一种补体C1q参考物质，制备方法及其应用

摘要

本发明提供了一种补体C1q参考物质，制备方法及其应用，所述补体C1q参考物质以人血清为制备材料，通过离心，过滤，沉淀、调PH、透析、冻融等各个步骤的优化组合，并配合组分优化的体系稀释液制得不同目标浓度的系列补体C1q参考物质的液体制剂，最高浓度赋值可达560mg/L，可应用于一次性制备获得覆盖正常测试范围及异常测试范围的不同浓度水平的标准品、质控品等参考物质，所获参考物质使用方便、特异性强、稳定性好，2～8℃保存最长可达15个月，本发明补体C1q参考物质的制备方法更适合批量生产，有助于工业化生产和市场标准的统一。

权利要求

1.一种补体C1q参考物质的制备方法，能够制备获得补体C1q参考物质，包括以下步骤：S1：取人血清样本于2‑8℃静置2～8小时后，离心弃沉淀，上清溶液过滤得滤液；

S2：滤液先用缓冲液稀释，再加入PEG沉淀至少2小时后离心，得沉淀物；

S3：沉淀物用缓冲液复溶，得复溶液；

S4：缓慢加入冰醋酸调复溶液的pH值至4.6～4.7后，于2‑8℃静置2‑10小时后，离心弃沉淀，得上清溶液；

S5：上清溶液中加入饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，离心得二次沉淀物；

S6：用缓冲液复溶二次沉淀物，得补体C1q的高浓度溶液；

S7：取高浓度溶液装入透析袋中，置于缓冲液中透析至电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；

S8：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻，再于室温完全融化后使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；

S9：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同目标浓度的系列参考物质；

步骤S9中，所述体系稀释液包括保护剂、防腐剂、缓冲液；体系稀释液中所述保护剂由牛血清白蛋白5～10g/L、乳糖20g/L和30%甘油组成；所述防腐剂为硫酸庆大霉素0.4g/L；所述缓冲液为PBS、HEPES、Tris中的任意一种，所述缓冲液浓度为50mmol/L。

2.根据权利要求1所述的补体C1q参考物质的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述人血清样本为新鲜的血清样本，或者是冷藏时间不超过两周的血清样本；步骤S2中，所述缓冲液为10mmol/L PBS；步骤S3中，所述缓冲液为10mmol/L PB；步骤S2和S3中，用量均为步骤S1中所述人血清样本体积的2～3倍；步骤S4中，所述冰醋酸的浓度为10%～50%；步骤S6中，所述缓冲液为10～15mmol/L PBS；步骤S7中，所述缓冲液为10～15mmol/L PBS。

3.根据权利要求1所述的补体C1q参考物质的制备方法，其特征在于：步骤S2中，用于沉淀的所述PEG为PEG6000、PEG8000、PEG20000中的任意一种，所述PEG的用量终浓度为8%～

15%；步骤S5中，用于沉淀的所述饱和硫酸铵溶液的浓度为2～3moL/L。

4.根据权利要求1所述的补体C1q参考物质的制备方法，其特征在于：步骤S1、步骤S2、步骤S4中、步骤S5和步骤S8中，所述离心的条件为低温。

5.一种补体C1q参考物质，根据权利要求1‑4任一项中所述的补体C1q参考物质的制备方法制备获得，为人血清来源的液体制品，采用所述体系稀释液制备获得一系列不同目标浓度的补体C1q参考物质，所述目标浓度的赋值范围为70～560mg/L。

6.权利要求1‑4任一项中所述的补体C1q参考物质的制备方法，或者权利要求5所述的补体C1q参考物质在制备补体C1q相关的体外诊断试剂盒中的应用，所述体外诊断试剂盒包括校准品、质控品、标准品或者检测试剂。

说明书

一种补体C1q参考物质，制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及补体C1q参考物质的制备方法及其在校准品、质控品及C1q检测试剂盒等体外诊断试剂中的应用。

背景技术

[0002] 补体C1q是构成补体C1的一个重要成分，成人补体C1q的正常值范围为50～130mg/L，C1q分子量为390000，由6个相同的亚单位组成对称的六聚体，是补体经典途径的始动分子，当两个以上的C1q与免疫复合物中的IgM或IgG的Fc段结合后，C1q构型发生改变，导致C1r和C1s的相继活化，启动补体经典激活途径，此外，补体C1q在固有免疫和特异性免疫之间发挥了主要的连接作用，调节各种免疫细胞，不但参与启动机体防御病原体的第一道防线，同时介导单核巨噬细胞对凋亡细胞和循环免疫复合物等的清除，在维持自身免疫耐受及调控炎性反应等方面发挥重要作用。研究显示，补体C1q亦可通过调节巨噬细胞炎性两极分化的过程，参与动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的发生、发展，因此，推测血清补体C1q水平的变化与动脉粥样硬化等高风险自身免疫性疾病、心脑血管等疾病的发生、发展存在相关性，测定补体C1q有助于辅助医生对炎性反应进行相关诊断和评估。

[0003] 参考物质是在体外诊断试剂定量检验中广泛应用的一类标准物质，其定值后可作为参考量值，用于评估试剂检测结果的偏倚，而测定人血清中补体C1q的方法多样，实际最常用单向免疫扩散法检测补体C1q，但用于评估任何一种补体C1q试剂的检测结果，都需要依赖参考物质，本发明所述补体C1q常见参考物质的应用包括但不限于校准品、质控品，比如用于定量检测时对检测项目的校准、评估体外诊断试剂或者试剂性能是否符合预先设置的标准。一般需要参考物质的赋值范围能够覆盖正常测试范围及异常测试范围，校准品或者质控品都是即可以单独申请注册、也可以与体外诊断试剂合并申请注册。

[0004] 补体C1q的高值参考物质稀有，不易获得，通常采用分段式分别提供2个至多个不同浓度水平，一般情况下低浓度水平的赋值范围在140～200mg/L内，高浓度水平的赋值范围在240～300mg/L内，如果能够提供140～300mg/L范围内连续赋值，就可以覆盖C1q正常值和C1q异常高值的检测范围。补体C1q参考物质的制备通常采用重组表达或者牛血清样本为原料，或是由于宿主不同重组表达的补体C1q特异性差，或是由于牛源样本制备的补体C1q的批间特异性差，目前尚无法克服。补体C1q参考物质还存在稳定性差的问题，通常会考虑将补体C1q通过制成冻干粉剂来保持其参考物质的稳定性，但是也会因此导致使用前需要增加复溶操作步骤，并因而存在批间差不一致的风险。此外，不同厂家自行生产的参考物质赋值范围常常不统一，也不利于市场化。目前，急需一种稳定的液态的补体C1q参考物质，还需要赋值准确、稳定性高，以及赋值范围能够一次覆盖正常测试范围及异常测试范围，从而解决现有补体C1q参考物质差异大，冻干粉剂使用不方便，液体2～8℃保存不稳定等问题。

