对羟基苯乙酮在制备抑制弓形虫增殖的药物中的应用转让专利
申请号 : CN202311478603.8
文献号 : CN117323314B
文献日 : 2024-03-22
发明人 : 高菲菲 , 陈新田 , 谭治明 , 邹晶晶 , 吴旭阳 , 赵梓全 , 钟焯岚
申请人 : 广东医科大学附属医院
摘要 :
本发明提供了对羟基苯乙酮在制备抑制弓形虫增殖的药物中的应用，属于弓形虫防治技术领域。本发明发现0.1～1μg/mL的对羟基苯乙酮对弓形虫的增殖具有抑制作用，还能够抑制弓形虫入侵细胞，并能够有效减少弓形虫缓殖子的数量和大小，为防治弓形虫提供了新的技术思路。
权利要求 :
1.对羟基苯乙酮在制备抑制弓形虫增殖的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述对羟基苯乙酮在所述药物中的浓度为
0.1～1μg/mL。
说明书 :
对羟基苯乙酮在制备抑制弓形虫增殖的药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及弓形虫防治技术领域，尤其涉及对羟基苯乙酮在制备抑制弓形虫增殖的药物中的应用。
背景技术
[0002] 弓形虫是一种重要的人类和动物的病原体，也是弓形虫病的病原体，弓形虫病是一种潜在的严重疾病，尤其是在免疫功能低下或先天性感染的人类中。尤其是孕妇感染弓形虫，妊娠早期感染可导致胎儿流产、死产或者胎儿畸形；妊娠中期感染可导致胎儿死胎、胎儿早产或胎儿有严重的脑部、眼部疾病；妊娠晚期感染，胎儿发育可能看似正常，但出生后几个月或几年后可逐渐出现弓形虫感染的症状，如心脏畸形、小头畸形、智力低下等。
[0003] 临床治疗弓形虫感染多依赖化学药物，例如乙胺嘧啶和磺胺嘧啶。乙胺嘧啶和磺胺嘧啶的联合用药是目前临床上治疗弓形虫病的黄金标准，但该治疗方法往往伴随着严重的副作用，服用之后也有可能会对身体造成很多不适的反应，比如说有些患者在服药期间，往往会引起恶心或者呕吐，以及腹痛和腹泻等症状。并且治疗不彻底，存在易复发的缺陷，治疗的失败率很高。且耐受性不佳，耐药性增加，疗效有限，需要长期治疗。在这种情况下，寻找新的治疗靶点对于药物发现至关重要，筛选出安全有效的抗弓形虫药物更是目前亟需解决的问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供对羟基苯乙酮在制备抑制弓形虫增殖的药物中的应用。本发明发现0.1～1μg/mL的对羟基苯乙酮对弓形虫的增殖具有抑制作用，还能够抑制弓形虫入侵细胞，并能够有效减少弓形虫缓殖子的数量和大小，为防治弓形虫提供了新的技术思路。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了对羟基苯乙酮在制备抑制弓形虫增殖的药物中的应用。
[0007] 本发明还提供了一种抑制弓形虫增殖的药物，所述药物包括对羟基苯乙酮。
[0008] 优选的，所述对羟基苯乙酮在所述药物中的浓度为0.1～1μg/mL。
[0009] 本发明提供了对羟基苯乙酮在制备抑制弓形虫增殖的药物中的应用。本发明发现0.1～1μg/mL的对羟基苯乙酮对弓形虫的增殖具有抑制作用，能够通过抑制GSK3β磷酸化来激活β‑catenin，进而减弱HIF‑1α稳定性，诱导HIF‑1α蛋白降解，降低HIF‑1α蛋白表达水平，而抑制HIF‑1α表达水平，能够干扰弓形虫的入侵和胞内增殖，有效减少弓形虫缓殖子的数量和大小，为防治弓形虫提供了新的技术思路。
附图说明
[0010] 图1为对羟基苯乙酮的细胞安全性实验检测结果图。
[0011] 图2为对羟基苯乙酮对弓形虫TP3蛋白表达水平的影响结果图。
[0012] 图3为对羟基苯乙酮对弓形虫SAG1基因表达水平的影响结果图。
[0013] 图4为对羟基苯乙酮对弓形虫增殖的抑制作用实验结果图，其中，A为免疫荧光染色结果图，B为感染细胞百分率统计图，C为弓形虫增殖情况统计图。
[0014] 图5为对羟基苯乙酮对感染24h弓形虫的增殖抑制作用实验的FACS检测结果图。
[0015] 图6为对羟基苯乙酮对感染1h弓形虫的增殖抑制作用实验的FACS检测结果图。
[0016] 图7为对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖实验的p‑GSK3β，GSK3β，p‑β‑catenin，β‑catenin，HIF‑1α，VEGF，IL‑33蛋白表达水平检测结果图。
[0017] 图8为对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖实验的HIF‑1α，VEGF，IL‑33基因表达水平检测结果图。
[0018] 图9为在蛋白酶抑制剂MG‑132干预下，对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖实验的p‑GSK3β，GSK3β，p‑β‑catenin，β‑catenin，HIF‑1α，VEGF，IL‑33蛋白表达水平检测结果图。
