一种评估植物组织生理发育进程的方法

摘要

本发明涉及植物生理发育技术领域，特别是涉及一种评估植物组织生理发育进程的方法。本发明先利用转录时间图谱筛选发育相关基因，即基因表达水平随（亚）组织生长时间分别呈线性增加或下降；再通过整合发育相关基因表达水平以检测目标植物（亚）组织生理发育进程，为定量评价和比较植物组织或组织内部的生理发育进程提供了重要的方法。本发明提供的方法操作简单，通过统计整合数千个发育过程相关基因的表达，能够定量计算植物组织生理发育程度。

权利要求

1.一种评估植物组织生理发育进程的方法，其特征在于，包括：获取待测植物组织从分化到成熟的时间转录组图谱；所述待测植物组织为玉米胚乳；

获取与所述待测植物组织发育相关的正相关基因和负相关基因；

所述正相关基因和负相关基因如下表所示：

其中，表中的基因ID前缀均为Zm00001，以d009907为例其完整的基因ID为Zm00001d009907，出自Zm‑B73‑REFERENCE‑GRAMENE‑4.0数据库；E为科学计数，即10的次方‑1的基数，以基因ID为d009907为例，其R值9.95E‑01为9.95×10 =0.995，其他基因对应的R值或P值中的E同理；

利用式Ⅰ分别将所述正相关基因和负相关基因的表达水平进行归一化处理；

A基因表达水平归一化=（X‑min）/（max‑min）   式Ⅰ；

其中，X为待测时间点A基因的表达水平，min为A基因在时间转录组图谱中的最小表达水平，max为A基因在时间转录组图谱中的最大表达水平，A基因为所述正相关基因中的任意一个基因或所述负相关基因中的任意一个基因；

利用式Ⅱ计算待测植物组织的生理发育指数，生理发育指数越大，植物组织生理发育程度越高；

生理发育指数=∑正相关基因表达水平的归一化结果+∑（1‑负相关基因表达水平的归一化结果）   式Ⅱ。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正相关基因和负相关基因的获取方法包括：对所述时间转录组图谱中实际生长时间和处于所述实际生长时间的植物组织基因表达水平之间进行斯皮尔曼相关性分析，根据相关性系数R值、基因表达水平和显著性p值，筛选得到植物组织发育的正相关基因和植物组织发育的负相关基因；所述植物组织发育的正相关基因的p值<0.005，基因表达水平≥1，且相关系数R＞0；所述植物组织发育的负相关基因的p值<0.005，基因表达水平≥1，且相关系数R＜0。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述正相关基因和负相关基因的筛选标准还包括：至少有一个时间点表达水平≥1。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述时间转录组图谱的获取目标为：适宜环境条件下生长的待测植物组织或已公开的待测植物组织的时间转录组图谱数据。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，获取所述时间转录组图谱为：待测植物组织从分化到成熟的过程中，获得连续不同时间点的转录组组成时间转录组图谱。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测植物组织为同一批植物组织。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因表达水平的单位包括FPKM、RPKM或TPM。

说明书

一种评估植物组织生理发育进程的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物生理发育技术领域，特别是涉及一种评估植物组织生理发育进程的方法。

背景技术

[0002] 植物组织从分化到成熟的过程中，同一组织或组织内的不同区域常常以不同的速度发育和衰老，这导致使用实际生长时间难以用于评比相同组织或组织内部不同区域的发育程度，生物发育程度的定量仍然很困难，方法的缺乏限制了对植物组织发育过程中与之相关的生理功能理解。

[0003] 植物中，通常使用发育阶段的细胞结构特征、细胞程序性死亡的标记物或衰老相关表型（例如叶片颜色变化）的时间跨度/阶段等来评估植物组织的生理发育程度。然而，这些方法仅能对发育程度差异明显的组织间进行含糊比较。迄今为止，还没有方法可以用于定量评估植物生理发育程度的方法。生物的生理发育涉及复杂的基因表达水平变化，医学生理学已经证明，生物体一些基因的表达水平是随着发育呈线性相关。近年来，植物上，发现拟南芥叶片随着衰老具有一系列增强表达的基因，除此以外，一些特定基因的表达水平与相关生理发育过程息息相关。越来越多的证据表明，利用转录组学可以反映植物组织生理发育阶段或程度。

