一种分泌抗小反刍兽疫病毒F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用转让专利
申请号 : CN202311659280.2
文献号 : CN117363582B
文献日 : 2024-03-01
发明人 : 薛青红 , 高月异 , 高金源 , 秦义娴 , 孙淼 , 陈延飞
申请人 : 中国兽医药品监察所
摘要 :
本申请公开了一种分泌抗小反刍兽疫病毒F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用。本申请中杂交瘤细胞株为2D10‑F‑PPRV，保藏编号为CGMCC No.45615，该单克隆抗体可用于检测PPRV，特异性强，抗体滴度高，其与感染小反刍兽疫病毒PPRV Nigeria 75/1株的Vero细胞发生特异性的荧光反应，不与正常Vero细胞及羊疱疹病毒Ⅰ型、牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型等常见羊病毒发生反应。
权利要求 :
1. 一种杂交瘤细胞，其中，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.45615。
2. 根据权利要求1所述的杂交瘤细胞，其中，所述杂交瘤细胞结合的抗原为PPRV Nigeria 75/1株F蛋白。
3. 根据权利要求2所述的杂交瘤细胞，其中，所述杂交瘤细胞结合的抗原表位的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。
4.根据权利要求1‑3所述的杂交瘤细胞株在制备检测和/或诊断小反刍兽疫病毒感染的动物的试剂中的应用。
5. 一种单克隆抗体，其中，该单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.45615的杂交瘤细胞株产生。
6. 根据权利要求5所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体能够结合PPRV Nigeria
75/1株F蛋白。
7. 根据权利要求6所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体能够结合包括如SEQ ID NO.1所示的序列的抗原表位。
8.根据权利要求5‑7所述的单克隆抗体，其中，所述抗体包含：
a）抗体重链互补决定区，其包含：CDR‑H1、CDR‑H2、CDR‑H3，其中：CDR‑H1具有序列SEQ ID NO 4：SYGLS的氨基酸序列，
CDR‑H2具有序列SEQ ID NO 5：TITWNGGSTYYPDTVKG的氨基酸序列，CDR‑H3具有序列SEQ ID NO 6：ESLLRLPAWFAY的氨基酸序列，b）抗体轻链互补决定区，其包含：CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3，其中：CDR‑L1具有序列SEQ ID NO 7：RASKSVSTSGYSYMH的氨基酸序列，CDR‑L2具有序列SEQ ID NO 8：LVSNLES的氨基酸序列，
CDR‑L3具有序列SEQ ID NO 9：QHIRELYT的氨基酸序列。
9. 一种结合PPRV Nigeria 75/1株F蛋白的单克隆抗体，其中，所述抗体包含：a）抗体重链互补决定区，其包含：CDR‑H1、CDR‑H2、CDR‑H3，其中：CDR‑H1的氨基酸序列如序列SEQ ID NO 4：SYGLS所示，
CDR‑H2的氨基酸序列如序列SEQ ID NO 5：TITWNGGSTYYPDTVKG所示，CDR‑H3的氨基酸序列如序列SEQ ID NO 6：ESLLRLPAWFAY所示，b）抗体轻链互补决定区，其包含：CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3，其中：CDR‑L1的氨基酸序列如序列SEQ ID NO 7：RASKSVSTSGYSYMH所示，CDR‑L2的氨基酸序列如序列SEQ ID NO 8：LVSNLES所示，
CDR‑L3的氨基酸序列如序列SEQ ID NO 9：QHIRELYT所示。
10. 根据权利要求8或9所述的单克隆抗体，其中，所述抗体包括如SEQ ID NO 10所示抗体重链可变区HCVR和如SEQ ID NO 11所示抗体轻链可变区LCVR，其中：HCVR具有序列SEQ ID NO 10：EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGLSWVRQTPDKRLELVATITWNGGSTYYPDTVKGRFTISRDSAKNILYLQMSSLKSEDTAMYYCARESLLRLPAWFAYWGQGTLVTVSA的氨基酸序列；
LCVR具有序列SEQ ID NO 11：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELYTFGGGTKLEIK的氨基酸序列。
11. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有90%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有90%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
12. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有91%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有91%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
13. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有92%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有92%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
14. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有93%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有93%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
15. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有94%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有94%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
16. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有95%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有95%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
17. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有96%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有96%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
18. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有97%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有97%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
19. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有98%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有98%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