[0019] 图10为在蛋白酶抑制剂MG‑132干预下，对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖实验结果图，其中，A为免疫荧光染色结果图，B为弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。
[0020] 图11为HIF‑1α基因沉默情况下，对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖实验结果图，其中，A为免疫荧光染色结果图，B为弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。
[0021] 图12为在GSK3β抑制剂SB216763干预下，对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖实验结果图，其中，A为免疫荧光染色结果图，B为感染细胞百分率，C为弓形虫增殖情况。
[0022] 图13为在GSK3β抑制剂SB216763干预下，对羟基苯乙酮抑制弓形虫入侵实验结果图，其中，A为免疫荧光染色结果图，B为速殖子入侵率。
[0023] 图14为对羟基苯乙酮抑制小鼠体内弓形虫感染与增殖实验结果图，其中，A为缓殖子数量统计图，B图为缓殖子粒径大小统计图。
具体实施方式
[0024] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0025] 本发明中可能用到的材料和试剂如下：
[0026] 1)人视网膜色素上皮细胞ARPE‑19购于ATCC。
[0027] 2)DMEM/F12培养基(DMEM/F‑12(1:1)basic(1:1))购自美国Gibco,货号为C11330500BT。
[0028] 3)1×磷酸盐缓冲液(1XPBS缓冲液)购自中国Solarbio公司，货号为P1020。
[0029] 4)澳洲胎牛血清(Fetal Bovine serum)购自美国Gibco公司，货号为10099‑141。
[0030] 5)胰酶细胞消化液(含EDTA，0.25％：0.02％)购自凯基生物，货号为VC2005。
[0031] 6)非放射性细胞毒性检测试剂盒(CytoTox 96Non‑Radioactive Cytotoxicity Assay kit)购自美国Promega公司，货号为G1782。
[0032] 7)BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)购自中国康润公司，货号为E162‑01。
[0033] 8)抗TP3抗体(Anti‑Toxoplasma gondii Antibody(TP3):SC‑52255)、抗α‑Tubulin抗体(anti‑alpha Tubulin Antibody(B‑7):SC‑5286)、抗VEGF抗体(Anti‑VEGF Antibody(C‑1):SC‑7269)购自美国Santa Cruz公司；
[0034] 抗p‑GSK‑3β抗体(Anti‑Phospho‑GSK‑3β(Ser9)(D85E12) Rabbit mAb#5558)、抗GSK‑3β抗体(Anti‑GSK‑3β(D5C5Z) Rabbit mAb#12456)、抗p‑β‑catenin抗体(Anti‑Phospho‑β‑catenin(Ser552)Antibody#9566)、抗β‑catenin抗体(Anti‑β‑catenin(D10A8) Rabbit mAb#8480)、抗HIF‑1α抗体(Anti‑HIF‑1α(D1S7W) Rabbit mAb#
36169)均购自美国CST公司；
36169)均购自美国CST公司；
[0035] 抗IL‑33抗体(Anti‑IL‑33antibody[EPR17831](ab187060))购自英国abcam公司。
[0036] 9)对羟基苯乙酮(4’‑Hydroxyacetophenone,4‑HAP)购自于中国Solarbio公司，货号为SH9210。
[0037] 实施例1
[0038] 本实施例提供了对羟基苯乙酮对弓形虫增殖的抑制作用，具体研究过程如下：
[0039] 1、对羟基苯乙酮的细胞安全性实验
[0040] 将ARPE‑19细胞按照0.5×104个/mL的密度接种于在96孔板中，置于37℃、5％CO2条件下培养。24h后待细胞长到80％，用相同体积、不同浓度的4‑HAP(对羟基苯乙酮)(0、0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、
2000μg/mL)处理细胞，每个样品准备三个副孔。处理24h后，每孔加入20μL MTS溶液，37℃、
5％CO2条件下避光孵育1h，于490nm波长处测定吸光度，并计算平均值。