[0004] 转录组是一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。现有研究方法中，由于植物组织的生理发育是由高度复杂的基因功能控制，尚未发现使用转录组学定量评估植物组织的生理发育程度。

发明内容

[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种评估植物组织生理发育进程的方法。本发明提供的方法可以相对定量评价和比较植物组织或组织内部的生理发育进程。

[0006] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种评估植物组织生理发育进程的方法，包括：

[0008] 获取待测植物组织从分化到成熟的时间转录组图谱；

[0009] 获取与所述待测植物组织发育相关的正相关基因和负相关基因；

[0010] 利用式Ⅰ分别将所述正相关基因和负相关基因的表达水平进行归一化处理；

[0011] A基因表达水平归一化=（X‑min）/（max‑min）   式Ⅰ；

[0012] 其中，X为待测时间点A基因的表达水平，min为A基因在时间转录组图谱中的最小表达水平，max为A基因在时间转录组图谱中的最大表达水平，A基因为所述正相关基因中的任意一个基因或所述负相关基因中的任意一个基因；

[0013] 利用式Ⅱ计算待测植物组织的生理发育指数，生理发育指数越大，植物组织生理发育程度越高；

[0014] 生理发育指数=∑正相关基因表达水平的归一化结果+∑（1‑负相关基因表达水平的归一化结果）   式Ⅱ。

[0015] 优选的，所述正相关基因和负相关基因的获取方法包括：

[0016] 对所述时间转录组图谱中实际生长时间和处于所述实际生长时间的植物组织基因表达水平之间进行斯皮尔曼相关性分析，根据相关性系数R值、基因表达水平和显著性p值，筛选得到植物组织发育的正相关基因和植物组织发育的负相关基因；所述植物组织发育的正相关基因的p值<0.005，基因表达水平≥1，且相关系数R＞0；所述植物组织发育的负相关基因的p值<0.005，基因表达水平≥1，且相关系数R＜0。

[0017] 优选的，所述正相关基因和负相关基因的筛选标准还包括：至少有一个时间点表达水平≥1。

[0018] 优选的，所述时间转录组图谱的获取目标为：适宜环境条件下生长的待测植物组织或已公开的待测植物组织的时间转录组图谱数据。

[0019] 优选的，获取所述时间转录组图谱为：待测植物组织从分化到成熟的过程中，获得连续不同时间点的转录组组成时间转录组图谱。

[0020] 优选的，所述待测植物组织为同一批植物组织。

[0021] 优选的，所述基因表达水平的单位包括FPKM、RPKM或TPM。

[0022] 优选的，所述植物包括玉米。

[0023] 有益效果：

[0024] 本发明先利用转录时间图谱筛选发育相关基因，即基因表达水平随（亚）组织生长时间分别呈线性增加或下降；再通过整合发育相关基因表达水平以检测目标植物（亚）组织生理发育进程，为定量评价和比较植物组织或组织内部的生理发育进程提供了重要的方法。本发明提供的方法操作简单，通过统计整合数千个发育过程相关基因的表达，能够定量计算植物组织生理发育程度。

附图说明

[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0026] 图1为玉米胚乳发育相关基因的筛选结果；其中DAP为授粉后天数；

[0027] 图2为干旱处理下和正常生长籽粒在授粉后8天的发育相关基因表达结果；

[0028] 图3为灌浆期高温和正常生长籽粒在授粉后30天的发育相关基因表达结果；

[0029] 图4为灌浆期玉米胚乳发育相关基因的时空模式。

具体实施方式

[0030] 本发明提供了一种评估植物组织生理发育进程的方法，包括：

[0031] 获取待测植物组织从分化到成熟的时间转录组图谱；

[0032] 获取与所述待测植物组织发育相关的正相关基因和负相关基因；

[0033] 利用式Ⅰ分别将所述正相关基因和负相关基因的表达水平进行归一化处理；

[0034] A基因表达水平归一化=（X‑min）/（max‑min）   式Ⅰ；

[0035] 其中，X为待测时间点A基因的表达水平，min为A基因在时间转录组图谱中的最小表达水平，max为A基因在时间转录组图谱中的最大表达水平，A基因为所述正相关基因中的任意一个基因或所述负相关基因中的任意一个基因；

