麦芽α淀粉酶变体

摘要

本发明人以麦芽α淀粉酶Novamyl的三维结构为基础，已修饰了麦芽α淀粉酶的氨基酸序列以得到具有改善性质的变体。所述变体具有改变的物理化学性质，例如改变的最佳pH值、改善的热稳定性、提高的比活性、改变的裂解模式或者提高的降低淀粉退化或面包变质的能力。

权利要求

1.一种多肽，

a)其具有麦芽α淀粉酶活性；

b)其与SEQ ID NO：1相比，在对应于F188、T288、N327、G370和/或N371的位置上具有氨基酸取代。

2.权利要求1的多肽，其中所述取代包括对应于F188E/K/H、T288E/K/R、N327D、G370N和/或N371D/E/G/K的取代。

3.权利要求1的多肽，其中所述取代包括相应于F188L+D261G+T288P的取代。

4.一种编码权利要求1-3中任一项的多肽的核酸序列。

5.权利要求4的核酸序列，其中所述核酸序列可操纵地连接到指导所述变体在适宜表达宿主中表达的一个或多个控制序列上。

6.一种含权利要求4或5之核酸序列、启动子、转录和翻译终止信号的重组表达载体。

7.权利要求6的重组表达载体，还含有选择标记。

8.一种含权利要求4或5的核酸序列或权利要求6或7的载体的转化的宿主细胞。

9.一种产生权利要求1-3中任一项的多肽的方法，所述方法包括：a)在有助于表达所述变体的条件下培养权利要求8的转化的宿主细胞；和b)回收所述变体。

10.一种从生面团制备生面或烘烤产品的方法，所述方法包括将权利要求1-3中任一项的多肽以有效延缓面包变质的量加到生面团中。

11.权利要求10的方法，其中将所述变体以0.1-5mg/kg面粉的量加入。

12.权利要求11的方法，其中将所述变体以0.5-2mg/kg面粉的量加入。

说明书

麦芽α淀粉酶变体

[0001] 所属技术领域

[0002] 本发明涉及麦芽淀粉酶(maltogenic amylase)变体和构建所述变体的方法。

背景技术

[0003] 麦芽α淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖，还能够水解麦芽三糖和环糊精。

[0004] 芽孢杆菌的麦芽α淀粉酶(EP120693)以商品名 (丹麦NovoNordiskA/S的产品)有销售，而且由于其降低淀粉退化的能力而被作为抗变质剂广泛地用于烘
烤业。 与环糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)共有几个特征，包括序列同源性
(Henrissat B.，Bairoch A.1996)和转糖基作用产物的形成(Christophersen，C.等，1997，Starch，vol.50，No.1，39-45)。

[0005] 环麦芽糊精葡聚糖转移酶(E.C.2.4.1.19)也称为环糊精葡聚糖转移酶或者环糊精糖基转移酶，本文缩写为CGT酶，经分子内转糖基反应催化淀粉和类似的底物转变成环
麦芽糊精，由此形成各种大小的环麦芽糊精(或CD)。

[0006] CGT酶广泛地分布于各种不同的细菌源中并可从所述细菌源中得到，所述细菌包括芽孢杆菌、短杆菌、梭菌、棒状杆菌、克雷伯氏菌、微球菌、热厌氧杆菌，在文献中已广泛地描述过热厌氧杆菌。Norman B E，JorgensenS T；Denpun Kagaku 1992 39 99-106和
WO89/03421中已描述由热厌氧杆菌属产生的CGT酶，在WO96/33267中公开了氨基酸序列。
在Internet(SCOP或PDF网页)可以得到作为pdf文件1CIU的来自热产硫磺热厌氧杆菌和
环状芽孢杆菌的CGT酶的序列，来自环状芽孢杆菌的CGT酶的序列可以作为pdf文件1CDG
获得。

[0007] Tachibana，Y.，发 酵 和 生 物 工 程 杂 志 (Joumal of FermentationandBioengineering)，83(6)，540-548(1997)描述了CGT酶的克隆和表达。Kim，Y.H.生物
化学和分子生物学国际(Biochemistry and Molecular BiologyInternational)41(2)，
227-234(1997)；Sin K-A，生物技术杂志(Journal of Biotechnology)，32(3)，283-288(！
994)；D Penninga，生物化学(Biochemistry)，34(10)，3368-3376(1995)和WO96/33267中描述了CGT酶的变体。

[0008] 最近，已报道了数种CGT酶的三级结构。Hofman等[Hofman B E，Bender H，Schultz G E；J.Mol.Biol.，1989 209 793-800]和Klein &Schulz[Klein C，Schulz G E；
J.Mol.Biol.，1991 217 737-750]报道了由环状芽孢杆菌菌株8得到的CGT酶的三级结
构，Kubota等[Kubota M，Matsuura Y，Sakai S和Katsube Y；Denpun Kagaku 1991 38
141-146]报道了由嗜热脂肪芽孢杆菌TC-91得到的CGT酶的三级结构，Lawson等[Lawson
C L，vanMontfort R，Strokopytov B，Rozeboom H J，Kalk K H，de Vries G E，Penninga D，Dijkhuizen L，和Dijkstra B W；J.Mol.Biol.1994 236 590-600]报道了由环状芽孢杆菌
菌株251得到的CGT酶的三级结构，Strokopytov等[Strokopytov B，Penninga D，Rozeboom H J；Kalk K H，Dijkhuizen L和Dijkstra B W；Biochemistry 1995 34 2234-2240]报道
了由环状芽孢杆菌菌株251得到的CGT酶的三级结构，CGT酶已与阿卡糖(acarbose)复合，
阿卡糖是一种有效的CGT酶抑制剂，Knegtel等[Knegtel R M A，Wind R D，Rozeboom H J，Kalk KH，Buitelaar R M，Dijkhuizen L和Dijkstra B W；J.Mol.Biol.1996 256 611-622]报道了由热产硫磺热厌氧杆菌产生的CGT酶的三级结构。

[0009] 发明概述

[0010] 本发明人以麦芽α淀粉酶Novamyl的三维结构为基础，修饰了麦芽α淀粉酶的氨基酸序列以得到具有改善性质的变体。所述变体具有改变了的物理化学性质，例如改变
的最佳pH值，改善的热稳定性，提高的比活性，改变的裂解模式或者降低淀粉退化或者面
包变质的能力提高。

[0011] 因此，本发明提供了构建亲本麦芽α淀粉酶变体的方法，其中与所述亲本麦芽α淀粉酶相比，所述变体至少具有一种改变的性质，所述方法包括：

[0012] I)在评估结构的基础上，分析麦芽α淀粉酶的结构以鉴定麦芽α淀粉酶的至少一个氨基酸残基或者至少一个结构区，所述氨基酸或结构区与改变所述性质有关；

[0013] ii)构建麦芽α淀粉酶变体，与亲本相比，所述变体在i)中所鉴定的氨基酸残基或结构部分已被修饰以便改变所述性质；和

[0014] iii)检测所得的麦芽α淀粉酶变体的所述性质。

[0015] 通过本发明的上述方法改变的性质可以是例如稳定性、pH依赖活性、降低淀粉退化或面包变质的能力、比活性或底物特异性。因此，所述变体可具有如升高的热稳定性或者在较低pH下有较高的活性、改变的最佳pH值、提高的热稳定性、提高的比活性或者降低淀
粉退化或面包变质的能力提高。