2000μg/mL)处理细胞，每个样品准备三个副孔。处理24h后，每孔加入20μL MTS溶液，37℃、
5％CO2条件下避光孵育1h，于490nm波长处测定吸光度，并计算平均值。
[0041] 检测结果如图1所示，可以看出，4‑HAP的IC50大约为550μg/mL，选取0.1～1μg/ml区间，对羟基苯乙酮在对宿主细胞本身没有影响的情况下，观察是否会影响弓形虫的增殖情况。
[0042] 2、对羟基苯乙酮对弓形虫TP3蛋白表达水平的影响实验
[0043] 将ARPE‑19细胞按照0.8×106个/mL的密度接种于60mm培养皿中，置于37℃、5％CO2条件下培养。24h后待细胞长到80％，分别用不同浓度4‑HAP(0、0.1、1、10μg/mL)预处理6
ARPE‑19细胞4h。预处理结束后，用接种细胞数量5倍数目(MOI，4×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞24h。
ARPE‑19细胞4h。预处理结束后，用接种细胞数量5倍数目(MOI，4×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞24h。
[0044] 同时设置不接种弓形虫，不进行预处理的空白对照组；不接种弓形虫，使用浓度为10μg/mL4‑HAP预处理细胞的对照组。
[0045] 提取各组蛋白，利用westernblotting法检测弓形虫表面蛋白TP3表达水平，α‑tubulin用作内参。检测结果如图2所示，MOI对应的数字为弓形虫接种的倍数，4‑HAP对应的数字为4‑HAP的浓度。可以看出，4‑HAP预处理之后，TP3的表达水平明显减弱，且随着4‑HAP浓度增加，TP3的表达水平递减，表明4‑HAP对弓形虫的增殖具有抑制作用。
[0046] 3、对羟基苯乙酮对弓形虫SAG1基因表达水平的影响实验
[0047] 将ARPE‑19细胞按照0.8×106个/mL的密度接种于60mm培养皿中置于37℃、5％CO2条件下培养。24h后待细胞长到80％，用不同浓度4‑HAP(0、0.1、1、10μg/mL)预处理ARPE‑196
细胞4h。将接种细胞数量5倍数目(MOI，4×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞24h。
细胞4h。将接种细胞数量5倍数目(MOI，4×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞24h。
[0048] 同时设置不接种弓形虫，不进行预处理的空白对照组；不接种弓形虫，但使用浓度为10μg/mL 4‑HAP预处理细胞的对照组。
[0049] 利用Trizol reagent提取mRNA，ReverTraAce RT kit合成cNDA后，利用RT‑PCR法检测弓形虫表面蛋白SAG1基因表达水平，GAPDH用作内参。检测结果如图3所示，MOI对应的数字为弓形虫接种的倍数，4‑HAP对应的数字为4‑HAP的浓度。可以看出，4‑HAP预处理之后，SAG1的表达水平明显减弱，且随着4‑HAP浓度增加，SAG1基因表达水平递减，表明4‑HAP对弓形虫的增殖具有抑制作用。
[0050] 4、对羟基苯乙酮对弓形虫增殖的抑制作用实验(免疫荧光染色法)
[0051] 设置实验组1(0.1μg/mL 4‑HAP)、实验组2(1.0μg/mL 4‑HAP)、阳性对照组、空白组。其中实验组分别为0.1μg/mL4‑HAP预处理组和1.0μg/mL4‑HAP预处理组；阳性对照组为乙胺嘧啶(Pyrimethamine)预处理组；空白组(MOI5)加入相同体积的DMEM/F12培养基。
[0052] 将ARPE‑19细胞按照0.5×104个/mL的密度接种在铺有细胞爬片的12孔板中，置于37℃、5％CO2条件下培养。24h后待细胞长到80％，分别用0.1μg/mL 4‑HAP、1μg/mL 4‑HAP、
5
10μg/mLPyrimethamine预处理ARPE‑19细胞4h。将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.5×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。感染2h(使弓形虫入侵)后，用PBS将未入侵的游离速殖子洗干净，换新鲜DMEM/F12培养基继续培养22h(使弓形虫增殖)。之后用4％多聚甲醛固定，含0.3％Triton X‑100的PBST洗三次，5min/次。
5
10μg/mLPyrimethamine预处理ARPE‑19细胞4h。将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.5×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。感染2h(使弓形虫入侵)后，用PBS将未入侵的游离速殖子洗干净，换新鲜DMEM/F12培养基继续培养22h(使弓形虫增殖)。之后用4％多聚甲醛固定，含0.3％Triton X‑100的PBST洗三次，5min/次。