[0036] 利用式Ⅱ计算待测植物组织的生理发育指数，生理发育指数越大，植物组织生理发育程度越高（老）；

[0037] 生理发育指数=∑正相关基因表达水平的归一化结果+∑（1‑负相关基因表达水平的归一化结果）   式Ⅱ。

[0038] 本发明获取待测植物组织从分化到成熟的时间转录组图谱。在本发明中，所述植物优选包括玉米；所述时间转录组图谱的获取目标优选为：适宜环境条件下生长的待测植物组织或已公开的待测植物组织的时间转录组图谱数据；获取所述时间转录组图谱的方法优选为：待测植物组织从分化到成熟的过程中，获得连续不同时间点的转录组组成时间转录组图谱；优选为每2天测一次转录组；所述待测植物组织优选为同一批植物组织。本发明对所述转录组的测序方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的测序方法即可。

[0039] 获取待测植物组织从分化到成熟的时间转录组图谱后，本发明优选根据所述时间转录组图谱获取与所述待测植物组织发育相关的正相关基因和负相关基因。在本发明中，所述正相关基因和负相关基因的获取方法优选包括：对所述时间转录组图谱中实际生长时间和处于所述实际生长时间的植物组织基因表达水平之间进行斯皮尔曼相关性分析，根据相关性系数R值、基因表达水平和显著性p值，筛选得到植物组织发育的正相关基因和植物组织发育的负相关基因；所述植物组织发育的正相关基因的p值<0.005，至少有一个时间点的基因表达水平≥1，且相关系数R＞0；所述植物组织发育的负相关基因的p值<0.005，至少有一个时间点的基因表达水平≥1，且相关系数R＜0；所述斯皮尔曼相关性分析的工具优选包括具有统计分析的软件，更优选为Excel或R语言。

[0040] 获取时间转录组图谱、正相关基因和负相关基因后，本发明利用式Ⅰ分别将所述正相关基因和负相关基因的表达水平进行归一化处理；

[0041] A基因表达水平归一化=（X‑min）/（max‑min）   式Ⅰ；

[0042] 其中，X为待测时间点A基因的表达水平，min为A基因在时间转录组图谱中的最小表达水平，max为A基因在时间转录组图谱中的最大表达水平，A基因为所述正相关基因中的任意一个基因或所述负相关基因中的任意一个基因。

[0043] 在本发明中，所述基因表达水平的单位优选包括FPKM（每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments），RPKM（每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数）或TPM（样本中平均每一百万个转录本中对应于特定基因或转录本的数量）。

[0044] 归一化处理后，本发明利用式Ⅱ计算待测植物组织的生理发育指数，生理发育指数越大，植物组织生理发育程度越高；

[0045] 生理发育指数=∑正相关基因表达水平的归一化结果+∑（1‑负相关基因表达水平的归一化结果）   式Ⅱ。

[0046] 本发明通过将正相关基因和负相关基因的表达水平分别进行归一化处理后利用式Ⅱ进行整合获得待测时间点每个正相关基因和负相关基因的归一化结果，从而得到植物组织的生理发育指数，根据生理发育指数可以相对定量的评估植物祖师发育程度，可以价不同组织或组织内部不同位置生理发育进程。

[0047] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种评估植物组织生理发育进程的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0048] 实施例1

[0049] 本发明以玉米胚乳为例，筛选其发育相关基因：

[0050] 利用玉米胚乳公开的高分辨率时间转录图谱，包含整个生育时期（材料为自交系B37，授粉后6到38天，每两天测一次转录组），参见【Yi F, Gu W, Chen J, Song N, Gao X, Zhang X, Zhou Y, Ma X, Song W, Zhao H et al. 2019. High temporal‑resolution transcriptome landscape of early maize seed development. Plant Cell 31, 974‑992.】。根据Spearman秩相关用等级相关系数来说明基因的表达水平（FPKM值）与时间的直线相关关系的密切程度与相关方向，其中p < 0.005，同时满足至少有一个时间点表达水平FPKM ≥ 1的基因，把它们定义为“发育相关基因”。

[0051] 根据相关系数R，当R > 0为与生理发育呈正相关基因；R < 0为与生理发育呈负相关基因。通过上述方法，共筛选669个随着发育过程中表达量增加的基因（正相关）和832个随着发育过程中表达量下降趋势的基因（负相关），见表1。

