本发明公开了一种海湾扇贝积累类胡萝卜素相关分子标记及其应用，属于分子育种技术领域。海湾扇贝积累类胡萝卜素相关的SNP分子标记，包括分子标记SNP1、或分子标记SNP2、或分子标记SNP3，或分子标记SNP4；还提供了海湾扇贝类胡萝卜素积累相关的SNP分子标记的引物组合SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。本发明能够快速、简便、批量化的在苗种期和亲本期鉴定和筛选纯合的积累类胡萝卜素的海湾扇贝，可有效减少扇贝的养殖成本，提高了养殖和育种效率，具有广阔的市场应用前景。
1.海湾扇贝积累类胡萝卜素相关分子标记，其特征在于，该分子标记如SEQ ID NO.1所示，其第172位为SNP3位点，该位置碱基为C或A。
2.海湾扇贝积累类胡萝卜素相关分子标记组合，其特征在于，该分子标记组合包括：如SEQ ID NO.1所示，其第172位为SNP3位点，该位置碱基为C或A；如SEQ ID NO.1所示，其第26位为SNP1位点，该位置碱基为T或G；如SEQ ID NO.1所示，其第27位为SNP2位点，该位置碱基为G或T；如SEQ ID NO.2所示，其第45位为SNP4位点，该位置碱基为T或C。
3.权利要求1所述的海湾扇贝积累类胡萝卜素相关分子标记在富含类胡萝卜素海湾扇贝选育中的应用。
4.权利要求2所述的海湾扇贝积累类胡萝卜素相关分子标记组合在富含类胡萝卜素海湾扇贝选育中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述SNP1位点，当个体基因型为GG型时，所述个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝，当个体基因型为TT型时，所述个体为普通的海湾扇贝；
所述SNP2位点，当个体基因型为TT型时，所述个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝，当个体基因型为GG型时，所述个体为普通的海湾扇贝；
所述SNP3位点，当个体基因型为AA型时，所述个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝，当个体基因型为CC型时，所述个体为普通的海湾扇贝；
所述SNP4位点，当个体基因型为CC型时，所述个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝，当个体基因型为TT型时，所述个体为普通的海湾扇贝。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，用于检测SNP1、SNP2、SNP3和SNP4的两对引物，具体的引物序列为：用于检测SNP1、SNP2和SNP3的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
用于检测SNP4的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。
7.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述应用具体为在富含类胡萝卜素海湾扇贝苗种鉴定和筛选、以及亲本选择中的应用。
8.一种基于分子标记筛选富集类胡萝卜素海湾扇贝的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）对待检测海湾扇贝进行取样；
（2）提取样品DNA作为模板，并使用SEQ ID NO.3 4和5 6所示的核苷酸序列作为引物，~ ~分别进行PCR扩增，获取PCR扩增产物；对PCR扩增产物进行测序，确定每个个体中4个SNP位点的基因型；
（3）当基因分型结果表现为含有SNP3位点样本基因型为AA型时；或SNP1位点样本基因型为GG型时、和当含有SNP2位点样本基因型为TT型时、和当含有SNP3位点样本基因型为AA型时、和当含有SNP4位点样本基因型为CC时，该个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝个体；
所述SNP1位点位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第26位，该处的碱基为T或G；
所述SNP2位点位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第27位，该处的碱基为G或T；
所述SNP3位点位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第172位，该处的碱基为C或A；
