一株罗伊氏粘液乳杆菌KA1及其在制备抗炎抗肿瘤药品中的应用

摘要

本发明属于益生菌及其应用技术领域，具体涉及一株罗伊氏粘液乳杆菌KA1及其在制备抗炎抗肿瘤药品中的应用。为进一步开发利用罗伊氏粘液乳杆菌的益生功能，本发明从一名健康成年人的粪便中分离出一株罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1，KA1菌株具有的多种益生功效，包括具有优越的蛋白酶活性，可产生和分泌γ‑氨基丁酸，可产生和分泌透明质酸，可抑制α‑葡萄糖苷酶活性，可产生和分泌罗伊氏菌素。因此，罗伊氏粘液乳杆菌菌株KA1具有促进对蛋白食物的消化吸收而改善蛋白过敏、抗抑郁和解酒；抗炎、抗衰和抗皱、降糖、抗肿瘤等益生功能，具有重要的应用价值和经济价值。

权利要求

1.一株罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株，其特征在于，所述罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株于2022年09月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 20221493；所述罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。

2.权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在产降解牛奶蛋白的蛋白酶中的应用。

3.权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在产γ‑氨基丁酸中的应用。

4.权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在产透明质酸中的应用。

5.权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

6.权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在产罗伊氏菌素中的应用。

7.一种用于具有益生功能的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株。

8.根据权利要求7所述的一种用于具有益生功能的菌剂，其特征在于，所述菌剂为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株发酵后的菌体混合物。

说明书

一株罗伊氏粘液乳杆菌KA1及其在制备抗炎抗肿瘤药品中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于益生菌及其应用技术领域，具体涉及一株罗伊氏粘液乳杆菌KA1及其在制备抗炎抗肿瘤药品中的应用。

背景技术

[0002] 罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，又名罗伊氏乳杆菌，属于乳酸菌的一种，最早于1962年被首次分离出来，是一种革兰氏阳性、非运动性、不产芽孢、过氧化氢酶阴性、专性异型发酵的兼性厌氧细菌。罗伊氏粘液乳杆菌主要定殖于人类和其他脊椎动物及哺乳动物的胃肠道中，能抗菌、抗炎、调节免疫，进而发挥重塑肠菌结构，增强肠道屏障，调节免疫的作用，还具有一定的抗肥胖、抗腹泻作用。

[0003] 罗伊氏粘液乳杆菌是可作为人类保健品的微生物菌种，是国际公认的新型益生乳酸菌，具有很高的理论研究和生产应用价值。罗伊氏粘液乳杆菌是人体正常菌群的一部分，作为肠道正常微生物体系的重要组成并终生伴随宿主，对于维持肠道微生态平衡有重要意义。罗伊氏粘液乳杆菌作为肠道菌群中的益生菌，也是一种可食用型的乳酸菌，是一种具有极大潜力的益生性乳杆菌，已成为近些年研究的热点，并且作为益生菌正在不断被用来制作成适用于人和动物的益生菌制剂。

