双带缟和纹缟虾虎鱼物种特异性标记、特异性引物、应用和鉴定的方法及试剂盒转让专利
申请号 : CN202311733365.0
文献号 : CN117418023B
文献日 : 2024-03-01
发明人 : 肖永双 , 陈少华 , 韦杰鸿 , 肖志忠 , 李军 , 刘静 , 马道远
申请人 : 中国科学院海洋研究所
摘要 :
本发明涉及分子生物学技术对物种种质鉴定的定性检测方法，具体说是一种双带缟和纹缟虾虎鱼物种特异性标记、特异性引物、应用和在物种识别中快速鉴定的方法及试剂盒。双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼线粒体基因组的特异性标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1（Xtbi ID Nm:1）和SEQ ID NO:2（Ytti ID Nm:1）所示碱基。该方法利用一对引物在双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼个体中扩增出497bp和644bp两个相差147bp的DNA片段，在双带缟虾虎鱼个体中仅扩增出497bp的单一DNA片段，在纹缟虾虎鱼个体中仅扩增出644bp的单一DNA片段，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了双带缟和纹缟虾虎鱼物种准确鉴定的时间，提升了物种识别检测效率。
权利要求 :
1.一种双带缟和纹缟虾虎鱼近缘种种间特异性标记，其特征在于：双带缟和纹缟虾虎鱼特异性标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼种间特异性标记，其特征在于：所述SEQ ID NO:1所示核苷酸为双带缟虾虎鱼物种特有标记片段，所述SEQ ID NO:2所示核苷酸为特异性标记SEQ ID NO:1所示核苷酸序列第100位点、110位点、135位点和143位点之间插入序列片段，即为纹缟虾虎鱼线粒体基因组特有的DNA标记。
3.一种权利要求1所述双带缟和纹缟虾虎鱼近缘种种间特异性标记的应用，其特征在于：所述特异性标记在鉴定双带缟和纹缟虾虎鱼物种中的应用。
4.一种鉴定双带缟和纹缟虾虎鱼物种的方法，其特征在于，
1）PCR扩增：取待测双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼物种特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与权利要求1所述的双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼物种特异性标记进行对比；所述物种特异性引物对为：MTrb_F:1 : 5’‑ CTAGCTCCCAAAGCTAGCATTC‑3’；
MTrb_R:2 : 5’‑ AACTCCACCAATAACTTATGCC‑3’
2） 结果判断：从待测双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼的基因组DNA中扩增出497bpSEQ ID NO:1所示核苷酸的单一DNA片段，即为判断该待测缟虾虎鱼为双带缟虾虎鱼个体（Tridentiger bifasciatus）；
或，待测缟虾虎鱼的基因组DNA中仅扩增出644bpSEQ ID NO:2所示核苷酸的单一DNA片段，即为判断该待测缟虾虎鱼为纹缟虾虎鱼个体（Tridentiger trigonocephalus）。
说明书 :
双带缟和纹缟虾虎鱼物种特异性标记、特异性引物、应用和鉴
定的方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术对物种种质鉴定的定性检测方法，具体说是一种双带缟和纹缟虾虎鱼物种特异性标记、特异性引物、应用和在物种识别中快速鉴定的方法及试剂盒。
背景技术
[0002] 双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼隶属于鲈形目（Perciformes），虾虎鱼科（Gobiidae），缟虾虎鱼属（Tridentige），为暖温性近岸底栖鱼类，主要栖息在西太平洋的热带、亚热带和温带淡水或半咸水环境。二者皆具有融合的腹鳍特征，形成的吸盘使它们极易适应近岸底栖生活；为潮间带优势物种，主要摄食底栖小型鱼类、幼虾、片脚类动物及其他底栖无脊椎动物。双带缟和纹缟虾虎鱼同时也是中华鲟等珍稀保护物种的饵料生物，处于食物链的中下游，是河口生态系统的关键种之一，在物质传递与能量流动中发挥了重要作用，生态地位十分重要。
