一种低温降解除草剂合成菌群及其应用

摘要

本发明公开的一种低温降解除草剂合成菌群及其应用，涉及微生物领域，本发明通过平板条件筛选方法筛选出分离出四株能够在低温下降解阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚八种除草剂的功能菌株，分别命名为H1、B1、K1、Y1，本发明涉及的合成菌群YKB、HKB，对东北地区黑土土壤中目前普遍存在的八种复合除草剂均有很好的降解效果，且对环境无不利影响，普适性较高。

权利要求

1.一种低温降解除草剂合成菌群，其特征在于，由以下微生物菌株组成：

芽孢杆菌（Bacillus sp.）H1和丛毛单胞菌（Comamonas sp.）Y1中的任意一种，保藏编号分别为CGMCC No.29207、CGMCC No.29208；

假单胞菌（Pseudomonas sp.）B1，保藏编号为CGMCC No.29205；

不动杆菌（Acinetobacter sp.）K1，保藏编号为CGMCC No.29206。

2.根据权利要求1所述的低温降解除草剂合成菌群，其特征在于：所述合成菌群包含的相应三种菌株的有效菌数量比为1:1:1。

3.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包含权利要求1所述的合成菌群。

4.根据权利要求3所述的一种复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂由相应的所述微生物菌株等比例混合得到。

5.权利要求1或2所述的合成菌群或权利要求3或4所述的复合菌剂在降解阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚除草剂中至少一种的用途。

6.权利要求1或2所述的合成菌群或权利要求3或4所述的复合菌剂在降解土壤中残留的阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚除草剂中至少一种的用途。

7.权利要求1或2所述的合成菌群或权利要求3或4所述的复合菌剂在低温条件下降解阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚除草剂中至少一种的用途，所述低温条件的温度范围为‑5—20℃。

8.权利要求1或2所述的合成菌群或权利要求3或4所述的复合菌剂在低温条件下降解土壤中残留的阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚除草剂中至少一种的用途，所述低温条件的温度为10℃。

9.权利要求1或2所述的合成菌群或权利要求3或4所述的复合菌剂在改善残留除草剂土壤生态功能方面的用途。

10.一种改善残留复合除草剂土壤生态功能的方法，其特征在于：所述方法包括将有效量的权利要求1或2 所述的合成菌群或权利要求3或4所述的复合菌剂施用于所述土壤。

说明书

一种低温降解除草剂合成菌群及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，尤其涉及一种低温降解除草剂合成菌群及其应用。

背景技术

[0002] 目前针对土壤复合除草剂污染，普遍使用的方法是物理、化学和生物等修复技术降解土壤中残留除草剂。其中物理修复主要包括填埋法、换土法和通风去污法，但这些方法只能解决短暂的问题，并不能长期有效的根治污染，且会消耗大量的时间、精力和金钱。化学修复是将化学改良剂加入土壤中，利用除草剂和改良剂之间的化学反应实现土壤修复，化学修复快速直接，但加入的化学物质会产生新的污染。生物修复是利用微生物自身的代谢活动，降解土壤中残留的农药，是目前环境领域污染修复和可持续发展的最佳途径。生物修复方法包括生物炭修复、动植物修复和微生物菌剂修复等，这些修复方法中，生物炭修复用量大，动植物修复的周期长，微生物修复操作简单成本低、无其他污染。

[0003] 东北地区冬季寒冷且漫长，黑土地微生物分解速度慢，土壤中有机质较多，因为这一因素，导致黑土土壤中除草剂残留难以降解。根据作用机理的不同，目前东北黑土土壤中常见的除草剂包括阿特拉津（莠去津），乙草胺，丁草胺，嗪草酮，异丙甲草胺，烟嘧磺隆，苄嘧磺隆，氟磺胺草醚等。典型除草剂污染可以通过微生物的共降解或协同作用被完全降解，除草剂的降解转化与土壤中微生物菌群结构及有机质含量存在着显著的相关性。目前除草剂的微生物降解主要聚焦单一菌株，普遍存在降解对象单一，降解能力不稳定等问题，且目前发现的微生物或菌剂虽然可以降解除草剂，却无法在东北的低温中发挥出很好的作用。目前研究发现的除草剂降解菌株多为中温（30—35℃）降解，低温条件下可降解除草剂的菌株发现较少。

