附图说明
[0044] 图 1 为实施例1乳酸片球菌Pacid‑1菌落形态正面照片。
[0045] 图 2 为实施例5乳酸片球菌Pacid‑1耐人工胃液结果图。
[0046] 图 3 为实施例6乳酸片球菌Pacid‑1抑菌实验结果图。
[0047] 图 4 为实施例7乳酸片球菌Pacid‑1对屏障修复试验结果。
[0048] 图 5 是实施例8乳酸片球菌Pacid‑1抑制细胞炎症表达的试验结果(A抑制IL‑6表达结果图；B 抑制TNF‑α表达结果图)。
[0049] 图 6为实施例9乳酸片球菌Pacid‑1对5‑氟尿嘧啶致腹泻小鼠的治疗效果图（A 第1‑9天各组腹泻评分曲线；B D8腹泻评分图；C各组腹泻总分图）。
具体实施方式
[0050] 定义与说明
[0051] 针对本发明所请求保护的菌株（微生物保藏号为CCTCC NO: M 20222030的乳酸片球菌菌株，Pacid‑1株），与Pacid‑1株的没有突变的基因组完全相同的、或传代中积累微小突变的，但毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株应当视为经过微生物保藏的Pacid‑1株。毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株或突变菌株主要指基于Pacid‑1株传代以及传代中积累微小突变的菌株。并且所述菌株包括活菌和灭活形式，完整的菌体或其裂解液或其发酵产物。
[0052] Pacid‑1株经传代应用不可避免引入微小突变，毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株或突变菌株应当属于本发明的贡献范围。毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化，包括担不限于，在检测灵敏度、检测限等检测技术的局限性和可接受或不可避免误差的范围内视为毒性、免疫原性与生物活性是相同的。
[0053] 经常需要用动物测定Pacid‑1株后代的毒性、免疫原性与生物活性，由于动物品种、年龄、性别、健康状况等体现的差别以及可预期或不可避免的系统误差属于没有实质性变化，属于毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株。
[0054] Pacid‑1株传代多次后不可避免引入微小的突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响菌株毒性、免疫原性与生物活性的突变（比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响毒性、免疫原性与生物活性的微小突变的残基），可以合理预期的是当这些微小变化没有明显影响后代毒株的毒性、免疫原性与生物活性的情况下，仍然在本发明的实质技术贡献范围内，这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为毒性、免疫原性与生物活性没有变化的突变菌株。
[0055] 本发明Pacid‑1株的培养基培养传代菌株，可合理预期的是，与其他细菌一样，不可避免引入微小突变，当其毒性、免疫原性与生物活性没有实质性变化时，属于毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株或突变菌株。
[0056] Pacid‑1株来自人粪便，必然在不同人体中或环境中有可能在本发明申请日以后分离到并鉴定的与Pacid‑1株具有共同祖先且与其他已知乳酸片球菌菌株存在明显生理遗传差别的同源菌株，它们基因组与Pacid‑1株可能完全相同，也可能有微小的差别。
[0057] 当这些同源菌株与Pacid‑1株的差别程度相当于毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株或突变菌株与Pacid‑1株的差别程度时，这些同源菌株与Pacid‑1株相同或视为毒性、免疫原性与生物活性没有差别，这些同源菌株属于与Pacid‑1株实质相同的菌株。
[0058] 本发明所述的组合物含有活性成分乳酸片球菌，以及其他成分，比如不具有生理功效的辅料成分，或者其他功效性成分。功效性成分包括但不限于其他功效菌株，或具有营养、膳食补充作用的营养成分、膳食纤维、益生元成分、后生元成分等。
[0059] 本发明所述的组合物可以制备成任一种便于使用的形式，例如临床或食品中常见的粉剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、胶囊或液体剂。