[0003] 分类学研究显示，双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼为同属近缘种，外部形态极其相似，形态特征差异极其微弱，形态差异主要集中在胸鳍最上方鳍条是否游离、生活时臀鳍是否具有红色纵带、头顶部的感觉管孔是否粗大等分类特征。由于双带缟和纹缟虾虎鱼体型偏小，无法基于上述微弱的形态特征进行快速的现场物种识别以及固定样本分类识别。研究还发现，双带缟和纹缟虾虎鱼在栖息地中的移动范围有限，往往在固定的区域内进行栖息觅食活动，且两者呈混居模式。这严重制约了对双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼渔业资源的精准评估和生物多样性保护进程。另外，研究还发现两种虾虎鱼在1龄时即开始性成熟，产卵期通常在4月至5月，由于双带缟和纹缟虾虎鱼呈混合生活方式且产沉黏性卵，二者在产卵时是否处在相似的产卵生境、是否具有相似的沉黏性卵粘附基质等问题不得而知。这也制约了人们对于这类潮间带优势鱼种资源量的可持续补充的认知，导致对其物种生物多样性保护策略的制定缺乏依据。
[0004] 目前，还未见关于双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼物种鉴定的报道，考虑到双带缟和纹缟虾虎鱼作为众多经济鱼类、濒危物种的饵料，其生态位变动对渔业生态系统稳定具有重要的支撑作用，因此，挖掘双带缟和纹缟虾虎鱼物种特异分子标记，建立双带缟和纹缟虾虎鱼种间高效、快捷鉴定的分子技术成为双带缟和纹缟虾虎鱼渔业资源精准评估和生物多样性保护亟待解决的技术难题。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服了现有双带缟和纹缟虾虎鱼物种鉴定检测技术不足，提供了一种双带缟和纹缟虾虎鱼物种特异性标记、特异性引物、应用和在物种识别中快速鉴定的方法及试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] 一种双带缟和纹缟虾虎鱼近缘种种间特异性标记，双带缟和纹缟虾虎鱼特异性标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1（Xtbi ID Nm:1）和/或SEQ ID NO:2（Ytti ID Nm:1）所示碱基。
[0008] 所述双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼特异性标记SEQ ID NO:1所示碱基为双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼线粒体基因组同源片段，为双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼线粒体基因组共有DNA特征标记；
[0009] 所述双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼特异性标记SEQ ID NO:2所示碱基为特异性标记SEQ ID NO:1所示碱基序列第100位点、110位点、135位点和143位点之间插入序列片段，即为纹缟虾虎鱼线粒体基因组特有的DNA标记。
[0010] 一种所述双带缟和纹缟虾虎鱼近缘种种间特异性标记的应用，所述特异性标记在鉴定双带缟和纹缟虾虎鱼物种中的应用。
[0011] 一种检测权利所述的双带缟和纹缟虾虎鱼近缘种种间特异性标记的物种鉴定特异性引物：
[0012] MTrb_F:1 : 5’‑ CTAGCTCCCAAAGCTAGCATTC‑3’；
[0013] MTrb_R:2 : 5’‑ AACTCCACCAATAACTTATGCC‑3’。
[0014] 一种鉴定双带缟和纹缟虾虎鱼物种的方法，
[0015] 1）PCR扩增：取待测双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用所示双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼物种特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与所述的双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼物种特异性标记进行对比；
[0016] 2） 结果判断：从待测双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼的基因组DNA中扩增出497bp（SEQ ID NO:1所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测缟虾虎鱼为双带缟虾虎鱼个体（Tridentiger bifasciatus）；
[0017] 或，待测缟虾虎鱼的基因组DNA中仅扩增出644bp（SEQ ID NO:2所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测缟虾虎鱼为纹缟虾虎鱼个体（Tridentiger trigonocephalus）。
[0018] 一种鉴定双带缟和纹缟虾虎鱼物种的试剂盒，所述试剂盒含所述的物种鉴定特异性引物。
[0019] 本发明所具有的优点：
[0020] 本发明通过双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼线粒体全基因组序列和线粒体控制区结构，获得了双带缟虾虎鱼线粒体控制区序列和纹缟虾虎鱼控制区序列同源且有显著DNA片段插入区域，发现了双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼共享且纹缟虾虎鱼特有的DNA标记，并将该片段运用到了双带缟和纹缟虾虎鱼物种鉴定；