[0004] 因此，挖掘能够高效降解去除土壤中除草剂的菌株并进行合成菌群的构建，提高菌剂对除草剂的稳定降解能力，对东北黑土地的农田土壤环境健康和可持续发展有着重要意义。

发明内容

[0005] 针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种低温降解除草剂合成菌群及其应用，涉及的低温降解除草剂合成菌群，包括保藏编号为CGMCC No.29205的假单胞菌（Pseudomonas sp.）B1、保藏编号为CGMCC No.29206的不动杆菌（Acinetobacter sp.）K1、保藏编号为CGMCC No.29207的芽孢杆菌（Bacillus sp.）H1和保藏编号为CGMCC No.29208的丛毛单胞菌（Comamonas sp.）Y1，构建的合成菌群为“Y1+K1+B1”和“H1+K1+B1”（下面分别简称为YBK/HBK），可在低温条件下，对八种成分的除草剂实现高效降解，改善残留复合除草剂土壤生态功能。

[0006] 发明人利用平板条件筛选的方法，筛选分离出四株能够在低温下降解阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚八种除草剂的功能菌株，进行生化鉴定后，分别鉴定为假单胞菌（Pseudomonas  sp.）B1、不动杆菌（Acinetobacter sp.）K1、芽孢杆菌（Bacillus sp.）H1和丛毛单胞菌（Comamonas sp.）Y1四株菌，并对上述四株菌分别进行保藏；以下对上述四株菌分别简称为：B1、K1、H1、Y1；菌株的基本特性参见表1。

[0007] 具体的，通过以下方案实现了本发明：

[0008] 在第一个方面，本发明提供两种合成菌群，分别为由H1、B1、K1三株菌形成HBK合成菌群，以及由Y1、B1、K1三株菌形成的YBK合成菌群，上述两种合成菌群均可将250mg/L复合除草剂完全降解（99.2%以上），且降解能力显著优于单个菌株B1、K1、H1、Y1，同时也明显优于菌株两两组合（Y1+B1、Y1+K1、K1+B1、H1+B1、H1+K1、K1+B1）的降解效果。

[0009] 优选的，在HBK合成菌群中，所述的H1、B1、K1三株菌的总活菌数比为1：1：1；在YBK合成菌群中，所述的Y1、B1、K1三株菌的总活菌数比为1：1：1。

[0010] 在第二个方面中，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包含了上一个方面所述的合成菌群。

[0011] 优选的，所述复合菌剂由单菌的种子液等比例混合制得。

[0012] 在第三个方面，本发明提供了上述第一个方面中的合成菌群或者上述第二个方面中的复合菌剂，在降解阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚除草剂中至少一种的用途。

[0013] 在第四个方面，本发明提供了上述第一个方面中的合成菌群或者上述第二个方面中的复合菌剂，在降解土壤中残留的阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚除草剂中至少一种的用途。

[0014] 在第五个方面，本发明提供了上述第一个方面中的合成菌群或者上述第二个方面中的复合菌剂，在低温环境下降解阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚除草剂中至少一种的用途。

[0015] 作为可选的方式，上述用途中，所述低温环境的温度范围为‑5—20℃。

[0016] 在第六个方面中，本发明提供了上述第一个方面的合成菌群或者上述第二个方面的复合菌剂，在低温下，降解土壤中残留阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚八种除草剂中至少一种的用途。

[0017] 作为可选的方式，在上述用途中，所述用途为降解土壤中残留的除草剂，包括三嗪类（阿拉特津、嗪草酮）、酰胺类（乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺）、磺酰脲类（烟嘧磺隆、苄嘧磺隆）和草醚类（氟磺胺草醚）的除草剂，对不同地区土壤中不同残留浓度的八种除草剂降解能力都非常可观。

[0018] 作为可选的方式，在上述用途中，所述低温环境的温度条件为10℃，在上述温度，去除土壤中复合除草剂，其降解的温度范围低于目前研究发现的除草剂降解菌株的降解温度范围（多为中温30—35℃降解），即在低温条件下也能够降解土壤中除草剂，尤其在去除东北地区黑土土壤中除草剂污染具有良好应用前景。