[0053] 用抗α‑Tubulin抗体(anti‑alpha Tubulin Antibody(B‑7):SC‑5286)按1：250稀释，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用PBST清洗三次，5min/次。按1：500稀释二抗(goat anti‑mouse IgG，Alexa FluorTM 568，A11031)，室温孵育2h。PBST洗三次，10min/次。染色封片后，于免疫荧光显微镜下观察拍照；使用DAPI对细胞核进行染色封片后，于免疫荧光显微镜下观察并拍照，软件合成merged图。同时计数每100个细胞中的弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。
[0054] 检测结果如图4所示，其中，A为免疫荧光染色结果图，B为感染细胞百分率统计图，C为弓形虫增殖情况统计图。可以看出，MOI5组，40％以上的速殖子会在24h分裂3次，20％速殖子分裂4次产生16个速殖子，0.1μg/mL4‑HAP表现出较弱的弓形虫抑制作用，只有5％虫子会分裂4次在一个囊泡内产生16个速殖子。但是1μg/mL 4‑HAP处理组同10μg/mL Pyrimethamine结果相似，只有20％的虫子会分裂3次，40％分裂1次，甚至20％以上的根本不分裂。说明4‑HAP与已用于临床的抗弓形虫药物乙胺嘧啶作用相当，可明显抑制弓形虫增殖情况。
[0055] 5、对羟基苯乙酮对弓形虫增殖的抑制作用实验(FACS法)
[0056] 设置对照组、实验组、阳性对照组、空白组。其中对照组为CTL，加入相同体积的DMEM/F12培养基，但不感染弓形虫；实验组分别为0.1μg/mL4‑HAP预处理组和1μg/mL 4‑HAP预处理组；阳性对照组为10μg/mL Pyrimethamine预处理组；空白组为MOI5，加入相同体积的DMEM/F12培养基，但感染弓形虫。具体过程如下：
[0057] 将ARPE‑19细胞按照0.5×104个/mL的密度接种在12孔板中，置于37℃、5％CO2条件下培养。24h后待细胞长到80％，分别用0.1μg/mL4‑HAP、1μg/mL4‑HAP、10μg/mL 5
Pyrimethamine预处理ARPE‑19细胞4h。将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.5×10 个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。待感染1h后，取出部分样本，添加0.25％胰蛋白酶‑EDTA消化细胞3min，用DMEM/F12培养基终止消化，1000rpm离心3min收集细胞沉淀，再用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)洗涤细胞两次，通过FACScan(BD Bio‑science)分析数据，记录中位荧光强度值(MFI)。
Pyrimethamine预处理ARPE‑19细胞4h。将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.5×10 个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。待感染1h后，取出部分样本，添加0.25％胰蛋白酶‑EDTA消化细胞3min，用DMEM/F12培养基终止消化，1000rpm离心3min收集细胞沉淀，再用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)洗涤细胞两次，通过FACScan(BD Bio‑science)分析数据，记录中位荧光强度值(MFI)。
[0058] 待感染2h后，用PBS将未感染的游离速殖子洗干净，换新鲜DMEM/F12培养基继续培养22h(使弓形虫增殖)。添加0.25％胰蛋白酶‑EDTA消化细胞3min，用DMEM/F12培养基终止消化，1000rpm离心3min收集细胞沉淀，再用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)洗涤细胞两次，通过FACScan(BD Bio‑science)分析数据，记录中位荧光强度值(MFI)。
[0059] 检测结果如图5和图6所示，图5为弓形虫感染24h时的检测结果，可以看出，MOI5组在没有药物预处理的情况下，感染24h可以检测GFP高于65％的中位荧光强度(MFI)，但是在0.1μg/mL 4‑HAP、1μg/mL 4‑HAP、10μg/mL Pyrimethamine预处理组，GFP的MFI分别降低至
36.6％、17.1％、14％；图6为弓形虫感染1h时的检测结果，可以看出，MOI5组可以检测到