发明内容

[0005] 本发明为了克服上述不足，提供了一种更稳定、更准确、使用更简便且能一次性提供更广赋值范围的C1q参考物质，及其制备方法和应用。

[0006] 为实现上述发明目的，本发明主要涉及补体C1q参考物质及其在普通免疫比浊法试剂中的配套应用，通过以下技术方案实现：

[0007] 第一方面，本发明提供了一种补体C1q参考物质，为人血清来源的液体制品，其中，该补体C1q参考物质采用体系稀释液制备成补体C1q一系列不同的目标浓度；其中，体系稀释液包括保护剂、防腐剂、10 100mmol/L 缓冲液、0.1～2g/L氯化钠和水，目标浓度的赋值~范围为60～560mg/L。

[0008] 根据本发明的一个优选实施例，所述补体C1q参考物质中，保护剂为乳糖、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、甘油、牛血清蛋白、甘氨酸或者精氨酸中的任意三种；防腐剂为硫酸庆大霉素、Krovin‑500、Proclin30或者苯甲酸钠中的任意一种；缓冲液为PBS、HEPES、Tris、MES或者甘氨酸缓冲液中的任意一种。

[0009] 根据本发明的一个优选实施例，所述补体C1q参考物质中，保护剂包括5 10g/L牛~血清白蛋白、10 20g/L乳糖和15% 30%甘油；防腐剂为0.4 0.8g/L硫酸庆大霉素；缓冲液为~ ~ ~
PBS、HEPES、Tris中的任意一种，缓冲液浓度为50mmol/L 。

[0010] 优选地，所述补体C1q参考物质置于2～8℃保存的有效期为15个月。

[0011] 优选地，所述保护剂包括5g/L牛血清白蛋白、20g/L乳糖和30%甘油。

[0012] 第二方面，本发明提供了一种补体C1q参考物质的制备方法，能够制备获得上述补体C1q参考物质，包括以下步骤：S1：取人血清样本于2‑8℃静置2～8小时后，离心后弃沉淀，上清溶液过滤得滤液；S2：滤液先用缓冲液稀释，再加入PEG沉淀至少2小时后离心，得沉淀物；S3：沉淀物用缓冲液复溶，得复溶液；S4：缓慢加入冰醋酸调复溶液的PH值至4.6～4.8，于2‑8℃静置2‑10小时后，再离心弃沉淀，得上清溶液；S5：上清溶液中加入饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，离心得二次沉淀物；S6：用缓冲液复溶二次沉淀物，得补体C1q的高浓度溶液；S7：取高浓度溶液装入透析袋中，置于缓冲液中透析至电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；S8：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻后，再于室温待完全融化后，使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；S9：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同目标浓度的系列参考物质。

[0013] 根据本发明的一个优选实施例，所述补体C1q参考物质的制备方法中，步骤S1中，人血清样本为新鲜的血清样本，或者是冷藏时间不超过两周的血清样本；步骤S2中，缓冲液为10mmol/L PBS；步骤S3中，缓冲液为10mmol/L PB；步骤S2和S3中，用量均为步骤S1中人血清样本体积的2～3倍；步骤S4中，冰醋酸的浓度为10%～50%；步骤S6中，缓冲液为10～15mmol/L PBS；步骤S7中，缓冲液为10～15mmol/L PBS。

[0014] 优选地，步骤S2中，缓冲液为10mmol/L PBS，制备组分包括1.44g/L Na2HPO4、0.24g/L KH2PO4、9g/L NaCl、0.2g/L KCl、HCl调试PH值至7.4，纯水定容至1L。

[0015] 所述优选地，步骤S3中，缓冲液为10mmol/L PB的制备组分包括3.007g/L Na2HPO4、0.2208g/L NaH2PO4、溶剂为纯化水。

[0016] 优选地，所述补体C1q参考物质的制备方法，在步骤S6中，缓冲液的体积用量为步骤S1中人血清样本体积的1/6～1/10。

[0017] 优选地，所述补体C1q参考物质的制备方法，在步骤S7中，透析过程中透析至少进行8小时，透析过程中的缓冲液至少进行1次换液。

[0018] 根据本发明的一个优选实施例，所述补体C1q参考物质的制备方法中，步骤S2中，用于沉淀的PEG为PEG6000、PEG8000、PEG20000中的任意一种，PEG的用量浓度为8%～15%；步骤S5中，用于沉淀的饱和硫酸铵溶液的浓度为2～3moL/L，该饱和硫酸铵溶液的用量体积与步骤S1中人血清样本的体积相同。

[0019] 优选地，所述步骤S2中，PEG为PEG6000，PEG的用量浓度为10%～15%。

[0020] 根据本发明的一个优选实施例，所述补体C1q参考物质的制备方法中，步骤S1、步骤S2、步骤S4和步骤S5中，离心的条件均为0～8℃的低温；步骤S8中，离心的条件为0～8℃的低温和10000 30000rpm的高转速。~

[0021] 根据本发明的一个优选实施例，所述补体C1q参考物质的制备方法中，步骤S9中，体系稀释液包括保护剂、防腐剂、10 100mmol/L 缓冲液、0.1～2g/L氯化钠和水；其中，保护~剂为乳糖、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、甘油、牛血清蛋白、甘氨酸或者精氨酸中的任意3种；防腐剂为硫酸庆大霉素、Krovin‑500、Proclin30或者苯甲酸钠中的任意一种；缓冲液为PBS、HEPES、Tris、MES或者甘氨酸缓冲液中的任意一种。

[0022] 优选地，所述的体系稀释液中，保护剂包括5 10g/L牛血清白蛋白、10 20g/L乳糖~ ~和15% 30%甘油；防腐剂为0.4g/L硫酸庆大霉素；缓冲液为PBS、HEPES、Tris中的任意一种，~
缓冲液浓度为50mmol/L 。