[0021] 本发明方法可以快速、准确和高效的区分双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼物种，由于线粒体基因组为单倍体基因组，该方法在双带缟虾虎鱼个体中仅扩增出一条特异目的条带（497bp），在纹缟虾虎鱼个体中也仅扩增出一条特异目的条带（644bp），双带缟虾虎鱼（497bp）和纹缟虾虎鱼（644bp）物种各自特异性条带都极易与引物二聚体区分，同时两个物种特异性条带相差147bp，可以采用琼脂糖凝胶电泳快速准确的分辨带型，实现了双带缟和纹缟虾虎鱼物种快速精确鉴定，该方法极度方便适用于渔业资源调查实验现场以及室内实验室等场地的物种快速鉴定操作。本发明高效、快速精准鉴定双带缟和纹缟虾虎鱼物种的方法，对于加强双带缟和纹缟虾虎鱼渔业资源精准评估和生物多样性保护，提升对二者资源量可持续补充的认知具有重要的意义和应用价值。
附图说明
[0022] 图1：本发明获得的双带缟虾虎鱼mtDNA控制区Tb与纹缟虾虎鱼mtDNA控制区Tt核苷酸序列比对图，两端引物位置用黑色粗下划线表示；|：代表Tt和Tb序列一致性；………：代表两者碱基不一致序列；‑‑‑‑‑‑‑‑：代表插入缺失序列；黑色下划线代表缺失序列所在区域。
[0023] 图2：本发明双带缟虾虎鱼线粒体控制区Tb与纹缟虾虎鱼线粒体控制区Tt核苷酸序列同源插入差异DNA片段模式图，引物位置用F和R表示；相同空白颜色区域代表同源区域，黑色区域代表插入位点信息。
[0024] 图3：本发明双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图，M：DL 2000 DNA Make；图中呈现一条带（497bp）的个体为双带缟虾虎鱼物种，胸鳍最上方鳍条不游离，生活时臀鳍红色；图中呈现一条带（644bp）的个体为纹缟虾虎鱼物种，胸鳍最上方鳍条游离，生活时臀鳍具两条红色纵带。
具体实施方式
[0025] 以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
[0026] 本发明基于纹缟虾虎鱼mtDNA控制区特有DNA标记和与双带缟虾虎鱼mtDNA控制区共有的DNA特征标记来确定物种分类：
[0027] 首先通过采用信息采集方法从NCBI（National Center of Biotechnology Information）数据库获得双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼线粒体基因组全序列；通过基因组生物信息学分析方法获知双带缟虾虎鱼与纹缟虾虎鱼在线粒体基因组控制区同源区域存在大片段的插入缺失特征，双带缟虾虎鱼mtDNA控制区DNA片段长度为497bp，命名为Tb，其序列为Xtbi ID Nm:1，纹缟虾虎鱼mtDNA控制区DNA片段长度为644bp，包含了与双带缟虾虎鱼mtDNA控制区同源序列和插入序列，命名为Tt，其序列为Ytti ID Nm:1；在与Tb同源的Tb第100位点、110位点、135位点和143位点之间发现了四个大片段的插入序列，大小分别为
51bp、24bp、18bp和54bp，其中纹缟虾虎鱼mtDNA控制区区域（Tt）DNA序列比双带缟虾虎鱼mtDNA控制区同源DNA区域（Tb）多插入了147bp大小的DNA序列，这个片段即为纹缟虾虎鱼mtDNA控制区特有的DNA标记，而Tb则为双带缟和纹缟虾虎鱼物种间共有的DNA序列，且为双带缟虾虎鱼物种DNA特征标记。
51bp、24bp、18bp和54bp，其中纹缟虾虎鱼mtDNA控制区区域（Tt）DNA序列比双带缟虾虎鱼mtDNA控制区同源DNA区域（Tb）多插入了147bp大小的DNA序列，这个片段即为纹缟虾虎鱼mtDNA控制区特有的DNA标记，而Tb则为双带缟和纹缟虾虎鱼物种间共有的DNA序列，且为双带缟虾虎鱼物种DNA特征标记。
[0028] 本发明双带缟和纹缟虾虎鱼物种快速鉴定的方法；具体检测方法，是确定待检测的缟虾虎鱼是否存在Xtbi ID Nm:1核苷酸片段（497bp）和Ytti ID Nm:1的核苷酸片段（644bp）；通过PCR引物进行快速鉴定；所述实现双带缟和纹缟虾虎鱼物种的精确鉴定，上下游引物序列分别为：
[0029] MTrb_F:1 : 5’‑ CTAGCTCCCAAAGCTAGCATTC‑3’；(Xtbtt ID Nm:2)
[0030] MTrb_R:2 : 5’‑ AACTCCACCAATAACTTATGCC‑3’ (Xtbtt ID Nm:3)
[0031] 其中在双带缟虾虎鱼个体中扩增出497bp单一DNA片段，497bp片段为双带缟虾虎鱼物种特有标记片段；而在纹缟虾虎鱼个体中扩增出644bp的单一DNA片段，644bp片段为纹缟虾虎鱼物种特有标记片段。
[0032] 实施例1双带缟和纹缟虾虎鱼物种特有DNA标记的筛选及验证
[0033] 双带缟和纹缟虾虎鱼线粒体基因组同源且含大片段插入目标DNA序列的发现：
