一种包括NK细胞和NK细胞接合器分子的组合物

摘要

本发明涉及一种包括NK细胞和NK细胞接合器分子的组合物。所述NK细胞为iPSC来源的高CD16表达的NK细胞，所述NK细胞接合器分子为接合器分子1、接合器分子2、接合器分子3和接合器分子4中的一种或多种。所述NK细胞接合器分子能够与NK细胞联合作用，在体外和体内都表现出了较好的抗肿瘤效果。

权利要求

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括NK细胞和NK细胞接合器分子，所述NK细胞为iPSC来源的NK细胞；

所述NK细胞接合器分子包括接合器分子1、接合器分子3和接合器分子4中的一种或多种；

所述接合器分子1的轻链可变区包括抗‑CD30 轻链可变区和抗‑CD16A 轻链可变区，重链可变区包括抗‑CD30 重链可变区和抗‑CD16A 重链可变区；

所述接合器分子3的轻链可变区包括抗‑CD30轻链可变区和抗‑NKp46 轻链可变区，重链可变区包括抗‑CD30 重链可变区和抗‑NKp46 重链可变区；

所述接合器分子4的轻链可变区包括抗‑CD30轻链可变区，重链可变区包括抗‑CD30 重链可变区；

所述抗‑CD30重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗‑CD30 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗‑CD16A 重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述抗‑CD16A 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述抗‑NKp46重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述抗‑NKp46轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

其中，所述NK细胞接合器分子的浓度为0.01 nM‑400 nM。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述NK细胞接合器分子为接合器分子1。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述NK细胞接合器分子的浓度为200 nM。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为注射剂、片剂、粒剂或胶囊。

6.一种制备根据权利要求1‑5中任一项所述的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（a）构建NK细胞接合器分子；

（b）将iPSC诱导分化为NK细胞；

（c）稀释所述NK细胞接合器分子，并将其加入所述NK细胞中；

（d）混匀后孵育。

7.一种根据权利要求1‑5中任一项所述的组合物或根据权利要求6所述的方法在制备抗间变性大细胞淋巴瘤药物中的应用。

说明书

一种包括NK细胞和NK细胞接合器分子的组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种包括NK细胞和NK细胞接合器分子的组合物。

背景技术

[0002] NK细胞是一种具有细胞毒性的先天淋巴样细胞，在免疫监视中发挥重要作用，并对感染、应激和恶性细胞表现出强有力的效应反应。与T细胞不同的是，NK细胞不表达抗原特异性受体来识别它们的靶标，相反，它们的激活和效应功能是由种系编码的激活或抑制受体与靶细胞上各自的配体之间的相互作用介导的，包括CD16A（FcγRIIIa）介导的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和细胞因子产生。NK细胞的功能和激活也可通过细胞因子受体调节，NK细胞对耐药癌症的识别和功能仍然是NK细胞免疫治疗广泛应用的实质性障碍。

[0003] 潜在的解决方案包括双特异性接合剂（例如，NK 接合器分子），通过NK激活受体靶向NK细胞活性，同时靶向肿瘤特异性抗原，通过NK 接合器分子介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）来最大化NK细胞的潜力，从而扩大了癌症免疫治疗的范围。但癌症患者自身的NK细胞在多种疾病环境中显示出效应功能受损。其机制包括激活受体的下调、CD16表达的缺失、抑制性受体的上调以及肿瘤微环境诱导的衰竭。由于这些原因，许多研究者已经探索了使用免疫治疗，并表明这些细胞也能杀死癌症。研究表明，将同种异体NK细胞与NK 接合器分子联合能发挥更大的抗肿瘤效果，目前的同种异体NK细胞的来源主要是外周血NK细胞（PB‑NK）和脐带血NK细胞（CB‑NK）。

[0004] 然而，外周血中循环的淋巴细胞只有5‑15%是NK细胞，从外周血淋巴细胞中分离的dim +NK（PB‑NK）细胞中高达90%是CD56 CD16A NK细胞，通常表现出成熟的表型，细胞毒性增加，但增殖能力降低。由于单个脐带血单位的体积有限，每个单位的NK细胞数量有限，CB‑NK细胞数量较少，这对获得足够数量的NK细胞用于临床使用构成了主要障碍。与PB‑NK细胞相比，CB‑NK细胞表现出较不成熟的表型，某些粘附分子、CD16、KIRs、穿孔素和颗粒酶B的表达减少，抑制分子如NKG2A的表达增加，对肿瘤细胞的细胞毒性较低。这两种来源的NK细胞，受数量和质量的限制，因此难以成为的标准化产品。

发明内容

[0005] 发明要解决的问题

[0006] 基于现有技术存在的上述问题，本发明目的是希望将NK 接合器分子与NK细胞联合作用，以达到较好的抗肿瘤效果。

[0007] 用于解决问题的方案

[0008] 本发明提供了一种组合物，所述组合物包括NK细胞和NK细胞接合器分子，所述NK细胞为iPSC来源的NK细胞。

[0009] 优选地，所述NK细胞接合器分子包括接合器分子1、接合器分子2、接合器分子3和接合器分子4中的一种或多种。

[0010] 更优选地，所述NK细胞接合器分子为接合器分子1。

[0011] 优选地，所述NK细胞接合器分子包括轻链可变区和重链可变区，其中：

[0012] 所述接合器分子1的轻链可变区包括抗‑CD30 轻链可变区和抗‑CD16A 轻链可变区，重链可变区包括抗‑CD30 重链可变区和抗‑CD16A 重链可变区；

[0013] 所述接合器分子2的轻链可变区包括抗‑DNP轻链可变区和抗‑NKp46 轻链可变区，重链可变区包括抗‑DNP 重链可变区和抗‑NKp46 重链可变区；

[0014] 所述接合器分子3的轻链可变区包括抗‑CD30轻链可变区和抗‑NKp46 轻链可变区，重链可变区包括抗‑CD30 重链可变区和抗‑NKp46 重链可变区；

[0015] 所述接合器分子4的轻链可变区包括抗‑CD30轻链可变区，重链可变区包括抗‑CD30 重链可变区。

[0016] 优选地，所述 抗‑CD30 重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗‑CD30 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗‑CD16A 重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述抗‑CD16A 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述抗‑NKp46重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述抗‑NKp46轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述抗‑DNP重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述抗‑DNP轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0017] 优选地，所述NK细胞接合器分子的浓度为0.01 nM ‑400 nM。