[0023] 优选地，所述的体系稀释液中，防腐剂还可以为1.0mL/L Krovin‑500或者1.0mL/L Proclin30。

[0024] 第三方面，本发明提供了一种应用，包括补体C1q参考物质，或者补体C1q参考物质的制备方法在制备补体C1q相关的体外诊断试剂盒中的应用，该体外诊断试剂盒包括但不限于校准品、质控品、或者检测试剂，该应用不包括疾病的诊断和治疗。

[0025] 根据本发明的一个优选实施例，在所述应用中，检测试剂采用免疫比浊法。

[0026] 本发明提供了一种补体C1q参考物质，该参考物质来源为人血清，特异性更高，能够克服牛血清或重组表达等方式引入的溯源方面的种属差异，而且赋值更准确，能够适配不同厂家补体C1q的检测试剂。本发明采用组分优化的体系稀释液制备获得一系列不同目标浓度的参考物质，可获得浓度高达560mg/L的高值参考物质，稳定性更高；其中，体系稀释液仅包括保护剂、防腐剂、缓冲液、氯化钠和水，组分简单、不影响补体C1q的含量和功能，还能够有效提高补体C1q参考物质的稳定性。该参考物质为由相同溯源制备成的液体制品，使用更方便，不仅避免了冻干粉剂复溶的操作步骤，使得液体制剂批间差较一致，而且液体制剂更适合批量生产，有助于补体C1q的工业化生产；该参考物质液体制剂的赋值范围覆盖60～560mg/L，赋值范围更广，可一次性直接获得即能覆盖正常测试范围、又能覆盖异常测试范围。本发明所获补体C1q参考物质的有效期长，置于2～8℃保存12个月，补体C1q含量的测定值的统计结果显示CV值均小于5%，其有效期不仅能够达到参考物质常见的12月，采用优化的体系稀释液所得补体C1q参考物质的有效期还有望延长至15月。

[0027] 本发明还提供了一种补体C1q参考物质的制备方法，以人血清作为制备补体C1q校准质控品的材料，通过离心，过滤，PEG沉淀、调PH、硫酸铵沉淀，透析、冻融等常见提取纯化方法，进行天然人血清的提取，制备得到补体C1q的高值半成品，并利用配置的体系稀释液获得所需不同浓度的系列参考物质。其中，人血清样本为制备原料，即克服了常用的重组表达方法由于表达的宿主不同而导致的溯源方面的差异性，又克服了常用牛血清样本制备中牛源与人源的差异性，而且常用的重组表达方法制备补体C1q的高值样本稀有，不易获得，而本发明所述制备方法可获得高达560mg/L的高值参考物质。此外，统一采用人血清样本还可以避免不同厂家赋值范围的差异性，有利于建立统一标准和市场化的规范标准。本发明最终制备的参考物质为液体制剂，相对于冻干粉剂所需复杂的工艺流程、较高的制备成本及复溶过程容易造成的瓶间差、使用操作复杂等问题，本申请所述液体制剂，可以直接使用，于2～8℃保存即可，避免了为了提高稳定性而制备成冻干粉剂所带来的一系列问题，液体制剂不仅工艺更加简单、成本更低、使用更加方便快捷，而且准确度，可信度高，浓度赋值稳定性好，由于不需要复溶使得批间差更加稳定可控。因此，本发明优化获得的所述液体制剂相对更适合批量生产，有助于生产工业化，更无需担心和不同厂家产品体外诊断试剂的适配度。

[0028] 本发明所述补体C1q参考物质稳定性更高，其关键技术方案是优化筛选获得的体系稀释液，组分包括保护剂、防腐剂、10 100mmol/L 缓冲液、0.1～2g/L氯化钠和水，其中，~保护剂的选择和含量优化很重要，选择合适的保护剂/防腐剂及其使用剂量，有利于保持参考物质的长期稳定性；筛选保护剂从乳糖、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、甘油、牛血清蛋白、甘氨酸或者精氨酸中优选牛血清白蛋白5 10g/L、乳糖10 20g/L和15% 30%甘油，防腐剂从硫酸~ ~ ~
庆大霉素、Krovin‑500、Proclin30或者苯甲酸钠中优选硫酸庆大霉素0.4g/L；缓冲液从PBS、HEPES、Tris、MES或者甘氨酸缓冲液中优选50mmol/L 的PBS、HEPES或者Tris。结果通过体系稀释液的保护，制备的补体C1q系列参考物质稳定性好，2～8℃保存12个月，保存前后补体C1q含量无明显变化，保存至15个月精密度CV仍可以保持在5%有效的范围内。

[0029] 本发明所述制备方法根据补体C1q的分子质量大小、蛋白等电点等特性，从制备原料入手，提供了一种优化、简便的C1q参考物质的制备方法。制备过程中虽然涉及离心、过滤、沉淀、调PH、透析、冻融等常见的纯化提取方法，但是，本发明通过优化各步骤的顺序和参数，出乎预料之外地发现优化的方法不仅能够获得高值补体C1q参考物质，还能够制备出稳定的液体制剂，解决了补体C1q参考物质制备多年未解决的高标准、高稳定性等技术问题。

