抗菌肽PLN-2及其应用转让专利
申请号 : CN202410035849.6
文献号 : CN117551175B
文献日 : 2024-03-19
发明人 : 扎木苏 , 李建立 , 青格乐 , 陈永福 , 夏亚男 , 乌斯嘎勒
申请人 : 内蒙古农业大学
摘要 :
本发明公开了抗菌肽PLN‑2及其应用，涉及肽类抑制剂技术领域。抗菌肽PLN‑2的氨基酸序列为VVSGHRINGKNQLLISAGLK，如SEQ ID NO.1所示。抗菌肽PLN‑2对大肠杆菌的最低抑菌浓度为2.97 mM。本发明采用上述的抗菌肽PLN‑2及其应用，PLN‑2具有大肠杆菌抑菌活性，通过对大肠杆菌细胞膜结构产生破坏从而发挥作用；抗菌肽PLN‑2不易产生耐药性，且低细胞毒性和高细胞选择性，可以用于制备治疗大肠杆菌感染的新型抗菌药物。
权利要求 :
1.抗菌肽PLN‑2在制备抗大肠杆菌药物中的应用，其特征在于：抗菌肽PLN‑2的氨基酸序列为VVSGHRINGKNQLLISAGLK，如SEQ ID NO.1所示。
2.抗菌肽PLN‑2在制备抗菌剂中的应用，其特征在于：抗菌肽PLN‑2的氨基酸序列为VVSGHRINGKNQLLISAGLK，如SEQ ID NO.1所示，抗菌剂为抗大肠杆菌的抗菌剂，抗菌肽PLN‑2对大肠杆菌的最低抑菌浓度为2.97 mM。
说明书 :
抗菌肽PLN‑2及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及肽类抑制剂技术领域，尤其是涉及抗菌肽PLN‑2及其应用。
背景技术
[0002] 在人类历史上，食源性疾病病一直是全球威胁生命健康的严重问题之一。致病性E.coil（大肠杆菌）具有许多毒力策略，除肠入侵性 E.coil 外，所有病原体是通过菌毛或鞭毛与宿主细胞粘附，之后产生分泌蛋白破坏宿主细胞的正常生命进程。亚硝酸盐和二氧化硫等化学防腐剂，可延缓甚至阻止微生物的生长，防止食品变质，目前被广泛应用于食品保存。但越来越多的研究证实，长期使用化学防腐剂可能对人体健康产生负面影响，近些年消费者也更倾向于选择不含化学添加剂的“天然食品”。同时由于抗生素滥用，细菌已进化出各种策略逃避其杀灭作用，使多重耐药菌感染治疗成为严峻的挑战。这促使研究人员寻找有效的天然抗菌剂替代化学防腐剂及抗生素，以提高产品质量和安全性，并防治食源性疾病。抗菌肽PLN‑2具有抗E. coil 活性，易被人体降解不易产生毒性，使其成为极有前景的防治食源性疾病的化合物。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供抗菌肽PLN‑2及其应用，PLN‑2具有大肠杆菌抑菌活性，通过对大肠杆菌细胞膜结构产生破坏从而发挥作用；抗菌肽PLN‑2不易产生耐药性，且低细胞毒性和高细胞选择性，可以用于制备治疗大肠杆菌感染的新型抗菌药物。
[0004] 为实现上述目的，本发明提供了抗菌肽PLN‑2，其氨基酸序列为VVSGHRINGKNQLLISAGLK，如SEQ ID NO.1所示。
[0005] 本发明还提供了抗菌肽PLN‑2在制备抗菌剂中的应用。
[0006] 进一步的，所述抗菌肽对大肠杆菌的最低抑菌浓度为2.97 mM。
[0007] 本发明还提供了抗菌肽PLN‑2在制备抗大肠杆菌药物中的应用。
[0008] 本发明还提供了一种组合物，所述组合物的有效成分为抗菌肽PLN‑2。
[0009] 本发明还提供了一种抑菌添加剂，所述抑菌添加剂的有效成分为抗菌肽PLN‑2。
[0010] 本发明所述的抗菌肽PLN‑2及其应用的优点和积极效果是：
[0011] 1、本发明中的抗菌肽PLN‑2具有大肠杆菌抑菌活性，通过对大肠杆菌细胞膜结构产生破坏从而发挥作用。
[0012] 2、本发明中的抗菌肽PLN‑2不易产生耐药性，且低细胞毒性和高细胞选择性，可以用于制备治疗大肠杆菌感染的新型抗菌药物。
[0013] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0014] 图1为本发明实施例中PLN‑2的最低抑菌浓度，其中A、B、C、D、E指示菌为E.coil（大7
肠杆菌），a、b、c、d、e指示菌为 S.aureus（金黄色葡萄球菌）；指示菌初始浓度均为10CFU/mL，A、B、C、D、E和a、b、c、d、e中PLN‑2 浓度分别为0 mM、0.76 mM、1.49 mM、2.97 mM和5.94 mM；