20. 根据权利要求10所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包括与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有99%同一性的抗体重链可变区HCVR和与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有99%同一性的抗体轻链可变区LCVR。
21. 根据权利要求8或9所述的单克隆抗体，其中，所述抗体包含如SEQ ID NO 12所示重链和如SEQ ID NO 13所示轻链，其中：所述重链氨基酸序列是SEQ ID NO 12：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKL的氨基酸序列；
所述轻链氨基酸序列是SEQ ID NO 13：RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC的氨基酸序列。
22. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有90%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有90%同一性的轻链。
23. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有91%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有91%同一性的轻链。
24. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有92%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有92%同一性的轻链。
25. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有93%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有93%同一性的轻链。
26. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有94%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有94%同一性的轻链。
27. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有95%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有95%同一性的轻链。
28. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有96%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有96%同一性的轻链。
29. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有97%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有97%同一性的轻链。
30. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有98%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有98%同一性的轻链。
31. 根据权利要求21所述的单克隆抗体，其中，所述抗体还包含与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有99%同一性的重链和与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有99%同一性的轻链。
32.根据权利要求5或9所述的单克隆抗体在制备检测和/或诊断小反刍兽疫病毒感染的动物的试剂中的应用。
33.一种用于检测和/或诊断动物小反刍兽疫病毒感染的试剂盒，其包括：权利要求5~
31中任一项所述的单克隆抗体或由权利要求1‑3所述的杂交瘤细胞产生的抗体。
说明书 :
一种分泌抗小反刍兽疫病毒F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞
株及其单抗与应用
技术领域
[0001] 本申请涉及生物检测领域，具体涉及一种分泌抗小反刍兽疫病毒F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与在小反刍兽疫病毒感染检测中的应用。
背景技术
[0002] 小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV) 引起的一种高度接触性病毒性传染病，主要感染山
羊、绵羊等小反刍动物，其中山羊高度易感，发病率高达100％，严重暴发时致死率为100％，为养殖业造成严重的经济损失。PPRV属于副黏病毒科麻疹病毒属，根据N基因和F基因可分
为4个谱系，目前只有一个血清型。
羊、绵羊等小反刍动物，其中山羊高度易感，发病率高达100％，严重暴发时致死率为100％，为养殖业造成严重的经济损失。PPRV属于副黏病毒科麻疹病毒属，根据N基因和F基因可分
为4个谱系，目前只有一个血清型。
[0003] 目前已经证实了国内目前存在的毒株主要都是Ⅳ系，虽然PPRV疫苗毒株属于Ⅱ系，但是该疫苗毒株免疫保护效果良好，通过制定合理的防疫措施，该病有望从国内清除。
发明内容
[0004] 在本领域中，建立快速、有效、高通量的PPRV检测方法，能够为消灭小反刍兽疫提供技术支撑。此前对PPRV病原的检测多用常规RT‑PCR和qRT‑PCR检测方法，需要进行病毒RNA提取等操作，操作繁杂、耗时长、成本较高，且不能高通量检测。单克隆抗体在动物病毒的诊断和防治中起重要作用。利用单克隆抗体建立的检测病原的双抗体夹心ELISA检测方法或间接免疫荧光方法，都在病原的临床监测和实验室检测中发挥着重要作用。目前国内
尚无针对PPRV病原F蛋白的单克隆抗体以及高通量检测方法，因此，需要提供一种简便、快速、敏感性高和特异性好的有效检测手段对大量样品进行PPRV病原检测。
尚无针对PPRV病原F蛋白的单克隆抗体以及高通量检测方法，因此，需要提供一种简便、快速、敏感性高和特异性好的有效检测手段对大量样品进行PPRV病原检测。
[0005] 本申请所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。
[0006] 本申请还要解决的技术问题是提供上述杂交瘤细胞株分泌的单抗及其制备方法。
[0007] 本申请最后要解决的技术问题是提供上述单抗的应用。具体来说，本申请涉及如下内容：
[0008] 本申请提供一种杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.45615。
[0009] 本申请的一个具体实施方式中，所述杂交瘤细胞结合的抗原为PPRV Nigeria 75/1株F蛋白，优选所述杂交瘤细胞结合的抗原表位的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的
序列，进一步优选所述杂交瘤细胞结合的抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
序列，进一步优选所述杂交瘤细胞结合的抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
[0010] 抗原表位序列SEQ ID NO.1为：
[0011] ALHQSLMNSQAIESLKTSLEKSNQAIEEIRLANKETILAVQGVQDYINNELVPSVHRMSCELVGHKLSLKLLRYYTEILSIFGPSLRDPIAAEISIQALSYALGGDINKILDKLGYSGGDFLAILESKGIKARVTYVDTRDYFI
ILSIAYPTLSEIKGVIVHKIEAISYNIGAQEWYTTIPRYVATQGYLISNFDETSCVFTPEGTVCSQNALYPMSPLL
QECFRGSTKSCARTLVSGTTSNRFILSKGNLIANCASVLCKCYTTETVINQDPDKLLTVIASDKCPVVEVDGVTIQ
VGSREYPDSVYLHEIDLGPAISLEKLDVGTNLGNAVTRLENAKELLDASDQILKTVKGVP的氨基酸序列。