[0004] 目前，罗伊氏粘液乳杆菌的不同菌株已被报道具有不同的益生功能：(1)抗菌：人和家禽来源的大部分罗伊氏乳杆菌能够产生罗伊氏菌素(reuterin)，罗伊氏粘液乳杆菌产生和分泌的罗伊氏菌素抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及酵母菌、真菌和原生动物的生长。同时，罗伊氏粘液乳杆菌还能合成乳酸、乙酸、乙醇等成分，已被证明对幽门螺杆菌、大肠杆菌、艰难梭菌和沙门氏菌等引起的胃肠道细菌感染有效。此外，罗伊氏粘液乳杆菌可抑制念珠菌等真菌的生长，罗伊氏粘液乳杆菌也可代谢苯丙氨酸产生苯乳酸，进而抑制真菌和霉菌生长。可见，罗伊氏粘液乳杆菌可通过抗菌物质的产生抑制有害菌的生长，进而发挥调节菌群结构的作用。(2)抗炎：罗伊氏粘液乳杆菌可以产生组胺，进而抑制受刺激的人单核细胞产生肿瘤坏死因子(TNF)；也可减少其他促炎细胞因子的产生并促进IL‑10的产生，发挥抗炎作用，进而改善炎症。(3)调节免疫：罗伊氏粘液乳杆菌的代谢物及其菌体成分可促进树突细胞成熟，也可产生过氧化氢刺激宿主免疫系统。(4)抗肥胖：罗伊氏粘液乳杆菌JBD30l可显著吸收肠道游离脂肪酸，进而减少游离脂肪酸在肠道中的积累，显著降低超重成年人的体重；罗伊氏粘液乳杆菌J1可通过调节肠道菌群，调节胆汁酸代谢，抑制脂肪生成，促进脂肪分解，进而改善饮食诱导的肥胖。(5)缓解肝病：罗伊氏粘液乳杆菌MJM60668可通过抑制脂肪合成，促进脂肪分解代谢，减轻肝中脂肪积累和抑制炎症，进而缓解高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝病；同时，该菌也可增加肠道中潜在益生菌(如乳杆菌属、阿克曼菌属细菌)的相对丰度，进而发挥调节肠道屏障的功能。此外，罗伊氏乳杆菌DSM17938能够通过改善脂肪变性和炎性细胞浸润，缓解肝功能受损和改善脂肪酸代谢来逆转酒精性脂肪肝(ALD)的进展。(6)调节神经发育：孕妇高脂饮食(MHFD)会影响后代神经发育，增加后代罹患自闭症谱系障碍(ASD)等神经发育疾病的风险，而罗伊氏粘液乳杆菌能够通过提高催产素水平，改善其社交行为和突触功能障碍，并且能够缓解不同ASD的症状。也有研究证明罗伊氏粘液乳杆菌能够上调GABA受体基因的表达，提高其在多个大脑区域的蛋白质水平，进而缓解ASD的相关行为。(7)抗肿瘤：罗伊氏粘液乳杆菌PTCC 1655可通过抑制参与细胞外基质降解的通路来抑制胃癌的进展，也可通过改变细胞氧化还原平衡及促凋亡作用来抑制结肠癌的发展。同时，罗伊氏粘液乳杆菌FLRE5K1可诱导TNF‑a及INF‑γ等抗癌细胞因子的产生，进而抑制黑色素瘤细胞的迁移和定植，实现预防黑色素瘤的作用。

[0005] 罗伊氏粘液乳杆菌来源的多样性导致其具有基因的多样性和功能的多样性。然而，目前针对罗伊氏粘液乳杆菌的分离鉴定、益生特性和代谢机制的研究依然较少，这在一定程度上也影响了对罗伊氏粘液乳杆菌的开发利用。因此，有必要根据罗伊氏粘液乳杆菌的不同来源使其更好地发挥作用，如根据菌株的功能或者益生代谢产物确定其功效，明确其应用前景。综上所述，益生性罗伊氏粘液乳杆菌的研究及应用具有较为广阔的发展空间。

发明内容

[0006] 为了克服上述现有技术的不足，本发明从一名健康成年人的粪便中分离出一株罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1，菌株KA1具有的多种益生功效，包括产蛋白酶，产γ‑氨基丁酸，产透明质酸等，具有重要的潜在应用价值。

[0007] 为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

[0008] 本发明第一方面提供了一株罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株，所述罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株于2022年09月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 20221493；所述罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。

[0009] 本 发 明 第 二 方面 提 供 了 第 一 方 面 所述 的 罗 伊 氏 粘 液 乳 杆 菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在产蛋白酶中的应用。

[0010] 经研究发现，益生菌罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可产蛋白酶，提示罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株有望用于生产蛋白酶，并通过产蛋白酶的这一特性用于促进人体对食物中蛋白质的消化吸收，提高对小肽和氨基酸的吸收，抗过敏等领域。