肠杆菌），a、b、c、d、e指示菌为 S.aureus（金黄色葡萄球菌）；指示菌初始浓度均为10CFU/mL，A、B、C、D、E和a、b、c、d、e中PLN‑2 浓度分别为0 mM、0.76 mM、1.49 mM、2.97 mM和5.94 mM；
[0015] 图2为本发明实施例中PLN‑2对E.coil的时间杀伤曲线；
[0016] 图3为本发明实施例中PLN‑2酶处理后对E.coil活菌数的影响；
[0017] 图4为本发明实施例中E.coil和S.aureus的SEM图，其中A为未经抗菌肽PLN‑2处理的正常E.coil，B为经过抗菌肽PLN‑2处理的E.coil，C为未经抗菌肽PLN‑2处理的S.aureus，D为经过抗菌肽PLN‑2处理的S.aureus；
[0018] 图5为本发明实施例中PEP‑FOLD与I‑TASSER预测PLN‑2的三维结构与分别绘制的Ramchndran和ProSA验证图，其中A为PEP‑FOLD预测的PLN‑2的三维结构，B为Ramchndranplot预测结果，C为ProSA验证结果，D为I‑TASSER预测的PLN‑2三维结构，E为Ramchndranplot预测结果，F为ProSA验证结果；
[0019] 图6为本发明实施例中PLN‑2与 E.coil 结构关键蛋白分子进行对接结果的3D可视化，其中A为PLN‑2与4RHB的最佳对接构象3D图，B为PLN‑2与4RHB的最佳对接3D可视化图，C为B中部分区域放大图；
[0020] 图7为本发明实施例中PLN‑2与 E.coil 结构关键蛋白进行分子对接结果的2D可视化。
具体实施方式
[0021] 以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
[0022] 本发明中 E.coil 为大肠杆菌， S. aureus 为金黄色葡萄球菌。
[0023] 本发明中植物乳植杆菌IMAU80028由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。
[0024] 实施例1
[0025] 采用固相合成法（常规步骤）合成抗菌肽PLN‑2。
[0026] 实施例2抗菌肽PLN‑2的安全评价
[0027] 筛选通过LC‑MS方法鉴定植物乳植杆菌IMAU80028半纯化上清液中的肽段。使用在线软件CAMPR3预测肽段的抑菌活性。肽段的理化性质包括净电荷数、GRAVY总平均亲水性和Wimley‑White全残基疏水性标度、蛋白结合势（Boman index）使用在线软件APD3进行计算；等电点和不稳定性指数使用ProtParam在ExPASy中预测。结合CAMPR3预测和肽段的理化性质，筛选出预测具有良好抑菌活性的肽段PLN‑2。
[0028] 将筛选的肽段PLN‑2进行ADMET评分，评分包括肽段的吸收、分布、代谢、排泄和毒性特性。首先通过基于网络的工具PepSMI获得了抗菌肽的SMILES结构式。随后将SMILES结构式输入ADMETlab平台，评估涉及人体肠道吸收、诱变性、致癌性、中枢神经系统渗透性、药物性肝损伤、细胞色素P450酶抑制、清除率、半衰期和皮肤致敏等关键参数的吸收、分布、代谢、排泄和毒性特征。
[0029] 定量构效关系建模是一种用于推断结构与活性之间关系的方法。这种方法利用了机器学习算法，使用统计方法学习和提取一些重要的特征进行预测分析新分子的性质。CAMPR3在线网站是一个包含原核生物和真核生物抗菌肽序列、结构和家族特异性特征的数据库，CAMPR3通过数据库检索和对抗菌肽家族特征检索，预测肽段序列是否具有有抑菌性。
同时，还可以整体上根据肽的分子量、净电荷、疏水性（GRAVY、Wimley‑White）和Bomanindex等特性，预测肽的抑菌潜力。
同时，还可以整体上根据肽的分子量、净电荷、疏水性（GRAVY、Wimley‑White）和Bomanindex等特性，预测肽的抑菌潜力。
[0030] 通过上述指标，得出肽段PLN‑2（VVSGHRINGKNQLLISAGLK，SEQ ID NO.1所示），CAMPR3分数均>0.5预测具有抑菌活性；净电荷数>2，GRAVY指数>0，Wimley‑White标度在2‑4之间，表明其均属于阳离子疏水性肽；Boman index在0‑1范围；pI为碱性（表1所示）。
[0031] 表1
[0032] ；
[0033] 此外，如表2所示，PLN‑2的ADMET谱表现出其为安全可靠的。
[0034] 表2
[0035] ；
[0036] 通过ADMET预测的肽段PLN‑2采用固相合成法合成。
[0037] 实施例3抗菌肽的活性分析