17.9％的MFI，在Sulfadiazine、4‑HAP预处理组，GFP的MFI分别降低至15.8％、14.7％，说明
4‑HAP确实可以抑制弓形虫增殖与感染情况，且与已用于临床的抗弓形虫药物乙胺嘧啶作用相当。
36.6％、17.1％、14％；图6为弓形虫感染1h时的检测结果，可以看出，MOI5组可以检测到
17.9％的MFI，在Sulfadiazine、4‑HAP预处理组，GFP的MFI分别降低至15.8％、14.7％，说明
4‑HAP确实可以抑制弓形虫增殖与感染情况，且与已用于临床的抗弓形虫药物乙胺嘧啶作用相当。
[0060] 6、对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖分子机制实验(Westernblotting法)
[0061] 将ARPE‑19细胞按照0.8×106个/mL的密度接种至60mm培养皿中置于37℃、5％CO2条件下培养。24h后待细胞长到80％，分别用不同浓度4‑HAP(0、0.1、0.5、1μg/mL)处理ARPE‑19细胞24h。提取蛋白，利用westernblotting法检测p‑GSK3β，GSK3β，p‑β‑catenin，β‑catenin，HIF‑1α，VEGF，IL‑33蛋白表达水平；α‑Tubulin用作内参。
[0062] 检测结果如图7所示，可以看出，随着4‑HAP浓度递增，GSK3β磷酸化水平逐渐减弱，说明GSK3β被激活，其下游的β‑catenin磷酸化水平逐渐增加，导致β‑catenin蛋白量减少，进而导致HIF‑1α蛋白表达减少其报告基因VEGF，IL‑33蛋白表达水平均减弱。说明4‑HAP本身会通过抑制GSK3β磷酸化来激活β‑catenin，进而减弱HIF‑1α稳定性。
[0063] 7、对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖分子机制实验(RT‑PCR法)
[0064] 将ARPE‑19细胞按照0.8×106个/mL的密度接种至60mm培养皿中置于37℃、5％CO2条件下培养。24h后待细胞长到80％，分别用不同浓度4‑HAP(0、0.1、0.5、1μg/mL)处理ARPE‑19细胞24h。利用Trizol提取mRNA，合成cNDA后，利用RT‑PCR法检测HIF‑1α，VEGF，IL‑33基因表达水平，GAPDH用作内参。
[0065] 检测结果如图8所示，随着4‑HAP浓度递增，HIF‑1α表达水平不变，但其下游VEGF，IL‑33基因转录水平明显减弱，结合实验6的结果，这表明4‑HAP降低HIF‑1α蛋白表达水平，不是通过基因转录，而是诱导蛋白降解。
[0066] 8、对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖分子机制实验(Westernblotting法)
[0067] 设置实验组和对照组。
[0068] 实验组：将ARPE‑19细胞按照0.8×106个/mL的密度接种至60mm培养皿中置于37℃、5％CO2条件下培养。24h后待细胞长到80％，用5μM蛋白酶抑制剂MG‑132预处理细胞4h后，分别设置以下小组：CTL：DMEM/F12培养基，不感染弓形虫；M5：DMEM/F12培养基，感染弓6 6
形虫(4.0×10 个/mL)；0.1：0.1μg/mL 4‑HAP处理，感染弓形虫(4.0×10个/mL)；1：1μg/
6
mL4‑HAP处理，感染弓形虫(4.0×10 个/mL)。提取蛋白，利用westernblotting法检测p‑GSK3β，GSK3β，p‑β‑catenin，β‑catenin，HIF‑1α，VEGF，IL‑33蛋白表达水平；α‑Tubulin用作内参。
形虫(4.0×10 个/mL)；0.1：0.1μg/mL 4‑HAP处理，感染弓形虫(4.0×10个/mL)；1：1μg/
6
mL4‑HAP处理，感染弓形虫(4.0×10 个/mL)。提取蛋白，利用westernblotting法检测p‑GSK3β，GSK3β，p‑β‑catenin，β‑catenin，HIF‑1α，VEGF，IL‑33蛋白表达水平；α‑Tubulin用作内参。
[0069] 对照组：除不采用MG‑132预处理细胞外，其他操作与实验组相同。
[0070] 检测结果如图9所示，可以看出，与弓形虫作用恰好相反，4‑HAP通过抑制GSK3β磷酸化来激活β‑catenin，进而减弱HIF‑1α稳定性。用蛋白酶抑制剂MG‑132处理，对GSK3β、β‑catenin没有影响，但会抑制HIF‑1α降解，增加其下游的VEGF，IL‑33蛋白表达水平。暗示对羟基苯乙酮可能是通过抑制HIF‑1α来抑制弓形虫感染与增殖效率。
[0071] 9、对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖分子机制实验(免疫荧光染色法)