[0060] 本发明所述的组合物以能发挥功效的含量（治疗有效量）和频率给予使用对象，推2 15 4 13 5 12
荐单次使用剂量中含有10 10 CFU、10 10 CFU或10 10 CFU的乳酸片球菌
~ ~ ~
（Pediococcus acidilactici）。
荐单次使用剂量中含有10 10 CFU、10 10 CFU或10 10 CFU的乳酸片球菌
~ ~ ~
（Pediococcus acidilactici）。
[0061] 本发明所述腹泻是指排便次数明显超过平时习惯（>3次/d），粪质稀薄，含水量增加（>85%），大便可伴有黏液、脓血或未消化的食物的一种临床症状。
[0062] 本发明所述的肠道炎症是指微生物感染、缺血、放射线、机体免疫失调等各种原因引起的肠道炎症性反应，最常见的症状有腹痛、腹泻、血便、发热等。可伴有白细胞介素‑6（IL‑6）等炎症因子指标的升高。
[0063] 本发明所述的肠道屏障损伤是指肠道黏膜的屏障功能受到破坏，导致肠道通透性改变，肠道内毒素、细菌和其他有害物质进入血液循环系统，引发一系列炎症反应和相关疾病。肠道通透性增大可反应肠黏膜的损伤，是评价肠屏障功能的重要指标。
[0064] 本发明中的特定温度参数，如无特殊说明，应理解为恒温处理，并允许在一定温度区间内存在变动。如在±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
[0065] 辅料成分包括药物载体和赋型剂。药物载体是指不对受试者引起显著刺激且不消除所施用的益生菌的生物活性及特性的药学载体。药学上可接受的载体可增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可包括溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物稳定剂、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，正如本领域技术人员已知的（参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版MackPrinting Company,1990,第1289‑1329页）。除非常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗性或药物组合物中。载体可经选择以使受试者的不利副作用降至最低和/或使活性成分的失活降至最低。
[0066] 赋型剂是指添加至药物组合物中以使药物具有一定形状或一定浓度的物质。例如无菌水、生理盐水、聚亚烷基二醇（诸如聚乙二醇）、植物油或氢化萘、碳酸氢钙、磷酸钙、多种糖、各种类型淀粉、纤维素衍生物、明胶等。
[0067] 下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均应属于本发明保护的范围。
[0068] 以下实施例中所用到的培养基配制方法如下：
[0069] YCFA液体培养基的配制：称取酪蛋白10.0 g，酵母提取物2.5 g，MgSO4·7H2O 0.45 mL（10%的母液），10 mg/mL的CaCl2 溶液0.45 mL，TE141 10 mL，K2HPO4 0.45 g，KH2PO4 0.45 g，NaCl 0.90 g，溶解于适量的蒸馏水中，加热煮沸后停止加热。培养基冷却过程中，先分批次向3.2 mL的VFA‑mix中添加NaOH调节pH至中性，待培养基冷却至室温后添加到培养基中，随后添加一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g，0.1% 刃天青1 mL搅拌均匀，NaOH调节pH至中性二次加热煮沸后，维持微沸状态20 min左右停止加热，N2置换降温并分装，121 ℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放，备用。