[0016] 本发明的另一方面还涉及麦芽α淀粉酶变体、编码所述变体的DNA和制备所述变体的方法。最后，本发明涉及所述变体在各种工业目的中的用途，特别是烘烤的用途。

[0017] 本发明另一方面涉及一种从生面团制备生面或烘烤产品的方法，所述方法包括用本发明的多肽或者通过本发明方法产生的变体以有效延缓面包变质的量加到生面团中。优
选将所述变体以0.1-5mg/kg面粉的量加入，更优选将所述变体以以0.5-2mg/kg的量加入。 [0018] 发明详述

[0019] 麦芽α淀粉酶

[0020] 麦芽α淀粉酶是在EC3.2.1.133中进行分类的酶。所述酶活性不需要底物的非还原末端，主要的酶活性导致支链淀粉和直链淀粉降解为麦芽糖或较长的麦芽糊精。它能
够将直链淀粉和支链淀粉水解为α构型的麦芽糖，而且还能水解麦芽三糖和环糊精。

[0021] 特别优选的麦芽α淀粉酶是从EP120693所述的芽孢杆菌克隆的淀粉酶(下文称为Novamyl)。Novamyl具有SEQ ID NO：1中所述的氨基酸1-686的氨基酸序列。Novamyl
由芽孢杆菌菌株NCIB11837中所含的基因编码，所述基因含有SEQ ID NO：1所述的核酸序
列。下文描述Novamyl的三维结构。

[0022] 通常，优选的麦芽α淀粉酶应具有一个或多个下列性质：

[0023] i)三维结构与Novamyl同源，

[0024] ii)与SEQ ID NO：1有至少70％，优选至少80％或90％，例如95％或98％同一性的氨基酸序列，

[0025] iii)与SEQ ID NO：1所述的DNA序列或者编码芽孢杆菌菌株NCIB11837中所含的Novamyl的DNA序列杂交的DNA序列；

[0026] iv)含配位体的钙结合位点，该配位体等同于Asn77骨架羰基原子、Glu102的侧链原子OE2和OE1，Asp79的侧链原子OD1，Asp76的侧链原子OD1和Glu101的侧链原子OE1，
和一个水分子WAT V21，原子OW0， 其中在附录1中说明了位置；

[0027] v)在与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的残基191-195相同的位置中相应于Pro-Ala-Gly-Phe-Ser的5个氨基酸的序列。

[0028] 上述i)中所说的结构同源性是以其他序列同源性、疏水簇分析或者通过反 向 穿 引 (reverse threading)(Huber，T；Torda，AE，PROTEIN SCIENCE Vol.7，
No.1pp142-149(1998))为基础的，根据这些方法中的任一中预测所述α淀粉酶与Novamyl
有相同的三级结构，其中三级结构指结构域A、B和C，更优选包括结构域D，最优选包括结构域E的总体折叠或者折叠。或者，可以用Novamyl与麦芽α淀粉酶间的结构对比来鉴定相
同的位置。

[0029] 上述iv)中的钙结合位点是以鉴定Novamyl三维结构中的钙结合位点为基础并在下文的“钙结合位点”部分中进行讨论。

[0030] 上述v)中的“相同的位置”是以用本领域已知的方法鉴定的氨基酸或DNA序列排列或结构同源性为基础。

[0031] 麦芽α淀粉酶的三维结构

[0032] 用Novamyl说明形成本发明基础的三维结构。

[0033] 按照X射线结晶学方法，例如X-Ray Structure Determination，Stout，G.K和Jensen，LH.，John Wiley & Sons，Inc.NY，1989所给出的方法求解Novamyl的结构。

[0034] 以附录1(即后面所述的结构坐标)所列的标准PDB格式(Protein DataBank，Brookhaven National Laboratory，Brookhaven，CT)给出利用同晶置换法以2.2埃求解的
结晶结构的结构坐标。应理解，附录1形成本申请的一部分。在附录1中，使用下列缩写：
CA指多肽骨架的钙离子或α碳原子，WAT指水或钙，MAL指麦芽糖，HEX指底物类似物的碳
水化合物单位，SUL指硫酸根离子。

[0035] 本文所述的酶的氨基酸残基用其相应的一个字母或三个字母的氨基酸编码来鉴定。

[0036] 所述麦芽α淀粉酶的结构是由5个球形结构域组成，依次为A、B、C、D和E。可将结构域定义为结构域A的残基1-132和204-403，结构域B的残基133-203，结构域C的残
基404-496，结构域D的残基497-579，结构域E的残基580-686，其中，标号指SEQ ID NO：
1中的氨基酸序列。下面描述特别重要的结构域A、B和C的特征。

[0037] 结构域A

[0038] 结构域A是最大的结构域，其含有包括3个氨基酸残基簇D329、D228和E256的活性位点，所述簇立体排列在酶表面裂口的底部。结构域A的结构表现出与结构已知的α淀
粉酶共有的总体折叠，即具有8个中心β链(标号1-8)和8个旁侧a-螺旋的(α/β)8
桶。在所引述的书中McGregor定义了β桶。β链1的C末端通过一表示为环1的环与螺
旋1相连，其它的环也有相同的模式，尽管环在大小上有些不同而且有些很广泛。

[0039] 在(α/β)8桶中的8个中心β链结构与已知结构的CGT酶重叠得非常好。这部分结构，包括位于β链C末端活性位点的周围与CGT酶有高度的同一性。

[0040] 相反，连接β链和α螺旋的环与已知结构的CGT酶有高度的不同。这些环构成活性位点的结构中心，与底物的主要接触存在于位于这些环内的残基中。通过具体氨基酸
和它们在这些环中所占据的位置来确定区别特征例如底物特异性、底物结合、pH活性分布、底物裂解模式等。在Novamyl结构域A中，含有两个钙结合位点，一个与CGT酶中的钙结合
位点同源，另一个是Novamyl特有的。在下文“钙结合位点”部分中将进一步讨论钙结合位点的结构。

[0041] 结构域B

[0042] 结构域B也称为(α/β)8桶的环3，含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的氨基酸残基133-203。该结构与CGT酶中的结构域B的结构部分同源，最显著的不同是存在对应
于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中位置191-195的5个氨基酸插入体，这在CGT酶中没有
发现。该插入体的空间位置接近活性位点残基并与底物紧密接触。

[0043] 结构域C

[0044] Novamyl中的结构域C包括SEQ ID NO：1中的氨基酸序列的氨基酸残基404-496。结构域C完全由β链组成，该β链形成本身折回的单一的8链片层结构，因此，可将其描
述为β夹心结构。β片层的一部分形成与结构域A的界面。

[0045] 钙结合位点

[0046] 麦芽α淀粉酶结构有3个钙结合位点；即在所述结构中存在3个钙离子。同大部分已知的家族的13种结构共同的是，一个钙离子，在附录1中WAT693位于A和B结构域
之间。该钙离子通过Gln184和His232的骨架羰基原子、Asp198的侧链原子OD2和OD1、
Asn131的侧链原子OD1以及三个水分子WAT V1、WAT V5和WAT V8来配位。

[0047] 第二个钙离子位于A结构域中并为CGT酶所共有，但在α淀粉酶中未发现。钙离子WAT694通过Gly48和Asp23的骨架羰基原子、Asp50的侧链原子OD2、Asp21的侧链原子
OD1、Asn26的侧链原子OD1以及Asn27的侧链原子OD1和一个水分子WAT V62来配位。