[0019] 在第七个方面，本发明提供了上述第一个方面的合成菌群和上述第二个方面的复合菌剂，在改善残留除草剂土壤生态功能方面的用途。

[0020] 作为可选的方式，在上述用途中，土壤中残留除草剂可以包含上述第三个方面中提及的八种除草剂，针对残留复合除草剂的土壤，保证较高的除草剂降解率，并且检测后可知，土壤中加入上述第一方面的合成菌群或第二方面的复合菌剂，对土壤生态功能有显著提高。

[0021] 在第八个方面，本发明提出一种改善残留复合除草剂土壤生态功能的方法，所述方法包括将有效量的上述第一方面的合成菌群或上述第二方面的复合菌剂施用于所述土壤，与土壤充分搅拌，混合均匀，土壤中β‑半乳糖苷酶、α‑葡萄糖苷酶、β‑葡萄糖苷酶、脲酶、蛋白酶、磷酸酶、脱氢酶含量升高，丙二醛和过氧化氢酶降低，显著提高土壤生态功能。

[0022] 本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

[0023] 上述两种合成菌群或复合菌剂，均能够在低温条件下高效降解土壤中残留的阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚八种除草剂，在温度为4 ℃时，可将250mg/L上述八种的复合除草剂完全降解（99.2%以上），具有广泛的应用潜力和价值。

[0024] 上述两种合成菌群或复合菌剂，在低温条件下，对五个典型黑土地的土壤中残留的上述八种除草剂的降解能力都非常可观，除草剂的降解率均达到63%以上，大部分降解率可达到85%以上，且土壤中β‑半乳糖苷酶、α‑葡萄糖苷酶、β‑葡萄糖苷酶、脲酶、蛋白酶、磷酸酶、脱氢酶含量升高，丙二醛和过氧化氢酶降低，对土壤生态功能有显著提高。

[0025] 因此，本发明涉及的合成菌群YKB、HKB，对东北黑土区土壤中目前普遍存在的八种复合除草剂均有很好的降解效果，且在低温时能够维持较高的活性（合成菌群或复合菌剂在降解八种除草剂方面的活性），对环境无不利影响，普适性较高，解决了现有的微生物菌剂在低温下，无法进行高效降解复合除草剂的难题，对现在东北黑土土壤中的残酷除草剂污染的缓解和去除有重大应用前景，对黑土地农田土壤质量、粮食安全和人体健康有重要意义。

[0026] 生物材料保藏信息：

[0027] 假单胞菌（Pseudomonas sp.）B1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29205，保藏日期为2023年12月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，状态为存活；

[0028] 不动杆菌（Acinetobacter sp.）K1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29206，保藏日期为2023年12月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，状态为存活；

[0029] 芽孢杆菌（Bacillus sp.）H1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29207，保藏日期为2023年12月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，状态为存活；

[0030] 丛毛单胞菌（Comamonas sp.）Y1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29208，保藏日期为2023年12月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，状态为存活。

附图说明

[0031] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

[0032] 图1为本发明的实施例1中，菌株筛选的技术路线图；

[0033] 图2为本发明的实施例1中筛选出的菌株菌落形态图（上）和SEM电镜成像图（下）（从左到右依次为菌株B1、H1、K1、Y1）；

[0034] 图3为本发明的实施例2中，单菌/复合菌群实验室条件中对八种除草剂的降解能力比较；

[0035] 图4为本发明的实施例3中，HBK在土壤模拟实验中对五个地区八种除草剂的降解能力比较的部分对比图；

[0036] 图5为本发明的实施例3中，HBK在土壤模拟实验中对五个地区八种除草剂的降解能力比较的另一部分对比图；

[0037] 图6为本发明的实施例3中，YBK在土壤模拟实验中对五个地区八种除草剂的降解能力比较的部分对比图；

[0038] 图7为本发明的实施例3中，YBK在土壤模拟实验中对五个地区八种除草剂的降解能力比较的另一部分对比图。

具体实施方式

[0039] 本发明公开了一种低温降解除草剂合成菌群及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0040] 在本发明的实施例中，涉及的培养基具体如下：R2A培养基配方如下(1L)：酵母粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，蛋白胨0.5g，磷酸氢二钾0.3g，酪蛋白氨基酸0.5g，丙酮酸钠0.3g，葡萄糖0.5g，MgSO4∙7H2O 0.05 g；121℃灭菌20min。1/10LB培养基配方如下(1L)：胰蛋白胨
1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4，将培养基各成分按比例称量溶解后121℃高压蒸汽灭菌20min。