[0011] 本 发 明 第 三 方面 提 供 了 第 一 方 面 所述 的 罗 伊 氏 粘 液 乳 杆 菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在产γ‑氨基丁酸中的应用。

[0012] 经研究发现，益生菌罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可产γ‑氨基丁酸(GABA)，提示罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株有望用于生产GABA，并通过产GABA的这一特性用于改善机体睡眠质量、抗抑郁、抗焦虑、降血压、改善脂质代谢、增强记忆能力、提高脑活力等领域。

[0013] 本 发 明 第 四 方面 提 供 了 第 一 方 面 所述 的 罗 伊 氏 粘 液 乳 杆 菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在产透明质酸中的应用。

[0014] 经研究发现，益生菌罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可产透明质酸(HA)，提示罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株有望用于生产HA，并通过产HA的这一特性用于抗炎、抗血管生成、抗衰老、促进伤口消炎及愈合等领域。

[0015] 本 发 明 第 五 方面 提 供 了 第 一 方 面 所述 的 罗 伊 氏 粘 液 乳 杆 菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

[0016] 经研究发现，益生菌罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可有效抑制α‑葡萄糖苷酶活性，而α‑葡萄糖苷酶与2型糖尿病有关，抑制α‑葡萄糖苷酶是控制餐后高血糖的方法之一，提示罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株有望用于降血糖和抑制肥胖等领域。

[0017] 本 发 明 第 六 方面 提 供 了 第 一 方 面 所述 的 罗 伊 氏 粘 液 乳 杆 菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株在产罗伊氏菌素中的应用。

[0018] 经研究发现，益生菌罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可产罗伊氏菌素，罗伊氏菌是一种广谱抗菌物质，也是抗肿瘤的效应分子，提示罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株有望用于生产罗伊氏菌素，并通过产罗伊氏菌素的这一特性用于抑菌、抗肿瘤等领域。

[0019] 本发明第七方面提供了一种用于具有益生功能的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括第一方面所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株。

[0020] 优选地，所述罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株为经发酵后的菌体混合物。发酵所用的培养基为MRS培养基。

[0021] 优选地，在医药应用领域，所述菌剂还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

[0022] 更优选地，上述赋形剂是指可用于药学领域的稀释剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂等以及一些药用基质。上述载体是药物领域中可得到的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(PLGA)、透明质酸等。

[0023] 优选地，在医药应用领域，所述菌剂的剂型包括注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂、缓释剂、口服液制剂。

[0024] 更优选地，上述剂型是指临床上常用的剂型。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。

[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0026] 本发明从一名健康成年人的粪便中分离出一株罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1，新分离出的罗伊氏粘液乳杆菌菌株KA1具有的多种益生功效，包括具有优越的蛋白酶活性，产生和分泌γ‑氨基丁酸，产生和分泌透明质酸，抑制α‑葡萄糖苷酶活性，产生和分泌罗伊氏菌素(抗肿瘤的效应分子)。因此，罗伊氏粘液乳杆菌菌株KA1具有促进对蛋白食物的消化吸收，改善蛋白过敏；抗抑郁和解酒；抗炎、抗衰和抗皱；降糖；抗肿瘤等益生功能。可见，本发明新分离得到的罗伊氏粘液乳杆菌菌株KA1菌株具有多种益生功效，可用于抗抑郁、降糖和抗肿瘤等领域，比如，制备成抗炎抗肿瘤药品，具有重要的应用价值和经济价值。