所述SNP4位点位于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第45位，该处的碱基为T或C。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，采取不同时期选择不同的取样策略，在小规格苗种期，在待测群体中随机选择50 100只扇贝进行全组织取样，主要用于~该群体苗种的鉴定；在大规格苗种期，取3 5根鳃丝进行无损取样，用于苗种的定向选育；在~成贝期，同样取鳃丝进行无损取样，用于亲本的选择。
海湾扇贝积累类胡萝卜素相关分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于海洋生物分子遗传育种领域，具体涉及一种与海湾扇贝积累类胡萝卜素相关的分子标记及其应用。
背景技术
[0002] 类胡萝卜素是一类具有生物活性的天然脂溶性色素，广泛存在于动植物以及微生物中，是人体维生素A原的主要来源，还具有抗氧化等功能，对人类具有多种健康益处。但人类无法自身合成类胡萝卜素，需要从食物中摄取。水产动物(如鱼、虾、贝和蟹)，能够积累陆生生物不具备的类胡萝卜素种类(如虾青素、扇贝醇酮等)，并且其类胡萝卜素含量和着色与品质和风味密切相关，是评价三文鱼等动物营养品质的重要指标。因此培育富含类胡萝卜素的高品质水产动物具有显著的经济价值和社会效益，已成为水产育种工作的重要方向。
[0003] 海湾扇贝(Argopecten irradians)是我国重要的养殖经济贝类。在海湾扇贝养殖群体中，有少量个体的闭壳肌因富集类胡萝卜素为橙色，而不是普通的白色。已有的研究发现，海湾扇贝闭壳肌富集类胡萝卜素这一性状是可遗传的，因此可通过遗传育种选育高品质的富含类胡萝卜素的海湾扇贝良种。开发该性状的分子标记，可为富含类胡萝卜素海湾扇贝选育提供有效的遗传筛选工具。另外，类胡萝卜素着色性状在收获期容易观察，而在苗种期，由于其闭壳肌所富集的类胡萝卜素较少，难以通过观察和含量检测进行分辨。因此，开发海湾扇贝富集类胡萝卜素相关分子标记，可以方便、快捷地鉴定富含类胡萝卜素积累海湾扇贝苗种，促进其大规模养殖推广，推动海湾扇贝养殖业提质增效。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种与海湾扇贝类胡萝卜素积累相关的SNP分子标记及其应用，以弥补现有技术的不足。
[0005] 为达到上述技术目的，本发明采取的具体技术方案如下：
[0006] 海湾扇贝积累类胡萝卜素相关的SNP分子标记，包括分子标记SNP1、或分子标记SNP2、或分子标记SNP3，或分子标记SNP4。
[0007] 所述分子标记SNP1位于海湾扇贝Chr03染色体第34979279位碱基，命名为Arg03g34979279：所述分子标记SNP1位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第26位，该处的碱基为T或G；
[0008] 所述分子标记SNP2位于海湾扇贝Chr03染色体第34979280位碱基，命名为Arg03g34979280：所述分子标记SNP2位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第27位，该处的碱基为G或T；
[0009] 所述分子标记SNP3位于海湾扇贝Chr03染色体第34979425位碱基，命名为Arg03g34979425：所述分子标记SNP3位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第172位，该处的碱基为C或A；
[0010] 所述分子标记SNP4位于海湾扇贝Chr03染色体第35046482位碱基，命名为Arg03g35046482：所述分子标记SNP4位于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第45位，该处的碱基为T或C。
[0011] 所述SNP1分子标记中，当个体基因型为GG型时，所述个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝，当个体基因型为TT型时，所述个体为普通的海湾扇贝；
[0012] 所述SNP2分子标记中，当个体基因型为TT型时，所述个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝，当个体基因型为GG型时，所述个体为普通的海湾扇贝；
[0013] 所述SNP3分子标记中，当个体基因型为AA型时，所述个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝，当个体基因型为CC型时，所述个体为普通的海湾扇贝；
[0014] 所述SNP4分子标记中，当个体基因型为CC型时，所述个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝，当个体基因型为TT型时，所述个体为普通的海湾扇贝。