[0070] TE141的配制：称取次氮基三乙酸1.50 g加入到200 mL纯水中，加入适量NaOH至溶液变澄清，之后加水800 mL，用50% HCl调节pH值至5.5，之后依次称取MgSO4·7H2O 3.00 g，MnSO4·H2O 0.50 g，NaCl 1.00 g，FeSO4·7H2O 0.10 g，CoSO4·7H2O 0.18 g，CaCl2·2H2O 0.10 g，ZnSO4·7H2O 0.18 g，CuSO4·5H2O 0.006 g，KAl(SO4)2·12H2O 0.02 g，H3BO3 0.01 g，Na2MoO4·2H2O 0.01 g，NiCl2·6H2O 0.03 g，10 mg/mL的Na2SeO3·5H2O溶液 0.03 mL，10 mg/mL的Na2WO4·2H2O溶液 0.03 mL加入上述试液中，加入过程中不断搅拌，保持溶液澄清，备用。
[0071] VFA‑mix的配制：量取乙酸90 mL，丙酸30 mL，正戊酸10 mL，异丁酸10 mL，丁酸10 mL混匀备用，使用前用5 M 浓度 NaOH溶液调至pH为中性。
[0072] 原始样本保护剂的配制：称取Na2HPO4·12H2O 3.85g，KH2PO40.27 g，NaCl 8.00 g，加入适量蒸馏水充分溶解后，加入200 mL丙三醇，补水至1.2 L加热煮沸后，通N2冷却至室温。然后加入1.00 g半胱氨酸盐和0.1%的刃天青1 mL，充分溶解后利用5 M浓度NaOH溶液调至pH为中性，二次煮沸至保护剂颜色恢复无色状态，继续维持加热20 min以上，通N2冷却至室温后分装，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放。
[0073] 三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）的配制：称取BHI肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8297‑5）19.25 g，MRS肉汤粉末（广东环凯生物科技有限公司，027312）13.5 g，改良GAM肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8518‑3）15 g（配置三混固体培养基时再加入琼脂粉12 g），溶解于1 L的蒸馏水中，N2置换除氧并分装，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放。
[0074] 二混培养基（BHI+MRS）的配制：称取BHI肉汤粉末19.25 g，MRS肉汤粉末27.0 g，一水合半胱氨酸盐酸盐（峨眉山市龙腾生物科技有限公司）0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，进行除氧分装，121℃高温湿热灭菌15 min，阴凉、干燥处存放。 MRS肉汤的配制：称取MRS肉汤粉末54.0 g，一水合半胱氨酸盐酸盐（峨眉山市龙腾生物科技有限公司）0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，N2置换除氧，121℃灭菌15 min。
[0075] MRS固体培养基、GAM固体培养基、TSB（胰蛋白胨大豆肉汤，青岛海博生物技术有限公司，HB4114）、TSA（胰蛋白胨大豆琼脂，青岛海博生物技术有限公司，HB4138）、布氏肉汤（青岛海博生物技术有限公司，HB0241）培养基的配制均按照说明书进行称量溶解，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放。
[0076] 人工胃液的配制：在pH3.0人工胃液（无酶，无菌，上海源叶生物科技有限公司，R24026）中补充胃蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司，S10028）至终浓度为10 g/L，持续通N2 1 h。于手套箱内用0.22 μm滤器过滤除菌，备用，4℃保存不超过30 d。
[0077] 菌粉制备培养基配制：称取葡萄糖12 g，大豆蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母浸粉5g，酵母蛋白胨5g，乙酸钠5 g，磷酸二氢钾4.5 g，磷酸氢二钠十二水合物 4.7 g，硫酸镁
0.1 g，硫酸锰 0.045 g，吐温80 1 g，一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，N2置换除氧，分装，121 ℃灭菌15 min。阴凉、干燥处存放。
0.1 g，硫酸锰 0.045 g，吐温80 1 g，一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，N2置换除氧，分装，121 ℃灭菌15 min。阴凉、干燥处存放。