[0041] 1/10LB固体培养基培养同液体培养基，只是需额外添加1.5%的琼脂。

[0042] 实施例1：（利用平板条件筛选的方法从东北黑土区土壤中分离潜在功能菌株）目前发现的微生物或菌剂虽然可以降解除草剂，却无法在我国东北的低温环境中发挥出很好的作用。目前研究发现的除草剂降解菌株多为中温（30—35℃）降解，低温条件下可降解除草剂的菌株发现较少。此外，发明人分析东北黑土区土壤的特性，尤其五个典型旱作区（地区辽宁省铁岭市、吉林省长春市、黑龙江省哈尔滨市、绥化市、黑河市）的土壤，分析表明，土壤中残留的典型除草剂有八种，包括阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚。上述八种除草剂的残留，导致东北黑土区土壤环境复杂，尤其东北地区一年中的环境温度大部分处于低温环境，对利用微生菌剂降解土壤中残留的除草剂非常不利。

[0043] 发明人基于上述现状，利用平板条件筛选的方法，从东北黑土区土壤中筛选分离出四株菌株，在进行相应的鉴定后，最终得到假单胞菌（Pseudomonas sp.）B1、不动杆菌（Acinetobacter sp.）K1、芽孢杆菌（Bacillus sp.）H1和丛毛单胞菌（Comamonas sp.）Y1四株菌。

[0044] 将得到的上述四株菌做拮抗实验，用不同的组合方式制备成合成菌群，测定相对应的复合除草剂（高效液相色谱法）降解能力，实验表明，上述四株菌可以在单独和复合培养条件下去除土壤中高浓度复合除草剂，且可在低温条件下降解土壤中残留的八种除草剂，对改善东北黑土区土壤环境具备重大意义。

[0045] 以下为本实施中平板筛选方法的具体步骤：

[0046] （1）样品采集：采集东北区的五个典型地区的土壤作为培养图样，针对东北地区土壤的特性进行有条件的筛选，筛选出的菌株更具备针对性。

[0047] 具体的，在本实施例中，2023年7月采取辽宁省铁岭市、吉林省长春市、黑龙江省哈尔滨市、绥化市、黑河市土壤。

[0048] （2）样品富集：精确称取土样100g于250mL灭菌三角瓶中，加入各200µg/kg的阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚，轻轻搅匀置28℃温箱中培养一周，注意补加无菌水，保持水分值不变。

[0049] （3）菌株分离：精确称取除草剂富集土样10g于装有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，置28℃摇床中振荡一小时，取出静置两小时，再依次取1mL到9mL无菌生理盐水中逐步稀‑3 ‑4 ‑5释至10 、10 、10 ，分别取0.1mL涂布含八种复合除草剂（浓度各200µg/kg）的R2A固体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置28℃温箱中培养5天，长出的菌株为可抵抗八种除草剂的抗性菌，将平板置4℃冰箱中保存待用。

[0050] （4）划线分离：将步骤（3）中得到的除草剂抗性菌，挑取不同形态的菌落并重复划线几次以获得纯分离株。划线用1/10LB培养基平板，待菌长出后用甘油管保藏至‑80℃冰箱。

[0051] （5）筛选具有八种复合除草剂去除能力的菌株：将步骤（4）中分离的各菌株进行除草剂降解能力试验，即在八种浓度为200µg的复合除草剂1/10LB培养基中分别接种各菌株，置于4℃ 、150rpm摇床培养72h，吸取1mL培养液，12000rpm离心1min，吸取上清过滤，取滤液用高效液相色谱仪检测溶液剩余除草剂含量，挑选能使除草剂去除80%以上菌株，作为初步筛选菌株。