[0018] 更优选地，所述NK细胞接合器分子的浓度为200 nM。

[0019] 优选地，所述组合物还包括药学上可接受的辅料。

[0020] 优选地，所述组合物的剂型为注射剂、片剂、粒剂或胶囊。

[0021] 本发明还提供了一种制备所述组合物的方法，所述方法包括如下步骤：

[0022] （a）构建NK细胞接合器分子；

[0023] （b）将iPSC诱导分化为NK细胞；

[0024] （c）稀释所述NK细胞接合器分子，并将其加入所述NK细胞中；

[0025] （d）混匀后孵育。

[0026] 本发明还提供了一种所述组合物或所述方法在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0027] 优选地，所述肿瘤包括：急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆道癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌、神经胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤中的一种或多种。

[0028] 发明的效果

[0029] 本发明的NK 接合器分子能够与NK细胞联合作用，在体外和体内都表现出了较好的抗肿瘤效果。

附图说明

[0030] 图1，A为接合器分子1的构型；B为接合器分子1的SDS‑PAGE；C为接合器分子1的SEC‑HPLC纯度。

[0031] 图2显示了接合器分子1与肿瘤细胞的结合能力。

[0032] 图3显示了接合器分子1与PB‑NK细胞的结合能力。

[0033] 图4显示了PB‑NK细胞CD16的表达量。

[0034] 图5，A显示了分化至第8天造血祖细胞CD34的表达量；B显示了CD43的表达量；C显示了CD45的表达量

[0035] 图6，A显示了分化至第21天具有CD3‑CD56+特征细胞的比例；B显示了CD16的表达量。

[0036] 图7，A显示了分化至第28天具有CD3‑CD56+特征细胞的比例；B显示了CD16的表达量。

[0037] 图8，A显示了iNK细胞CD3‑CD56+的纯度；B显示了CD16的表达量。

[0038] 图9显示了接合器分子1联合PB‑NK或iNK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

[0039] 图10，A显示了INF‑γ细胞因子的释放量；B显示了TNF‑α细胞因子的释放量；C显示了CD107a细胞因子的释放量。

[0040] 图11，A为接合器分子2的构型；B为接合器分子3的构型；C为接合器分子4的构型。U、T：代表不同的靶点；Ux: Anti‑DNP（靶向无关靶点DNP）；U1：CD30；T1：NKp46；VL：轻链可变区；CL：轻链恒定区；CH1：抗体恒定区；VH：重链可变区。

[0041] 图12，A显示了接合器分子2和接合器分子3与NK细胞的结合能力；B显示了接合器分子3与肿瘤细胞的结合能力；C显示了接合器分子4与肿瘤细胞的结合能力。

[0042] 图13，A显示了NK 接合器分子联合PB‑NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力；B显示了NK 接合器分子联合CB‑NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

[0043] 图14，A显示了iNK的纯度（CD3‑CD56+）；B显示了iNK的CD16的表达量；C显示了CB‑NK的纯度（CD3‑CD56+）；D显示了CB‑NK的CD16的表达量。

[0044] 图15，A显示了NK 接合器分子在iNK细胞表面的残留量；B显示了NK 接合器分子在CBNK细胞表面的残留量。

[0045] 图16，A显示了NK 接合器分子联合iNK细胞对肿瘤细胞的短时杀伤能力；B和C显示了NK 接合器分子联合iNK细胞对肿瘤细胞的长时杀伤能力。

[0046] 图17，A显示了接合器分子1联合iNK的体内药效；B显示了接合器分子1联合iNK体现较好的生存期。

具体实施方式

[0047] 为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。

[0048] 如本文所用，术语“和/或”是指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。

[0049] 如本文所用，术语“包含”或“包括”是指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本发明中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。

[0050] 如本文所用，术语“iPSC”是指诱导性多能干细胞，是通过表达或诱导表达细胞因子而从体细胞生成的、具有分化成各种胚层的潜能的细胞。本领域已知的多种重编程方法，可以用于将体细胞重编程为诱导的多能干细胞。参见例如公开的美国专利申请号20090246875、美国专利申请号2010/0210014、美国专利申请号20120276636、美国专利号8,
058,065、美国专利8,129,187、美国专利号8,268,620、PCT公开号WO 2007/069666 A1和美国专利8,268,620，其通过引用并入本文。通常，将体细胞重编程为去分化或多能状态，涉及重编程因子（包括转录因子）的表达。相关的转录因子可以包含以下一种或多种，或由以下一种或多种因子组成或基本上由其组成：OCT4、SOX2、KLF4和MYC(OSKM)；SOX2、KLF4和OCT4 (SKO)； OCT4、SOX2、KLF4和GLIS1 (OSKG)； OCT4、SOX2、NANOG和LIN28 (OSNL)；或OCT4、SOX2、KLF4、c‑MYC、NANOG和LIN28 (OKSMNL)。用于将重编程因子或编码这些重编程因子的核酸引入体细胞的方法是本领域已知的，参见例如美国专利号8,268,620、8,691,574、8,
741,648、8,546,140，以及美国专利号8,900,871和美国专利号8,071,369。也可以使用体细胞核移植技术（SCNT）生成iPSC。

[0051] 如本文所用，术语“分化”是指将较低分化程度的细胞转化为较高分化程度的细胞，特别是有丝分裂后组织特异性细胞类型的一个或多个步骤，例如将iPSC分化为NK细胞。可以例如通过向细胞培养基中加入分化因子，诱导iPSC向NK细胞分化。

[0052] 如本文所用，术语“表达标志物”或“标志物”可用于确定细胞类型的身份。细胞特异性基因的某些有信息的DNA序列可以被转录成mRNA，并且通常随后被翻译成在细胞中发挥特定功能的蛋白质（其基因产物）。标志物的表达可以通过本领域已知的方法在RNA水平或蛋白质水平上检测和定量。NK细胞标志物是本领域已知的，并且包括但不限于CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2A、NKG2D、2B4、KIR2DL1、KIR2DL2/L3、TIGIT等。