附图说明

[0027] 图1为罗伊氏粘液乳杆菌KA1与其他同源乳酸菌的系统发育树；

[0028] 图2为罗伊氏粘液乳杆菌KA1对牛奶平板的降解实验(左边，空白对照组；右边，实验组)；

[0029] 图3为罗伊氏粘液乳杆菌KA1可以产生和分泌γ‑氨基丁酸；

[0030] 图4为罗伊氏粘液乳杆菌KA1可以产生和分泌透明质酸；

[0031] 图5为罗伊氏粘液乳杆菌KA1发酵液可分泌物质显著抑制α‑葡萄糖苷酶活性；

[0032] 图6为罗伊氏粘液乳杆菌KA1可产生和分泌罗伊氏菌素。

具体实施方式

[0033] 下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0034] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

[0035] 下列实施例涉及的实验材料如下：

[0036] (1)菌株：罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1菌株，由中山大学生命科学学院肠道微生物组研究润泽实验室分离自中国广东一名健康的成年人的粪便中，保存于甘油管内‑80℃低温冷冻保藏。一般情况下，将其接种于MRS固体培养基平板表面并在37℃恒温厌氧培养箱中倒置培养24h可获得菌落，或在37℃恒温厌氧培养箱内于MRS液体培养基中振荡培养24‑48h可获得发酵液。

[0037] (2)试剂盒：γ ‑氨基丁酸(GABA)检测试剂盒(Cloud‑Clone Corp.,Cat:CEA900Ge)，透明质酸(又名玻尿酸，HA)检测试剂盒(Cloud‑Clone Corp.,Cat:CEA182Ge)，α‑葡萄糖苷酶抑制剂筛选试剂盒(abcam,Cat:ab284520)。

[0038] (3)MRS平板：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，ddH2O补齐至1L，调pH至6.2‑6.6，121℃高压灭菌20min，配置成MRS平板。

[0039] (4)MRS液体培养基：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，ddH2O补齐至1L，调pH至6.2‑6.6，121℃高压灭菌20min，配置成MRS液体培养基。

[0040] (5)MP平板：脱脂奶粉10g，氯化钠1g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，吐温80 0.5mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，ddH2O补齐至1L，调pH至6.2‑6.6，121℃高压灭菌20min，配置成MP平板。

[0041] 实施例1罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1的分离鉴定[0042] 罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri KA1从中国广东省广州市海珠区一名健康成年人(男性，34岁，BMI＝24.4)的粪便中分离得到，具体如下：

[0043] 用无菌水将粪便样品反复清洗3次，置于研钵中，每100mg粪便加入500uL无菌水，彻底研磨成匀浆，然后用移液器吸取适量研磨液，涂布于MRS平板上，室温培养3天。用记号笔将分离实验平板中待划线纯化的菌落编号，并相应地在平板上标明菌株编号。挑取菌落接种到MRS平板上，用平板划线法纯化菌株。若此法不能将菌株分离则需要从富集平板上挑取菌落，经MRS液体培养基梯度稀释后，涂布于MRS平板上。参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)和《真菌分类鉴定手册》，首先分辨属于细菌的菌株。初步分离得到一株纯化菌株，菌株编号为KA1，培养24小时后观察该菌的菌落为不规则型、圆形、凸起、光滑、边缘整齐。

[0044] 接着，通过16S rDNA通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT)进行分子鉴定后，由北京百迈客生物科技有限公司对分离得到的L.reuteri KA1菌株进行全基因组测序。将得到的序列16S rDNA sequence(SEQ ID No：
1)在NCBI的Genome数据库进行BLAST比对。结果表明，KA1菌株与已知的罗伊氏粘液乳杆菌
16S rDNA序列的同源性>99％；并与同源菌株进行进化分析(图1)，确认菌株KA1是同种不同株的罗伊氏粘液乳杆菌。

[0045] 最后，对菌株KA1进行保藏，保藏信息如下：保藏时间：2022年09月27日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏号：CCTCC NO:M 20221493；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；分类命名：Limosilactobacillus reuteri。