[0052] 在此基础上，将得到的四株菌做拮抗实验，用不同的组合方式制备成合成菌群，测定相对应的复合除草剂（高效液相色谱法）降解能力，转接到1/10LB液体培养基中，加入八种复合除草剂（浓度各200µg/kg），置28℃摇床中振荡培养，72h取2mL菌液12000rpm离心2min，用高效液相色谱检测检测上清液中除草剂去除情况。

[0053] （6）具有除草剂降解能力的菌株的分类鉴定：一是利用16SrDNA鉴定，即采用原核生物的16SrDNA通用引物27F(5'‑AGAGTTTGATCMTGGCTCAG‑3')和1492R(5'‑GGYTACCTTGTTACGACTT‑3')进行PCR扩增（具体PCR方法参见专利 “一种土壤总DNA小量快速提取方法(专利号：2005101205847，公开日：2007年7月4日)并测序，再与国际NCBIGenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库比对，核苷酸同源性为99%；二是利用透射电镜进行形态学鉴定(见附图2)和生长特性鉴定。

[0054] 形态学特征如下：菌株Y1、K1、B1、H1菌落颜色均偏黄，可在低温条件（0—4℃）下生长，最适生长温度是28—35℃，最适生长NaCl浓度是0—0.5%。生理生化分析参考表1。

[0055] 表1菌株基本特性表

[0056]

[0057] 假单胞菌（Pseudomonas sp.）B1，芽孢杆菌（Bacillus sp.）H1，不动杆菌（Acinetobacter sp.）K1，丛毛单胞菌（Comamonas sp.）Y1在1/10LB液体或固体培养基上在28℃培养，培养后可在4℃下作短期保藏。

[0058] 若长期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管（具体方法请参见：赵斌，何绍江，微生物学实验，第一版，科学出版社.北京，2002：P202－205）保藏菌株比较合适。

[0059] 实施例2：（低温条件下，探究新型合成菌群YKB和HKB在模拟复合除草剂污染的培养基中对复合除草剂的降解）发明人将实施例1中筛选并鉴定后得到的四株菌，用不同的组合方式制备成合成菌群，测定相对应的复合除草剂（高效液相色谱法）降解能力，具体的，首先发明人在4 ℃，分别对单菌（H1、Y1、B1、K1）和不同的组合方式（Y1+B1、H1+K1、Y1+K1、H1+B1、K1+B1、Y1+K1+B1、H1+K1+B1）菌群进行降解能力的测定，实验结果参考表2以及附图3。

[0060] 从实验结果可得知，单个菌株对高浓度除草剂的去除情况为40‑70%，将菌株两两组合（Y1+B1、Y1+K1、K1+B1、H1+B1、H1+K1、K1+B1）降解率升高至50‑96%，合成菌群YKB和HKB的降解率最高，可将250mg/L复合除草剂完全降解（99.2%以上），从浓度和去除效率来看，远高于以往研究中所发现的菌株/合成菌群，从上述分析可以看出，三种菌株之间具备协同作用，Y1+K1+B1和H1+K1+B1两种合成菌群中的三个菌株，相互作用，共同降解同一反应体系中的高浓度的八种除草剂，降解率远高于单一菌株的降解率，验证了在低温条件下，合成菌群仍能保持降解高浓度除草剂的活性。

[0061] 其他因素不变，针对上述合成菌群YKB和HKB，在反应体系温度分别为‑5 ℃、0 ℃、10 ℃、15 ℃和20 ℃时，检测对高浓度复合除草剂的降解率，检测结果，参考表3，从表3可以得知，温度在10 ℃、20 ℃时，两种复合菌群的降解率可达到100%，这也可以预见，菌株随着温度的升高（升高至最适的生长温度），活性保持越好，符合菌株本身的特性，在温度逐步降低后，活性会有一定的降低甚至休眠和死亡，但是本申请涉及的复合菌株，在温度为4—
10℃时，仍能保持极高的降解率，符合发明人对复合菌株在低温环境下保持高的除草剂降解率的预期。