ILSIAYPTLSEIKGVIVHKIEAISYNIGAQEWYTTIPRYVATQGYLISNFDETSCVFTPEGTVCSQNALYPMSPLL
QECFRGSTKSCARTLVSGTTSNRFILSKGNLIANCASVLCKCYTTETVINQDPDKLLTVIASDKCPVVEVDGVTIQ
VGSREYPDSVYLHEIDLGPAISLEKLDVGTNLGNAVTRLENAKELLDASDQILKTVKGVP的氨基酸序列。
[0012] 本申请提供一种单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45615的杂交瘤细胞株产生。
[0013] 本申请的一个具体实施方式中，所述单克隆抗体能够结合PPRV Nigeria 75/1株F蛋白，优选能够结合包括如SEQ ID NO.1所示的序列的抗原表位，优选能够结合如SEQ ID
NO.1所示的抗原表位。
NO.1所示的抗原表位。
[0014] 本申请的一个具体实施方式中，所述单克隆抗体包含抗体重链互补决定区，其包含：CDR‑H1、CDR‑H2、CDR‑H3，其中：CDR‑H1具有序列SEQ ID NO 4：SYGLS的氨基酸序列，CDR‑H2具有序列SEQ ID NO 5：TITWNGGSTYYPDTVKG的氨基酸序列，CDR‑H3具有序列SEQ ID NO
6：ESLLRLPAWFAY的氨基酸序列。
6：ESLLRLPAWFAY的氨基酸序列。
[0015] 本申请的一个具体实施方式中，所述单克隆抗体包含抗体轻链互补决定区，其包含：CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3，其中：CDR‑L1具有序列SEQ ID NO 7：RASKSVSTSGYSYMH的氨基酸序列，CDR‑L2具有序列SEQ ID NO 8：LVSNLES的氨基酸序列，CDR‑L3具有序列SEQ ID NO
9：QHIRELYT的氨基酸序列。
9：QHIRELYT的氨基酸序列。
[0016] 本申请的一个具体实施方式中，一种结合PPRV Nigeria 75/1株F蛋白的单克隆抗体包含：
[0017] a）抗体重链互补决定区，其包含：CDR‑H1、CDR‑H2、CDR‑H3，其中：
[0018] CDR‑H1具有序列SEQ ID NO 4：SYGLS的氨基酸序列，
[0019] CDR‑H2具有序列SEQ ID NO 5：TITWNGGSTYYPDTVKG的氨基酸序列，
[0020] CDR‑H3具有序列SEQ ID NO 6：ESLLRLPAWFAY的氨基酸序列，
[0021] b）抗体轻链互补决定区，其包含：CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3，其中：
[0022] CDR‑L1具有序列SEQ ID NO 7：RASKSVSTSGYSYMH的氨基酸序列，
[0023] CDR‑L2具有序列SEQ ID NO 8：LVSNLES的氨基酸序列，
[0024] CDR‑L3具有序列SEQ ID NO 9：QHIRELYT的氨基酸序列。
[0025] 本申请的一个具体实施方式中，所述单克隆抗体包括如SEQ ID NO 10所示抗体重链可变区HCVR或与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%或99%同一性的抗体重链可变区HCVR和如SEQ ID NO 11所示抗体轻链可变区LCVR
或与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的抗体重链可变区LCVR，其中：
97%、98%或99%同一性的抗体重链可变区HCVR和如SEQ ID NO 11所示抗体轻链可变区LCVR
或与SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的抗体重链可变区LCVR，其中：
[0026] HCVR具有序列SEQ ID NO 10：EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGLSWVRQTPDKRLELVATITWNGGSTYYPDTVKGRFTISRDSAKNILYLQMSSLKSEDTAMYYCARESLLRLPAWFAYWGQGTLVTV
SA的氨基酸序列；
SA的氨基酸序列；
[0027] LCVR具有序列SEQ ID NO 11：
[0028] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELYTFGGGTKLEIK的氨基酸序列。
[0029] 本申请的一个具体实施方式中，所述单克隆抗体包括如SEQ ID NO 12所示重链或与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链和如SEQ ID NO 13所示轻链或与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链，其中：
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链，其中：
[0030] 所述重链氨基酸序列是SEQ ID NO 12：
[0031] AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDIS
KDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRP
KAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEA
GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKL的氨基酸序列；
KDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRP
KAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEA
GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKL的氨基酸序列；
[0032] 所述轻链氨基酸序列是SEQ ID NO 13：RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC的氨
基酸序列。
基酸序列。
[0033] 一种用于检测和/或诊断动物小反刍兽疫病毒感染的试剂盒，其包括：上述单克隆抗体或由保藏编号为CGMCC No.45615的杂交瘤细胞产生的抗体。
[0034] 有益效果：与现有技术相比，本申请具有如下优势：
[0035] （1）本申请得到的单克隆抗体可用于检测PPRV，特异性强，抗体滴度高，其与感染小反刍兽疫病毒PPRV Nigeria 75/1株的Vero细胞发生特异性的荧光反应，不与正常Vero细胞及羊疱疹病毒Ⅰ型、牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型等常见羊病毒发生反应。
[0036] （2）本申请的提出为建立一种快速、简易、准确的检测方法，以及在免疫机制研究、免疫功能研究、检测方法建立等方面提供技术手段，对PPRV的防控及实验室研究都具有重要意义。
附图说明
[0037] 附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
[0038] 图1为pET28a‑PPRV‑F重组蛋白的鉴定结果。
[0039] 图2为含小反刍兽疫病毒的间接免疫荧光检测结果。
[0040] 图3为Western blot实验检测单克隆抗体2D10‑F‑PPRV株与PPRV反应。
具体实施方式
[0041] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0042] 需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利
要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准
则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要
求所界定者为准。
要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准
则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要