[0030] 其中，预处理步骤S1中，先“静置”后通过简单的离心、过滤操作，去掉了部分杂质和脂类蛋白。稀释、沉淀步骤S2中，先优化筛选出用于稀释的缓冲液10mmol/LPBS及优化的用量，再根据分子量的不同，通过PEG沉淀，从不同分子量的蛋白中分离获得补体C1q。分离后进一步通过复溶步骤S3中优化筛选的缓冲液10mmol/LPB及优化的用量，获得10mmol/LPB的复溶液。研究过程中发现通过调PH步骤S4进行脂类沉淀是影响补体C1q外观纯净度的重要因素。在上述步骤S2根据分子量用PEG6000进行初次沉淀的基础上，特别设置了二次沉淀的步骤S5，优化筛选本领域常见用于金属沉淀的饱和硫酸铵溶液来沉淀糖蛋白的补体C1q，尤其是在调PH至酸性条件后使用饱和硫酸铵溶液为蛋白沉淀溶液，不仅不需要额外添加盐酸或硝酸等促溶剂，而且配合步骤S2的PEG沉淀和缓慢滴加硫酸铵溶液的细节操作、意外克服了常规所获得的硫酸铵沉淀物纯度不高等缺点，实现了对补体C1q的高浓度沉淀。二次复溶步骤S6优化筛选出用于复溶的缓冲液为10mmol/LPBS。透析步骤S7优化筛选出用于透析的缓冲液为10mmol/LPBS。本发明中补体C1q的制备来源为人血清，蛋白类杂质相对较多，制备过程中还存在2次“2～8℃静置”的过程中，在静置过程中更容易析出脂类、不溶性蛋白类等杂质，增加步骤S8所述冻融，一方面制备过程中有且仅有1次冻融操作，研究发现如果“冻存+复溶”反复操作超过1次，破碎细胞过程中也容易引起补体C1q变性，如果该冷冻融化过程仅进行1次，能够实现在保证尽可能清除脂类等杂蛋白的基础上，避免因多次冻融引起补体C1q结构被破坏而导致后续可能出现的浑浊、不稳定和基质效应等；另一方面本步骤中冻融结合低温高速离心，二者结合后进一步加强了清除脂类杂蛋白的能力，有助于获得更纯净的补体C1q的高值。普通的离心即可清除脂类等杂蛋白，但本发明制备中所述离心进一步限定为低温离心，由于低温时脂类和杂蛋白溶解度低，利用此特征进行低温离心，能够更有效地清除脂类等杂质；步骤S8中所述离心不仅强调为低温离心，还强调为大于10000rpm的高转速离心，配合透析等操作，更有利于获得相对更加纯净的高值粗品；步骤S8中所述冻融还特别强调置于‑15℃以下需要待完全冷冻（=冻结实了）后于室温完全融化（完全无冰晶）等操作细节，也加强了所获得高值粗品的纯净度。

[0031] 本发明所述制备过程中的关键步骤包括调PH步骤S4和最后的配制步骤S9。其中，优化筛选出用于调PH的溶液为10‑50%冰醋酸，此处特别强调要缓慢地加入冰醋酸，以便将PH值严格调至4.6～4.8的酸性范围内，该过程中需要严格控制PH值，保证PH值在4.6～4.8内，进一步筛选出的最优PH值=4.65。具体地，研究过程中发现PH值在4.6～4.8内对获得补体C1q的高值尤其重要：如果PH值偏高则获得的补体C1q中高值参考物质的含量降低，甚至于无法获得高达560mg/L补体C1q的高值；如果PH值偏低则获得的补体C1q参考物质中因含脂类杂蛋白多造成整体高值但明显浑浊的溶液外观。如果PH值限定在4.6～4.8内，不仅能够尽可能降低高值脂类的含量，还能够保证补体C1q参考物质的外观透亮度；反之，如果选用其他酸性溶液调PH值、或者酸性范围不能严格控制在4.6～4.8内，最终获得的补体C1q参考物质中高值脂类的含量较高从而导致外观浑浊不透亮。此外，步骤S4中在将PH值调至4.6～4.8内后，置于2～8℃静置2‑10小时后、再进行离心后弃沉淀。S1和S4中的“静置”都有助于将溶液中的沉淀物初步静置下来，在步骤S4离心前加入“静置”的细节优化，有助于后续的离心进一步去除溶液沉淀中的杂蛋白和脂类，实现“1+1>2”的有益效果。因此，步骤S4中用冰醋酸将PH值且调至4.6～4.8是补体C1q参考物质的关键制备步骤和关键参数。此外，步骤S9中，优选的体系稀释液也是本发明的关键，通过体系稀释液解决了传统液体制剂2～8℃保存不稳定的问题。

[0032] 体外诊断试剂的检测系统是指由样本处理用产品、检测试剂、校准品、质控品、检测设备等构成的，可完成待测样本从处理到最终结果报告所有阶段的组合。本发明所述补体C1q参考物质的制备方法可以制备获得补体C1q不同浓度的系列参考物质，从而可以一次性制备获得覆盖正常测试范围和异常测试范围内的校准品或质控品，这些系列参考物质可以单独注册、也可以与对应的补体C1q检测试剂合并申请注册，优选用于免疫比浊法的补体C1q检测试剂，有助于完善补体C1q的检测系统、并提高补体C1q检测系统的性能水平。此外，本发明所述液体参考物质的制备方法简便可控、成本低廉且生产原料获取容易，适合批量生产，有助于工业化生产，与各个厂家试剂的适配性高，从热加速实验和长期存放实验可以看出本发明所述参考物质特异性强、稳定性好，于2～8℃保存有效期可延长至15个月。

附图说明

[0033] 图1为本发明补体C1q参考物质的制备方法的流程图。

具体实施方式

[0034] 下面结合附图详细描述本发明的示例性的实施例，其中相同或相似的表示相同的概念，比如补体C1q可以简称C1q、PBS=磷酸缓冲液、HEPES=4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、MES=2‑（N‑吗啉代）乙磺酸、Tris=三羟甲基氨基甲烷、CAA=二氯乙酰胺。

[0035] 在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

[0036] 下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照检测试剂和其产品说明书进行。

[0037] 本发明实施中所述试剂，是指按医疗器械管理的体外诊断试剂，包括体外检测离体样本的提取试剂、检测试剂盒、校准品、质控品等产品。所述检测应用对象是指采自于人体或动物体的组织、体液或排泄物等生物样本，比如已经脱离了有生命的人体或动物体的血液样品（全血/血清/血浆）和体液样品（尿液/粪便/脑脊液/浆膜腔积液/精液/前列腺液/阴道分泌物/胃液/十二指肠引流液及胆汁/痰液）等，属于离体的、无生命的样本；所述检测的直接目的，是为了检测待测样品中补体C1q的含量，不存在直接获得疾病的诊断结果或健康状况的过程，因此，本发明不属于疾病的诊断方法，符合《专利法》对专利保护客体的基本要求。

[0038] 本发明提供了一种补体C1q参考物质、制备方法及其应用，其中补体C1q参考物质为能够覆盖正常测试范围及异常测试范围的一系列不同的目标浓度的液体制品，该目标浓度的赋值范围为60～560mg/L。该补体C1q参考物质利用人血清作为制备材料，通过离心，过滤，PEG沉淀、硫酸铵沉淀、调PH值=4.65±、透析、冻融等步骤制备获得补体C1q的高值半成品，再用体系稀释液配置成不同目标浓度的系列参考物质，该制备方法能够一次性获得较广浓度覆盖范围的参考范围，解决现有的不同厂家差异较大、液体制剂在2～8℃保存不稳定、高值参考物质稀有等技术问题。本发明制备的补体C1q的系列参考物质可以单独注册，也可以与对应的补体C1q试剂合并申请注册，能够广泛应用在补体C1q的校准品、质控品、标准品或者检测试剂盒等试剂领域中。下面将详细描述本发明的优化筛选的具体实施例。以下实施例中，如果以新鲜的人血清作为制备材料，需要静置至少2小时后使用，如果以2～8℃冷藏的人血清作为制备材料，要求于2～8℃冷藏时间不超过两周；根据常见行业标准，参考物质的有效期暂定为12个月。