[0062] 综合上述实验结果，温度在4—20℃时，合成菌群（复合菌剂）仍能保持高的降解率，可将250mg/L复合除草剂完全去除（99.2%以上），尤其在更低温度范围（‑5—4℃)内，合成菌群（复合菌剂）HKB、YKB仍能保持较高的降解率（大于50%），其中HKB合成菌群/复合菌剂在更低温的范围内，保持70%的降解率，更适应低温的降解环境。

[0063] 下面为单菌/复合菌群在实验室条件下的降解高浓度除草剂的实验步骤：

[0064] 挑取菌株单克隆接种到100mL的1/10LB液体培养基，于4℃摇床中振荡培养至OD600为0.5左右，将其作为种子液，以1%的接种量(复合培养条件下三个菌分别以0.33%的接种量)接种于新鲜的100mL1/10LB液体培养基(起始OD600＜0.01)，并分别向培养基中添加250mg/L的阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚；将其置于4℃摇床中振荡培养。每隔6h取一次样。12000rpm离心2min后用高效液相色谱检测上清液中除草剂含量变化。其中，测定方法可参考实施例1。

[0065] 表2单菌/复合菌群实验室条件中对八种除草剂的降解能力

[0066]

[0067] 表3合成菌群YKB和HKB在东北黑土土壤中对复合除草剂的降解和对土壤生态功能的改善

[0068]

[0069] 实施例3：（合成菌群YKB和HKB在东北黑土土壤中对复合除草剂的降解和对土壤生态功能的改善）发明人根据目前的研究发现，东北黑土区比较典型的五个地区的土壤中残留的除草剂的种类为八种，包括阿拉特津、乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺、嗪草酮、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和氟磺胺草醚，但是浓度偏好并不相同，根据上述五个地区土壤残留的除草剂种类和浓度偏好，模拟上述五个地区的除草剂残留情况，进行土壤功能改善实验，具体的在环境温度为10℃左右进行，向模拟上述五个地区的除草剂残留偏好的土壤中，分别加入两种4
合成菌群或者复合菌剂，和土壤充分搅拌（接种到土壤中的菌剂的起始生物量为10cfu/g），混合均匀，静置35天，每7天取样，检测土壤中不同除草剂的含量。

[0070] 上述实验过程中，模拟上述五个地区的除草剂残留情况的土壤中除草剂的初始浓度如下（mg/kg）：

[0071] 辽宁省铁岭市：阿拉特津92.5mg/kg、乙草胺98.8mg/kg、丁草胺73.73mg/kg、异丙甲草胺49.81mg/kg、嗪草酮19.98mg/kg、烟嘧磺隆17.48mg/kg、苄嘧磺隆11.25mg/kg、氟磺胺草醚0.68mg/kg；

[0072] 吉林省长春市：阿拉特津86.67mg/kg、乙草胺94.17mg/kg、丁草胺34.85mg/kg、异丙甲草胺26.07mg/kg、嗪草酮76mg/kg、烟嘧磺隆27.21mg/kg、苄嘧磺隆23.7mg/kg、氟磺胺草醚0.35mg/kg；

[0073] 黑龙江省哈尔滨市：阿拉特津66.5mg/kg、乙草胺122.89mg/kg、丁草胺127.47mg/kg、异丙甲草胺45.66mg/kg、嗪草酮26.17mg/kg、烟嘧磺隆12.82mg/kg、苄嘧磺隆5.757mg/kg、氟磺胺草醚4.17mg/kg；

[0074] 黑龙江省绥化市：阿拉特津85.8mg/kg、乙草胺41.33mg/kg、丁草胺66.02mg/kg、异丙甲草胺17.31mg/kg、嗪草酮4.9mg/kg、烟嘧磺隆7.44mg/kg、苄嘧磺隆3.96mg/kg、氟磺胺草醚13.96mg/kg；

[0075] 黑龙江省黑河市：阿拉特津5.45mg/kg、乙草胺17.16mg/kg、丁草胺7.78mg/kg、异丙甲草胺5.01mg/kg、嗪草酮8.81mg/kg、烟嘧磺隆2.43mg/kg、苄嘧磺隆1.8mg/kg、氟磺胺草醚84.4mg/kg。