求所界定者为准。
[0043] 本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
[0044] 一般而言，本说明书中采用的术语具有如下含义。
[0045] 在本说明书中，术语“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存
在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制
品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例
如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制
品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例
如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
[0046] 在本说明书中，术语“杂交瘤细胞”表示一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞，一般通过瘤细胞培养来制备。
[0047] 在本说明书中，术语“重链”（“CH”）、“轻链”（“CL”）、“重链恒定区”、“轻链恒定区”、“轻链可变区”（“VL”）、“重链可变区”（“VH”）、“骨架区”（“Framework Region，FR”）、“互补决定区”（“CDR”）是抗体的组成部分，通过不同的组合可以形成不同种类的抗体。例如常规IgG抗体是由两条轻链和两条重链组成的四聚体。其中，VL及VH均由不同的CDR和FR组成，CDR包含与抗原接触的残基，决定VL及VH的抗原特异性，FR用于维持可变区结构并决定CDR环的位置。通常，重链可变区和重链恒定区组成一条完整的重链，而轻链可变区与轻链恒定区组成一条完整的轻链。
[0048] 在本说明书中，术语“标记”是指抗体结合后，可通过颜色、化学反应、激发光、质谱等指示抗体位置或量的分子。包括例如：碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶、荧光素、荧光蛋白、同位素等。
[0049] 在本说明书中，术语“多核苷酸”或“核酸”、“核酸分子”可互换使用，包括但不限于DNA、RNA、cDNA(互补DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微小RNA)、基因组DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA。
[0050] 在本说明书中，“酶联免疫吸附测定(EILSA)”是指利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白结合，并利用特殊的标记
物对其定性或定量分析的一种检测方法。其原理是：抗原或抗体能物理性地吸附于固相表
面，并且保持其免疫活性；抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性或酶活性；酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确
定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。根据待检测物
质以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法，双抗体夹心法是检测抗原最
常用的方法。其是将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗涤一次；加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，然后把多余抗体洗除；加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体，使形成"夹心"；加入该酶的底物，若看到有色的酶解产物产生，说明在存在相应的抗原。
物对其定性或定量分析的一种检测方法。其原理是：抗原或抗体能物理性地吸附于固相表
面，并且保持其免疫活性；抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性或酶活性；酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确
定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。根据待检测物
质以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法，双抗体夹心法是检测抗原最
常用的方法。其是将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗涤一次；加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，然后把多余抗体洗除；加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体，使形成"夹心"；加入该酶的底物，若看到有色的酶解产物产生，说明在存在相应的抗原。
[0051] 在本说明书中，“质粒”是指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质或细胞核中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
[0052] 在本说明书中，术语“载体”是指通过其可以将多核苷酸序列(例如外来基因)引入宿主细胞中，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)的载体。载体包括质粒、噬菌体载体、病毒载体等。其中“病毒载体”，是由病毒基因组改造而成的载体，其通过病毒侵染将外来基因引入宿主细胞。
[0053] 本申请提供了一种杂交瘤细胞株2D10‑F‑PPRV，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.45615。
[0054] 本申请还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45615的杂交瘤细胞株产生。本申请中的杂交瘤细胞株名称为2D10‑F‑PPRV，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.45615，保藏日期：2023年05月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
[0055] 本申请提供的一种单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含：a)抗体重链互补决定区，其包含：CDR‑H1、CDR‑H2、CDR‑H3，其中：CDR‑H1具有序列SEQ ID NO 4: SYGLS的氨基酸序列，CDR‑H2具有序列SEQ ID NO 5: TITWNGGSTYYPDTVKG的氨基酸序列，CDR‑H3具有序列SEQ ID NO 6: ESLLRLPAWFAY的氨基酸序列；b)抗体轻链互补决定区，其包含：CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3，其中：CDR‑L1具有序列SEQ ID NO 7: RASKSVSTSGYSYMH的氨基酸序列，CDR‑L2具有序列SEQ ID NO 8: LVSNLES的氨基酸序列，CDR‑L3具有序列SEQ ID NO 9: QHIRELYT的氨基酸序列。
[0056] 本申请还提供的一种结合PPRV Nigeria 75/1株F蛋白的单克隆抗体，其包含：a)抗体重链互补决定区，其包含：CDR‑H1、CDR‑H2、CDR‑H3，其中：CDR‑H1具有序列SEQ ID NO
4: SYGLS的氨基酸序列，CDR‑H2具有序列SEQ ID NO 5: TITWNGGSTYYPDTVKG的氨基酸序
列，CDR‑H3具有序列SEQ ID NO 6: ESLLRLPAWFAY的氨基酸序列；b)抗体轻链互补决定区，其包含：CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3，其中：CDR‑L1具有序列SEQ ID NO 7: RASKSVSTSGYSYMH的氨基酸序列，CDR‑L2具有序列SEQ ID NO 8: LVSNLES的氨基酸序列，CDR‑L3具有序列SEQ ID NO 9: QHIRELYT的氨基酸序列。