[0038] 1.最低抑菌浓度测定。
[0039] 将指示菌 E.coil 与 S.aureus 活化传至第二代，37℃震荡培养12 h至对数生长6 7
期，使用磷酸缓冲液将指示菌浓度调整至1×10‑10CFU/mL。取抗菌肽PLN‑2样品25 mg溶解与1mL PBS中，过0.22 μm滤膜除菌，将其梯度稀释，分别与等体积菌悬液混合，使抗菌肽终浓度为12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.13 mg/mL、和1.56 mg/mL。空白对照为PBS与等体积菌悬液混合。在37℃下孵育2 h使抗菌肽充分发挥作用后，取30 μL反应液进行涂布，置于37℃培养箱培养14 h。抑菌活性如图1所示，结果表明，PLN‑2浓度为1.49mM和2.97 mM时，使 E.coil 活菌数分别减少33%和100% （图1中A、B、C、D、E所示）。但对 S.aureus 无抑菌活性(（图1中a、b、c、d、e所示）。最低抑菌浓度MIC为2.97 mM。
期，使用磷酸缓冲液将指示菌浓度调整至1×10‑10CFU/mL。取抗菌肽PLN‑2样品25 mg溶解与1mL PBS中，过0.22 μm滤膜除菌，将其梯度稀释，分别与等体积菌悬液混合，使抗菌肽终浓度为12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.13 mg/mL、和1.56 mg/mL。空白对照为PBS与等体积菌悬液混合。在37℃下孵育2 h使抗菌肽充分发挥作用后，取30 μL反应液进行涂布，置于37℃培养箱培养14 h。抑菌活性如图1所示，结果表明，PLN‑2浓度为1.49mM和2.97 mM时，使 E.coil 活菌数分别减少33%和100% （图1中A、B、C、D、E所示）。但对 S.aureus 无抑菌活性(（图1中a、b、c、d、e所示）。最低抑菌浓度MIC为2.97 mM。
[0040] 2.时间杀伤曲线。
[0041] 培养 E.coil 指示菌。将指示菌悬液与抗菌肽溶液或PBS体积比1：1混合，使抗菌肽终浓度为0MIC、0.5MIC、1MIC，0MIC作为空白对照。在0h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h时取样，使用平板倾注法活菌计数。37℃培养24 h后统计活菌数，绘制抗菌肽对指示菌的时间杀伤曲线。
[0042] 时间杀伤曲线如图2所示。PLN‑2对 E.coil 具有浓度依赖性的抑菌活性，同时抑菌效果随着处理时间的延长而增强。并且1MIC处理0.5h时可将全部指示菌杀死，说明PLN‑2具有迅速的抑菌作用。
[0043] 综上，图1中PLN‑2对两种指示菌（ E.coil 和 S.aureus ）抑菌活性的差异，推测原因为两种指示菌（ E.coil 和 S.aureus ）分别属于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖结构较厚使得部分抗菌肽难以穿过，而革兰氏阴性菌虽然肽聚糖层较薄，但具有外膜结构防御抗菌肽。
[0044] 3.蛋白酶处理。
[0045] 培养 E.coil 指示菌。分别称取终浓度2mg/mL胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶k，与终浓度1MIC的PLN‑2充分混合；同时浓度为1MIC但未经蛋白酶处理PLN‑2作为酶处理实验组的对照组。37℃孵育5h使其充分反应。之后将样品与等体积菌悬液混合处理2h，通过平板倾注法活菌计数验证其抑菌效果，37℃培养24h后统计活菌数。
[0046] 结果如图3所示，对照组为指示菌加1MIC抗菌肽处理，空白组为指示菌加等量的PBS处理，其余实验组为指示菌加被蛋白酶处理后的抗菌肽。实验结果中指示菌的活菌数越高，说明样品的抑菌活性越差。PLN‑2被胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理后活性降低，其中木瓜蛋白酶使其活性完全丧失，但胰蛋白酶处理没有影响PLN‑2的活性。酶处理实验表明产生抑菌活性的物质为抗菌肽，并且这种对蛋白酶的敏感性可以防止抗菌肽在体内积累，提高其安全性。
[0047] 实施例4抗菌肽的抑菌机制
[0048] 1.扫描电子显微镜。