[0052] 表1 与发育相关的基因

[0053]

[0054]

[0055]

[0056]

[0057]

[0058]

[0059]

[0060]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067]

[0068]

[0069]

[0070] 注：表1中的基因ID前缀均为Zm00001，以d009907为例其完整的基因ID为Zm00001d009907，出自Zm‑B73‑REFERENCE‑GRAMENE‑4.0 (also known as B73v4，https://maizegdb.org/)；E为科学计数，即10的次方的基数，以基因ID为d009907为例，其R值9.95E‑‑101为9.95×10 =0.995，其他基因对应的R值或P值中的E同理。

[0071] 使用log2（FPKM+1）进行heatmap聚类和箱形图显示，结果见图1，可见，随着胚乳发育，正相关的基因表达量随时间逐渐增加，而负相关的基因表达量随时间逐渐下降（图1）。

[0072] 在此基础上，对不同环境下生长的玉米胚乳的生理发育程度进行定量评估。

[0073] 实施例2

[0074] 利用文献【Shen S, Liang XG, Zhang L, Zhao X, Liu YP, Lin S, Gao Z, Wang P, Wang ZM, Zhou SL. 2020. Intervening in sibling competition for assimilates  by controlled pollination prevents seed abortion under postpollination drought in maize. Plant, Cell & Environment 43, 903‑919.】公开的转录组数据，选择分别经过干旱和正常水分条件下生长的玉米，其中干旱（WD）处理于授粉前一天（‑1天）开始控制灌水，将土壤相对含水量维持于45% ± 5%，直至16天时复水；对照（CK）保证充足的水分供应，使其土壤相对含水量保持在85%以上，并一直维持至成熟期。玉米胚乳分别取自以上环境条件下授粉后8天的样品，对其公开的转录组数据进行分析；

[0075] 比较WD vs CK籽粒发育相关基因（即表1的基因）的表达水平高低，与正常发育的籽粒相比，经过干旱条件下生长的玉米籽粒发育正相关的基因分别有83.6%表达上调，与发育负相关的基因分别有83.5%表达下调（图2）。

[0076] 实施例3

[0077] 利用文献【Boehlein SK, Liu P, Webster A, Ribeiro C, Suzuki M, Wu S, Guan JC, Stewart JD, Tracy WF, Settles AM et al. 2019. Effects of long‑term exposure to elevated temperature on Zea mays endosperm development during grain fill. Plant Journal 99, 23‑40.】公开的转录组数据，选择分别经过高温和正常温度环境条件下生长的玉米，其中高温（HH）处理：玉米授粉后12天开始对植株持续进行高温（白天38℃，夜晚28℃），直至成熟；和对照（CK）：玉米植株始终生长在适宜温度环境中（白天28℃，夜晚17℃）。玉米胚乳分别取自以上环境条件下授粉后30天的样品，对其公开的转录组数据进行分析；

[0078] 比较HH vs CK胚乳发育相关基因（即表1的基因）的表达模式，与发育正相关的基因分别有86.2%表达上调，与发育负相关的基因分别有67.6%表达下调（图3）。

[0079] 高温和干旱可以促进玉米胚乳发育，由实施例2和3的结果可知，本发明筛选得到的发育相关基因的表达随着胚乳发育分别呈线性增加或下降。此外，在其他已发表的在外部刺激下衰老或加速生长的籽粒或胚乳的转录组数据中，本发明筛选得到的与发育正相关的基因大部分被促进，而与发育负相关的基因大部分被抑制。综上所述，本发明筛选得到的发育相关基因可以用来来评估植物组织的生理发育进程。