4: SYGLS的氨基酸序列，CDR‑H2具有序列SEQ ID NO 5: TITWNGGSTYYPDTVKG的氨基酸序
列，CDR‑H3具有序列SEQ ID NO 6: ESLLRLPAWFAY的氨基酸序列；b)抗体轻链互补决定区，其包含：CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3，其中：CDR‑L1具有序列SEQ ID NO 7: RASKSVSTSGYSYMH的氨基酸序列，CDR‑L2具有序列SEQ ID NO 8: LVSNLES的氨基酸序列，CDR‑L3具有序列SEQ ID NO 9: QHIRELYT的氨基酸序列。
[0057] 本申请的一个具体实施方式中，上述结合PPRV Nigeria 75/1株F蛋白的单克隆抗体包括但不限于由保藏编号为CGMCC No.45615的杂交瘤细胞株产生，或采用化学合成的方
法获取。
法获取。
[0058] 本申请的一个具体实施方式中，上述抗体包含如SEQ ID NO 10所示抗体重链可变区HCVR或与SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的抗体重链可变区HCVR和如SEQ ID NO 11所示抗体轻链可变区LCVR或与SEQ
ID NO 11所示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的抗体重链可变区LCVR，其中：
ID NO 11所示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的抗体重链可变区LCVR，其中：
[0059] HCVR具有序列SEQ ID NO 10：
[0060] EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGLSWVRQTPDKRLELVATITWNGGSTYYPDTVKGRFTISRDSAKNILYLQMSSLKSEDTAMYYCARESLLRLPAWFAYWGQGTLVTVSA的氨基酸序列；
[0061] LCVR具有序列SEQ ID NO 11：
[0062] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELYTFGGGTKLEIK的氨基酸序列。
[0063] 本申请的一个具体实施方式中，上述抗体包含如SEQ ID NO 12所示重链或与SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链和如SEQ ID NO 13所示轻链或与SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链，其中：
93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链，其中：
[0064] 所述重链氨基酸序列是SEQ ID NO 12：
[0065] AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDIS
KDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRP
KAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEA
GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKL的氨基酸序列；
KDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRP
KAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEA
GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKL的氨基酸序列；
[0066] 所述轻链氨基酸序列是SEQ ID NO 13：
[0067] RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC的氨基酸序列。
[0068] 本申请的一个具体实施方式中，由保藏编号为CGMCC No.45615的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体的方法为本领域常规方法。
[0069] 本申请的一个具体实施方式中，由保藏编号为CGMCC No.45615的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体的方法为小鼠腹水法。
[0070] 本申请还提供了上述单克隆抗体的制备方法，本申请的一个具体实施方式中，将灭菌的液体石蜡腹腔注射6～8周龄的Balb/c小鼠中；本申请的一个具体实施方式中，7日
后，将杂交瘤细胞株2D10‑F‑PPRV注射入小鼠腹腔；本申请的一个具体实施方式中，7日后收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水；本申请的一个具体实施方式中，将小鼠的腹水进行4000rpm离心10min，收集腹水上清，分装，标记，保存，备用。
后，将杂交瘤细胞株2D10‑F‑PPRV注射入小鼠腹腔；本申请的一个具体实施方式中，7日后收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水；本申请的一个具体实施方式中，将小鼠的腹水进行4000rpm离心10min，收集腹水上清，分装，标记，保存，备用。
[0071] 本申请还提供了如上所述的单克隆抗体在小反刍兽疫病毒感染检测中的应用。
[0072] 本申请的一个具体实施方式中，分泌小反刍兽疫病毒（PPRV）单克隆抗体的杂交瘤细胞株是将小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾脏细胞融合得到；本申请的一个具体实施方式中，细胞融合采取PEG细胞融合方法。本申请的一个具体实施方式中，小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与
免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞的比例为1:8；本申请的一个具体实施方式中，进行离心后，弃上清，再加入适量的无血清DMEM培养基重悬；本申请的一个具体实施方式中，1000rpm 25℃离心6min重旋转以清洗细胞，弃上清，轻击管底，使细胞松散均匀；本申请的一个具体实施方式中，分散均匀的细胞置37℃水浴预热1min，再向其中加入0.6mL预热后的PEG1460；本申请的一个具体实施方式中，加入融合剂后在水浴中静置90s，由慢到快加入预热的10 mL
DMEM培养液；本申请的一个具体实施方式中，混匀后37℃培养箱内静置5 min；本申请的一个具体实施方式中，静置后进行500r/min离心10min，再重复洗涤2次；本申请的一个具体实施方式中，加入含15%FBS和HAT的DMEM培养基重悬细胞，以每孔100μL加入到含有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃，5% CO2的恒温培养箱内培养；
免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞的比例为1:8；本申请的一个具体实施方式中，进行离心后，弃上清，再加入适量的无血清DMEM培养基重悬；本申请的一个具体实施方式中，1000rpm 25℃离心6min重旋转以清洗细胞，弃上清，轻击管底，使细胞松散均匀；本申请的一个具体实施方式中，分散均匀的细胞置37℃水浴预热1min，再向其中加入0.6mL预热后的PEG1460；本申请的一个具体实施方式中，加入融合剂后在水浴中静置90s，由慢到快加入预热的10 mL
DMEM培养液；本申请的一个具体实施方式中，混匀后37℃培养箱内静置5 min；本申请的一个具体实施方式中，静置后进行500r/min离心10min，再重复洗涤2次；本申请的一个具体实施方式中，加入含15%FBS和HAT的DMEM培养基重悬细胞，以每孔100μL加入到含有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃，5% CO2的恒温培养箱内培养；