[0034] 本发明所用的双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼线粒体基因组全序列，来自NCBI（National Center of Biotechnology Information）国际数据库，双带缟虾虎鱼NCBI注册号为NC015992，纹缟虾虎鱼NCBI注册号为NC029738。采用基因组序列同源比对生物信息学分析双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼线粒体基因组序列可见（参见图1），双带缟和纹缟虾虎鱼线粒体基因组控制区同源且有大片段DNA片段插入，其中双带缟虾虎鱼mtDNA控制区上DNA片段长度为497bp，命名为Tb，其SEQ ID NO:1序列为Xtbi ID Nm:1：
[0035] SEQ ID NO:1（Xtbi ID Nm:1）
[0036] CTAGCTCCCAAAGCTAGCATTCTAAATTTAACTATTCTTTGTTATAAACATATATGTAATATCACCATATATATATATCGAACATATATATTAATGTTTACTAACACATATATGTATAATAACCATTCAGTTACTTCGACCATTCATTCATCAACATTCATCCAAGAATTACAAATTGCATCTCTCTAGATTTAACATAACTGCACACTAACAAAATATATTAATGCTCAAAGACAAGAATGAACACTCAATATATATATATATAAAACAATAAGCCATCACCACAAAATTTAAGTACACATTTTTGGGCCACATCACCCGTAAACACGACCATCTATTCGTATTTAATAGAAATTACCCAATGATAGTGATGTACCCTAATTGTGAGGGTCGCTCACAGTGAATTTTTACAGACATTTGGCTCTACATCTCAAGGCCATTACCTGCAAGTCTTCCCCACACTTTCACTGGCCCTGGCATAAGTTATTGGTGGAGTT。
[0037] 而在纹缟虾虎鱼mtDNA控制区上的DNA片段长度为644bp，其包含了与双带缟虾虎鱼mtDNA控制区的同源序列和插入序列，命名为Tt，其SEQ ID NO:2序列为Ytti ID Nm:1：
[0038] SEQ ID NO:2（Ytti ID Nm:1）：
[0039] CTAGCTCCCAAAGCTAGCATTCTAAATTTAACTATTCTTTGTACATATATGTAATTAAACCATTAATATATCTAGACCATATATATTAATGTTTATAAGATATATTATGTATAATAACCATCTATTTCTTTAAACCATTAATATATCTAGACCATATATATTAATGTTTATAAGATATATTATGTATAATAACCATCTATTTCTTTAAACCATTAATATATCTAGACCATATATATTAATGTTTATAAGATATATTATGTATAATAACCATTTATCTCTTTTAACCACTCAGGAATTAACATTCATCCAAGAAAAACAAATTACATCATCTGTAAATGAACACAATTGCACACTAAAAAGAAATATTAATGCTTTAAGACAATAATCTTAAAATTCAAAATAATATGATATAATACAATAACCCATCACCATTAAACTTAAACTTACATTTCTCAGCCACATCAACCGTAAACACGACCATCTATTCGCATATAATAGAAATTACCCAATGATAGTGATGTACCCTACTCGTGAGGGTCGCTCATAGTGAATTTTTACAGACATTTGGCTCTACATCTCAAGGCCAATACCTGCAAGTCTTCCCCACACTTTCACTGGCCCTGGCATAAGTTATTGGTGGAGTT。
[0040] 双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼线粒体基因组DNA序列比对显示在双带缟虾虎鱼Tb的第100位点、110位点、135位点和143位点之间发现了四个大片段的插入序列，大小分别为51bp、24bp、18bp和54bp，其中纹缟虾虎鱼mtDNA控制区区域（Tt）DNA序列比双带缟虾虎鱼mtDNA控制区同源DNA区域（Tb）多插入了147bp大小的DNA序列，这个片段即为纹缟虾虎鱼mtDNA控制区特有的DNA标记，其存在与否可用来鉴别纹缟虾虎鱼物种；而Tb则为双带缟和纹缟虾虎鱼物种间共有的DNA序列，且为双带缟虾虎鱼物种DNA特征标记，其存在与否可用来鉴别双带缟虾虎鱼物种，如图2所示。
[0041] 双带缟和纹缟虾虎鱼物种特有DNA标记的序列验证：基于纹缟虾虎鱼mtDNA控制区Ytti ID Nm:1核苷酸序列与双带缟虾虎鱼mtDNA同源控制区上Xtbi ID Nm:1核苷酸序列特征，设计两条引物。选择形态学鉴定已知物种的双带缟和纹缟虾虎鱼DNA，同时使用MTrb_F:1、MTrb_R:2两条引物进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系为20µL，包括5.0µL