[0080] 实施例4

[0081] 选择玉米杂交种郑单958为试验材料，于2020年在河北省中国农业大学吴桥实验站（37°36´N，116°21´E，海拔19.7 m）种植。5月20日播种，在每个盆栽桶（高30 cm，半径17 cm）中播种3粒种子，桶内含有富含矿物质的干砂土（沙壤土）10 kg，每盆边施上11 g复合肥（N 15%，P2O5 15%，K2O 15%），播种后覆盖一层从淮安市中禾农业科技开发有限公司购买的通用型营养土（富含泥炭、有机物和蛭石等）。在三叶期（V3）定苗，以保证每盆内留一株长势一致的幼苗。在大喇叭口期（V12）施加5 g尿素（N 46%）以供植株后期正常生长。植株生长在自然环境中，人工定量浇水以保持盆栽土壤水分充足一致。在整个生长过程中，植物免受虫害或非生物胁迫。在吐丝前，将所有穗子套袋以防止自然授粉。当所有的花丝都吐出后（大约吐丝后第5天），收集新鲜花粉进行人工同步授粉。在15、20、25、35天（DAP）取穗中部5圈籽粒。每颗籽粒取样后立即将胚和种皮丢弃后，按照胚乳长度均匀的切分为胚乳上部（AE）、中部（ME）和下部（BE）后立即冷冻保存于‑80℃用于转录组测序。

[0082] 保存的胚乳分别用TRizol试剂（Invitrogen，美国）和RN40‑EASYspin试剂盒（Aidlab，中国）提取总RNA。A260/A280比值≥1.9的RNA进行cDNA合成。使用NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit 制备cDNA库，并在BioMarkerTechnologies Illumina公司的Illumina HiSeq2500平台上（中国，北京）进行测序。利用Tophat2剔除接头序列并过滤低质量序列后将reads  映射到玉米B73  ReferenceGenome version 3（V3，http://www.maizegdb.org/assembly/）。每个基因的表达归一化为每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments（FPKM）。

[0083] 转录组测序后，分别筛选每个样品所有发育相关基因（即表1的基因）表达水平，结果见图4。

[0084] 图4显示，发育相关基因在胚乳不同时间和不同区域的表达是不同的。大多数与发育正相关的基因在AE或35天的ME中是高表达，BE是低表达。与发育负相关的基因表现出相反的模式，它们的表达在BE中较高，随着时间进程在所有胚乳中表达逐渐降低。而胚乳从下到上在相同时间点的发育程度是逐渐增加是已知的【Young TE, Gallie DR, and DeMason DA. Ethylene‑mediated programmed cell death during maize endosperm development of wild‑type and shrunken2 genotypes. 1997. Plant Physiology 115, 737‑751】，可见，本发明实施例1筛选的1501个发育相关基因的时间转录图谱可以为进一步量化AE、ME和BE的发育过程提供基础。

[0085] 为了进一步对AE、ME和BE之间的生理发育进行定量化比较，将发育相关基因的FPKM值进行数学整合，从而计算出相对生理发育程度。其中所有选定的发育相关基因的FPKM值分别通过在所有样品中“最大‑最小值归一化”，归一化范围为0 1。随后，每个样本的~生理发育相对程度的计算公式如下：

[0086] 生理发育指数=∑归一化FPKM（发育正相关基因）+∑ [1 ‑归一化 FPKM（发育负相关基因）]；结果见表2。

[0087] 表2 灌浆期玉米胚乳不同区域的生理发育指数差异

[0088] 胚乳区域 15天 20天 25天 35天胚乳上部（AE） 732.3 782.6 788.6 1093.1
胚乳中部（ME） 591.4 621.9 632.8 748.4
胚乳下部（BE） 409.8 418.4 432.9 563.1

[0089] 在胚乳15 35天，AE、ME和BE的生理发育指数分别为732.3 1093.1、591.4 748.4和~ ~ ~409.8 563.1，递增幅度分别为360.8、157.0和153.3。说明15 35天，AE的生理发育速度更~ ~
快，而ME和BE的速度接近AE的一半。

[0090] 综上所述，生理发育指数作为反映生理发育程度的参数，它的计算方法是综合了一系列发育相关基因的表达水平值，克服了用实际时间来评估组织内生理发育进程的困难，能够了解胚乳不同区域等组织内的发育进程。

[0091] 动植物生理发育涉及复杂的基因表达变化，但许多发生显著变化的发育相关基因都符合一种常见的模式。在生物体中，发育过程往往不是由单一基因或代谢途径控制的，而是由机体内多个细胞器和代谢途径综合调控的。本发明通过统计整合数千个年龄相关基因的表达，提供了一种定量计算生理发育指数的方法，为定量评价胚乳等组织内的生理进程提供了重要的方法，区分了植物组织生理发育程度与实际发育时间。

[0092] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。