[0078] 实施例1 乳酸片球菌Pacid‑1的分离、鉴定与保藏
[0079] 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）Pacid‑1的筛选分离方法如下：
[0080] （1）采集健康志愿者的新鲜粪便样本，称取1 2 g样本于50 mL离心管中，按照质量~体积比1:10的比例加入原始样本保护剂，充分震荡，重悬样本。在N2保护下，经纱布过滤重悬菌液至50 mL离心管中，然后传递进入手套箱进行分装。分装时使用2 mL螺帽管，每支分装1 mL，分装后贴好标签并套袋抽真空，于‑80℃冰箱保存备用。
[0081] （2）分离时取1支冻存的样本管，传递进手套箱进行解冻。待样本解冻后用移液器‑6取0.5 mL菌悬液于4.5 mL无氧PBS中振荡混匀，梯度稀释至10 ，取适当梯度菌液与YCFA培养基混匀后分布到384孔板中，37℃厌氧培养一周。提供OD监测，挑取已生长孔位菌液转接到新的384孔板中，一式两份，培养48 h后，一份利用MALDI‑TOF‑MS检测，初步对分离菌株进行分类，另一份根据质谱结果，再次转接到96孔板中，一式两份，培养48 h后一个板进行16S rDNA基因扩增并委托北京擎科生物科技有限公司成都分公司测序，另一板按1：1加入50%的甘油混合均匀临时保藏，待PCR结果确认后使用。
[0082] （3）对16S rDNA基因测序结果进行分析，将序列与NCBI Nucleotide数据库做比对，结果显示与一株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的序列相似度最高（> 99%），由此初步鉴定所分离菌株为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），命名为乳酸片球菌Pacid‑1。采用三混培养基培养后，其菌落形态呈白色不透明状圆形菌落，中间凸起、表面光滑湿润，正面照片见图1。
[0083] 采用同样的筛选分离方法还分离得到了一株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）Pacid‑2，用作下述实施例9的对照菌株。
[0084] 实施例2 乳酸片球菌Pacid‑1的全基因组分析
[0085] 按2%接种量将乳酸片球菌 Pacid‑1接种至5 mL无氧三混培养基中，培养至对数生长后期，提取菌株全基因组DNA，利用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行全基因组测序。组装及注释后，将蛋白序列输入毒力基因库Virulence Factor Databases（VFDB）进行毒力因子分析。结果显示，该菌不具有毒力因子。
[0086] 利用平均核苷酸相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）进行菌株的新颖性分析。通过在Genbank中进行搜索，找到了503个已公开的Pediococcus acidilactici全基因组，通过fastANI（v1.33）比较发现，与乳酸片球菌Pacid‑1全基因组最相近的两个菌株分别为GCA_009913875.1（ANI= 99.93%）和GCA_015557285.1（ANI= 99.92%），均低于99.99%，故可认为乳酸片球菌Pacid‑1为新菌株，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0087] 通过emapper‑2.1.9对全基因组序列进行注释，进一步发现乳酸片球菌Pacid‑1可编码4个序列分别如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的产乙酸相关酶、1个序列如SEQ ID NO:6所示的产丙酸相关酶、1个序列如SEQ ID NO:7所示的产CAT（过氧化氢酶）相关酶。
[0088] 该菌株已于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，武汉大学保藏中心），该菌株保藏号为：CCTCC NO: M 20222030。
[0089] 实施例3 乳酸片球菌Pacid‑1的溶血试验