10 Buffer；4.0µL dNTP（2.5mmol/L）；1.0µL rTaq酶（5U/µL）；1.0µL MTrb_F:1；1.0 µL MTrb_R:2；1.0µL DNA模板，7.0µL ddH2O；混匀后离心。PCR扩增反应程序：96℃ 4mins；96℃
60s，58℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min，4℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出双带缟和纹缟虾虎鱼个体存在差异。将双带缟和纹缟虾虎鱼差异片段产物割胶回收并通过PMD18‑T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了双带缟和纹缟虾虎鱼mtDNA控制区同源且含大片段插入目标DNA序列片段。
10 Buffer；4.0µL dNTP（2.5mmol/L）；1.0µL rTaq酶（5U/µL）；1.0µL MTrb_F:1；1.0 µL MTrb_R:2；1.0µL DNA模板，7.0µL ddH2O；混匀后离心。PCR扩增反应程序：96℃ 4mins；96℃
60s，58℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min，4℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出双带缟和纹缟虾虎鱼个体存在差异。将双带缟和纹缟虾虎鱼差异片段产物割胶回收并通过PMD18‑T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了双带缟和纹缟虾虎鱼mtDNA控制区同源且含大片段插入目标DNA序列片段。
[0042] 实施例2双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼物种鉴定技术的建立与应用
[0043] 对于来自山东青岛汇泉湾双带缟虾虎鱼12尾和纹缟虾虎鱼12尾进行种间物种鉴定：
[0044] 高质量DNA提取：使用天根海洋动物DNA提取试剂盒提取双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼鳍条DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的完整性，采用紫外分光光度计测量DNA上清的OD值，调整使得DNA浓度至70ng/µL，于‑20℃冻存备用。
[0045] PCR反应体系及PCR扩增鉴定：使用双带缟和纹缟虾虎鱼物种特异的DNA片段引物MTrb_F:1、MTrb_R:2通过PCR方法检测双带缟和纹缟虾虎鱼物种归属。PCR反应体系20µL：10Buffer 5.0µL、dNTP 4.0µL、rTaq酶（5U/µL）1.0µL、上下游引物（MTrb_F:1和MTrb_R:2）各1.0µL、DNA模板1.0µL、ddH2O 7.0µL。PCR扩增反应程序：96℃ 4mins；96℃ 60s，58℃ 30s，
72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min，4℃保存。每个待检测的PCR样品中加入10 Loading Buffer 2.0µL，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下30分钟，凝胶成像可清晰的分辨双带缟和纹缟虾虎鱼物种归属（参见图3）。
72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min，4℃保存。每个待检测的PCR样品中加入10 Loading Buffer 2.0µL，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下30分钟，凝胶成像可清晰的分辨双带缟和纹缟虾虎鱼物种归属（参见图3）。
[0046] 如图3所示，在双带缟虾虎鱼个体中仅扩增出一条特异目的条带（497bp），在纹缟虾虎鱼个体中也仅扩增出一条特异目的条带（644bp），双带缟虾虎鱼（497bp）和纹缟虾虎鱼（644bp）物种各自特异性条带都极易与引物二聚体区分，可见采用本发明方法本实验开发的物种特异分子标记适用于野生双带缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼物种种质归属的快速鉴定，具有普适性。
[0047] SEQ ID NO:3
[0048] 22
[0049] DNA
[0050] 人工序列（Artificial Sequence）
[0051] CTAGCTCCCAAAGCTAGCATTC
[0052] SEQ ID NO: 4
[0053] 22
[0054] DNA
[0055] 人工序列（Artificial Sequence）
[0056] AACTCCACCAATAACTTATGCC 。