[0049] 将指示菌 S.aureus 与 E.coil 分别培养至对数生长期，4000r/min低速离心5min收集绿豆大小菌泥，使用PBS清洗菌泥三次，以清除菌体表面附着的杂质。使用1MIC浓度的PLN‑2处理E.coil为实验组，使用1MIC浓度的PLN‑2处理S.aureus 为实验对照组，使用等体积PBS处理指示菌为空白组。将指示菌与处理液充分混合，于37℃孵育2h，之后4000r/min离心5min，吸弃上清，保留菌泥沉淀。继续加入2.5%戊二醛电镜固定液室温固定2h，然后置于4℃过夜固定，接着用乙醇脱水15min，进行充分干燥后，在IB‑3型离子镀金仪上对菌体细胞进行喷金镀膜，通过SEM对样品进行观察。结果如图4所示，图4中A为未经抗菌肽处理的正常E.coil，细胞形态呈饱满的杆状，可以观察到细胞壁表面完整清晰的纹理结构。图4中B为经过PLN‑2处理的E.coil，菌体边缘模糊并且菌体之间发生粘连，细胞壁细胞膜明显发生破损甚至崩解，伴有细胞内容物的流失导致菌体不复饱满。图4中C为未经抗菌肽处理的S.aureus，图4中D为经过PLN‑2处理的S.aureus，可以观察到菌体具有完整的球形细胞形状，细胞壁表面光滑，边缘清晰，均呈现正常的细胞结构。推测PLN‑2的抑菌机制为通过破坏 E. coil 的细胞壁细胞膜结构，导致细胞内容物渗漏，从而达到杀菌效果。
[0050] 2.分子对接。
[0051] 使用PEP‑FOLD与I‑TASSER在线网站预测抗菌肽PLN‑2的三维结构。选择预测排名最优的模型，通过ProSA工具预测查询蛋白z‑score评分，ProSA z‑score是将被查询的结构与PDB库中经过实验验证的结构进行对比评价；z‑score值越高，表明相似性越高。随后，使用pymol绘制PDB文件格式的拉式图，对模拟抗菌肽结构的立体化学性质进行了估计。拉式图以一种易于理解的方式显示给定蛋白质或多肽结构中主链氨基酸残基二面角ψ和φ的可视化；在理论偏好区有大部分残基，而在不允许区域没有残基或残基很少(<3%)的模型被认为是质量好的模型。
[0052] 分子对接研究用于研究多肽与指示菌关键结构蛋白之间的相互作用。E.coil外模脂多糖的X衍射晶体结构从结构生物学研究合作实验室（RCSB）蛋白质数据库中获得，PDB代码分别为4RHB。PLN‑2选择PEP‑FOLD平台预测的PDB结构，作为配体。指示菌蛋白结构作为受体。使用Pymol v2.6.0对受体分子进行前处理去除配体和水分，使用AutoDock Vinav1.1.2定位结合区并进行分子对接，选择对接50次，根据所有对接结果的最小能量得分，选出结合能最低的最佳构象进行分析。对接结果通过Pymol v2.6.0进行3D可视化分析，同时通过LigPlot+ v2.2.4进行2D可视化分析。
[0053] 使用PEP‑FOLD和I‑TASSER预测PLN‑2的三维结构，结果如图5中A和D所示，分别对结构的PDB文件进行Ramchndran plot预测和ProSA验证，结果如图5中B、C和E、F所示，PLN‑2在PEP‑FOLD和I‑TASSER网站中预测的三维结构有较大差异，结合拉式图和ProSA验证，判断PEP‑FOLD网站预测结果具有更高可信度。因此选择由PEP‑FOLD网站预测PLN‑2的三维结构模型用于下一步的分子对接。
[0054] 脂多糖（4RHB）是E.coil细胞膜的重要组成结构，它的抑制剂被认为是治疗细菌感染的有效候选化合物。通过分子对接进一步探究抗菌肽的作用机制。Autodock Vina对接结果发现，PLN‑2与4RHB结合能为‑60.25KJ/mol。PLN‑2与4RHB的最佳对接构象3D图如图6中A、B、C所示，PLN‑2与4RHB的SER‑318、ASN‑316和ARG‑277残基通过氢键连接，在图7的2D可视化结果同能看到相同的作用。此外PLN‑2可与TYR‑314、GLY‑285、LEU‑286、ALA‑284、ASN‑764、GLN‑770、ARG‑774、THR‑103、LYS‑79、SER‑81、VAL‑80、ILE‑82、ALA‑83产生疏水相互作用。对接结果提示这种抗菌肽对E. coil的抑制作用是通过抗菌肽与关键蛋白的相互作用介导的。
[0055] 因此，本发明采用上述的抗菌肽PLN‑2及其应用，PLN‑2具有大肠杆菌抑菌活性，通过对大肠杆菌细胞膜结构产生破坏从而发挥作用；抗菌肽PLN‑2不易产生耐药性，且低细胞毒性和高细胞选择性，可以用于制备治疗大肠杆菌感染的新型抗菌药物。
[0056] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。