[0053] 如本文所用，术语“CD16A”（也称为FcγRIII）是指在天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞多形核白细胞、单核细胞和巨噬细胞的表面上发现的分化簇分子，是涉及抗体依赖性细胞毒性（ADCC）的免疫球蛋白超家族（IgSF）的分子。

[0054] 如本文所用，术语“抗体依赖性细胞毒性（ADCC）”是指一种体外或体内过程，其中抗体可以与细胞表面上的抗原结合，然后经由抗体Fc结构域内的序列与免疫效应细胞接合，进而导致它们释放可以杀伤结合的细胞的毒素。

[0055] 如本文所用，术语“特异性结合”或“特异地结合”是指抗体或抗原结合片段与抗原（包括抗体本身所含的序列）的结合具有对齐其他抗原更大的亲和力。通常，特异性抗体或‑6抗原结合片段以约5×10 M或更小的平衡解离常数KD结合靶抗原。

[0056] 如本文所用，术语“双特异性细胞接合器分子”、“双特异性细胞接合器”、“细胞接合器”、“双特异性抗体”、“NK 接合器分子”可互换使用，均指细胞接合器分子。

[0057] 如本文所用，术语“iNK”是指iPSC来源的NK细胞。

[0058] 如本文所用，术语“PB‑NK”是指外周血NK细胞（PB‑NK）。

[0059] 如本文所用，术语“CB‑NK”是指脐带血NK细胞（CB‑NK）。

[0060] 如本文所用，术语“靶细胞”是指表达特定抗体或含抗体部分的抗原的真核或原核细胞或细胞群。

[0061] 如本文所用，术语“Karpars299”是指人间变性大细胞淋巴瘤细胞。

[0062] 如本文所用，术语“药学上可接受的”是指从药理学和毒理学方面可接受施用于患者并且使用本领域已知的方法制造的物质。“药学上可接受的载体”是指不干扰一种或多种活性成分的生物活性的有效性并且对宿主无毒的基质。

[0063] 如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效”可互换使用，并且在以足以在患者中产生增强的临床结果的量施用药剂的上下文中使用。根据这里描述的方法以“有效方案”施用有效量的药剂。术语“有效方案”是指足以为患有特定癌症的患者实现增强的临床结果的药剂的量和给药频率的组合。当给患者施用能够比亲本化合物更好地克服发病率的药剂或能够增强有效方案的临床结果的药剂时，增强的功效是改善的临床结果。

[0064] 如本文所用，术语“癌症”和“肿瘤”在本领域中是众所周知的并且是指存在具有不受调节的细胞生长和与类似来源的正常细胞类型不同的形态特征的细胞，也称为失调细胞。恶性是指那些能够导致发病和/或死亡的癌细胞。如本文所用，“癌症”和“肿瘤”包括癌前和恶性类型。

[0065] 除非另有说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。除非另有说明，本发明所使用的各种材料和试剂，可以使用本领域常规的方法获得，也可以通过商业渠道获得。

[0066] 本发明提供了一种组合物，所述组合物包括NK细胞和NK细胞接合器分子，所述NK细胞为iPSC来源的NK细胞。

[0067] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子包括接合器分子1、接合器分子2、接合器分子3和接合器分子4中的一种或多种。

[0068] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子为接合器分子1。

[0069] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子为接合器分子2。

[0070] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子为接合器分子3。

[0071] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子为接合器分子4。

[0072] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子包括轻链可变区和重链可变区。

[0073] 在某些实施方案中，所述接合器分子1的轻链可变区包括抗‑CD30 轻链可变区和抗‑CD16A 轻链可变区，重链可变区包括抗‑CD30 重链可变区和抗‑CD16A 重链可变区。

[0074] 在某些实施方案中，所述接合器分子2的轻链可变区包括抗‑DNP轻链可变区和抗‑NKp46 轻链可变区，重链可变区包括抗‑DNP 重链可变区和抗‑NKp46 重链可变区。

[0075] 在某些实施方案中，所述接合器分子3的轻链可变区包括抗‑CD30轻链可变区和抗‑NKp46 轻链可变区，重链可变区包括抗‑CD30 重链可变区和抗‑NKp46 重链可变区。

[0076] 在某些实施方案中，所述接合器分子4的轻链可变区包括抗‑CD30轻链可变区，重链可变区包括抗‑CD30 重链可变区。

[0077] 在某些实施方案中，所述 抗‑CD30 重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0078] SEQ ID NO.1：抗‑CD30 重链可变区

[0079] QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSS。

[0080] 在某些实施方案中，所述抗‑CD30 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0081] SEQ ID NO.2：抗‑CD30 轻链可变区

[0082] DIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIN。

[0083] 在某些实施方案中，所述抗‑CD16A 重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0084] SEQ ID NO.3：抗‑CD16A 重链可变区

[0085] QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS。

[0086] 在某些实施方案中，所述抗‑CD16A 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0087] SEQ ID NO.4：抗‑CD16A 轻链可变区

[0088] SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL。

[0089] 在某些实施方案中，所述抗‑NKp46重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0090] SEQ ID NO.5：抗‑NKp46重链可变区

[0091] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYVINWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGTNYYNEKFKAKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRYGLYAMDYWGQGTTVTVSS。

[0092] 在某些实施方案中，所述抗‑NKp46轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

[0093] SEQ ID NO.6：抗‑NKp46轻链可变区

[0094] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTRPWTFGGGTKVEIK。

[0095] 在某些实施方案中，所述抗‑DNP重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0096] SEQ ID NO.7：抗‑DNP重链可变区

[0097] DVQLQESGPGLVKPSQSQSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYMSYSGSTRYNPSLRSRISITRDTSKNQFFLQLKSVTTEDTATYFCARGWPLAYWGQGTQVSVSE。

[0098] 在某些实施方案中，所述抗‑DNP轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0099] SEQ ID NO.8：抗‑DNP轻链可变区

[0100] QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVYYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPPITFGVGTKLELKRA。

[0101] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子的浓度为0.01 nM ‑400 nM。

[0102] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子的浓度为0.01 nM、0.1 nM、0.16 nM、0.2 nM、0.3 nM、0.32 nM、0.4 nM、0.5 nM、0.6 nM、0.7 nM、0.8 nM、0.9 nM、1 nM、1.6 nM、2 nM、3 nM、4 nM、5 nM、6 nM、7 nM、8 nM、9 nM、10 nM、20 nM、30 nM、40 nM、50nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM、100 nM、150 nM、200 nM、250 nM、300 nM、350 nM或400 nM。

[0103] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子的浓度为0.16 nM‑200 nM。

[0104] 在某些实施方案中，所述NK细胞接合器分子的浓度为200 nM。

[0105] 在某些实施方案中，所述组合物还包括药学上可接受的辅料。

[0106] 在某些实施方案中，所述组合物的剂型为注射剂、片剂、粒剂或胶囊。

[0107] 本发明还提供了一种制备所述组合物的方法，所述方法包括如下步骤：

[0108] （a）构建NK细胞接合器分子；

[0109] （b）将iPSC诱导分化为NK细胞；

[0110] （c）稀释所述NK细胞接合器分子，并将其加入所述NK细胞中；

[0111] （d）混匀后孵育。

[0112] 在某些实施方案中，步骤（b）包括如下步骤：

[0113] （b1）培养诱导的多能干细胞（iPSC）以生成胚状体；

[0114] （b2）在包含细胞分化因子的NK细胞分化培养基中分化所述胚状体；

[0115] （b3）在包含IL‑2的NK细胞扩增培养基中扩增步骤（b2）得到的细胞以产生所述NK细胞。

[0116] 在某些实施方案中，所述步骤（b1）包括步骤（b11）将iPSC常规培养于Essential 8培养基中。

[0117] 在某些实施方案中，所述Essential 8培养基补充有10％CloneR。

[0118] 在某些实施方案中，所述步骤（b1）还包括步骤（b12）使用TrypLETMExpress将细胞解离为单个细胞，过滤以去除任何未解离的细胞聚集体。

[0119] 在某些实施方案中，所述过滤是使用40μm的细胞筛过滤。

[0120] 在某些实施方案中，所述步骤（b1）还包括步骤（b13）将细胞接种在超低附着圆底96孔板上，并使用补充有40ng/mL SCF、20ng/mL BMP4、20ng/mL VEGF和10％CloneR的TM TM
STEMdiff APEL 2培养基。

[0121] 在某些实施方案中，所述步骤（b1）还包括步骤（b14）将板以300x g离心5分钟，并在37℃、5％CO2中孵育6天以生成造血型胚状体（HE EB）。

[0122] 在某些实施方案中，所述步骤（b2）包括步骤（b21）将收集的HE EB平板接种到2％明胶包被或未包被的6孔板上，并使用NK细胞分化培养基。

[0123] 在某些实施方案中，所述NK细胞分化培养基包括56.6％DMEM+GlutaMAXTM‑I、TM28.3％F12+GlutaMAX ‑I、15％热失活人AB血清、1％P/S、2mM L‑谷氨酰胺、1μMβ‑巯基乙醇、
5ng/mL亚硒酸钠、50μM乙醇胺、20mg/L抗坏血酸、5ng/mL IL‑3、20ng/mL SCF、20ng/mL IL‑
7、10ng/mLIL‑15、10ng/mL FLT3配体（FLT3L）和50U/mL IL‑2。

[0124] 在某些实施方案中，所述步骤（b2）包括步骤（b22）在分化的前14天每6天更换培养基，在分化14天后每3天更换培养基。

[0125] 在某些实施方案中，从分化的第7天起，培养基中不再补充IL‑3。

[0126] 在某些实施方案中，所述步骤（b3）包括将NK细胞与髓系白血病细胞系在NK细胞扩增培养基中共培养。

[0127] 在某些实施方案中，所述髓系白血病细胞系为表达mbIL‑21的K562髓系白血病细胞系。

[0128] 在某些实施方案中，所述NK细胞扩增培养基为补充有10％FBS、2mM L‑谷氨酰胺、1％P/S和50U/mL IL‑2的RPMI 1640培养基。

[0129] 在某些实施方案中，所述共培养是将NK细胞与髓系白血病细胞系以1:1的比率和5
2.5x10个细胞/mL的最小密度共培养。

[0130] 在某些实施方案中，步骤（d）所述孵育是在37℃孵育。

[0131] 在某些实施方案中，步骤（d）所述孵育是在37℃孵育1小时。

[0132] 本发明还提供了一种所述组合物或根据所述方法制备的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0133] 在某些实施方案中，所述肿瘤包括：急性髓细胞白血病（AML）、多发性骨髓瘤（MM）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性淋巴白血病（ALL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆道癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌、神经胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤中的一种或多种。

[0134] 实施例1：接合器分子1的生产

[0135] 构建如图1中A所示的接合器分子1（NK 接合器分子），接合器分子1由两条链CD16aVH‑CD30VL‑CD30VH‑CD16aVL组成，其中，CD16aVH与CD16aVL匹配，CD30VL与CD30VH匹配。CD30和CD16A的序列参考专利WO2013013700A1，接合器分子1的序列如下列所示。瞬时转染CHO细胞，培养7天后收获细胞上清，纯化得到纯度较好的接合器分子1，接合器分子1的SDS‑PAGE纯度如图1中B所示，其SEC‑HPLC纯度如图1中C所示，根据专利中的序列构建的接合器分子1在SDS‑APGE及SEC‑HPLC上都显示出大于90 %的纯度。

[0136] 接合器分子1的完整序列（抗‑CD16aVH‑抗‑CD30VL‑抗‑CD30VH‑抗‑CD16aVL）如SEQ ID NO.9所示：

[0137] QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEINGGSGGSGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL

[0138] 其中，抗‑CD30 重链可变区如SEQ ID NO.1所示：

[0139] QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSS

[0140] 抗‑CD30 轻链可变区如SEQ ID NO.2所示：

[0141] DIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIN

[0142] 抗‑CD16A 重链可变区如SEQ ID NO.3所示：

[0143] QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS

[0144] 抗‑CD16A 轻链可变区如SEQ ID NO.4所示：

[0145] SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL

[0146] 实施例2：接合器分子1与肿瘤细胞结合能力验证

[0147] 将接合器分子1从100 nM依次往下5倍稀释8个浓度，每个孔铺1E5个KARPAS‑299细胞，将稀释好的接合器分子1加到KARPAS‑299细胞中，混匀后37℃共孵育1小时，1小时后用含1% FBS的DPBS（FACS 缓冲液）洗涤两次，然后加生物素标记的CD16A抗体到细胞中37℃共孵育1小时，1小时后用FACS 缓冲液洗涤两次，再把PE‑SA二抗加到细胞中避光4℃共孵育45分钟，用FACS 缓冲液洗涤两次，最后用FACS检测并分析数据，结果如图2所示。接合器分子1是靶向CD30和CD16A的双特异性抗体，KARPAS‑299细胞高表达CD30，从结果上看，MFI最高值是29801，EC50是2.4 nM，本发明中生产的接合器分子1与KARPAS‑299肿瘤细胞显示出很好的结合能力。

[0148] 实施例3：接合器分子1与PB‑NK细胞结合能力验证

[0149] 将接合器分子1从100 nM依次往下5倍稀释8个浓度，每个孔铺1E5个PB‑NK细胞（PBMC购买于赛笠生物，使用美天旎（Miltenyi）细胞分选磁珠NK细胞分选试剂盒分选NK得到PB‑NK细胞）将稀释好的接合器分子1加到PB‑NK细胞中，混匀后37℃共孵育1小时，1小时后用含1% FBS的DPBS（FACS 缓冲液）洗涤两次，然后加生物素标记的CD30抗体到细胞中，混匀后37℃共孵育1小时，1小时后用FACS 缓冲液洗涤两次，再把PE‑SA二抗加到细胞中，混匀后避光4℃共孵育45分钟，用FACS 缓冲液洗涤两次，最后用FACS检测并分析数据，结果如图3所示。PB‑NK高表达CD16，接合器分子1是靶向CD16A的双特异性抗体，MFI最高值是8080，EC50是29.33 nM，说明本发明中生产的接合器分子1与PB‑NK细胞显示出很好的结合能力。

[0150] 实施例4：流式细胞术验证PB‑NK细胞的CD16的表达量

[0151] 每个孔铺1E5个PB‑NK细胞（PBMC购买于赛笠生物，使用美天旎Miltenyi细胞分选磁珠NK细胞分选试剂盒分选NK得到PB‑NK细胞），把人Fc受体封闭试剂加到细胞中，混匀后避光4℃共孵育20分钟，然后加入流式抗体CD56‑APC和CD16‑FITC，混匀后避光4℃共孵育1小时，用FACS 缓冲液洗涤两次，最后用FACS检测并分析数据。结果如图4所示，PB‑NK细胞CD16的表达高达81.6%，所以接合器分子1在PB‑NK细胞上显示出了较好的结合能力。

[0152] 实施例5：iPSC诱导分化成高表达CD16的NK细胞

[0153] 将人类iPSC常规培养于商业可得的Essential 8培养基中。在启动NK细胞分化之前，将融合度为40‑50％的iPSC在补充有10％CloneR的Essential 8培养基中培养至少24小时，直到细胞融合度达到70‑80％，以提高单细胞生存力。一旦汇合度达到70‑80％，其中TMiPSC准备好进行分化，用TrypLE Express将细胞解离为单个细胞，并用40μm的细胞筛过滤以去除任何未解离的细胞聚集体。对收集的细胞进行计数，并以8000个细胞/孔的密度接种在超低附着圆底96孔板上，于补充有40ng/mL SCF、20ng/mL BMP4、20ng/mL VEGF和10％TM TM
CloneR的STEMdiff APEL 2培养基中，最终体积为100μL。然后将板以300x g离心5分钟，并在37℃、5％CO2中孵育6天以生成造血型胚状体（HE EB）。然后将在第6天形成的HE EB汇集到15ml锥形离心管管中并通过沉降收集。将收集的HE EB平板接种到2％明胶包被或未包被TM
的6孔板上，于NK细胞分化培养基中，该培养基的组成为56.6％DMEM+GlutaMAX ‑I、28.3％TM
F12+GlutaMAX ‑I、15％热失活人AB血清、1％P/S、2mM L‑谷氨酰胺、1μMβ‑巯基乙醇、5ng/mL亚硒酸钠、50μM乙醇胺、20mg/L抗坏血酸、5ng/mL IL‑3、20ng/mL SCF、20ng/mL IL‑7、10ng/mLIL‑15、10ng/mL FLT3配体（FLT3L）以及50U/mL IL‑2。对于6孔板的每个孔，将约16个EB平板接种。在分化的前14天每6天更换培养基，在分化14天后每3天更换培养基。从分化的第7天起，培养基中不再补充IL‑3。具有纺锤状形态的漂浮NK细胞在分化21‑35天左右逐渐出现，加以收集用于后续分析和验证。对于扩增，将NK细胞与表达mbIL‑21的K562髓系白血病
5
细胞系以1:1的比率和2.5x10 个细胞/mL的最小密度在NK扩增培养基（RPMI 1640培养基，补充有10％FBS、2mM L‑谷氨酰胺、1％P/S和50U/mL IL‑2）中共培养。

[0154] 从iPSC开始经过5‑6周的分化后，通过AO/PI染色细胞计数显示，细胞活率大于80%。培养过程中细胞形态的变化清晰可见。初始接种的iPSC细胞形态扁平、紧密、均匀，边缘清晰。经过8天向造血祖细胞（HPC）分化，通过流式细胞术检测CD34、CD43和CD45的表达量如图5中A、B和C所示，这三者的表达量分别达到67.6%、80.1%和30.1%。

[0155] 显微镜下可见外形圆润、明亮的HPC。在后续3‑4周向NK诱导分化，在第21天时通过流式细胞术检测具有CD3‑CD56+表型的细胞比例以及CD16的表达量，结果如图6中A和B所示，具有NK细胞表型CD3‑CD56+的细胞达到42.6%，此时CD16的表达量是18.3%。

[0156] 在第28天时通过流式细胞术检测具有CD3‑CD56+表型的细胞比例以及CD16的表达量，结果如图7中A和B所示，具有NK细胞表型CD3‑CD56+的细胞已达到91.1%，此时CD16的表达量是25.1%。