[0046] 罗伊氏粘液乳杆菌是国家批准可用于食品的益生菌菌株，具有广泛的益生功效，如抗菌、抗炎、抗肿瘤等，但不同来源的菌株其功效不同，说明本发明从人体粪便中分离得到的新罗伊氏粘液乳杆菌KA1可以作为益生菌使用，并可能具有新的功效和功能。

[0047] L.reuteri KA1 16S rDNA sequence(1445bp，SEQ ID No：1)：

[0048] TGCAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCTTTATGGAGGAGCCGCCTA。

[0049] 实施例2罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)KA1的功能及其应用[0050] (1)罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可产降解牛奶蛋白的蛋白酶

[0051] 罗伊氏粘液乳杆菌KA1分泌蛋白酶水解蛋白能力的鉴定和测量是根据琼脂孔扩散试验进行的，使用的培养基为脱脂牛奶平板培养基(MP平板)。试验时，往实验组滴加3uL浓度为10Abs的罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌液，对照组滴加3uL空白MRS培养基。在37℃恒温厌氧培养箱中倒置培养3天。结果表明，与滴加空白培养基的对照相比，KA1可以显著的降解蛋白，并形成明显的降解圈(图2)，说明罗伊氏粘液乳杆菌KA1可产蛋白酶。

[0052] 可见，罗伊氏粘液乳杆菌KA1作为益生菌菌株使用可以促进人体对食物中蛋白质的消化吸收，提高对小肽和氨基酸的吸收。同时，也可用于抗过敏(改善蛋白消化不良或不吸收导致的食物过敏)。此外，也可以用于蛋白酶的提取，应用于食品工业或洗涤工业等蛋白酶领域的生产；也可用于微生物饲料中以帮助动物消化吸收营养，提高对饲料的利用率。

[0053] (2)罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可产生γ‑氨基丁酸(GABA)

[0054] 将用MRS液体培养基培养至稳定期的罗伊氏粘液乳杆菌KA1以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取培养的菌体，所得菌体用buffer PBS(称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.2，最后加蒸馏水定容至1L，即得PBS缓冲液)裂解制成菌体裂解液后，通过GABA特定ELISA试剂盒(CEA900Ge)测定培养后菌体中的GABA浓度。结果显示，与裂解菌体所用的buffer PBS相比，KA1的菌体裂解液中GABA的浓度显著性增加，可积累量为32.24pg/mL，说明罗伊氏粘液乳杆菌KA1可以在稳定期产生γ‑氨基丁酸(图3)。

[0055] γ‑氨基丁酸是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，广泛存在于动植物、微生物体内。现已证实，作为小分子量非蛋白质氨基酸的GABA具备食用安全性，可作为食品添加剂。研究表明，摄入一定量的GABA具有改善机体睡眠质量、抗抑郁、抗焦虑、降血压、改善脂质代谢、增强记忆能力并提高脑活力、加快大脑新陈代谢、健肝利肾、促进乙醇代谢(解酒)、改善更年期综合症等生理功效。

[0056] 因此，益生菌罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可通过产生γ‑氨基丁酸的功效发挥以上多个用途。

[0057] (3)罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可产生和分泌透明质酸(HA)

[0058] 将用MRS液体培养基培养至稳定期的罗伊氏粘液乳杆菌KA1以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，通过透明质酸(又名玻尿酸，HA)特定ELISA试剂盒(CEA182Ge)测定发酵液上清的HA浓度。结果显示，与空白培养基MRS的中低浓度HA相比，KA1的发酵上清液中HA的浓度显著性增加，可积累量为6.534ng/mL，说明罗伊氏粘液乳杆菌KA1可以在稳定期产生并分泌透明质酸(图4)。

[0059] 透明质酸是一种可生物降解、生物相容性、无毒、无致敏性的聚合物，具有多种生物学功能。既具有抗炎和抗血管生成作用，又具有较强的抗衰老、水润、抚平皱纹的能力。由于其有助于皮肤抗皱，促进伤口消炎及愈合，可用于抗皱剂，具有开发皮肤化妆品的潜力。此外，由于HA具有很高的润滑、吸水和保水能力，可以影响多种细胞功能，如迁移、粘附和增殖，使得HA也被广泛应用于眼科手术，关节炎治疗，伤口愈合支架，组织工程，以及植入材料等生物医学领域。