[0039] 实施例1：制备补体C1q参考物质（PBS缓冲液）

[0040] S1预处理：取用量体积为V的人血清样本，于2～8℃静置8小时后，低温离心弃沉淀（去除杂质和部分脂类蛋白），上清溶液过滤得滤液；

[0041] S2稀释、沉淀：滤液先用2倍人血清样本体积的10mmol/L PBS缓冲液（用量体积为2V）稀释，再加入15%PEG6000沉淀至少2小时（2～8小时）后低温离心弃上清，得沉淀物；

[0042] S3复溶：沉淀物用10mmol/L PB缓冲液进行复溶，该复溶缓冲液的用量体积为2V，得复溶液；

[0043] S4调PH：复溶液中缓慢加入10%冰醋酸用于调PH值，PH值调至4.7后，第二次置于2～8℃静置6小时，再次低温离心弃沉淀，得上清溶液；

[0044] S5二次沉淀：上清溶液中加入2moL/L饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，低温离心得二次沉淀物；

[0045] S6二次复溶：用10mmol/L PBS缓冲液复溶二次沉淀物，该二次复溶缓冲液用量体积为1/6V，完全溶解后得补体C1q的高浓度溶液；

[0046] S7透析：取高浓度溶液装入透析袋中，置于10mmol/L PBS缓冲液中进行透析去除高盐，用电导仪测定至电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；

[0047] S8冻融：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻后，再于室温待完全融化后，使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；

[0048] S9配制：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同浓度的系列参考物质，包括4个浓度水平（70mg/L±、140mg/L±、280mg/L±、560mg/L±）的标准品和2个浓度水平（180mg/L±、280mg/L±）的质控品。其中，体系稀释液的组成为：50mmol/L PBS、20g/L乳糖、5g/L牛血清白蛋白、30%甘油、0.4g/L硫酸庆大霉素。

[0049] 对制备的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品置于2～8℃长期保存至有效期后三个月，有效期内每月定期取样进行补体C1q的含量测定、有效期后三个月再次进行含量测定，数据如下：

[0050] 表1：实施例1所制得补体C1q含量的稳定性

[0051] ；

[0052] 表1所示按照实施例1所述制备获得的系列参考物质的稳定性检测结果：由系列参考物质稀释获得的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品，置于2～8℃长期保存12个月后，CV值均小于5%，且CV值能保持在小于等于2.01%范围内，即实施例1制备获得的不同浓度水平的标准品和质控品均具有良好的稳定性。此外，上述参考物质于2～8℃长期保存至有效期后三个月的含量与初始保存1月的含量之间偏差均小于5%，可见按照实施例1所述制备获得的系列参考物质，推测由于调节PH值=4.7及体系稀释液中组分和比例的主要优化（50mmol/L PBS、20g/L乳糖、30%甘油、0.4g/L硫酸庆大霉素），使得于2～8℃长期保存15个月依然具有良好的稳定性，因此，实施例1所述制备获得的系列参考物质的有效期可延长至15个月。

[0053] 实施例2：制备补体C1q参考物质（PBS缓冲液）

[0054] S1预处理：取用量体积为V的人血清样本，于2～8℃静置6小时后，低温离心弃沉淀（去除杂质和部分脂类蛋白），上清溶液过滤得滤液；

[0055] S2稀释、沉淀：滤液先用3倍人血清样本体积的10mmol/L PBS缓冲液（用量体积为3V）稀释，再加入10% PEG6000沉淀至少2小时后低温离心弃上清，得沉淀物；

[0056] S3复溶：沉淀物用10mmol/L PB缓冲液进行复溶，该复溶缓冲液的用量体积为3V，得复溶液；

[0057] S4调PH：向复溶液中缓慢加入20%冰醋酸，调PH值至4.8后，第二次置于2～8℃静置4小时，再次低温离心弃沉淀，得上清溶液；

[0058] S5二次沉淀：上清溶液中加入3moL/L饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，低温离心得二次沉淀物；

[0059] S6二次复溶：用15mmol/L PBS缓冲液复溶二次沉淀物，该二次复溶缓冲液用量体积为1/7V，完全溶解后得补体C1q的高浓度溶液；

[0060] S7透析：取高浓度溶液装入透析袋中，置于15mmol/L PBS缓冲液中进行透析去除高盐，用电导仪测定电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；

[0061] S8冻融：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻后，再于室温待完全融化后，使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；

[0062] S9配制：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同浓度的系列参考物质，包括4个浓度水平（70mg/L±、140mg/L±、280mg/L±、560mg/L±）的标准品和2个浓度水平（180mg/L±、280mg/L±）的质控品。其中，体系稀释液的组成为：40mmol/L PBS、10g/L乳糖、5g/L牛血清白蛋白、15%甘油、0.05%苯甲酸钠。

[0063] 对制备的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品置于2～8℃长期保存至有效期后三个月，有效期内每月定期取样进行补体C1q蛋白的含量测定、有效期后三个月再次进行含量测定，数据如下：

[0064] 表2：实施例2所制得补体C1q含量的稳定性

[0065] ；

[0066] 表2所示按照实施例2所述制备获得的系列参考物质的稳定性检测结果：由系列参考物质稀释获得的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品，置于2～8℃长期保存12个月后，参考物质制备为70mg/L±和180mg/L±这2个浓度水平的CV值大于5%，而且长期保存至超过有效期后三个月的含量偏差均远远大于5%，可见按照实施例2所述制备获得的系列参考物质，由于制备方法中参数的微小变化，尤其体系稀释液的组分和比例的变化（40mmol/L PBS、乳糖浓度调至10g/L、甘油浓度调至15%、0.05%苯甲酸钠），与实施例1相比，体系稀释液中缓冲液、乳糖和甘油的浓度有所调整，导致制备获得的不同浓度水平的参考物质有效期内相对不稳定，12月稳定性也不能符合参考物质的基本质量标准要求，可见保护剂中乳糖和甘油的浓度对保持参考物质的稳定性存在一定的影响。