[0157] 随着诱导分化时间的延长，造血祖细胞（HPC）逐渐向NK细胞分化，具有CD3‑CD56+表型的NK细胞比例越来越高。显微镜下可见大部分的细胞体积变小，呈悬浮状，逐渐具有NK细胞的特征。通过特定方法的分化，可获得形态上体积偏小、悬浮、近似梭形或圆形等具备NK特征的细胞。流式细胞术检测具有CD3‑CD56+表型的细胞比例以及CD16的表达量，结果如图8中A和B所示，最终得到的iNK细胞CD3‑CD56+的纯度高达99.1%，CD16的表达量高达89%。

[0158] 实施例6：接合器分子1联合PB‑NK或iNK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力

[0159] 将接合器分子1抗体从200 nM依次往下5倍稀释4个浓度，每个孔铺1E5个PB‑NK或iNK细胞，将稀释好的抗体加到PB‑NK或iNK细胞中，混匀后37℃共孵育1小时，然后每个孔加入2E4个KARPAS‑299细胞，在37℃，5% CO2的培养箱中共培养杀伤5小时，在只铺KARPAS‑299细胞的孔中加入裂解液，将上清转移到ELISA板中，然后300g离心5分钟，把LDH lysis buffer（LDH裂解试剂）加到孔中，混匀后室温避光反应15‑30分钟，然后用EnVision2105读OD492 nm的值并分析数据，结果如图9所示，在接合器分子1不同浓度下都显示出接合器分子1 联合iNK对肿瘤细胞的杀伤强于PB‑NK。

[0160] 实施例7：接合器分子1联合PB‑NK或iNK细胞对肿瘤细胞的杀伤时细胞因子的释放量

[0161] 将接合器分子1抗体的终浓度调整为200nM，每个孔铺1E5个PB‑NK或iNK细胞，将稀释好的抗体加到PB‑NK或iNK细胞中，混匀后37℃共孵育1小时。然后每个孔加入2E4个KARPAS‑299细胞，再加入CD107a(LAMP‑1)单克隆抗体(eBioH4A3)（FITC，eBioscience™ Invitrogen 11‑1079‑42），在37℃，5% CO2的培养箱中共培养1小时，再把BD Golgi Stop™和BD Golgi Plug™加到每个孔中，37℃，5% CO2的培养箱中共培养4小时。人Fc受体封闭试剂加到每个孔中，混匀后避光4℃共孵育20分钟，再把流式抗体LIVE/DEAD™可固定近红外死细胞染色剂试剂盒、IgG1 Isotype APC、CD56‑APC和CD3‑PE加到对应的孔中，混匀后避光4℃共孵育30分钟，彻底重悬细胞，每孔再加入100μL固定/通透溶液，4℃共孵育30分钟。用碧迪公司固定/破膜试剂洗涤两次，用IFN‑γ(BV421)、TNFα(PE‑Cy7)染色细胞，避光4℃共孵育30分钟，最后再用碧迪公司固定/破膜试剂洗涤两次，FACS检测并分析数据，结果如图
10所示。PB‑NK联合接合器分子1 对肿瘤细胞杀伤时INF‑γ细胞因子的释放量高于iNK，但TNF‑α和CD107a这两个细胞因子的释放量是iNK高于PB‑NK，所以综合分析INF‑γ、TNF‑α、CD107a三个细胞因子的释放量可知接合器分子1 联合iNK对肿瘤细胞的刺激强于PB‑NK。

[0162] 实施例8：NK 接合器分子的生产

[0163] 为了与接合器分子1进行对比，构建TAA 是CD30同时靶向NKp46的双特异性抗体接合器分子3，如图11中B所示，CD30序列参考专利WO2013013700A1，NKp46序列参考专利WO2019101695A1，构建的接合器分子3的序列如下列所示。同时构建如图11中A所示的接合器分子2，接合器分子2是将接合器分子3中的CD30序列更换成无关的抗‑DNP序列，Fc是在野生型IgG1的基础上突变成ADCC增强型，构建的接合器分子2的序列如下列所示。构建如11中C所示的接合器分子4，CD30序列参考专利WO2013013700A1，接合器分子4的Fc是在野生型IgG1的基础上突变成ADCC增强型，序列如下列所示。三个分子质粒合成后瞬时转染CHO细胞，培养7天后收获细胞上清，纯化得到纯度较好的抗体。

[0164] 接合器分子3的序列

[0165] 接合器分子3轻链完整序列（抗‑NKp46 VL‑CH1）如SEQ ID NO.13所示：

[0166] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTRPWTFGGGTKVEIKASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH

[0167] 其中抗‑NKp46轻链可变区序列如SEQ ID NO.6所示：

[0168] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTRPWTFGGGTKVEIK

[0169] 接合器分子3重链完整序列（抗‑CD30 VH‑CH1‑Fc‑抗‑NKp46 VH‑CL）如SEQ ID NO.14所示：

[0170] QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSTGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYVINWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGTNYYNEKFKAKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRYGLYAMDYWGQGTTVTVSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[0171] 其中抗‑CD30 重链可变区的序列如SEQ ID NO.1所示：

[0172] QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSS

[0173] 其中抗‑NKp46重链可变区的序列如SEQ ID NO.5所示：

[0174] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYVINWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGTNYYNEKFKAKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRYGLYAMDYWGQGTTVTVSS

[0175] 接合器分子3另一链完整序列（抗‑CD30 VL‑CL‑Fc）如SEQ ID NO.15所示：

[0176] DIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEINRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0177] 其中抗‑CD30 轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示：

[0178] DIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIN

[0179] 接合器分子 2的序列

[0180] 接合器分子2轻链完整序列（抗‑NKp46 VL‑CH1）如SEQ ID NO.10所示：

[0181] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTRPWTFGGGTKVEIKASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH

[0182] 其中抗‑NKp46轻链可变区序列如SEQ ID NO.6所示：

[0183] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTRPWTFGGGTKVEIK

[0184] 接合器分子 2重链完整序列（抗‑DNP VH‑CH1‑Fc‑抗‑NKp46 VH‑CL）如SEQ ID NO.11所示：

[0185] DVQLQESGPGLVKPSQSQSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYMSYSGSTRYNPSLRSRISITRDTSKNQFFLQLKSVTTEDTATYFCARGWPLAYWGQGTQVSVSEASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSTGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYVINWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGTNYYNEKFKAKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRYGLYAMDYWGQGTTVTVSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0186] 其中抗‑DNP 重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示：