[0048] 第三个钙离子位于A结构域中并且是Novamyl所特有的。钙离子是WAT692，而且配位包括Asn77的骨架羰基原子、Glu102的侧链原子OE2和OE1，Asp79的侧链原子OD1，
Asp76的侧链原子OD1和Glu101的侧链原子OE1以及一个水分子WAT V21。

[0049] 底物结合位点

[0050] 结构域A和B中讨论的环部分对于底物相互作用和活性位点反应性是特别重要的。具体地讲，在结构域A中，环1中的残基37-45，环5中的残基261-266，环7中的残基
327-330和环8中的残基370-376；在结构域B中，环3中的残基135-145，环3中的残基
173-180和188-196，其中残基的位置对应于SEQ ID NO：1中的氨基酸序列中的氨基酸。

[0051] 不受任何理论的限制，目前认为底物分子与酶间4-6埃范围内发现的有利的相互作用，例如氢键和/或强静电作用支持底物与酶间的结合。Novamyl(SEQ ID NO：1)的下列
残基在底物HEX的6埃的距离内，由此认为其与所述底物的相互作用有关：

[0052] 44，89，90，92，93，127，129，132，135，177，178，188，191，194，196，226，228，229，230，231，232，256，258-261，288，328，329，371，372，373，376和690。

[0053] Novamyl(SEQ ID NO：1)的下列残基在底物HEX4埃的距离内，由此认为与所述底物的相互作用有关：

[0054] 90，92，93，129，132，177，188，190，191，196，226，228，229，231，232，256，258，259，260，261，328，329，372，376和690。

[0055] 的同源构建

[0056] 在本文附录1公开的结构的基础上用模型构建 的结构。可以类似地构建其它麦芽α淀粉酶的结构。

[0057] 用同源程序或者可比较程序，例如Modeller(均来自Molecular Simulations，Inc.，San Diego，CA)可构建麦芽α淀粉酶的模型结构。原理是将具有已知结构的麦
芽α淀粉酶的序列与要构建其模型结构的麦芽α淀粉酶的序列排列。在共有序列的基
础上可以构建结构保守的区域。在缺乏同源性的区域，用例如程序同源性，用必需残基的
随后结合可以插入环结构，或者缺失序列。然后用同源性或另一分子模拟程序，例如来自
MolecularSimulations的CHARMm完成结构的随后松弛和优化。

[0058] 设计新麦芽α淀粉酶变体的方法

[0059] 在第一方面，本发明涉及构建亲本麦芽α淀粉酶的变体，其中与所述亲本麦芽α淀粉酶相比，所述变体具有至少一种改变的性质，所述方法包括：

[0060] i)分析麦芽α淀粉酶的结构以鉴定所述α淀粉酶的至少一个氨基酸或结构区域，在结构或功能考虑的基础上，确定其与改变亲本麦芽α淀粉酶之所述性质有关；

[0061] ii)构建麦芽α淀粉酶变体，与亲本相比，所述变体的在i)中鉴定的氨基酸残基或结构区已被修饰以便改变所述性质；和

[0062] iii)检测所得变体的所述性质。

[0063] 用本发明方法的步骤i)鉴定的结构部分可由一个氨基酸残基组成。但是，通常所述结构部分包括通常构成麦芽α淀粉酶结构的上述部分之一，例如A、B、C、D或E结构域
之一、任何这些结构域间的界面、钙结合位点、环结构、底物结合位点等的一个以上氨基酸残基。

[0064] 结构或功能考虑可能涉及分析相关结构或结构部分以及其对酶功能的影响。例如，将麦芽α淀粉酶与各种CGT酶间功能差异的分析用于将Novamyl的特定性质给予
Novamyl结构的特定部分或者考虑所述关系。例如，活性位点周围环的模式或结构差异可能会导致接近所述底物的活性位点的差异并由此引起底物特异性和/或裂解模式的差异。

[0065] 此外，已鉴定了与底物结合有关的麦芽α淀粉酶的部分，并由此例如鉴定了所述酶的底物特异性和/或裂解、对于所述酶的钙依赖性至关重要的钙离子结合等(参见下
文)。

[0066] 通过适当修饰编码所述亲本酶的DNA序列通常可以修饰氨基酸残基或结构区。所述修饰可以是取代、缺失或插入一个氨基酸或结构部分。

[0067] 被修饰的性质可以是稳定性(例如热稳定性)、pH依赖活性、底物特异 性、比活性或者降低淀粉退化或面包变质的能力。因此，所改变的性质可以是在给定的pH下改变的比活性和/或改变的底物特异性，例如改变的底物裂解模式或者改变的底物抑制模式。

[0068] 在本发明方法的步骤ii)中，待鉴定的结构部分优选是折叠的酶中被认为与底物接触(参见在上文“底物结合位点”部分中公开的内容)或者与底物特异性和/或裂解模
式有关的部分，和/或与钙离子之一接触的部分和/或影响酶的pH或温度分布或者影响麦
芽α淀粉酶性质的部分。

[0069] 下文详细描述已用本发明方法设计的具体的变体类型。

[0070] 本发明的变体可包括除本文所述修饰外的其它修饰。所述变体优选含有与SEQ ID NO：1有70％以上，优选80％以上，具体是90％以上，特别是95％以上，例如98％以上同一性的氨基酸。

[0071] 具有改变的pH依赖活性分布的麦芽α淀粉酶

[0072] 通过改变麦芽α淀粉酶活性位点残基10埃内的残基的pKa可改变pH依赖性分布。通过例如改变给定氨基酸残基的氨基酸侧链官能团与其附近环境间的静电作用或疏水
作用可改变活性位点残基的pKa。为了在较高pH下得到较高的活性，在给氢体酸的附近放
置带负电荷的残基，而在亲核酸附近放带正电荷的残基将会导致在低pH下有较高的活性。
另外，通过降低水的可接近性或提高周围的疏水性可降低pKa。

[0073] 因此，本发明的另一方面涉及亲本麦芽α淀粉酶的变体，其中与所述亲本相比，所述变体具有改变的pH依赖活性分布，其中可通过下列方法得到所述变体：

[0074] i)鉴定所述亲本麦芽α淀粉酶的三维结构中距麦芽α淀粉酶活性位点残基15埃内，特别是10埃内的氨基酸残基，其中认为所述氨基酸残基与活性位点残基的静电或疏
水作用相关；

[0075] ii)用改变活性位点残基的静电和/或疏水环境的氨基酸残基取代在所述结构中的所述氨基酸残基；

[0076] iii)任选地循环重复步骤i)和/或步骤ii)直到鉴定出容纳在所述结构中的氨基酸取代，

[0077] iv)构建从步骤i)和ii)和任选的iii)产生的麦芽α淀粉酶变体，然后检测所述变体的pH依赖的酶活性。

[0078] 在优选的实施方案中，与亲本麦芽α淀粉酶相比，具有改变的pH依赖活性分布的麦芽α淀粉酶变体包括氨基酸残基的修饰，所述氨基酸残基相应于SEQ ID NO：1中所列氨
基酸序列的下列一个或多个残基：