[0073] 本申请的一个具体实施方式中，分泌PPRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株的抗原为重组表达的PPRV Nigeria 75/1株F蛋白。
[0074] 本申请的一个具体实施方式中，优选所述杂交瘤细胞结合的抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0075] 本申请的一个具体实施方式中，重组表达的PPRV Nigeria 75/1株F蛋白的制备方法为在大肠杆菌表达系统表达PPRV Nigeria 75/1株F蛋白，纯化。
[0076] 本申请还提供了一种抗小反刍兽疫病毒抗原检测试剂盒，其包含由上述保藏编号为CGMCC No.45615的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，可以用于检测PPRV。本申请的一个
具体实施方式中，所述试剂盒是体外检测试剂盒。本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒是免疫检测试剂盒，例如ELISA试剂盒或免疫组化试剂盒，其包含前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段。本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒是体内无创诊断试剂盒，其包含前述复合物。本申请的一个具体实施方式中，所述体内无创诊断试剂盒可用于选自以下
的显像方法：放射免疫显像或靶向超声造影。当用于放射免疫显像时，所述复合物为前述
PPRV的中和抗体或其抗原结合片段与放射性核素的复合物。当用于靶向超声造影时，所述
复合物为前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段与超声造影剂的复合物。
具体实施方式中，所述试剂盒是体外检测试剂盒。本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒是免疫检测试剂盒，例如ELISA试剂盒或免疫组化试剂盒，其包含前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段。本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒是体内无创诊断试剂盒，其包含前述复合物。本申请的一个具体实施方式中，所述体内无创诊断试剂盒可用于选自以下
的显像方法：放射免疫显像或靶向超声造影。当用于放射免疫显像时，所述复合物为前述
PPRV的中和抗体或其抗原结合片段与放射性核素的复合物。当用于靶向超声造影时，所述
复合物为前述PPRV的中和抗体或其抗原结合片段与超声造影剂的复合物。
[0077] 本申请实施例中所使用的BL21(DE3)感受态细胞是采用大肠杆菌BL21(DE3)经过特殊工艺处理得到的感受态细胞，可以用于质粒的化学转化
[0078] 本申请实施例中所用Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋
白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记
的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的
蛋白成分。
白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记
的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的
蛋白成分。
[0079] 本申请中所述的“重组表达的PPRV Nigeria 75/1株F蛋白”，以及“重组PPRV‑F蛋白”均指的是表达之后的蛋白，是同一种蛋白。
[0080] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0081] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
[0082] 实施例1 重组F‑His蛋白的制备
[0083] 1. PPRV‑F基因的PCR扩增
[0084] 根据PPRV Nigeria 75/1株基因序列(KY628761 .1) 以及本实验室保存的PPRV Clone9株基因序列，对F蛋白进行亲疏水性、抗原性和功能区的分析。结果发现132AA‑487AA蛋白序列抗原表位相对集中，可作为表达蛋白的备选片段。根据蛋白结构分析，选取上述蛋白区域的核苷酸片段（1071bp）进行密码子优化后合成。并在3’和5’端引入BamHI和XhoI位点，利用同源重组的方法，扩增F基因片段。引物序列如下：
[0085] F:GtggacagcaaatgggtcgCGGATCCGCACTCCATCAGTCATTGATGAAT（SEQ ID No.2）；
[0086] R:CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTAGGTCTTTATGCG（SEQ ID No.3）；以上引物由华大生物工程股份有限公司合成。以F蛋白氨基酸同义优化后的质粒为模板，利用上下游引物，扩增带有载体序列同源臂和酶切位点的目的基因。根据KOD PCR酶的说明书（日本TOYOBO公司）采用50μL反应体系，反应程序如下：94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃
50s，反应30个循环；68℃7min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。根据凝胶回收试剂盒说明回收目的条带。用BamHI和XhoI(NEB)对pET‑28a(+)原核表达载体进行双酶切，按照
Seamless Cloning Mix同源重组酶说明书（Beyotime公司），进行同源重组，放于50℃反应
15min。同源重组产物转化TOP10（全式金生物技术有限公司）感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。挑取单菌落，在含卡那霉素的LB培养基中振荡培养，提取质粒，经PCR和BamHI和XhoI双酶切鉴定。阳性质粒送华大生物工程股份有限公司进行测序。
50s，反应30个循环；68℃7min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。根据凝胶回收试剂盒说明回收目的条带。用BamHI和XhoI(NEB)对pET‑28a(+)原核表达载体进行双酶切，按照
Seamless Cloning Mix同源重组酶说明书（Beyotime公司），进行同源重组，放于50℃反应
15min。同源重组产物转化TOP10（全式金生物技术有限公司）感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。挑取单菌落，在含卡那霉素的LB培养基中振荡培养，提取质粒，经PCR和BamHI和XhoI双酶切鉴定。阳性质粒送华大生物工程股份有限公司进行测序。
[0087] 抗原表位序列如下：
[0088] ALHQSLMNSQAIESLKTSLEKSNQAIEEIRLANKETILAVQGVQDYINNELVPSVHRMSCELVGHKLSLKLLRYYTEILSIFGPSLRDPIAAEISIQALSYALGGDINKILDKLGYSGGDFLAILESKGIKARVTYVDTRDYFI
ILSIAYPTLSEIKGVIVHKIEAISYNIGAQEWYTTIPRYVATQGYLISNFDETSCVFTPEGTVCSQNALYPMSPLL
QECFRGSTKSCARTLVSGTTSNRFILSKGNLIANCASVLCKCYTTETVINQDPDKLLTVIASDKCPVVEVDGVTIQ
VGSREYPDSVYLHEIDLGPAISLEKLDVGTNLGNAVTRLENAKELLDASDQILKTVKGVP（SEQ ID No.1）。
ILSIAYPTLSEIKGVIVHKIEAISYNIGAQEWYTTIPRYVATQGYLISNFDETSCVFTPEGTVCSQNALYPMSPLL
QECFRGSTKSCARTLVSGTTSNRFILSKGNLIANCASVLCKCYTTETVINQDPDKLLTVIASDKCPVVEVDGVTIQ
VGSREYPDSVYLHEIDLGPAISLEKLDVGTNLGNAVTRLENAKELLDASDQILKTVKGVP（SEQ ID No.1）。