[0067] 实施例3：制备补体C1q参考物质（HEPES缓冲液）

[0068] S1预处理：取用量体积为V的人血清样本，于2～8℃静置4小时后，低温离心弃沉淀（去除杂质和部分脂类蛋白），上清溶液过滤得滤液；

[0069] S2稀释、沉淀：滤液先用2倍人血清样本体积的10mmol/L PBS缓冲液（用量体积为2V）稀释，再加入10% PEG6000沉淀至少2小时后低温离心弃上清，得沉淀物；

[0070] S3复溶：沉淀物用10mmol/L PB缓冲液进行复溶，该复溶缓冲液的用量体积为3V，得复溶液；

[0071] S4调PH：向复溶液中缓慢加入30%冰醋酸，调PH值至4.6后，第二次置于2～8℃静置2小时，再次低温离心弃沉淀，得上清溶液；

[0072] S5二次沉淀：上清溶液中加入2moL/L饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，低温离心得二次沉淀物；

[0073] S6二次复溶：用15mmol/L PBS缓冲液复溶二次沉淀物，该二次复溶缓冲液用量体积为1/8V，完全溶解后得补体C1q的高浓度溶液；

[0074] S7透析：取高浓度溶液装入透析袋中，置于15mmol/L PBS缓冲液中进行透析去除高盐，用电导仪测定电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；

[0075] S8冻融：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻后，再于室温待完全融化后，使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；

[0076] S9配制：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同浓度的系列参考物质，包括4个浓度水平（70mg/L±、140mg/L±、280mg/L±、560mg/L±）的标准品和2个浓度水平（180mg/L±、280mg/L±）的质控品。其中，体系稀释液的组成为：50mmol/L HEPES、20g/L乳糖、5g/L牛血清白蛋白、30%甘油、0.4g/L硫酸庆大霉素。

[0077] 对制备的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品置于2～8℃长期保存至有效期后三个月，有效期内每月定期取样进行补体C1q蛋白的含量测定、有效期后三个月再次进行含量测定，数据如下：

[0078] 表3：实施例3所制得补体C1q含量的稳定性

[0079] ；

[0080] 表3所示按照实施例3所述制备获得的系列参考物质的稳定性检测结果：由系列参考物质稀释获得的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品，置于2～8℃长期保存12个月后，CV值均小于5%、且不超过2%，即制备获得的不同浓度水平的标准品和质控品均具有良好的稳定性。此外，上述参考物质于2～8℃长期保存至有效期后三个月的含量与初始保存1月的含量之间偏差也均小于5%，推测由于调节PH值=4.6及体系稀释液中组分和比例的主要优化（50mmol/L HEPES、20g/L乳糖、30%甘油、0.4g/L硫酸庆大霉素），使得实施例3制备获得的系列参考物质于2～8℃长期保存15个月依然具有良好的稳定性，与实施例1相比，实施例3的有效期也能够延长至15个月。

[0081] 实施例4：制备补体C1q参考物质（TRIS缓冲液）

[0082] S1预处理：取用量体积为V的人血清样本，于2～8℃静置8小时后，低温离心弃沉淀（去除杂质和部分脂类蛋白），上清溶液过滤得滤液；

[0083] S2稀释、沉淀：滤液先用2倍人血清样本体积的10mmol/L PBS缓冲液（用量体积为2V）稀释，再加入13% PEG6000沉淀至少2小时后低温离心弃上清，得沉淀物；

[0084] S3复溶：沉淀物用10mmol/L PB缓冲液进行复溶，该复溶缓冲液的用量体积为2V，得复溶液；

[0085] S4调PH：向复溶液中缓慢加入50%冰醋酸，调PH值至4.65后，第二次置于2～8℃静置8小时，再次低温离心弃沉淀，得上清溶液；

[0086] S5二次沉淀：上清溶液中加入2moL/L饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，低温离心得二次沉淀物；

[0087] S6二次复溶：用10mmol/L PBS缓冲液复溶二次沉淀物，该二次复溶缓冲液用量体积为1/9V，完全溶解后得补体C1q的高浓度溶液；

[0088] S7透析：取高浓度溶液装入透析袋中，置于15mmol/L PBS缓冲液中进行透析去除高盐，用电导仪测定电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；

[0089] S8冻融：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻后，再于室温待完全融化后，使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；

[0090] S9配制：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同浓度的系列参考物质，包括4个浓度水平（70mg/L±、140mg/L±、280mg/L±、560mg/L±）的标准品和2个浓度水平（180mg/L±、280mg/L±）的质控品。其中，体系稀释液的组成为：50mmol/L Tris、20g/L乳糖、5g/L牛血清白蛋白、30%甘油、0.4g/L硫酸庆大霉素。

[0091] 对制备的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品置于2～8℃长期保存至有效期后三个月，有效期内每月定期取样进行补体C1q蛋白的含量测定、有效期后三个月再次进行含量测定，数据如下：

[0092] 表4：实施例4所制得补体C1q含量的稳定性

[0093] ；

[0094] 表4所示按照实施例4所述制备获得的系列参考物质的稳定性检测结果：由系列参考物质稀释获得的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品，置于2～8℃长期保存12个月后，CV值均小于5%、且不超过1.5%，即制备获得的不同浓度水平的标准品和质控品均具有良好的稳定性。此外，上述参考物质于2～8℃长期保存至有效期后三个月的含量与初始保存1月的含量之间偏差也均小于5%、且不超过3%，推测按照实施例4所述制备获得的系列参考物质，由于调节PH值=4.65及体系稀释液中组分和比例的主要优化（50mmol/L Tris、20g/L乳糖、30%甘油、0.4g/L硫酸庆大霉素），使得实施例4制备获得的系列参考物质于2～8℃长期保存15个月的稳定性依然良好，其有效期可适当延长至15个月。

[0095] 实施例5：制备补体C1q参考物质（甘氨酸缓冲液）

[0096] S1预处理：取用量体积为V的人血清样本，于2～8℃静置2小时后，低温离心弃沉淀（去除杂质和部分脂类蛋白），上清溶液过滤得滤液；

[0097] S2稀释、沉淀：滤液先用3倍人血清样本体积的10mmol/L PBS缓冲液（用量体积为3V）稀释，再加入13% PEG20000沉淀至少2小时后低温离心弃上清，得沉淀物；