[0090] 按2%接种量将保藏的乳酸片球菌Pacid‑1接种至5 mL无氧三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）中，以粪肠球菌（β溶血，CICC23658，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心）作为阳性对照，以空白培养基作为阴性对照。所有菌株均在无氧三混培养基中37℃厌氧培养12 h，得到活化菌株。各取2.5 μL活化菌株接种至哥伦比亚血平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司）上，每组设置3个平行。于37℃厌氧培养48 h后进行观察，阳性对照菌株菌落周围形成界限明显、完全透明的溶血环，为β溶血；乳酸片球菌Pacid‑1菌落周围的培养基没有变化，为γ溶血，即不溶血。
[0091] 实施例4 乳酸片球菌Pacid‑1的抗生素敏感试验
[0092] 根据《中国药典》（2020版）第三部“微生态活菌制剂总论”中抗生素敏感性试验的要求，使用三混培养基（BHI+MRS+改良GAM），采用琼脂扩散纸片法测定菌株对抗生素的敏感性，根据抑菌圈的大小判断菌株对抗生素敏感性级别。
[0093] 结果显示乳酸片球菌 Pacid‑1对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、头孢曲松、四环素、克林霉素、左氧氟沙星、呋喃妥因、高浓度庆大霉素、链霉素、利福平这11种抗生素敏感，对红霉素中介。
[0094] 实施例5 乳酸片球菌Pacid‑1的耐人工胃液试验
[0095] 菌株活化与培养：将乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）Pacid‑1按2%接种量接种至5 mL无氧二混培养基中，培养至对数生长后期。
[0096] 菌株耐胃液处理：取1 mL培养好的菌液，5000 rpm×5 min离心，弃去上清后用1 mL无氧无刃天青PBS将菌体重悬。取0.1 ml菌悬液补充0.9 ml无氧无刃天青PBS作为对照组，取0.1 ml菌悬液补充0.9 ml人工胃液作为实验组。混匀后于37℃厌氧静置。人工胃液组孵育6 h，吸取0.1 ml菌液稀释至适宜梯度后，取25 μl于三混固体培养基。37 ℃厌氧培养至单菌落长出后计数。
[0097] 数据处理：菌株存活率=实验组活菌数/对照组活菌数×100%。 结果如表1、图2所示，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）Pacid‑1对人工胃液具有较好的耐受性。
[0098] 表1 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）Pacid‑1经胃液处理后存活率[0099]组别 对照组 pH 3.0胃液组
9 8
活菌数（CFU/mL） （1.07±0.07）×10 （8.73±0.01）×10
存活率（%） N/A 81.9%
9 8
活菌数（CFU/mL） （1.07±0.07）×10 （8.73±0.01）×10
存活率（%） N/A 81.9%
[0100] 实施例6 乳酸片球菌Pacid‑1对病原菌的抑菌能力
[0101] 选取4种常见的可导致腹泻的致病菌进行抑菌能力检测，致病菌株来源信息如表2所示。
[0102] 表2 致病菌珠来源信息
[0103] 菌株名称 菌株保藏号 菌株保藏单位铜绿假单胞菌 CMCC(B)10104 中国食品药品检定研究院
痢疾志贺氏菌 CMCC(B)51252 中国食品药品检定研究院
小肠结肠炎耶尔森菌 CMCC(B)52204 中国食品药品检定研究院
艰难梭菌 CICC 22951 中国工业微生物菌种保藏管理中心
痢疾志贺氏菌 CMCC(B)51252 中国食品药品检定研究院
小肠结肠炎耶尔森菌 CMCC(B)52204 中国食品药品检定研究院
艰难梭菌 CICC 22951 中国工业微生物菌种保藏管理中心
[0104] 乳酸片球菌 Pacid‑1发酵液制备：乳酸片球菌 Pacid‑1经活化后，按2%的接种量接种于无氧三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）中，于37℃厌氧培养48 h，获得发酵液。
[0105] 致病菌制备与涂布：铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和小肠结肠炎耶尔森菌为好氧菌，经TSB肉汤培养基活化后，于TSB肉汤培养基中稀释50倍达到合适浓度，取0.2 mL稀释好的菌液于TSA固体培养基上涂布。艰难梭菌为厌氧菌，用三混培养基活化后，用三混培养基稀释50倍达到合适浓度，取200 μL涂布于无氧GAM固体培养基（添加5%马血清，北京索莱宝科技有限公司，S9050），每个平板中放置3个牛津杯，牛津杯中加入200 μL待测发酵液，除艰难梭菌在厌氧条件下培养，其余致病菌均在有氧条件下培养。37℃培养24 h后，测量抑菌圈直径。