[0076] 从附图4、附图5并结合表4和表5，可以看出，在自然环境为10℃左右时：

[0077] 从去除土壤中残留的除草剂种类复杂程度分析，可得知，两种复合菌剂，对模拟黑龙江省三个地区的土壤，可去除90%以上上述土壤中七种除草剂，对土壤的复杂除草剂去除效果非常可观，且HBK的降解率优于YBK的降解率，在针对上述土壤环境，可优先选择包含HBK的微生物制剂；此外，两种复合菌剂，对上述模拟的五个地区的残留有八种除草剂的土壤，八种除草剂的降解率基本能够达到70%以上，针对土壤复杂的除草剂环境，除草剂的降解率是可以预见的，且HBK的降解率优于YBK的降解率，在针对上述土壤环境，可优先选择包含HBK的微生物制剂。

[0078] 从分别去除土壤中八种除草剂的降解率分析，可得知，两种复合菌剂，在不同的土壤环境，对八种除草剂的平均降解率基本能达到80%以上，其中，尤其HBK的降解率优于YBK的降解率，基本可以达到90%，在针对除草剂种类较多的复杂土壤环境，可优先选择包含HBK的微生物制剂；此外，两种复合菌剂，在不同的土壤环境，对氟磺胺草醚除草剂效果最好，可达到97.52%，对磺酰脲类（烟嘧磺隆、苄嘧磺隆）降解率可达到94%以上，对酰胺类（乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺）降解率可达到90%以上，对三嗪类（阿特拉津、嗪草酮）降解率可达到80%以上。

[0079] 从上述两个方面的分析，可得知，实施例中的两种复合菌剂，对残留多种除草剂（除草剂环境复杂）的土壤，除草剂的降解率非常可观，尤其在低温环境下，针对复杂的除草剂残留，保持比较高的降解率，尤其适合应用于东北较低温度环境，相对于其他菌剂，拉长了最佳的施用时间，适用范围更广，更加具有推广意义。

[0080] 参考表5，对其中模拟的两个地区土壤中残留的八种除草剂，降解率均能够达到70%以上，且对残留的七种除草剂，降解率能够达到75%以上，对残留的五种除草剂，降解率能够达到80%以上，对残留多种除草剂（除草剂环境复杂）的土壤，除草剂的降解率非常可观，尤其在低温环境下（空气温度10℃），能够维持较高的活性，因此使用本申请中涉及的合成菌群或者复合菌剂，对改善复杂除草剂污染的土壤的效果是可以预见的。

[0081] 从附图4、5、6和7中可以看出，本发明中的合成菌群对五个地区的八种除草剂降解能力都非常可观，除草剂降解率均达到63%以上，大部分降解率可达到85%以上，其中，对模拟的四个地区土壤中至少残留的三种除草剂，降解率能够达到90%以上；其中一个地区可去除五种除草剂，且降解率达到90%以上；对其中模拟的四个地区土壤中至少残留的六种除草剂，降解率能够达到80%以上；对模拟的五个地区土壤中至少残留的五种除草剂的降解率均能达到80%以上；对模拟的五个地区土壤中至少残留的六种除草剂的降解率均能达到70%以上；且参考表格6，表格6为本实施例中，黑土土壤中生态功能的改善比较（加入两种合成菌群后各个参数改善的平均值），其中对照组为土壤样本，修复组为添加了复合菌剂的土壤样本，从表格6可以看出，土壤中β‑半乳糖苷酶、α‑葡萄糖苷酶、β‑葡萄糖苷酶、脲酶、蛋白酶、磷酸酶、脱氢酶含量升高，丙二醛和过氧化氢酶降低，可见加入合成菌群对土壤生态功能有显著提高。

[0082] 表4两种复合菌剂在35天内，对五个不同地区的八种除草剂的降解率

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[0084] 表5 两种复合菌剂在35天内，去除除草剂情况统计（同时降解不同种类除草剂数量以及相应的降解率）

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[0086] 表6黑土土壤中生态功能的改善比较

[0087]

[0088] 综上所述，本发明所设计的两种新型合成菌群（或菌剂）YKB、HKB，在低温条件为10℃左右时（空气环境），对东北地区黑土土壤中目前普遍存在的八种复合除草剂均有很好的降解效果，且对环境无不利影响，普适性较高，显示本发明具有较好的应用前景。

[0089] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。