[0079] D127、V129、F188、A229、Y258、V281、F284、T288、N327、M330、G370、N371和D372， [0080] L71、S72、V74、L75、L78、T80、L81、G83、T84、D85、N86、T87、G88、Y89、H90、G91、T94、R95、D96、F97、I174、S175、N176、D178、D179、R180、Y181、E182、A183、Q184、K186、N187、F188、T189、D190、A192、G193、F194、S195、L196。

[0081] 在更优选的实施方案中，所述变体包括对应于SEQ ID NO：1氨基酸序列中的一个或多个下列修饰的修饰：

[0082] D127N/L、V129S/T/G/V、F188E/K/H、A229S/T/G/V、Y258E/D/K/R/F/N、V281L/T、F284K/H/D/E/Y、T288E/K/R、N327D、M330L/F/I/D/E/K、G370N、N371D/E/G/K和D372N/V， [0083] L71I、S72C、V74I、L75N/D/Q/I/V、L78N/I、T80I/L/V/S/N/G、L81I/V/S/T/N/O/K/H、G83A/S/T/N/Q/E/D/R/H/L、T84S/A/N/D/G、D85A/T/S/N/G、N86Q/E/D/Y/H/K、T87S/I、G88A/S/T、Y89F、H90N/Q/K、G91A/S/T、T94N/D/A/M/V/I、R95K/Q、D96N/V/Q/I、F97Y、I174N/Q/L、S175T/A/N/D、N176S/T/H/Q/P、D178N/Q/E/K/H、D179Y/N/H、R180W、Y181R/F/C/L、E182D、A183S/C/G、Q184E、K186R、N187Q/E/L/F/H/K/V/L、F188Y/L/I/H/N、T189N/D/A/S/H/Y/G、D190E/Q/H/N/K、A192T/D/E/N/K、G193A/S/T、F194Y、S195N/D/E/R/K/G、L196I。

[0084] 可将类似的修饰导入其它麦芽α淀粉酶的等同位置。特别重要的变体含有一个或多个上述修饰与本文所述其它修饰中任一的组合。

[0085] 具有改变的稳定性的麦芽α淀粉酶变体

[0086] 通过钙结合的稳定、用脯氨酸取代、用另一氨基酸取代组氨酸、导入结构域间(interdomain)二硫键、除去脱酰胺位点、改变氢键接触、用带有较庞大侧基的一个或多个氨基酸填充内结构腔、导入结构域间作用，改变电荷分 布、螺旋加帽或导入盐桥。

[0087] 钙结合

[0088] 本发明提供了亲本麦芽α淀粉酶的变体，所述变体由于被改变的钙(Ca2+)结合稳定作用而具有改变的稳定性。所述酶变体可具有改变的热稳定性或者pH依赖稳定性，或
者，在存在较低浓度钙离子的条件下，它可以有麦芽α淀粉酶活性。目前认为，距钙离子10
2+ 2+
埃内的氨基酸残基与酶的Ca 结合能力有关或者对于酶的Ca 结合能力是非常重要的。

[0089] 按实施例2所述确定距麦芽α淀粉酶之Ca2+结合位点10埃距离内的氨基酸残基并在下文列出，所述麦芽α淀粉酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：

[0090] 16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，2829，30，31，32，33，35，36，40，46，47，48，49，50，51，52，53，54，56，73，74，75，76，77，78，79，80，81，87，88，89，91，93，94，95，96，
99，100，101，102，103，104，105，109，129，130，131，132，133，134，145，150，167，168，169，
170，171，172，174，177，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，196，197，198，199，
200，201，202，206，210，228，229，230，231，232，233，234，235，237，378，和637。 [0091] 为了构建本发明该方面的变体，理想的是用可提高变体酶的Ca2+结合亲和性的任
何其他氨基酸残基取代上述至少一个与被确定为与最佳钙结合无关的氨基酸残基。因此，
本发明的另一方面涉及构建亲本麦芽α淀粉酶的变体，其中与所述亲本相比，所述变体具
2+
有稳定的Ca 结合，所述方法包括：

[0092] i)鉴定所述α淀粉酶的三维结构模型中距所述麦芽α淀粉酶Ca2+结合位点10埃内的氨基酸残基，从结构或功能考虑，认为所述氨基酸残基不会引起最佳的钙离子相互
作用；

[0093] ii)构建变体，在所述变体中，用另一氨基酸残基取代所述氨基酸残基，从结构或2+
功能考虑，该另一氨基酸残基对于改变Ca 结合亲和性非常重要的；和

[0094] iii)检测所得麦芽α淀粉酶变体的Ca2+结合。

[0095] 用另一残基取代不会引起最佳钙离子相互作用的氨基酸残基可改变所述酶的钙离子结合作用。例如，在一个或多个下列目的的基础上选择所研究的氨基酸残基：

[0096] a)为了改进钙离子与从麦芽α淀粉酶结构鉴定出的氨基酸残基之间的相 互作用。例如，如果所研究的氨基酸残基与周围溶剂接触，有利的是使所述氨基酸残基与所述溶剂隔开以便稳定所述氨基酸残基与钙离子间的相互作用。通过用带有较庞大侧基或者可提
高屏蔽作用的的氨基酸残基取代所述残基或者在有助于屏蔽的所述残基附近的氨基酸残
基可达到该目的。

[0097] b)为了稳定钙结合位点，例如通过稳定麦芽α淀粉酶结构，例如通过稳定5个结构域之二或多个间的接触或者分别稳定一个或多个所述各个结构域。例如通过给氨基酸侧
链提供更好的配位(coordination)可达到该目的，例如通过在钙结合位点10埃，优选3或
4埃内，用D残基取代N残基和/或用E残基取代Q残基可实现该目的。

[0098] c)例如通过改进离子和配位残基间的相互作用或者通过用氨基酸侧链取代配位水增加侧链配位数以提高钙离子和钙结合残基间的配位。

[0099] d)用配位钙氨基酸残基取代水。

[0100] 优选，将被修饰的氨基酸残基位于Ca2+离子8埃内，优选Ca2+离子5埃内。通过类似于鉴定10埃内氨基酸残基的方法，很容易鉴定分别为8埃和5埃内的氨基酸残基(参见
实施例2)。

[0101] 在一优选的实施方案中，与亲本麦芽α淀粉酶相比，具有改变的Ca2+结合的麦芽α淀粉酶变体含有在对应于SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的下列一个或多个残基的氨
基酸残基取代：

[0102] D17，A30，S32，R95，H103，N131，Q201，I174，和/或H169，

[0103] V74，L75，L78，T80，L81，T87，G88，Y89，H90，G91，T94，R95，D96，F97，Y167，F168，H169，H170，N171，G172，D173，I174，S175，N176，D178，D179，R180，Y181，E182，A183，Q184，K186，N187，F188，T189。

[0104] 在更优选的实施方案中，麦芽α淀粉酶变体含有对应于SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的下列一个或多个取代的取代：