[0187] DVQLQESGPGLVKPSQSQSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYMSYSGSTRYNPSLRSRISITRDTSKNQFFLQLKSVTTEDTATYFCARGWPLAYWGQGTQVSVSE

[0188] 其中抗‑NKp46重链可变区的序列如SEQ ID NO.5所示：

[0189] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYVINWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGTNYYNEKFKAKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRYGLYAMDYWGQGTTVTVSS

[0190] 接合器分子 2另一链完整序列（抗‑DNP VL‑CL‑Fc）如SEQ ID NO.12所示：

[0191] QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVYYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPPITFGVGTKLELKRARTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0192] 其中抗‑DNP 轻链可变区的序列如SEQ ID NO.8所示：

[0193] QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVYYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPPITFGVGTKLELKRA

[0194] 接合器分子4的序列

[0195] 接合器分子4轻链完整序列（抗‑CD30 VL‑CL）如SEQ ID NO.16所示：

[0196] DIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEINRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0197] 其中抗‑CD30轻链可变区序列如SEQ ID NO.2所示：

[0198] DIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEIN

[0199] 接合器分子4重链完整序列（抗‑CD30 VH‑CH1‑Fc）如SEQ ID NO.17所示：

[0200] QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[0201] 其中抗‑CD30重链可变区的序列如SEQ ID NO.1所示：

[0202] QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSS

[0203] 实施例9：NK 接合器分子与PB‑NK细胞或与肿瘤细胞的结合能力

[0204] 将接合器分子2和接合器分子3抗体分别从100nM依次往下5倍稀释8个浓度，每个孔铺1E5个PB‑NK细胞，将稀释好的抗体加到PB‑NK细胞中，混匀后37℃共孵育1小时。1小时后用含1% FBS的DPBS（FACS 缓冲液）洗涤两次，然后加生物素标记的CD16抗体到细胞中，混匀后37℃共孵育1小时。1小时后用FACS 缓冲液洗涤两次，再把PE‑SA二抗加到细胞中，混匀后避光4℃共孵育45分钟，用FACS 缓冲液洗涤两次，最后用FACS检测并分析数据。结果如图12中A所示，接合器分子 2与PB‑NK细胞的结合强于接合器分子3。

[0205] 将接合器分子3和4分别从100nM依次往下5倍稀释8个浓度，每个孔铺1E5个KARPAS‑299细胞，将稀释好的抗体加到KARPAS‑299细胞中，混匀后37℃共孵育1小时，1小时后用含1% FBS的DPBS（FACS 缓冲液）洗涤两次，然后加抗人Fc二抗到细胞中避光4℃共孵育45分钟，用FACS 缓冲液洗涤两次，最后用FACS检测并分析数据，结果如图12中B和C所示。如图12中B可看出，MFI高达是93680，EC50是4.9 nM , 说明本发明中生产的接合器分子3与肿瘤细胞显示出非常好的结合能力。如图12中C可看出，MFI高达是61680，EC50是2.34 nM  , 说明本发明中生产的接合器分子4与肿瘤细胞显示出很好的结合能力。

[0206] 实施例10：NK 接合器分子联合PB‑NK和CB‑NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力[0207] 将接合器分子1、接合器分子2、接合器分子3和接合器分子4抗体分别从200nM依次往下10倍稀释3个浓度，每个孔铺1E5个PB‑NK或CB‑NK（购买于山东省细胞组织库上海实验室）细胞，将稀释好的抗体加到PB‑NK或CB‑NK细胞中，混匀后37℃共孵育1小时；KARPAS‑299细胞用CFSE染色20分钟，然后每个孔加入染色后的2E4个KARPAS‑299细胞，在37℃，5% CO2的培养箱中共培养杀伤5小时，300g离心5分钟弃上清，再把LIVE/DEAD™ 可固定近红外死细胞染色剂试剂盒加到每个孔中，混匀后4℃共孵育30分钟，然后用FACS 缓冲液洗涤两次，最后用FACS检测并分析数据，结果如图13中A和B所示。图13中A显示，接合器分子2联合PB‑NK对肿瘤细胞杀伤的效果是最差的，且在不同抗体浓度几乎没有差异，因为接合器分子2没有靶向肿瘤细胞的功能。接合器分子4联合PB‑NK对肿瘤细胞杀伤的效果与接合器分子3的杀伤效果相当。接合器分子1联合PB‑NK对肿瘤细胞杀伤的效果最好，且随着接合器分子1浓度的增高，特异性杀伤效果越好。图13中B显示，NK 接合器分子1‑4联合CB‑NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力与联合PB‑NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力类似。

[0208] 实施例11：CB‑NK和iNK细胞的纯度及CD16的表达量

[0209] 每个孔铺1E5个CB‑NK或iNK细胞（按照实施例5中的流程再诱导分化新批次的iNK细胞），把人Fc受体封闭试剂加到细胞中，混匀后避光4℃共孵育20分钟，然后加入流式抗体CD56‑APC、CD3‑Percp/cy5.5和CD16‑FITC染色，混匀后避光4℃共孵育1小时，用FACS 缓冲液洗涤两次，最后用FACS检测并分析数据，结果如图14所示。图14中A显示iNK CD3‑CD56+的纯度高达98.5%，图14在B显示本发明中iPSC分化的iNK细胞的 CD16的表达量高达91.7%。从iPSC诱导分化的两批次的iNK细胞，CD3‑CD56+的纯度类似，CD16的表达量相近。图14中C显示CB‑NK CD3‑CD56+的纯度高达95.9%，图14中D显示CB‑NK细胞CD16的表达量高达92.3 %。