[0106] 实验结果如图3所示，乳酸片球菌Pacid‑1对铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌和艰难梭菌均有抑制能力。
[0107] 实施例7 乳酸片球菌Pacid‑1的体外屏障修复试验
[0108] Caco‑2细胞（商城北纳创联生物科技有限公司，BNCC编号：350769）接种：使用37℃预热的胰酶细胞消化液对Caco‑2细胞进行消化处理，用含10%FBS（Gibco，16000‑044）和1%5
PS（Gibco，15140‑122）的DMEM培养基（Gibco，C11995500BT）进行重悬，以1.1×10 个细胞/孔的接种密度将Caco‑2细胞接种于24孔的Transwell（可穿透性细胞培养小室）中，5% CO2、
37℃培养箱静置培养21天。
PS（Gibco，15140‑122）的DMEM培养基（Gibco，C11995500BT）进行重悬，以1.1×10 个细胞/孔的接种密度将Caco‑2细胞接种于24孔的Transwell（可穿透性细胞培养小室）中，5% CO2、
37℃培养箱静置培养21天。
[0109] 菌株培养：将乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）Pacid‑1、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）GG（LGG，CICC 6141，中国工业微生物菌种保藏管理中心）分别以5%接种量接种至5 mL二混培养基中（相关试剂提前除氧），37℃电热恒温培养箱厌氧培养24 h。传代接种一次，厌氧培养8 h。取1 mL菌液，12000 rpm/min离心3 min。用含10% FBS的
7
DMEM培养基将菌株至1×10 CFU/mL，待用。
7
DMEM培养基将菌株至1×10 CFU/mL，待用。
[0110] 探究乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）Pacid‑1对Caco‑2细胞模型中肠上皮屏障功能的影响：本实验共分4组，分别为正常对照组、模型组、阳性对照LGG组、乳酸片球菌Pacid‑1组。
[0111] 肠上皮屏障功能检测：使用炎症因子IFN‑γ（PeproTech，AF‑300‑02）和TNF‑α（PeproTech，300‑01A）构建屏障损伤模型。Caco‑2细胞培养21天后，待其分化形成致密单层细胞，吸去下室旧培养基，正常对照组下室加入800 μL DMEM培养基，模型组、阳性对照LGG组、乳酸片球菌Pacid‑1组下室分别加入800 μL IFN‑γ溶液。置于5%二氧化碳培养箱中，37℃静置培养22 h后，吸去上室及下室溶液，正常对照组上室加入200 μL DMEM培养基，下室加入800 μL DMEM培养基；模型组上室加入200 μL DMEM培养基，下室加入800 μL TNF‑α溶液；阳性对照LGG组，上室加入200 μL LGG菌液，下室加入800 μL TNF‑α溶液；乳酸片球菌Pacid‑1组上室加入200 μL乳酸片球菌Pacid‑1菌液；下室加入800 μL TNF‑α溶液。置于5%二氧化碳培养箱中，37℃静置培养5 h后，检测各组别细胞单层跨膜电阻（TEER）值。
[0112] 结果如图4所示：与模型组相比，LGG可显著增加TEER值，表明对细胞屏障损伤具有明显的修复作用。同样，与模型组相比，乳酸片球菌Pacid‑1也可以显著增加TEER值。结果表明乳酸片球菌Pacid‑1可有效缓解炎症因子（如IFN‑γ、TNF‑α）造成的屏障功能障碍。
[0113] 实施例8 乳酸片球菌Pacid‑1的体外细胞炎症抑制试验
[0114] THP‑1细胞极化：使用含10%（v/v） FBS和终浓度为100 ng/mL PMA（佛波醇12‑十四酸酯13‑乙酸酯，Sigma‑Aldrich Company, P1585）的RPMI‑1640（Thermo Fisher，5
C11875500BT）培养基，以1×10 个细胞/孔的接种密度将THP‑1细胞接种于96孔板中，置于
5% CO2培养箱，37℃培养24 h使其极化成为成熟巨噬细胞。