[0072] 设置实验组和对照组。
[0073] 实验组(MG‑132)：将ARPE‑19细胞按照0.5×104个/mL的密度接种在铺有细胞爬片的12孔板中，置于37℃、5％CO2条件下培养。24h后待细胞长到80％，先用5μM MG‑132预处理细胞4h，再分别用DMEM/F12培养基(MOI5组)、0.1μg/mL4‑HAP、1μg/mL 4‑HAP处理细胞4h。将5
2.5×10个/mL的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。待入侵2h后，用PBS将未入侵的游离速殖子洗干净，换新鲜DMEM/F12培养基继续培养22h。之后用4％多聚甲醛固定，含0.3％Triton X‑
100的PBST洗三次，5min/次。鬼笔环肽1:250稀释，避光室温孵育30min。使用DAPI对细胞核进行染色封片后，免疫荧光显微镜下观察拍照，并计数每100个细胞中的弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。
2.5×10个/mL的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。待入侵2h后，用PBS将未入侵的游离速殖子洗干净，换新鲜DMEM/F12培养基继续培养22h。之后用4％多聚甲醛固定，含0.3％Triton X‑
100的PBST洗三次，5min/次。鬼笔环肽1:250稀释，避光室温孵育30min。使用DAPI对细胞核进行染色封片后，免疫荧光显微镜下观察拍照，并计数每100个细胞中的弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。
[0074] 对照组(CTL)：除不采用MG‑132预处理细胞外，其他操作与实验组相同。
[0075] 检测结果如图10所示，A为免疫荧光染色结果图，B为弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。可以看出，MOI5组，一半以上的速殖子会在24h分裂3次在一个囊泡内产生8个速殖子，甚至有一些会分裂4次产生16个速殖子。但低浓度4‑HAP处理组(0.1μg/mL)40％分裂两次产生4个速殖子，50％只分裂一次；高浓度4‑HAP处理组(1μg/mL)80％只分裂一次，甚至有些不分裂。然而，蛋白酶抑制剂预处理组，即使1μg/mL4‑HAP处理过的细胞，都有30％弓形虫能够在24h分裂3次，说明抑制HIF‑1α蛋白降解可逆转4‑HAP对弓形虫增殖的抑制作用。表明4‑HAP通过抑制HIF‑1α稳定性干扰弓形虫胞内增殖情况。
[0076] 10、对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖分子机制实验(基因沉默后免疫荧光染色法)
[0077] 将ARPE‑19细胞按照0.4×104个/mL的密度接种在铺有细胞爬片的12孔板中，置于37℃、5％CO2条件下培养，24h后待细胞长到70％开始转染。准备A、B、C、D四个1.5mL EP管，A管加入450μL Medium+27μL RNAiMAX Reagent；B管加入150
μL Medium+1.5μL siCTL(30pmol)；C管加入150μL Medium+1.5
μL siHIF‑1α‑1(30pmol)；D管加入150μL Medium+1.5μL siHIF‑1α‑2
(30pmol)。按照AB、AC、AD，分别两管各150μL按1:1混合均匀，室温孵育5min。将混匀物加入
5
到上述细胞孔板中，37℃孵育24h。之后将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.0×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。待入侵2h后，用PBS将未入侵的游离速殖子洗干净，换新鲜DMEM/F12培养基继续培养22h。之后用4％多聚甲醛固定，含0.3％TritonX‑100的PBST洗三次，
5min/次。鬼笔环肽1:250稀释，避光室温孵育30min。染色封片后，免疫荧光显微镜下观察拍照，并计数每100个细胞中的弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。
μL Medium+1.5μL siCTL(30pmol)；C管加入150μL Medium+1.5
μL siHIF‑1α‑1(30pmol)；D管加入150μL Medium+1.5μL siHIF‑1α‑2
(30pmol)。按照AB、AC、AD，分别两管各150μL按1:1混合均匀，室温孵育5min。将混匀物加入
5