[0060] 因此，益生菌罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可通过产生透明质酸的功效发挥以上多个用途。

[0061] (4)罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株发酵液可有效抑制α‑葡萄糖苷酶活性[0062] 将用MRS液体培养基培养至稳定期的罗伊氏粘液乳杆菌KA1以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，通过α‑葡萄糖苷酶抑制剂筛选试剂盒(ab284520)测定发酵液上清对α‑葡萄糖苷酶水解葡萄糖的酶活性能力的影响。结果显示，与空白培养基MRS的无抑制作用相比，KA1的发酵上清液显著抑制了α‑葡萄糖苷酶水解葡萄糖的能力，其抑制率约为18.63％，说明罗伊氏粘液乳杆菌KA1的发酵液可以有效的抑制α‑葡萄糖苷酶的活性(图5)。

[0063] α‑葡萄糖苷酶是一种在碳水化合物分解中起作用的酶，与2型糖尿病有关，抑制α‑葡萄糖苷酶是控制餐后高血糖的方法之一，从而有助于糖尿病的治疗。因此，α‑葡萄糖苷酶抑制剂有助于维持血糖水平，能够改善糖尿病并发症。此外，抑制α‑葡萄糖苷酶的活性可以控制肥胖。

[0064] 因此，益生菌罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株具有抑制α‑葡萄糖苷酶活性，这使它成为潜在的降血糖和抑制肥胖的益生菌。

[0065] (5)罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可产生和分泌罗伊氏菌素

[0066] 将用MRS液体培养基培养至稳定期的罗伊氏粘液乳杆菌KA1以1:30的稀释倍数扩培至添加了甘油的MRS培养基(v:v＝1:10)中，培养24h后收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min收取发酵液上清。然后，通过丙烯醛在浓盐酸的作用下与色氨酸进行缩合反应生成紫色化合物，来测定上清液中的罗伊氏菌素的含量。取1mL发酵液，加入0.75mL的10mM色氨酸溶于0.05M HCL中，再加入3mL 37％的浓盐酸，37℃孵育20min，在OD560处测定罗伊氏菌素的产量。

[0067] 结果显示，与空白培养基MRS相比，利用甘油作为前体物质，KA1菌株的发酵上清液中测得罗伊氏菌素的浓度约为46.5ug/mL，说明罗伊氏粘液乳杆菌KA1可以产生和分泌罗伊氏菌素(图6)。

[0068] 罗伊氏菌素(Reuterin)是一种广谱抗菌物质，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长。同时，罗伊氏菌素可以改变肠道氧化还原平衡，并减少结直肠癌细胞的增殖和存活，诱导选择性蛋白质氧化并抑制核糖体生物合成和蛋白质翻译。此外，罗伊氏菌素可有效抑制结直肠癌细胞生长，是可以分泌抗肿瘤的效应分子。

[0069] 因此，益生菌罗伊氏粘液乳杆菌KA1菌株可以产生和分泌罗伊氏菌素，这使它成为潜在的可以抗肿瘤的益生菌。

[0070] 综上可知，本发明新分离的罗伊氏粘液乳杆菌菌株KA1具有的多种益生功效：(1)具有优越的蛋白酶活性；(2)可产生和分泌γ‑氨基丁酸；(3)可产生和分泌透明质酸；(4)可抑制α‑葡萄糖苷酶活性；(5)可产生和分泌罗伊氏菌素(抗肿瘤的效应分子)。可见，本发明新分离得到的罗伊氏粘液乳杆菌菌株KA1具有重要的应用价值和经济价值。

[0071] 以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。