C11875500BT）培养基，以1×10 个细胞/孔的接种密度将THP‑1细胞接种于96孔板中，置于
5% CO2培养箱，37℃培养24 h使其极化成为成熟巨噬细胞。
[0115] 菌株培养：从菌保管中接种乳酸片球菌 Pacid‑1菌液200 μL至5 mL二混培养基（BHI+MRS）中，37℃电热恒温培养箱厌氧培养24 h。转接一次后，厌氧培养8 h。取1 mL菌液，6
5000 rpm/min离心15 min。用含10%（v/v）FBS的RPMI‑1640培养基稀释至2×10 CFU/mL备用。
5000 rpm/min离心15 min。用含10%（v/v）FBS的RPMI‑1640培养基稀释至2×10 CFU/mL备用。
[0116] 乳酸片球菌Pacid‑1对THP‑1细胞表达TNF‑α和IL‑6的影响：THP‑1成熟细胞培养好后，正常对照组更换含10%（v/v） FBS的RPMI‑1640培养基；模型组、阳性对照地塞米松组及Pacid‑1试验组分别更换含10%（v/v） FBS、终浓度为100 ng/mL LPS（Sigma‑Aldrich Company, L3024）和20 ng/mL IFN‑γ（PeproTech，AF‑300‑02）的RPMI‑1640培养基，进行炎症型巨噬细胞的造模。各组均置于5% CO2培养箱中，37℃培养24 h。吸去培养基，正常对照组和模型组分别添加100 μL含10% （v/v）FBS的RPMI‑1640培养基；阳性对照组添加100 μL含10% FBS和终浓度为25 μg/mL的地塞米松（Sigma‑Aldrich Company，D4902‑25）的RPMI‑1640培养基；Pacid‑1试验组添加100 μL前期制备好的乳酸片球菌 Pacid‑1菌液。置于5% CO2培养箱，37℃培养24 h后，各组分别吸取80 μL细胞培养液，4℃，5000 rpm/min，离心15 min，收集上清液，使用Human TNF‑α (Tumor Necrosis Factor Alpha) ELISA试剂盒检测TNF‑α含量（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E‑EL‑H0109c），使用Human IL‑6 (Interleukin 6) ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E‑EL‑H6156) 检测IL‑6含量。
[0117] 试验结果：如图5所示，模型对照组细胞TNF‑α和IL‑6的表达显著高于正常对照组（P<0.01）；阳性对照地塞米松与乳酸片球菌Pacid‑1均能够显著抑制THP‑1细胞中促炎因子IL‑6（图5A）和TNF‑α（图5B）的表达（P<0.01），表明乳酸片球菌Pacid‑1在体外具有非常明显的抗炎作用。
[0118] 实施例9 乳酸片球菌Pacid‑1对5‑氟尿嘧啶（5‑FU）致腹泻小鼠的治疗效果[0119] 冻干保护剂配制：
[0120] A液：蔗糖8 g，海藻糖8 g，纯化水44 g；
[0121] B液：谷氨酸钠2 g，精氨酸盐酸盐2 g，纯化水16 g； 115℃灭菌20 min。
[0122] C液：维生素C钠4 g，纯化水16 g。过滤除菌备用。
[0123] 使用时按体积比A:B:C=6:2:2混合。
[0124] 菌粉制备：将保藏的乳酸片球菌Pacid‑1和乳酸片球菌Pacid‑2分别按10%接种量接种至菌粉制备培养基，37℃、90 rpm厌氧培养14~20 h，得到一级种子液（OD600值≥2.0）。随后，按3.0%接种量转接至菌粉制备培养基，37℃、90 rpm厌氧培养5 10 h，得到二级种子~
液（OD600值≥2.0）。按1.5%接种量将二级种子液用蠕动泵泵入发酵罐中，设置发酵参数（37℃、pH 5.1、100 rpm、0.06 MPa），发酵培养。发酵菌液OD600值≥1.8或OD600值增长≤0.1时停止发酵，设置发酵温度为20℃，离心收集菌体。按菌泥和冻干保护剂重量比1:1 1:2添加冻~
干保护剂，混匀乳化菌泥。乳化后的菌悬液，放入降温至‑40℃的冷冻干燥机的板层上冻干，冻干程序结束后取出菌饼，粉碎后即得菌粉。动物给药前使用生理盐水将乳酸片球菌
9
Pacid‑1和乳酸片球菌Pacid‑2配置成5×10 CFU/mL的菌悬液。