到上述细胞孔板中，37℃孵育24h。之后将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.0×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。待入侵2h后，用PBS将未入侵的游离速殖子洗干净，换新鲜DMEM/F12培养基继续培养22h。之后用4％多聚甲醛固定，含0.3％TritonX‑100的PBST洗三次，
5min/次。鬼笔环肽1:250稀释，避光室温孵育30min。染色封片后，免疫荧光显微镜下观察拍照，并计数每100个细胞中的弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。
[0078] 检测结果如图11所示，A为免疫荧光染色结果图，B为弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。可以看出，MOI5组40％以上的速殖子会在24h分裂3次在一个囊泡内产生8个速殖子，甚至有5％左右虫子会分裂4次产生16个速殖子。但由siRNA转染，基因沉默HIF‑1α后，只有不到20％的速殖子可分裂3次，30％左右的速殖子只分裂两次，停留在一个囊泡4个速殖子。说明抑制HIF‑1α会干扰弓形虫的胞内增殖情况。
[0079] 11、对羟基苯乙酮抑制弓形虫感染与增殖分子机制实验(免疫荧光染色法)
[0080] 设置实验组和对照组。
[0081] 实验组(SB216763)：将ARPE‑19细胞按照0.5×104个/mL的密度接种在铺有细胞爬片的12孔板中，置于37℃、5％CO2条件下培养，24h后待细胞长到80％，用10μM GSK3β抑制剂5
SB216763预处理ARPE‑19细胞4h后。将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.5×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。待入侵2h后，用PBS将未入侵的游离速殖子洗干净，换新鲜DMEM/F12培养基继续培养22h。之后用4％多聚甲醛固定，含0.3％Triton X‑100的PBST洗三次，5min/次。抗α‑Tubulin抗体按1：250稀释，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用PBST清洗三次，5min/次。按1：500稀释二抗(goat anti‑mouse IgG,AlexaFluorTM 488，A11029)，室温孵育2h。
PBST洗三次，10min/次。染色封片后，共聚焦显微镜下观察拍照，并计数每100个细胞中的弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。
SB216763预处理ARPE‑19细胞4h后。将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.5×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。待入侵2h后，用PBS将未入侵的游离速殖子洗干净，换新鲜DMEM/F12培养基继续培养22h。之后用4％多聚甲醛固定，含0.3％Triton X‑100的PBST洗三次，5min/次。抗α‑Tubulin抗体按1：250稀释，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用PBST清洗三次，5min/次。按1：500稀释二抗(goat anti‑mouse IgG,AlexaFluorTM 488，A11029)，室温孵育2h。
PBST洗三次，10min/次。染色封片后，共聚焦显微镜下观察拍照，并计数每100个细胞中的弓形虫感染率及弓形虫增殖情况。
[0082] 对照组(MOI5)：除不采用GSK3β抑制剂SB216763预处理细胞外，其他操作与实验组相同。
[0083] 检测结果如图12所示，A为免疫荧光染色结果图，B为感染细胞百分率，C为弓形虫增殖情况。可以看出，MOI5组，40％的速殖子在24h分裂3次，可在一个囊泡内产生8个速殖子，20％虫子会分裂4次产生16个速殖子。而GSK3β抑制剂SB216763预处理组，弓形虫增殖表现出明显的改善情况：40％速殖子可分裂4次产生16个速殖子，甚至10％虫子可分裂5次，在一个囊泡内产生32个速殖子。说明抑制GSK3β有利于弓形虫在胞内增殖。进一步表明4‑HAP确实通过促进GSK3β活性(磷酸化被抑制)进而干扰HIF‑1α稳定性来抑制弓形虫增殖情况。
[0084] 12、对羟基苯乙酮抑制弓形虫入侵分子机制实验(免疫荧光染色法)
[0085] 设置实验组和对照组。
[0086] 实验组(SB216763)：将ARPE‑19细胞按照0.5×104个/mL的密度接种在铺有细胞爬片的12孔板中，置于37℃、5％CO2条件下培养，24h后待细胞长到80％，用10μM GSK3β抑制剂5