[0015] 一种用于扩增海湾扇贝积累类胡萝卜素相关的分子标记的引物组合，包括用于扩增SNP1、SNP2、SNP3和SNP4的两对引物，具体的引物序列为：
[0016] 用于检测SNP1、SNP2和SNP3的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
[0017] 用于检测SNP4的引物对，上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。
[0018] 所述海湾扇贝积累类胡萝卜素相关的SNP分子标记或分子标记组合或所述的引物组合在富含类胡萝卜素海湾扇贝选育中的应用。
[0019] 具体地，所述海湾扇贝积累类胡萝卜素相关的SNP分子标记或分子标记组合或所述的引物组合在富含类胡萝卜素海湾扇贝苗种鉴定和筛选、以及亲本选择中的应用。
[0020] 基于所述SNP分子标记筛选富集类胡萝卜素海湾扇贝的方法：
[0021] (1)对待检测海湾扇贝进行取样，不同时期选择不同的取样策略，在小规格苗种期(壳高约0.5cm规格)，在待测群体中随机选择50～100只扇贝进行全组织取样，主要用于该群体苗种的鉴定；在大规格苗种期(壳高3～5cm规格)，取3～5根鳃丝进行无损取样，用于苗种的定向选育；在成贝期，同样取鳃丝进行无损取样，用于亲本的选择；
[0022] (2)提取样品DNA作为模板，并使用SEQ ID NO.3～4和5～6所示的核苷酸序列作为引物，分别进行PCR扩增，获取PCR扩增产物；对PCR扩增产物进行测序，确定每个个体中4个SNP位点的基因型；
[0023] (3)当基因分型结果表现为含有SNP1位点样本基因型为GG型时、或当含有SNP2位点样本基因型为TT型时、或当含有SNP3位点样本基因型为AA型时、或当含有SNP4位点样本基因型为CC时，或当含有以上4个位点任一组合时，该个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝个体。
[0024] 所述的SNP分子标记与海湾扇贝闭壳肌积累胡萝卜素这一性状显著相关，能够准确高效地鉴定海湾扇贝闭壳肌富集类胡萝卜素性状，既可在海湾扇贝苗种期对富含类胡萝卜素的品种进行准确鉴定和筛选，也可在扇贝成贝期实现对含有纯合型位点的亲贝进行选育。
[0025] 与现有技术相比，本发明的优点和有益成果在于：
[0026] 本发明提供了与海湾扇贝类胡萝卜素相关的SNP分子标记及其组合、相应的引物及其组合，并通过检测所述SNP分子标记，能够快速、简便、批量化的在苗种期和亲本期鉴定和筛选纯合的积累类胡萝卜素的海湾扇贝，可有效减少扇贝的养殖成本，提高了养殖和育种效率，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
[0027] 图1为普通白色闭壳肌海湾扇贝和橙色闭壳肌海湾扇贝的总类胡萝卜素含量比较。
[0028] 图2为普通白色闭壳肌海湾扇贝和橙色闭壳肌海湾扇贝群体遗传分化分析。
[0029] 图3为富集类胡萝卜素的海湾扇贝筛选后培育结果。
具体实施方式
[0030] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。以下实施例是对本发明的进一步说明，而非对本发明的限制。
[0031] 实施例1与海湾扇贝类胡萝卜素积累相关的SNP分子标记的提取、鉴定方法[0032] (1)自山东省青岛市黄岛区扇贝养殖场选取10月龄海湾扇贝个体，其中包括20只普通白色闭壳肌海湾扇贝，19只橙色闭壳肌海湾扇贝。经检测，橙色闭壳肌海湾扇贝中总类胡萝卜素含量显著高于普通白色闭壳肌海湾扇贝(如图1所示)。对39只海湾扇贝的闭壳肌组织进行取样，置于液氮中冷冻后，‑80℃保存备用。
[0033] (2)利用酚氯仿提取法提取步骤(1)中所取个体闭壳肌组织的全基因组DNA，随后将样本送至北京安诺优达公司进行DNA文库构建和全基因组重测序。
[0034] (3)利用Trimmomatic‑0.39软件对每个样品的下机clean data进行质量控制，获得高质量clean data。
[0035] (4)利用BWA软件的MEM算法将clean data比对到海湾扇贝参考基因组上得到sam文件。利用Samtools工具和Picard软件对生成的sam文件进行排序及重复序列校正消除，获得bam格式文件。
[0036] (5)利用GATK软件HaplotypeCaller命令，对bam文件进行多态性位点的检测分型，生成vcf文件；利用GATK软件VariantFiltration命令和Vcftools软件对vcf文件中的SNP位点进行质量控制，以获得符合筛选条件的高质量SNP位点，质控条件为：次等位基因频率(MAF)>0.05；符合哈迪‑温伯格平衡位点；位点缺失率<20％。