[0210] 实施例12：NK 接合器分子在iNK和CB‑NK细胞表面上的残留量

[0211] 将接合器分子1稀释到1uM和200nM，将接合器分子3稀释到200nM。每个孔铺2E5个iNK或CB‑NK细胞，将稀释好的抗体加到细胞中，混匀后4℃共孵育45分钟，然后在37℃，5% CO2的培养箱中分别共培养1小时、72小时、96小时后分别取出，用FACS 缓冲液洗涤两次，然后把生物素标记的CD30抗体加到每个孔中4℃共孵育1小时，用FACS 缓冲液洗涤两次，再把PE‑SA二抗和LIVE/DEAD™可固定近红外死细胞染色剂试剂盒加到每个孔中避光4℃共孵育45分钟，用FACS 缓冲液洗涤两次，最后用FACS检测并分析数据，结果如图15所示。图15中A和B分别展示的是NK 接合器分子在iNK和CB‑NK细胞上96小时内的残留量，从百分比的结果上看，孵育 1uM 接合器分子1的NK在96小时和在1小时的接合器分子1细胞表面残留量相当，但细胞形态以及活细胞的比例明显降低，而孵育200nM 接合器分子1的NK细胞在96小时接合器分子1的细胞表面残留量与1小时相比明显降低，但NK细胞形态及活率并没有明显的变化，1uM的接合器分子1这个剂量对NK细胞来说太高，而且常规的抗体而言，剂量在200nM时已达到饱和。所以后续的体外杀伤实验及体内的药效实验接合器分子1的使用浓度是
200nM。孵育同样的抗体浓度200nM条件下的NK细胞，在不同的时间接合器分子1的细胞表面残留量都高于接合器分子3，说明接合器分子1中的CD16A与NK细胞的结合能力强于接合器分子3中NKp46。

[0212] 实施例13：NK 接合器分子联合iNK细胞对肿瘤细胞的短时杀伤能力

[0213] 将接合器分子 1、人 IgG1、接合器分子3和接合器分子4分别稀释到200nM，分别铺6E4（E:T=3）和1E5（E:T=5）个iNK细胞，将稀释好的抗体加到iNK细胞中，混匀后37℃共孵育1小时；KARPAS‑299细胞用CFSE染色20分钟，然后每个孔加入染色后的2E4个KARPAS‑299细胞，在37℃，5% CO2的培养箱中共培养杀伤5小时，300g离心5分钟弃上清，再把LIVE/DEAD™可固定近红外死细胞染色剂试剂盒加到每个孔中，混匀后4℃共孵育30分钟，然后用FACS 缓冲液洗涤两次，最后用FACS检测并分析数据，结果如图16中A所示。接合器分子1、接合器分子3和接合器分子4这三个分子分别在E:T=3和5时的杀伤效果差异不大，说明此时的iNK细胞已达到饱和的状态，后续长时杀伤实验可降低ET比值。在相同的ET比值下及一样的抗体浓度200nM下，接合器分子3短时的特异性杀伤效果最好，接合器分子1次之，接合器分子4最差，但这三个分子的特异性杀伤效果总体上差异不大，在两个不同的ET比值下结论一致。

[0214] 实施例14：NK 接合器分子联合iNK或PB‑NK细胞对肿瘤细胞的长时杀伤能力[0215] 先用多聚鸟氨酸处理96孔平底板，KARPAS‑299细胞用Incucyte® Cytolight快速绿色染料染色20分钟，然后每个孔加入染色后的5E3个KARPAS‑299细胞，生物安全柜中放置20分钟后转移到在37℃，5% CO2的培养箱中培养过夜。然后在对应孔中加5E3（E:T=1）或
1.5E4（E:T=3）的iNK或PB‑NK细胞，并将稀释好的抗体接合器分子1、人 IgG1和接合器分子3（200nM）加到iNK或PB‑NK细胞中，在每个孔中加入膜联蛋白V中进行染色，混匀后放入IncuCyte实时成像系统中培养24小时，每隔2个小时拍照，分析数据，结果如图16中B和C所示。图16中B显示的是E:T=1时NK 接合器分子1和接合器分子3联合NK细胞对肿瘤细胞的长时杀伤能力，接合器分子1联合iNK对肿瘤细胞杀伤效果最好，其次是接合器分子1联合PB‑NK，在肿瘤细胞与预孵接合器分子1的NK细胞共孵育24小时后，NK细胞几乎能杀死所有的肿瘤细胞，接合器分子3联合iNK对肿瘤细胞杀伤效果比联合PB‑NK杀伤效果更好，没有联合NK 接合器分子的iNK和PB‑NK对肿瘤细胞杀伤效果相当，有较弱的特异性杀伤效果。图16中C显示的是E:T=3时NK 接合器分子1和接合器分子3联合NK细胞对肿瘤细胞的长时杀伤能力，依然是接合器分子1联合iNK对肿瘤细胞杀伤效果最好，不同组间的杀伤效果与E:T=1时类似。
在短时4小时以前，接合器分子3联合iNK的杀伤效果接合器分子1联合iNK的杀伤效果相当，与实施例12中短时杀伤效果的结论类似。结合图16中B和图16中C的结果可知，随着ET比值的增加，NK 接合器分子联合NK或单独的NK细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效果增强。

[0216] 实施例15：接合器分子1联合iNK在体内药效及生存期观察

[0217] 6‑8周龄雌性免疫缺陷小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）在第1天7
辐照，剂量为1.4Gy。第0天，按照小鼠体重设置荷瘤对照组、1×10的接合器分子1‑iNK单次
7
给药联合1mg/kg的接合器分子1每周给两次连续给药3周组、1×10的接合器分子1‑iNK单
7
次给药组、1×10的iNK单次给药组、1mg/kg的接合器分子1每周给药两次连续给药三周组、
5
1mg/kg 的接合器分子1单次给药组。每只小鼠经尾静脉注射1×10的人淋巴瘤细胞系‑luc细胞，间隔4小时后，将接合器分子1抗体稀释到200nM，并加到iNK细胞中，混匀后37℃共孵育1小时。在第1天、第4天、第7天、第10天、第18天、第27天、第31天、第33天对小鼠进行成像拍摄，同时观察生存期。结果如图17中A和B所示。实验结果表明，在人淋巴瘤（Karpas299）的小鼠异种移植模型中，CD16高表达的iNK和预孵接合器分子1的iNK展现出良好的疗效，能显著抑制肿瘤生长；与iNK相比，预孵接合器分子1的 iNK的对肿瘤的抑制效果明显更好。

[0218] 应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。