液（OD600值≥2.0）。按1.5%接种量将二级种子液用蠕动泵泵入发酵罐中，设置发酵参数（37℃、pH 5.1、100 rpm、0.06 MPa），发酵培养。发酵菌液OD600值≥1.8或OD600值增长≤0.1时停止发酵，设置发酵温度为20℃，离心收集菌体。按菌泥和冻干保护剂重量比1:1 1:2添加冻~
干保护剂，混匀乳化菌泥。乳化后的菌悬液，放入降温至‑40℃的冷冻干燥机的板层上冻干，冻干程序结束后取出菌饼，粉碎后即得菌粉。动物给药前使用生理盐水将乳酸片球菌
9
Pacid‑1和乳酸片球菌Pacid‑2配置成5×10 CFU/mL的菌悬液。
[0125] 试验动物：25只SPF级雄性Balb/c小鼠，体重18 22 g，购自北京维通利华实验动物~技术有限公司，饲养于SPF级动物房。
[0126] 试验设计：采用5‑FU（5‑氟尿嘧啶，购自天津金耀药业有限公司，规格10 mL/支，0.25 g/10 mL）溶液诱导小鼠化疗相关性腹泻模型，根据小鼠初始体重随机分为5组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照洛哌丁胺组、Pacid‑1组和Pacid‑2组，每组5只。
[0127] 总体试验周期为9天，记为D1‑D9。D3进行5‑FU单次造模处理，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其他组均进行5‑FU单次腹腔注射造模处理，造模剂量按体重给药（350 mg/kg）。
[0128] 所有组给药方式为灌胃，正常对照组、模型对照组灌胃冻干保护剂，连续灌胃5天（D1‑D5）；阳性对照组按体重连续灌胃洛哌丁胺（购自西安杨森制药有限公司，LFJ8684）9天9
（D1‑D9，20 mg/kg）；Pacid‑1组和Pacid‑2组连续5天（D1‑D5）灌胃1×10 CFU/只的菌悬液。
在D5给药结束后，连续观察4天。具体试验分组和给药方案见表3。
（D1‑D9，20 mg/kg）；Pacid‑1组和Pacid‑2组连续5天（D1‑D5）灌胃1×10 CFU/只的菌悬液。
在D5给药结束后，连续观察4天。具体试验分组和给药方案见表3。
[0129] 表3 乳酸片球菌治疗5‑FU致腹泻小鼠的实验分组和给药方案
[0130] 组别 数量 造模剂 造模剂量 受试物 给药体积 给药剂量 给药天数正常对照组 5 生理盐水 / 冻干保护剂 0.2 mL/只 / 5 d
模型对照组 5 5‑FU 350mg/kg 冻干保护剂 0.2 mL/只 / 5 d
洛哌丁胺组 5 5‑FU 350mg/kg 洛哌丁胺 10 mL/kg 20 mg/kg 9 d
Pacid‑1组 5 5‑FU 350mg/kg Pacid‑1 0.2 mL/只 1×109 CFU/只 5 d
Pacid‑2组 5 5‑FU 350mg/kg Pacid‑2 0.2 mL/只 1×109 CFU/只 5 d
模型对照组 5 5‑FU 350mg/kg 冻干保护剂 0.2 mL/只 / 5 d
洛哌丁胺组 5 5‑FU 350mg/kg 洛哌丁胺 10 mL/kg 20 mg/kg 9 d
Pacid‑1组 5 5‑FU 350mg/kg Pacid‑1 0.2 mL/只 1×109 CFU/只 5 d
Pacid‑2组 5 5‑FU 350mg/kg Pacid‑2 0.2 mL/只 1×109 CFU/只 5 d
[0131] 注：5‑FU:5‑氟尿嘧啶；CFU: colony forming unit 菌落形成单位；d: 天[0132] 腹泻观察与评分：将小鼠置于垫有洁净滤纸的小鼠笼内，每笼1只。粪便硬，正常便视为0分；轻度、轻微湿便或软便视为1分；中度，湿便、粪便不成形且肛周不洁视为2分；重度，稀便且严重肛周不洁视为3分。实验周期内，每天对小鼠粪便进行观察、评分。腹泻总分为每天腹泻评分的总和。
[0133] 试验结果：如图6所示，与模型对照组相比，Pacid‑1对5‑FU导致的腹泻具有明显改善作用（图6A），与模型对照组相比D8腹泻评分显著降低（P<0.01）（图6B），腹泻总分显著降低（P<0.01）（图6C），而Pacid‑2与模型对照组相比未见显著性差异。
[0134] 以上结果说明本发明的乳酸片球菌Pacid‑1能够显著改善化疗药物5‑FU导致的腹泻，其改善腹泻效果优于Pacid‑2。
[0135] 以上所述，仅为本发明的较佳具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员，在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。