[0098] S3复溶：沉淀物用10mmol/L PB缓冲液进行复溶，该复溶缓冲液的用量体积为2V，得复溶液；

[0099] S4调PH：向复溶液中缓慢加入40%冰醋酸，调PH值至4.5后，第二次置于2～8℃静置10小时，再次低温离心弃沉淀，得上清溶液；

[0100] S5二次沉淀：上清溶液中加入3moL/L饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，低温离心得二次沉淀物；

[0101] S6二次复溶：用15mmol/L PBS缓冲液复溶二次沉淀物，该二次复溶缓冲液用量体积为1/10V，完全溶解后得补体C1q的高浓度溶液；

[0102] S7透析：取高浓度溶液装入透析袋中，置于15mmol/L PBS缓冲液中进行透析去除高盐，用电导仪测定电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；

[0103] S8冻融：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻后，再于室温待完全融化后，使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；

[0104] S9配制：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同浓度的系列参考物质，包括4个浓度水平（70mg/L±、140mg/L±、280mg/L±、560mg/L±）的标准品和2个浓度水平（180mg/L±、280mg/L±）的质控品。其中，体系稀释液的组成为：50mmol/L 甘氨酸缓冲液、20g/L蔗糖、5g/L牛血清白蛋白、30%甘油、1.0 mL/L Krovin‑500。

[0105] 对制备的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品置于2～8℃长期保存至有效期后三个月，有效期内每月定期取样进行补体C1q蛋白的含量测定、有效期后三个月再次进行含量测定，数据如下：

[0106] 表5：实施例5所制得补体C1q含量的稳定性

[0107] ；

[0108] 表5所示按照实施例5所述制备获得的系列参考物质的稳定性检测结果：由系列参考物质稀释获得的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品，置于2～8℃长期保存12个月，随着保存时间的延长、C1q含量的检测值逐渐下降，且参考物质制备为70mg/L±和180mg/L±这2个浓度水平的CV值大于5%，而且超过有效期后三个月(即保存15月后)，4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品的偏差均远远大于5%，可见按照实施例5所述制备获得的系列参考物质，由于制备方法中参数的微小变化，尤其PH值调至4.5和体系稀释液中组分和比例的变化：50mmol/L 甘氨酸缓冲液、20g/L蔗糖、30%甘油、1ml/L Krovin‑500，导致获得的不同浓度水平的参考物质的含量极不稳定，即便在常见12个月有效期范围内也无法使用。

[0109] 实施例6：制备补体C1q参考物质（MES缓冲液）

[0110] S1预处理：取用量体积为V的人血清样本，于2～8℃静置4小时后，低温离心弃沉淀（去除杂质和部分脂类蛋白），上清溶液过滤得滤液；

[0111] S2稀释、沉淀：滤液先用3倍人血清样本体积的10mmol/L PBS缓冲液（用量体积为3V）稀释，再加入8% PEG6000沉淀至少2小时后低温离心弃上清，得沉淀物；

[0112] S3复溶：沉淀物用10mmol/L PB缓冲液进行复溶，该复溶缓冲液的用量体积为2V，得复溶液；

[0113] S4调PH：向复溶液中缓慢加入10%冰醋酸，调PH值至4.9后，第二次置于2～8℃静置4小时，再次低温离心弃沉淀，得上清溶液；

[0114] S5二次沉淀：上清溶液中加入4moL/L饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，低温离心得二次沉淀物；

[0115] S6二次复溶：用15mmol/L PBS缓冲液复溶二次沉淀物，该二次复溶缓冲液用量体积为1/11V，完全溶解后得补体C1q的高浓度溶液；

[0116] S7透析：取高浓度溶液装入透析袋中，置于10mmol/L PBS缓冲液中进行透析去除高盐，用电导仪测定电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；

[0117] S8冻融：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻后，再于室温待完全融化后，使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；

[0118] S9配制：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同浓度的系列参考物质，包括4个浓度水平（70mg/L±、140mg/L±、280mg/L±、560mg/L±）的标准品和2个浓度水平（180mg/L±、280mg/L±）的质控品。其中，体系稀释液的组成为：50mmol/L MES缓冲液、20g/L右旋糖酐、5g/L牛血清白蛋白、30%甘油、1.0mL/L Proclin30。

[0119] 对制备的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品置于2～8℃长期保存至有效期后三个月，有效期内每月定期取样进行补体C1q蛋白的含量测定、有效期后三个月再次进行含量测定，数据如下：

[0120] 表6：实施例6所制得补体C1q含量的稳定性

[0121] ；

[0122] 表6所示按照实施例6所述制备获得的系列参考物质的稳定性检测结果：由系列参考物质稀释获得的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品，置于2～8℃长期保存12个月，虽然，随着保存时间的延长、C1q含量的检测值存在逐渐下降的趋势，且有效期后三个月(15月)，4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品含量与初始保存1月含量之间的偏差均大于5%，其中高值560mg/L±浓度水平的标准品的偏差为‑5.11%，与实施例1相比，实施例6所制得参考物质的稳定性相对较差。但是，有效期内参考物质的CV值均小于5%，即12个月有效期内参考物质处于能够接受的质量标准内。推测按照实施例6所述制备获得的系列参考物质，由于制备方法中参数的微小变化，尤其体系稀释液中组分和比例的变化：50mmol/L MES缓冲液、20g/L右旋糖酐、1.0mL/L Proclin30，导致获得的不同浓度水平的参考物质仅在12个月有效期内可用。

[0123] 实施例7：制备补体C1q参考物质（PBS缓冲液）

[0124] S1预处理：取用量体积为V的人血清样本，于2～8℃静置8小时后，低温离心弃沉淀（去除杂质和部分脂类蛋白），上清溶液过滤得滤液；

[0125] S2稀释、沉淀：滤液先用2倍人血清样本体积的10mmol/L PBS缓冲液（用量体积为2V）稀释，再加入15% PEG6000沉淀至少2小时后低温离心弃上清，得沉淀物；

[0126] S3复溶：沉淀物用10mmol/L PB缓冲液进行复溶，该复溶缓冲液的用量体积为2V，得复溶液；

[0127] S4调PH：向复溶液中缓慢加入30%冰醋酸，调PH值至4.7后，第二次置于2～8℃静置2小时，再次低温离心弃沉淀，得上清溶液；

[0128] S5二次沉淀：上清溶液中加入3moL/L饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，低温离心得二次沉淀物；