[0105] D17E/Q，A30M/L/AN/I/E/Q，S32D/E/N/Q，R95M/L/A/V/I/E/Q，H103Y/N/Q/D/E，N131D，Q201E，I74E/Q，和H169N/D/E/Q

[0106] V741，L75N/D/Q/I/V，L78N/I，T80I/L/V/S/N/G，L81I/V/S/T/N/Q/K/H，T87S/I，G88A/S/T，Y89F，H90N/Q/K，G91A/S/T，T94N/D/A/MN/I，R95K/Q，D96N/V/Q/I，F97Y，Y167F/R/C，F168Y，H169N/Q/K，H170N/Q/K，N171D/E/Q/H/R/K/G，G172A/T/S，D173N/S/T/Y/R/G，I174N/Q/L，S175T/A/N/D，N176S/T/H/Q/P，D178N/Q/E/K/H，D179Y/N/H，R180W，Y181R/F/C/L，E182D，A183S/C/G，Q184E，K186R，N187Q/E/L/F/H/K/V/L，F188Y/L/I/H/N，T189N/D/A/S/H/Y/G。

[0107] 在本发明的改变麦芽α淀粉酶的Ca2+结合的另一优选实施方案中，修饰SEQ IDNO：1中的部分序列N28-P29-A30-K31-S32-Y33-G34。

[0108] 在其他麦芽α淀粉酶的等同位置可以导入类似的取代。特别重要的修饰是上述一种或多种与本文公开的其他修饰中任一的组合。

[0109] 其他取代

[0110] 通过改善现有的或导入新结构域间和结构域内接触可得到具有改善的酶稳定性的变体。通过下列所述修饰可得到这类改善的稳定性。

[0111] 通过导入一个或多个结构域间二硫键可稳定具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的麦芽α淀粉酶。因此，本发明的另一优选的实施方案涉及与所述亲本麦芽α淀粉酶相
比，具有改善的稳定性和至少一个以上结构域间二硫键桥的亲本麦芽α淀粉酶，其中所述
变体包括在对应于SEQ ID NO：1中的至少一个下列位置对的位置上的修饰：

[0112] G236+S583，G618+R272，T252+V433和/或A348+V487。

[0113] 在一更优选的实施方案中，所述取代对应于至少一个下列对：

[0114] G236C+S583C，G618C+R272C，T252C+V433C和/或A348C+V487C。

[0115] 本发明的另一优选的实施方案涉及与所述亲本相比，具有改善的稳定性和改变的结构域间作用的亲本麦芽α淀粉酶的变体，其中所述变体包括对应于SEQ ID NO：1中的至
少一组下列位置上的取代：

[0116] i)F143，F194，L78；

[0117] ii)A341，A348，L398，1415，T439，L464，L465；

[0118] iii)L557；

[0119] iv)S240，L268；

[0120] v)Q208，L628；

[0121] vi)F427，Q500，N507，M508，S573；和

[0122] vii)1510，V620.

[0123] 在一更优选的实施方案中，所述取代对应于至少下列一组：

[0124] i)F143Y，F194Y，L78Y/F/W/E/Q；

[0125] ii)A341S/D/N，A348V/I/L，L398E/Q/N/D，I415E/Q，T439D/E/Q/N，L464D/E，L465D/E/N/Q/R/K；

[0126] iii)L557Q/E/N/D；

[0127] iv)S240D/E/N/Q，L268D/E/N/Q/R/K；

[0128] v)Q208D/E/Q，L628E/Q/N/D；

[0129] vi)F427E/Q/R/K/Y，Q500Y，N507Q/E/D，M508K/R/E/Q，S573D/E/N/Q；和/或

[0130] vii)I510D/E/N/Q/S，V620D/E/N/Q。

[0131] 本发明的另一优选实施方案涉及与亲本麦芽α淀粉酶相比，具有改善的稳定性和一个或多个盐桥的所述亲本的变体，其中所述变体包括对应于SEQID NO：1中的至少一
组下列位置上的取代：

[0132] N106，N320和Q624。

[0133] 在一更优选的实施方案中，麦芽α淀粉酶的变体含有对应于SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列中的下列取代的取代：

[0134] N106R，N320E/D和/或Q624E。

[0135] 本发明的另一实施方案涉及具有改善的稳定性的亲本麦芽α淀粉酶的变体，其中所述变体含有对应于SEQ ID NO：1中的至少一组下列位置上的取代：

[0136] K40，V74，S141，T142，F188，N234，K249，D261，D261，L268，V279，N342，G397，A403，K425，S442，S479，S493，T494，S495，A496，S497，A498，Q500，K520，A555和N595。 [0137] 在一更优选的实施方案中，麦芽α淀粉酶的变体含有对应于SEQ IDNO：1所述氨基酸序列中的用脯氨酸进行的一个或多个下列取代的取代：

[0138] V74P，S141P，N234P，K249P，L268P，V279P，N342P，G397P，A403P，S442P，S479P，S493P，T494P，S495P，A496P，S497P，A498P，Q500P，和/或A555P。

[0139] 其他优选的取代是K40R，T142A，F188I/L，D261G，K425E，K520R和/或N595I。

[0140] 同样，优选用非组氨酸残基例如Y，V，I，L，F，M，E，Q，N或D取代亲本麦芽α淀粉酶中的一个或多个组氨酸残基。因此，在另一优选的实施方案中，麦芽α淀粉酶的变体含有氨基酸残基取代，所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO：1所述氨基酸序列中的一个或多个
下列残基：

[0141] H103，H220和H344。

[0142] 在更优选的实施方案中，麦芽α淀粉酶的变体含有对应于SEQ ID NO：1所述氨基酸序列中的一个或多个下列取代的取代：

[0143] H103Y/V/I/L/F/Y，H220Y/L/M和H344E/Q/N/D/Y。

[0144] 优选用在侧链上不带酰胺的残基取代亲本麦芽α淀粉酶中存在的一个 或多个精氨酸或谷氨酰胺残基。因此，在另一优选的实施方案中，Novamyl-样的变体含有氨基酸残基取代，所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO：1所述氨基酸序列中的一个或多个下列残基： [0145] Q13，N26，N77，N86，N99，Q119，N120，N131，N152，N171，N176，N187，Q201，N203，N234，Q247，N266，N275，N276，N280，N287，Q299，N320，N327，N342，Q365，N371，N375，N401，N436，N454，N468，N474，Q500，N507，N513，Q526，N575，Q581，N621，Q624和N664。 [0146] 在更优选的实施方案中，麦芽α淀粉酶的变体含有对应于SEQ ID NO：1所述氨基
酸序列中的一个或多个下列取代的取代：

[0147] Q13S/T/A/V/L/I/F/M，N26S/T/A/V/L/I，N77S/T/A/V/L/I，N86S/T/A/V/L/I，N99T/S/V/L，Q119T/S，N120S/T/A/V/L/I，N131S/T/A/V/L/I，N152T/S/V/L，N171Y/D/S/T，N176S/T/A/V/L/I，N187S/T/A/V/L/I，Q201S/T/A/V/L/I/F/M，N203D/S/T/A/V/L/I，N234S/T/A/V/L/I，Q247S/T/A/V/L/I/F/M，N266S/T/A/V/L/I，N275S/T/A/V/L/I，N276S/T/A/V/L/I，N280S/T/A/V/L/I，N287S/T/A/V/L/I，Q299L/T/S，N320S/T/A/V/L/I，N327S/T/A/V/L/I，N342S/T/A/V/L/I，Q365S/T/A/V/L/I，N371S/T/A/V/L/I，N375S/T/A/V/L/I，N401S/T/A/
V/L/I，N436S/T/A/V/L/I，N454D/S/T/AN/L/I，N468D/S/T/A/V/L/I，N474D/S/T/A/V/L/I，Q500S/T/A/V/L/I/F/M，N507S/T/A/V/L/I，N513S/T/A/V/L/I，Q526D/S/T/A/V/L/I，N575S/T/A/V/L/I，Q581S/T/A/V/L/I/F/M，N621S/T/A/V/L/IQ624S/T/A/V/L/I/F/M和N664D/S/T/
A/V/L/I。