[0037] (6)利用Vcftools软件计算海湾扇贝不同闭壳肌颜色群体中的遗传分化系数(Fst)。以Z‑transformation校正后的ZFst>5为阈值，在第3号染色体上发现存在两群体高度分化的信号区间(如图2所示)。对该信号区间过阈值的SNP，比较等位基因频率和性状差异，在Arg0059510.1和Arg0059530.1基因的编码区筛选到在普通白色闭壳肌海湾扇贝和橙色闭壳肌海湾扇贝显著差异的4个SNP(表1)，分别为SNP1(T/G)、SNP2(G/T)、SNP3(C/A)和SNP4(T/C)，与类胡萝卜素积累性状显著相关的基因型分别是：SNP1：GG，SNP2：TT，SNP3：AA，SNP4：CC。
[0038] 表1定位到在两群体中高度分化的SNP位点信息
[0039]SNP标记 染色体 位置(bp) ZFst 所在基因
SNP1 Chr03 34979279 5.32219 Arg0059510.1
SNP2 Chr03 34979280 5.32219 Arg0059510.1
SNP3 Chr03 34979425 6.30338 Arg0059510.1
SNP4 Chr03 35046482 7.98409 Arg0059530.1
[0040] 针对所定位到的4个SNP位点，见表2，开发出相应的引物，对位点的可靠性在海湾扇贝群体中进行验证。引物信息如表3所示。
[0041] 表2与海湾扇贝类胡萝卜素积累相关SNPs分子标记的信息
[0042]
[0043]
[0044] 表3引物信息
[0045]
[0046] 选取海湾扇贝97只，其中包括48只普通白色闭壳肌海湾扇贝和49个橙色闭壳肌海湾扇贝，利用Sanger测序对所鉴定的4个SNP位点进行基因型分型检测。
[0047] 包括以下步骤：
[0048] (1)提取待测海湾扇贝的基因组DNA；
[0049] (2)以步骤(1)获取的DNA作为模板，以SEQ ID NO.3～6所示的核苷酸序列作为引物，分别进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
[0050] (3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行Sanger测序，确定待测海湾扇贝的4个SNP位点的基因型；
[0051] (4)计算4个SNP位点在普通白色闭壳肌海湾扇贝群体和橙色闭壳肌海湾扇贝群体中的基因型频率。
[0052] (5)结合测序结果和表型性状，发现4个SNP位点为紧密连锁的位点，当SNP1位点基因分型结果为GG型时、或当SNP2位点基因分型结果为TT型时、或当SNP3位点基因分型结果为AA型时、或SNP4位点基因分型结果为CC时，100％的比例为橙色闭壳肌海湾扇贝；当SNP1位点基因分型结果为TT型时、或当SNP2位点基因分型结果为GG型时、或当SNP3位点基因分型结果为CC型时、或SNP4位点基因分型结果为TT时，100％的比例为普通白色闭壳肌海湾扇贝。该验证结果与实施例1中数据分析结果一致，表明所鉴定的SNP位点是可以有效区分富集类胡萝卜素的海湾扇贝个体和普通海湾扇贝个体的。
[0053] 表4.SNP位点不同基因型在普通白色闭壳肌海湾扇贝和橙色闭壳肌海湾扇贝中的比例
[0054]
[0055] 实施例2
[0056] 利用与海湾扇贝类胡萝卜素积累相关的SNP分子标记进行海湾扇贝苗种的分子鉴定、筛选和亲本选择的方法，包含以下步骤：
[0057] (1)随机挑选50～100只待检测海湾扇贝，采用不同的取样策略进行取样，具体为：在小规格苗种期(壳高约0.5cm规格)，进行全组织取样用于该群体苗种的鉴定；在大规格苗种期(壳高3～5cm规格)，进行无损取样(3～5根鳃丝)用于苗种的定向选育；在成贝期，同样取鳃丝进行无损取样用于纯合位点亲本的选择；
[0058] (2)利用酚氯仿提取法提取样品DNA作为模板，并使用SEQ ID NO.3～4和5～6所示的核苷酸序列作为引物，分别进行PCR扩增，获取PCR扩增产物；对PCR扩增产物进行Sanger测序，确定每个个体中4个SNP位点的基因型；
[0059] (3)当基因分型结果表现为含有SNP1位点样本基因型为GG型时、或当含有SNP2位点样本基因型为TT型时、或当含有SNP3位点样本基因型为AA型时、或当含有SNP4位点样本基因型为CC时，该个体为富集类胡萝卜素的海湾扇贝个体；另外，由于以上位点为紧密连锁位点，含有以上4个位点任一组合的个体，同样为富含类胡萝卜素的海湾扇贝个体。
[0060] 利用以上所述的基因型情况对富含类胡萝卜素海湾扇贝进行鉴定和筛选，即可筛选出富集类胡萝卜素海湾扇贝个体。图3所示的即为筛选后的富集类胡萝卜素的海湾扇贝。
[0061] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