SB216763预处理ARPE‑19细胞4h后。将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.5×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。在37℃、5％CO2条件下入侵一个小时后，去掉上清，并用PBS洗涤3次，将尚未入侵的弓形虫清洗干净，每孔加入1mL的4％多聚甲醛(无需透化作用的多聚甲醛)室温固定1h。之后用PBS在摇床上低速清洗3次，5min/次。清洗结束后，每孔加入1mL用PBS配置的3％BSA免疫荧光封闭液，室温封闭1h。抗TP3抗体(Anti‑Toxoplasma gondii Antibody(TP3):SC‑52255)按1：250用3％BSA稀释后，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用PBS清洗三次，5min/次。100％无水乙醇室温孵育1h后，每孔加入1mL用含0.3％Triton X‑100的PBST配置的3％BSA清洗三次，10min/次。用PBST配置的3％BSA按1：500稀释二抗(goat anti‑mouse IgG，Alexa FluorTM 568，A11031)，室温孵育2h。含0.3％TritonX‑100的PBST洗三次，
10min/次。染色封片后，免疫荧光显微镜下观察拍照，未入侵成功的弓形虫速殖子将被染成红色，与GFP‑RH本身自带的绿色荧光组合为黄色。而入侵成功的弓形虫则不能被染色，只显示绿色荧光。入侵数与所有速殖子数目的比值即为速殖子的入侵率。
SB216763预处理ARPE‑19细胞4h后。将接种细胞数量5倍数目(MOI5，2.5×10个/mL)的弓形虫GFP‑RH株感染细胞。在37℃、5％CO2条件下入侵一个小时后，去掉上清，并用PBS洗涤3次，将尚未入侵的弓形虫清洗干净，每孔加入1mL的4％多聚甲醛(无需透化作用的多聚甲醛)室温固定1h。之后用PBS在摇床上低速清洗3次，5min/次。清洗结束后，每孔加入1mL用PBS配置的3％BSA免疫荧光封闭液，室温封闭1h。抗TP3抗体(Anti‑Toxoplasma gondii Antibody(TP3):SC‑52255)按1：250用3％BSA稀释后，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用PBS清洗三次，5min/次。100％无水乙醇室温孵育1h后，每孔加入1mL用含0.3％Triton X‑100的PBST配置的3％BSA清洗三次，10min/次。用PBST配置的3％BSA按1：500稀释二抗(goat anti‑mouse IgG，Alexa FluorTM 568，A11031)，室温孵育2h。含0.3％TritonX‑100的PBST洗三次，
10min/次。染色封片后，免疫荧光显微镜下观察拍照，未入侵成功的弓形虫速殖子将被染成红色，与GFP‑RH本身自带的绿色荧光组合为黄色。而入侵成功的弓形虫则不能被染色，只显示绿色荧光。入侵数与所有速殖子数目的比值即为速殖子的入侵率。
[0087] 对照组(MOI5)：除不采用GSK3β抑制剂SB216763预处理细胞外，其他操作与实验组相同。
[0088] 检测结果如图13所示，A为免疫荧光染色结果图，B为速殖子入侵率。可以看出，MOI5组，61％弓形虫入侵至细胞胞浆内，而抑制GSK3β活性后，入侵率高达68％。说明抑制GSK3β有利于弓形虫入侵宿主细胞。进一步表明4‑HAP确实通过促进GSK3β活性(磷酸化被抑制)进而干扰HIF‑1α稳定性来抑制弓形虫入侵情况。
[0089] 13、对羟基苯乙酮抑制小鼠体内弓形虫感染与增殖实验
[0090] 选取6只相近重量，相同周龄(7周)，相同性别(雄性)的C57BL/c鼠，随机均分为两组，对照组(CTL)和实验组(4‑HAP)。通过对每只鼠灌胃80个ME‑49弓形虫缓殖子来模仿人感染弓形虫的路径。一周之后，给实验组小鼠以1mg/kg的量通过腹腔注射方式，每天一次给药4‑HAP，连续给药一周。而对照组小鼠则以同样方式在同样时间给予等量体积的PBS缓冲液。
试验结束后，以颈椎脱臼的方式将小鼠处死，收取脑部组织。将1/4脑部组织研磨在300μLPBS缓冲液中。取10μL在显微镜下观察ME‑49缓殖子状态并计数。比较对照组与实验组两组之间的差异。
试验结束后，以颈椎脱臼的方式将小鼠处死，收取脑部组织。将1/4脑部组织研磨在300μLPBS缓冲液中。取10μL在显微镜下观察ME‑49缓殖子状态并计数。比较对照组与实验组两组之间的差异。
[0091] 检测结果如图14所示，A为缓殖子数量统计图，B图为缓殖子粒径大小统计图。可以看出，连续给药一周4‑HAP组的实验组小鼠，缓殖子的数量、大小均明显小于对照组。明确了对羟基苯乙酮确实可以抑制弓形虫的增殖情况。
[0092] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。