[0148] 本发明的另一实施方案涉及与亲本麦芽α淀粉酶相比，具有改善的稳定性和改善的氢键接触的所述亲本的变体，其中所述变体包括对应于SEQ IDNO：1所述氨基酸序列
中的一个或多个下列位置的位置上的修饰：

[0149] l16，L35，M45，P73，D76，D79，A192，I100，A148，A163+G172，L268，V281，D285，L321，F297，N305，K316，S573，A341，M378，A381，F389，A483，A486，1510，A564，F586，K589，F636，K645，A629，和/或T681。

[0150] 在一优选的实施方案中，所述修饰对应于下列一种或多种：

[0151] I16T/D/N，L35Q，M45K，P73Q，D76E，D79E/Y，A192S/D/N，I100T/S/D/N/E/Q，A148D/N/E/Q/S/T/R/K，A163Y+G172S/D/N，L268R/K，V281/Q，D285R/K，L321Q，F297N/D/Q/E，N305K/R，K316N/D，S573N/D，A341R/K，M378R/K，A381S/D/N，F389Y，A483S/D/N，A486Q/E，I510R/K，A564S/D/N，F586S/D/N，K589S/D/Q/N，F636Y，K645T，A629N/D/E/Q，和/或T681D/N/E/Q/S。 [0152] 在其他麦芽α淀粉酶的等同位置可导入相似的取代。特别重要的取代是上述一种或多种与本文所述的其他修饰中任一的组合。

[0153] 在实际构建麦芽α淀粉酶以达到上述目的之前，可以方便地评估预期的氨基酸修饰是否可被容纳到麦芽α淀粉酶结构中，例如是否可被容纳到亲本麦芽α淀粉酶的三
维结构模型中。

[0154] 具有改变的热稳定性和/或改变的温度依赖性的活性分布的麦芽α淀粉酶变体

[0155] 本发明还涉及亲本麦芽α淀粉酶的变体，所述变体可由取代、缺失或插入一个或多个氨基酸残基而产生以便得到具有改变的温度稳定性或热依赖性活性分布的变体。

[0156] 麦芽α淀粉酶的结构含有大量可含水的特有内腔和大量裂隙。为了提高所述多肽的热稳定性，理想的是例如通过导入一个或多个疏水接触，减少腔和裂隙的数量或大小，优选是通过在所述腔附近或周围导入带有庞大侧基的氨基酸来实现。例如，待修饰的氨基
酸残基是那些与腔形成有关的残基。

[0157] 因此，本发明的另一方面涉及提高亲本麦芽α淀粉酶的热稳定性和/或改变其温度依赖性活性分布的方法，所述方法包括：

[0158] i)鉴定所述多肽的三维结构中的亲本麦芽α淀粉酶的内腔或裂隙；

[0159] ii)用另一氨基酸残基取代步骤i)中鉴定的所述腔或裂隙附近的一个或多个氨基酸残基，从结构或功能考虑，所述另一氨基酸残基被确定为提高所述腔或裂隙的疏水作
用并填充或减小所述腔或裂隙大小；和

[0160] iii)构建从步骤ii)产生的亲本麦芽α淀粉酶的变体并检测所述变体的热稳定性和/或温度依赖性活性。

[0161] 可将附录1中鉴定的结构用于鉴定亲本麦芽α淀粉酶的所述腔或裂隙。

[0162] 应理解，通过所述腔或裂隙周围的氨基酸残基鉴定所述腔或裂隙，而且所述氨基酸残基的修饰对于填充或减小所述腔或裂隙的大小是非常重要的。优选，所述修饰是用庞
大氨基酸残基，即带有较大侧链的氨基酸残基进行的取代。例如，所述氨基酸均比Gly大，而Tyr和Trp比Phe大。下文所指的特定氨基酸残基是在所研究的腔或裂隙旁侧发现的晶
体结构中的那些氨基酸残基。

[0163] 在优选的实施方案中，为了完全或部分填充位于结构内的腔，麦芽α淀粉酶的变体包括对应于SEQ ID NO：1所述氨基酸序列中的一个或多个下列 残基的氨基酸残基的取
代：

[0164] L51，L75，L78，G88，G91，T94，V114，I125，V126，T134，G157，L217，S235，G236，V254，V279，V281，L286，V289，I290，V308，L321，I325，D326，L343，F349，S353，I359，I405，L448，Q449，L452，I470，G509，V515，S583，G625，L627，L628和A670。

[0165] L71，S72，V74，L75，L78，T80，L81，G83，T84，D85，N86，T87，G88，Y89，H90，G91，T94，R95，D96，F97，Y167，F168，H169，H170，N171，G172，D173，I174，S175，N176，D178，D179，R180，Y181，E182，A183，Q184，K186，N187，F188，T189，D190，A192，G193，F194，S195，L196。 [0166] 在更优选的实施方案中，麦芽α淀粉酶的变体含有对应于SEQ ID NO：1所述氨基酸序列中的下列取代的一个或多个取代：

[0167] L27结合L75(如，L217F/Y结合L75F/Y)

[0168] L51W，L75F/Y，L78I，G88A/V/T，G91T/S/V/N，T94V/I/L，V114V/I/L，I25L/M/F/Y/W，V126I/L，T134V/I/L/M/F/Y/W，G157A/V/I/0L，L217V/I/M/F/Y/W，S235I/L/M/F/Y/W，G236A/V/I/L/M/F/Y/W，V254I/L/M/F/Y/W，V279M/I/L/F，V281I/L/M/F/Y/W，L286F，V289I/L/R，I290M/L/F，V3081/L/M/F/Y/W，L321I/M/F/Y/W，I325L/M/F/Y/W，D326E/Q，L343M/F/Y/W，F349W/Y，S353V/I/L，I359L/M/F/Y/W，I405M/L/Y/F/VV，L448Y，Q449Y，L452M/Y/F/W，I470M/L/F，G509A/V/I/L/M/S/T/D/N，V515I/L，S583V/I/L/V，G625A/V/I/L/M/F/Y/W，L627M/F/Y，L628M/I/F/Y/VV和A670V/I/L/M/F/Y/W，

[0169] L711，S72C，V74I，L75N/D/Q/I/V，L78N/I，T80I/L/V/S/N/G，L811/V/S/T/N/Q/K/H，G83A/S/T/N/Q/E/D/R/H/L，T84S/A/N/D/G，D85A/T/S/N/G，N86Q/E/D/Y/H/K，T87S/I，G88A/S/T，Y89F，H90N/Q/K，G91A/S/T，T94N/D/A/M/V/I，R95K/Q，D96N/V/Q/I，F97Y，Y167F/R/C，F168Y，H169N/Q/K，H170N/Q/K，N171D/E/Q/H/R/K/G，G172A/T/S，D173N/S/T/Y/R/G，I74N/Q/L，S175T/A/N/D，N176S/T/H/Q/P，D178N/Q/E/K/H，D179Y/N/H，R180W，Y181R/F/C/L，E182D，A183S/C/G，Q184E，K186R，N187Q/E/L/F/H/K/V/L，F188Y/L/I/H/N，T189N/D/A/S/H/Y/G，D190E/Q/H/N/K，A192T/D/E/N/K，G193A/S/T，F194Y，S195N/D/E/R/K/G，L1961I