[0089] 2. 重组表达菌株BL21(DE3)‑F的构建与蛋白表达
[0090] 经序列测定正确的重组质粒pET28a‑F转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。取过夜培养的菌液接种于新的培
养基中，37℃培养至OD600nm约0.6‑0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG于20℃诱导表达12h，离心后超声裂解细菌，沉淀与上清分别进行SDS‑PAGE鉴定。蛋白纯化方法参照GE公司Ni‑NTA Agarose操作说明进行。表达上清经镍柱进行亲和层析纯化后进行SDS‑PAGE电泳，在39kDa左右有明显的目的蛋白表达条带(图1A)。
养基中，37℃培养至OD600nm约0.6‑0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG于20℃诱导表达12h，离心后超声裂解细菌，沉淀与上清分别进行SDS‑PAGE鉴定。蛋白纯化方法参照GE公司Ni‑NTA Agarose操作说明进行。表达上清经镍柱进行亲和层析纯化后进行SDS‑PAGE电泳，在39kDa左右有明显的目的蛋白表达条带(图1A)。
[0091] 3. 重组蛋白的Western blot鉴定
[0092] SDS‑PAGE结束后，采用湿转法将重组蛋白转印至PVDF膜(Millipore)上，用含2%的脱脂乳的PBST封闭2h；加入1:10000稀释的His‑Tag Mouse mAb单克隆抗体（proteintech），室温孵育2h；PBST洗涤3次；加入1:10000稀释的山羊抗鼠IgG‑HRP（北京全式金生物技术有限公司），室温轻摇1h；PBST洗涤3次，TMB显色试剂盒（SeraCare）显色。结果表明，在39kDa可检测到特异条带，证明重组蛋白成功表达及纯化(图1B)。经BCA法测定蛋白浓度为0.81mg/mL，‑80℃保存备用。
[0093] 实施例2 抗小反刍兽疫病毒F蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选
[0094] 1.免疫Balb/c小鼠：将纯化的重组F‑His蛋白皮下多点注射免疫6‑8周龄雌性BALB/c小鼠(北京维通利华公司) ，一共免疫3次，每次免疫间隔3周，首免使用50μg纯化的重组F‑His蛋白与等体积完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)免疫，后两次均使用100μg纯化的重组F‑His蛋白与等体积不完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)混合免疫；第三次免疫后10‑14天采血，检测小鼠的免疫血清效价，选取ELISA抗体效价>106的小鼠，细胞融合前3天加强免疫一次，采用100μg纯化的重组F‑His蛋白腹腔注射。
[0095] 2.细胞融合：细胞融合采取PEG细胞融合方法。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞按1:8的比例(细胞数量比)充分混匀，1000rpm 25℃离心6min，弃上清，再加入适量的无血清DMEM培养基重悬，1000rpm 25℃离心6min以清洗细胞，弃上清，轻击管底，使细胞松散均匀，置37℃水浴预热1min，再向其中加入0.6mL提前在37℃水浴中预热的PEG1460，加入融合剂后在水浴中静置90s，由慢到快加入预热的10 mL DMEM培养液，混匀后37℃培养箱内静置5 min，500r/min离心10min，再重复洗涤2次。加入含15%FBS和HAT的DMEM培养基重悬细胞，以每孔100μL加入到含有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，置于37
℃，5% CO2的恒温培养箱内培养。期间观察孔中细胞情况，当细胞集落长至细胞孔1/2时，取细胞培养上清进行抗体检测。
℃，5% CO2的恒温培养箱内培养。期间观察孔中细胞情况，当细胞集落长至细胞孔1/2时，取细胞培养上清进行抗体检测。
[0096] 3.杂交瘤细胞的筛选：以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液为包被液，以2μg/μL倍稀释的纯化F蛋白为包被抗原包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。PBST洗涤3次，拍干；将融合细胞上清，1:1000(v/v)稀释的Balb/c免疫小鼠阳性血清以及1:1000(v/v)稀释的小鼠阴性血清加入相应的孔内，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次，拍干；加入1:5000(v/v)稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自北京全式金生物技术有限公司) ，100μL/孔，
37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入底物TMB（SeraCare），100μL/孔，室温避光显色10min；
每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。酶标仪测定酶标板OD450nm值，P为各检测孔的OD450nm值，N为阴性血清的OD450nm值，当阴性血清OD450nm值≤0 .1且阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm的比值≥2 .1，即阴、阳性对照均成立的前提下，以P/N≥2 .1判定为阳性孔的判定标准判定检测孔的阴阳性。隔2d后再检测一次，选择两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株
进行亚克隆。
37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入底物TMB（SeraCare），100μL/孔，室温避光显色10min；
每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。酶标仪测定酶标板OD450nm值，P为各检测孔的OD450nm值，N为阴性血清的OD450nm值，当阴性血清OD450nm值≤0 .1且阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm的比值≥2 .1，即阴、阳性对照均成立的前提下，以P/N≥2 .1判定为阳性孔的判定标准判定检测孔的阴阳性。隔2d后再检测一次，选择两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株
进行亚克隆。
[0097] 4.杂交瘤细胞的克隆化：将筛选出的阳性孔细胞株用台盼蓝染色，计数，用含15％FBS的DMEM培养基稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释后的细胞悬液加入提前铺有饲养细胞的96孔板，每孔100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养，期间观察细胞株，待生长至96孔板孔底面积1/2时，按照之前建立的间接ELISA方法及时进行ELISA检测。记录单克隆细胞的阳性孔，并进行同样的亚克隆3次以上，直至克隆后所有的克隆细胞株上清检测均为阳性且各孔检测的OD450nm值较接近。将克隆化的PPRV F特异单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，冻存，并将其命名为杂交瘤细胞株2D10‑F‑PPRV。
[0098] 实施例3 单克隆抗体的制备与纯化
[0099] 采用腹水制备法：将灭菌的液体石蜡腹腔注射6～8周龄的Balb/c小鼠(购北京维通利华公司) ，0.5mL/只，7天后，将杂交瘤细胞株2D10‑F‑PPRV注射入小鼠腹腔，每只
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0.5mL(10 个杂交瘤细胞) 。7天后收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水，4000rpm离心10min，收集腹水上清，分装，标记并保存至‑80℃备用。