[0129] S6二次复溶：用15mmol/L PBS缓冲液复溶二次沉淀物，该二次复溶缓冲液用量体积为1/6V，完全溶解后得补体C1q的高浓度溶液；

[0130] S7透析：取高浓度溶液装入透析袋中，置于10mmol/L PBS缓冲液中进行透析去除高盐，用电导仪测定电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；

[0131] S8冻融：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻后，再于室温待完全融化后，使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；

[0132] S9配制：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同浓度的系列参考物质，包括4个浓度水平（70mg/L±、140mg/L±、280mg/L±、560mg/L±）的标准品和2个浓度水平（180mg/L±、280mg/L±）的质控品。其中，体系稀释液的组成为：50mmol/L PBS缓冲液、20g/L乳糖、10g/L牛血清白蛋白、30%甘油、0.4g/L硫酸庆大霉素。

[0133] 对制备的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品置于2～8℃长期保存至有效期后三个月，有效期内每月定期取样进行补体C1q蛋白的含量测定、有效期后三个月再次进行含量测定，数据如下；

[0134] 表7：实施例7所制得补体C1q含量的稳定性

[0135] ；

[0136] 表7所示按照实施例7所述制备获得的系列参考物质的稳定性检测结果：由系列参考物质稀释获得的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品，置于2～8℃长期保存12个月后，CV值均小于5%、且均不超过2%，即制备获得的不同浓度水平的标准品和质控品均具有良好的稳定性。此外，上述参考物质于2～8℃长期保存至超过有效期后三个月（15月）含量与初始保存1月含量之间的偏差也均小于4%，可见按照实施例4所述制备获得的系列参考物质，推测由于调节PH值=4.7及体系稀释液中组分和比例的主要优化（50mmol/L PBS缓冲液、牛血清白蛋白调至10g/L、0.4g/L硫酸庆大霉素），使得于2～8℃长期保存15个月的稳定性良好，其有效期可适当延长至15个月。

[0137] 实施例8：制备补体C1q参考物质（PBS缓冲液）

[0138] S1预处理：取用量体积为V的人血清样本，于2～8℃静置10小时后，低温离心弃沉淀（去除杂质和部分脂类蛋白），上清溶液过滤得滤液；

[0139] S2稀释、沉淀：滤液先用2倍人血清样本体积（用量体积为2V）的10mmol/L PBS缓冲液稀释，再加入10% PEG6000沉淀至少2小时后低温离心弃上清，得沉淀物；

[0140] S3复溶：沉淀物用10mmol/L PB缓冲液进行复溶，该复溶缓冲液的用量体积为3V，得复溶液；

[0141] S4调PH：向复溶液中缓慢加入50%冰醋酸，调PH值至4.8后，第二次置于2～8℃静置8小时，再次低温离心弃沉淀，得上清溶液；

[0142] S5二次沉淀：上清溶液中加入2moL/L饱和硫酸铵溶液沉淀至少2小时后，低温离心得二次沉淀物；

[0143] S6二次复溶：用10mmol/L PBS缓冲液复溶二次沉淀物，该二次复溶缓冲液用量体积为1/5V，完全溶解后得补体C1q的高浓度溶液；

[0144] S7透析：取高浓度溶液装入透析袋中，置于15mmol/L PBS缓冲液中进行透析去除高盐，用电导仪测定电导为10～20ms/cm，得补体C1q的高值粗品；

[0145] S8冻融：取高值粗品置于‑15℃以下完全冷冻后，再于室温待完全融化后，使用低温高速离心机进行离心，取上清液，得补体C1q的高值半成品；

[0146] S9配制：高值半成品中分别加入不同体积的体系稀释液，得补体C1q不同浓度的系列参考物质，包括4个浓度水平（70mg/L±、140mg/L±、280mg/L±、560mg/L±）的标准品和2个浓度水平（180mg/L±、280mg/L±）的质控品。其中，体系稀释液的组成为：60mmol/L PBS缓冲液、20g/L海藻糖、15g/L牛血清白蛋白、30%甘油、0.4g/L硫酸庆大霉素。

[0147] 对制备的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品置于2～8℃长期保存至有效期后三个月，有效期内每月定期取样进行补体C1q蛋白的含量测定、有效期后三个月再次进行含量测定，数据如下；

[0148] 表8：实施例8所制得补体C1q含量的稳定性

[0149] ；

[0150] 表8所示按照实施例8所述制备获得的系列参考物质的稳定性检测结果：由系列参考物质稀释获得的4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品，置于2～8℃长期保存12个月，虽然随着保存时间的延长、C1q含量的检测值略存在下降趋势，且有效期后三个月(即保存15月后)，4个浓度水平的标准品和2个浓度水平的质控品的CV值基本都大于5%，其中280mg/L±浓度水平的质控品的CV值为‑4.47%，与实施例1相比，稳定性相对较差。但是，有效期内参考物质的CV值均小于5%且保持在小于3%的水平，即有效期内参考物质处于能够接受的质量标准内。推测按照实施例8所述制备获得的系列参考物质，由于制备方法中参数的微小变化，尤其体系稀释液中组分和比例的变化：60mmol/LPBS缓冲液、15g/L牛血清白蛋白、0.4g/L硫酸庆大霉素，导致获得的不同浓度水平的参考物质虽然在有效期内可用，但时保存15月已超出质量标准要求的稳定性范围。

[0151] 与实施例1所配制的体系稀释液的组分相比，实施例3和实施例4仅缓冲液不同、分别是50mmol/L PBS、50mmol/L HEPES和50mmol/L Tris，实施例7仅牛血清白蛋白的浓度调整为10g/L，但是，按照实施例3、实施例4和实施例7所制备获得的系列参考物质的有效期都能够延长至15个月，且参考物质的稳定性相对较好。

[0152] 本发明提供了一种补体C1q参考物质，制备方法及其应用，以人血清为制备材料，通过离心，过滤，沉淀、调PH、透析、冻融等各个步骤的优化组合，其中，PH值优选4.65±，并配合组分优化的体系稀释液制得不同目标浓度的系列补体C1q参考物质的液体制剂，该目标浓度的赋值范围为60～560mg/L，该范围覆盖正常测试范围及异常测试范围，可以应用于制备成不同目标浓度水平的标准品、质控品等参考物质，所获参考物质使用方便、特异性强、稳定性好，2～8℃冷藏保存最长可达15个月，解决现有的不同厂家差异较大、液体制剂在2～8℃保存不稳定、高值参考物质稀有等技术问题，本发明补体C1q参考物质的制备方法更适合批量生产，有助于工业化生产和市场标准的统一。