[0170] 可将类似的修饰导入其它麦芽α淀粉酶的等同位置。特别重要的变体含有一个或多个上述修饰与本文所述其它修饰中任一的组合。

[0171] 具有改变的裂解模式的麦芽α淀粉酶变体

[0172] 本发明的一个目的是改变麦芽α淀粉酶的降解特征。因此，Novamyl水解淀粉主要形成麦芽糖(G2)和少量葡萄糖(G1)，但是事实上没有更高级的寡糖(G3+)。理想的是改
变这种裂解模式例如以便形成大量较高级的寡糖，例如麦芽三糖(G3)，麦芽四糖(G4)和麦
芽五糖(G5)。

[0173] 可以通过下列方法构建与亲本麦芽α淀粉酶相比，改变了底物裂解模式的所述亲本的变体，所述方法包括：

[0174] i)鉴定三维结构模型中亲本麦芽α淀粉酶的底物结合区，例如距上述“底物结合位点”节中所定义的底物结合位点4埃的范围内；

[0175] ii)从结构或功能考虑，用认为可导致改变的底物裂解模式的另一氨基酸残基取代模型中认为决定着亲本裂解模式的i)中所鉴定的裂隙中的底物结合区的一个或多个氨
基酸残基，或者缺失所述预期的底物结合区的一个或多个氨基酸残基以导入对底物有利的
相互作用或者在所述预期的底物结合区中增加一个或多个氨基酸残基以导入对底物有利
的相互作用；和

[0176] iii)构建从步骤ii)产生的麦芽α淀粉酶变体并检测所述变体的底物裂解模式。

[0177] 因此，本发明的另一方面涉及与亲本相比，具有改变的底物结合位点的所述亲本麦芽α淀粉酶的变体，所述变体含有对应于SEQ ID NO：1中的下列一个或多个位置的位置
上的修饰：V281和/或A629。

[0178] 在一优选的实施方案中，所述变体含有对应于下列的修饰：

[0179] V281Q和/或A629N/D/E/Q。

[0180] 可将类似的修饰导入其它麦芽α淀粉酶的等同位置。特别重要的变体含有一个或两个上述修饰与本文所述其它修饰中任一的任意组合。

[0181] 具有改善的降低淀粉退化和/或面包变质的能力的麦芽α淀粉酶变体

[0182] 本发明提供了具有改善的降低淀粉退化和/或面包变质的能力的麦芽α淀粉酶变体。优选的变体含有对应于SEQ ID NO：1中的下列氨基酸残基的一个或多个位置上的修
饰：

[0183] A30、K40、N115、T142、F188、T189、P191、A192、G193、F194、S195、D261、N327、K425、K520和N595。

[0184] 在更优选的实施方案中，所述变体含有对应于SEQ ID NO：1下列残基的一个或多个修饰：

[0185] A30D、K40R、N115D、T142A、F188L、T189Y、Δ(191-195)、D261G、N327S、K425E、K520R和N595I。

[0186] 确定距钙离子10埃内的残基

[0187] 用INSIGHT程序(BIOSYM Technologies)读附录1的坐标。列出了说明原子间键的空间坐标。列出了离子及水的原子。通过使用ZONE命令，用产 生子集的部分程序包产
生结构中钙离子周围的10埃子集。编译在距钙离子10埃距离内带有原子的所有残基并用
LIST MOLECULE命令列出。在坐标文件中，通过将离子命名为“VAT CA”，编译10埃范围内所有称为“VATCA”的原子。在上文“钙结合”节中进一步给出用该方法鉴定的具体残基。 [0188] 腔的确定

[0189] 用附录1中所列的结构坐标求解出的Novamyl结构表明有许多内腔和裂隙。当分析所述腔时，通常使用Connolly程序(Lee，B.和Richards，F.M.(1971)J.Mol.Biol.55：
379-400)。该程序使用带有半径的探针以检索所述蛋白质的外和内表面。用该方法可观察
到的最小腔具有探针半径。

[0190] 为了分析求解的结构，使用在INSIGHT程序中包含的修改版的Connolly程序。在第一步中，通过从所述求解出的结构中使这些原子解合并(unmerging)除去水分子和离
子。通过使用MOLECULE SURFACE SOLVENT命令，用1.4埃的探针半径计算出所有原子和残
基的溶剂可接近的表面积，然后与求解出的结构模型一起用图形表示。然后，可以看出与外表面没有连接的点表面形式的内腔。

[0191] 在以上标题为“具有改变的热稳定性和/或改变的温度依赖性活性分布的变体”的部分中给出了用于填充腔的特异性修饰的建议。通过使用同源的构建结构和/或以序列
排列为基础的比较，可以制得麦芽α淀粉酶的同源结构的突变。

[0192] 氨基酸修饰的命名

[0193] 本文用于定义突变的命名基本如WO92/05249所述。因此，F188H表示在188位用氨基酸H(His)取代氨基酸F(Phe)。V129S/T/G/V表示用S、T、G或V取代V129。Δ(191-195)
或Δ(191-195)表示缺失第191-195位的氨基酸。192-A-193表示在192和193氨基酸之
间插入了A。

[0194] 多肽序列同一性

[0195] 对于本发明的目的，按照Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，Journal ofMolecular Biology，48，443-445所述的方法可适当地确定同一性程度，用下列设置比较多肽序列：GAP产生罚分为3.0，GAP延伸罚分为0.1。可以通过已知的计算机程序进行确定，
例如GCG软件包中提供的GAP(Wisconsin软件包程序手册，第8版，1994年8月，Genetics
Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)。

[0196] 本发明的变体与SEQ IN NO：1的氨基酸具有至少70％，优选80％，例如至少90％，特别是至少95％或至少98％的氨基酸同一性。

[0197] 杂交

[0198] 用于测定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间的杂交的适宜实验条件包括，将含有DNA片段或RNA的滤器在5x SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)中预浸以
杂交10分钟，并将滤器在5x SSC，5xDenhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和
100μg/ml变性的超声处理的鲑精DNA(Sambrook等，1989)溶液中预杂交，然后在含有随
机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化学(Anal.Biochem.)132：
32 9
6-13)、p-dCTP-标记(比活性>1×10cpm/μg)探针的相同溶液中于大约45℃杂交12小
时。然后将滤器在2xSSC，0.5％SDS中于至少55℃下(低严紧度)、优选在至少60℃下(中
等严紧度)、更优选在至少65℃下(中等/高严紧度)、更优选在至少70℃下(高严紧度)、
最优选在至少75℃下(很高的严紧度)洗涤两次，每次30分钟。