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0.5mL(10 个杂交瘤细胞) 。7天后收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水，4000rpm离心10min，收集腹水上清，分装，标记并保存至‑80℃备用。
[0100] 采用饱和硫酸铵处理粗提IgG：将腹水加入100mL带有转子的烧杯中，按与腹水体积相同的量加入PBS，将烧杯置于冰上，放在磁力搅拌器上；逐滴慢速加入2倍腹水样品体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，4℃环境下搅拌4h以上；10000g离心10min，弃去上清，使用与腹水等体积的PBS重悬沉淀，将重悬起来的液体装入透析袋中并将透析袋两端密封好；采用PBS对IgG样品4℃透析约12h以上，期间至少更换2次 PBS，以除去样品中残留的硫酸铵。
[0101] 粗提IgG的进一步纯化：将透析后的粗提IgG样品10000g离心10min，收集上清，使用Protein G Resin进行纯化。用PBS洗涤Protein G Resin层析柱直至流出液的OD280nm小
于0.01。将样品加入柱子中，控制流速为5s/滴，预先准备好空管回收样品的流出液，将一次结合后的流出液重复加到ProteinG层析柱中，重复加入3次，最后一次流出液留存于4℃；使用PBS洗脱杂蛋白，流速为5s/滴，至流出液OD280 nm小于0.01。取定量的甘氨酸(如10 ml)，加入Tris‑HCI的体积，使得二者中和后混合液的PH在7 8 之间。使用甘氨酸溶液洗脱目的~
蛋白，用灭菌后的离心管收取洗脱下来的目的蛋白，收集的样品立即用预先测定好中和体
积比加入Tris‑HCI中和，使PH为7 8，流出液OD280 nm<0.1时停止收样；用PBS对收集样品4~
℃透析约12h以上，期间至少更换2次PBS，最后收集纯化的目的抗体，保存于‑20℃。
于0.01。将样品加入柱子中，控制流速为5s/滴，预先准备好空管回收样品的流出液，将一次结合后的流出液重复加到ProteinG层析柱中，重复加入3次，最后一次流出液留存于4℃；使用PBS洗脱杂蛋白，流速为5s/滴，至流出液OD280 nm小于0.01。取定量的甘氨酸(如10 ml)，加入Tris‑HCI的体积，使得二者中和后混合液的PH在7 8 之间。使用甘氨酸溶液洗脱目的~
蛋白，用灭菌后的离心管收取洗脱下来的目的蛋白，收集的样品立即用预先测定好中和体
积比加入Tris‑HCI中和，使PH为7 8，流出液OD280 nm<0.1时停止收样；用PBS对收集样品4~
℃透析约12h以上，期间至少更换2次PBS，最后收集纯化的目的抗体，保存于‑20℃。
[0102] 实施例4 抗体特性分析
[0103] 1.单抗效价检测
[0104] 用间接ELISA方法分别检测实施例3所得的杂交瘤细胞培养上清效价和腹水效价，结果见表1，诱导小鼠产生的腹水效价为1:32000，杂交瘤细胞培养细胞上清效价为1:320。
[0105] 表1单克隆抗体效价检测
[0106] 。
[0107] 2.间接免疫荧光实验(IFA)
[0108] 将PPRV Nigeria75/1株感染的Vero细胞及正常细胞分别培养4天后，弃上清，经PBS洗涤3次后，用4%的多聚甲醛（100μL/孔）固定细胞6‑8min，PBS洗涤3次；100μL/孔2% BSA封闭细胞，室温封闭2h，弃封闭液，PBS洗涤3次；每孔加入杂交瘤细胞上清100μL，同时以SP2/0细胞上清和免疫前小鼠血清，免疫后小鼠血清作为阴性、阳性对照，37℃反应1h；经PBS洗涤3次，用FITC标记的羊抗鼠IgG(1:200，Sigma公司)于37℃反应1h；经PBS洗涤3次后拍干，于荧光显微镜下观察。
[0109] 间接免疫荧光实验表明，SP2/0细胞上清和免疫前小鼠血清与PPRV Nigeria75/1株感染的Vero细胞及正常细胞反应均无特异性荧光，重组PPRV‑F蛋白免疫后小鼠血清与
PPRV Nigeria75/1株感染的Vero细胞反应产生特异性荧光，说明阴性、阳性对照均成立。单克隆抗体2D10‑F‑PPRV与感染小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的Vero细胞发生反应，可观察到明显的特异性荧光反应，而不与正常Vero细胞发生反应，结果见图2，其中A：感染小反刍兽疫病毒的Vero细胞；B：正常Vero细胞。
PPRV Nigeria75/1株感染的Vero细胞反应产生特异性荧光，说明阴性、阳性对照均成立。单克隆抗体2D10‑F‑PPRV与感染小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的Vero细胞发生反应，可观察到明显的特异性荧光反应，而不与正常Vero细胞发生反应，结果见图2，其中A：感染小反刍兽疫病毒的Vero细胞；B：正常Vero细胞。
[0110] 3.特异性实验
[0111] 用间接免疫荧光实验分别对本实验室保存的羊疱疹病毒Ⅰ型(CHpV‑1)、牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型(BVDV‑1)、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型(BVDV‑2)进行特异性试验，结果表明该单克隆抗体2D10‑F‑PPRV与PPRV反应呈阳性，而不与其它病毒发生反应，说明该方法具有很好的特异性。详细结果见表2。
[0112] 表2特异性实验检测结果
[0113] 。
[0114] 4.免疫印迹法检测
[0115] 将PPRV Nigeria75/1株感染的Vero细胞及正常细胞分别培养4天后，弃上清，经PBS洗涤3次后，用100μL/孔裂解液(碧云天生物科技有限公司)裂解细胞，然后加入蛋白电泳上样缓冲液，煮沸5min，制备电泳用蛋白样品。SDS‑PAGE结束后，采用湿转法分别将蛋白转印至PVDF膜(Millipore)上，用含2%的脱脂乳的PBST封闭2h；分别加入1:2000稀释的
2D10‑F‑PPRV单克隆抗体，室温孵育2h；PBST洗涤3次；加入1:10000稀释的山羊抗鼠IgG‑HRP（北京全式金生物技术有限公司），室温轻摇1h；PBST洗涤3次，TMB显色试剂盒（SeraCare）显色。
2D10‑F‑PPRV单克隆抗体，室温孵育2h；PBST洗涤3次；加入1:10000稀释的山羊抗鼠IgG‑HRP（北京全式金生物技术有限公司），室温轻摇1h；PBST洗涤3次，TMB显色试剂盒（SeraCare）显色。
[0116] 检测结果显示，2D10‑F‑PPRV单抗孵育后，感染PPRV的Vero细胞样品在48‑63kDa处出现明显的条带（预测大小为58kDa），但正常Vero细胞样品无条带(图3)。说明该单抗可用于实验室Western blot检测。
[0117] 5.中和活性检测
[0118] 利用固定病毒（PPRV Nigeria75/1的工作浓度为100TCID50 /0.1ml）与稀释腹水的方法进行中和试验，鉴定单抗的中和活性。将2D10‑F‑PPRV腹水作1:20、1:40、1:80、1:160稀释，利用Reed‑Muench法计算其中和效价。
[0119] 结果显示，2D10‑F‑PPRV株单抗腹水效价为1:50.1，表明2D10‑F‑PPRV单抗具有中和PPRV的活性。详细结果见表3。
[0120] 表3中和活性检测结果
[0121] 。
[0122] 综上，间接免疫荧光检测和中和试验结果表明，本申请中的单克隆抗体能与感染PPRV Nigeria 75/1株的Vero细胞发生特异性的荧光反应，而不与正常Vero细胞发生反应，说明本申请获得的单克隆抗体能与PPRV发生特异性反应，并具有中和活性，中和效价为1:
50.1。进一步地发现，本申请中获得的单克隆抗体不与羊疱疹病毒、牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型发生反应，说明本申请中的单克隆抗体具有良好的特异性。
50.1。进一步地发现，本申请中获得的单克隆抗体不与羊疱疹病毒、牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型发生反应，说明本申请中的单克隆抗体具有良好的特异性。
[0123] 本申请提供了一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本申请的优
选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。