[0199] 通过暴露于x-射线胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。

[0200] 制备麦芽α淀粉酶变体的方法

[0201] 克隆编码Novamyl-样多肽的DNA序列

[0202] 可以用本领域熟知的各种方法从生产所述麦芽α淀粉酶的任何细胞或微生物，例如从芽孢杆菌菌株NCIB11837来分离编码亲本麦芽α淀粉酶的DNA序列。

[0203] 首先，用来自可以生产所研究的麦芽α淀粉酶之生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果麦芽α淀粉酶的氨基酸序列是已知的，则可
以合成同源的、标记的寡核苷酸探针并用于从所研究的生物体制备的基因组文库中鉴定编
码麦芽α淀粉酶的克隆。或者，可以用含有与已知的α淀粉酶基因同源的序列的标记寡
核苷酸探针作为探针，用较低严紧度的杂交和洗涤条件来鉴定编码麦芽α淀粉酶的克隆。 [0204] 用于鉴定编码麦芽α淀粉酶的克隆的另一种方法涉及将基因组DNA片段插入到
表达载体，例如质粒中，用所得的基因组DNA文库转化α淀粉酶 阴性菌，然后将转化的细
菌铺在含麦芽α淀粉酶底物的琼脂上，由此鉴定出表达麦芽α淀粉酶活性的克隆。

[0205] 或者，用已确立的标准方法，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)所述的氨基磷酸盐(phosphoroamidite)法或Matthes等(1984)所述的方法合成制备编码所述酶
的DNA序列。在氨基磷酸盐法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化、退火、连接然后克隆到适当的载体中。

[0206] 最后，按照本领域熟知的技术通过连接合成的、基因组或cDNA来源的片段制得的DNA序列可以是基因组和合成来源的混合物、合成和cDNA来源的混合物或者基因组和cDNA
来源的混合物，其中所述的片段对应于完整DNA序列的各个部分。DNA序列还可以通过聚合
酶链反应(PCR)用特定的引物制得，例如US4683202或R.K.Saiki等(1988)所述。

[0207] 定点诱变

[0208] 在分离了编码麦芽α淀粉酶的DNA序列并鉴定了用于修饰的理想位点后，可以用合成的寡核苷酸导入修饰。这些寡核苷酸含有位于理想修饰位点旁侧的核苷酸序列；在合
成寡核苷酸过程中插入突变核苷酸。在具体的方法中，在携带麦芽α淀粉酶基因的载体中
产生桥接麦芽α淀粉酶编码序列的单链DNA缺口。然后将携带所需修饰的合成寡核苷酸
与单链DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶I(Klenow片段)填平剩余的缺口，然后用T4
连接酶连接构建体。在Morinaga等(1984)中描述了这种方法的具体实例。US4760025公
开了通过对盒作小改变来导入编码多个修饰的寡核苷酸。但是，由于可导入各种长度的多
种寡核苷酸，因此，用Morinaga的方法，可以在任何时间导入甚至更多的修饰。

[0209] Nelson和Long(1989)描述了将修饰导入编码麦芽α淀粉酶的DNA序列的方法。它包括一个产生PCR片段的3步反应，所述PCR片段含有用化学合成的DNA链作为PCR反
应的引物之一导入的所需的修饰。从PCR产生的片段，通过用限制核酸内切酶裂解可分离
携带修饰的DNA片段，然后将所述DNA片段再插入到表达质粒中。

[0210] 随机诱变

[0211] 在翻译成所研究的氨基酸序列之基因的至少3个部分或全部基因内，按照定位或区域特异性随机诱变适当地完成随机诱变。

[0212] 用本领域熟知的任何方法均可方便地完成对编码亲本麦芽α淀粉酶之DNA序列的随机诱变。

[0213] 就上述而言，本发明的另一方面涉及产生亲本Novamyl-样α淀粉酶变体的方法，其中所述变体在相对于亲本低的pH和低钙浓度下表现出提高的稳定性，所述方法包括：

[0214] (a)对编码亲本Novamyl-样α淀粉酶的DNA序列进行随后诱变，

[0215] (b)在宿主细胞中表达在步骤(a)中得到的突变DNA序列，和

[0216] (c)筛选表达Novamyl-样α淀粉酶变体的宿主细胞，所述变体相对于亲本Novamyl-样α淀粉酶具有被改变的性质。

[0217] 优选用掺杂的引物，按本文实施例(参见下文)所述完成本发明上述方法的步骤(a)。

[0218] 例如，通过利用适宜的物理或化学诱变剂，利用适宜的寡核苷酸，或者对DNA序列进行PCR产生的诱变可完成随机诱变。此外，利用这些诱变剂的任何组合也可完成随机诱变。所述诱变剂可以是例如诱导转化、颠换、翻转、混杂、缺失和/或插入的试剂。

[0219] 适用于本发明的物理或化学诱变剂包括紫外线(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用所述试剂时，通常在适于发生诱变的条件下，通过在存在所选诱变剂条件下将编码待诱变的亲本酶的DNA序列保温，然后筛选具有所需特性的突变DNA来完成诱变。 [0220] 当用寡核苷酸完成诱变时，在合成寡核苷酸的过程中，在待改变的位置，可将所述寡核苷酸与三个非亲本的核苷酸混杂或者掺杂(spiked)。可进行混杂或掺杂以便避免不想
要氨基酸的密码子。通过任何公开的技术，用例如PCR、LCR或根据需要用任何DNA聚合酶
和连接酶可将混杂的或掺杂的寡核苷酸掺入编码麦芽α淀粉酶的DNA。

[0221] 优选，用恒定随机掺杂完成混杂(doping)，其中在每个位置处野生型和修饰的百分比是预先确定的。此外，混杂可针对导入的特定核苷酸的择优性，由此针对导入的一种
或多种具体氨基酸残基的择优性。可进行混杂以便例如在每个位置导入90％的野生型和
10％的修饰。选择混杂方案的其他原因是基于遗传以及蛋白质-结构限制。用尤其确保避
免导入终止密码子的 DOPE程序完成混杂方案。

[0222] 当采用PCR-产生的诱变时，在改进核苷酸错误掺入的条件下，使进化学处理的或未处理的编码亲本麦芽α淀粉酶的基因进行PCR(Deshler，1992；Leung等，Technique，
Vol.1，1989，PP.11-15)。

[0223] 通过例如将含亲本酶的质粒转化到增变株中，使所述增变株与质粒一起生长，然后从增变株中分离突变的质粒，这样可以将大肠杆菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133，
1974，PP.179-191)、啤酒糖酵母或任何其他微生物体的增变株用于随机诱变编码麦芽α
淀粉酶的DNA。随后将突变质粒转化到表达生物体中。

[0224] 待诱变的DNA可以合适地存在于基因组DNA或者从表达亲本麦芽α淀粉酶的生物中制备的cDNA文库中。或者所述DNA序列存在于适当的载体例如质粒或噬菌体上，然后
与诱变剂一起保温或暴露于诱变剂。待诱变的DNA还可通过整合到宿主细胞的基因组中而
存在于所述细胞内或者存在于所述细胞所含的载体中。最后，被诱变的DNA可以是分离形
式。应理解，经随机诱变的DNA序列优选是cDNA或基因组DNA序列。

[0225] 在一些情况下，可以在进行表达步骤b)或筛选步骤c)前扩增突变的DNA序列。可按照本领域熟知的方法进行所述扩增，目前优选的方法是用在亲本酶的DNA或氨基酸序列
基础上制备的寡核苷酸引物进行PCR产生的扩增。

[0226] 与诱变剂一起培养或暴露于诱变剂后，在可以发生表达的条件下，通过培养携带所述DNA序列的适宜宿主细胞来表达突变的DNA。用于该目的宿主细胞可以是已用突变DNA
序列(任选存在于载体上)转化的细胞或者在诱变处理期间携带编码亲本酶之DNA序列的
细胞。适宜宿主细胞的实例是革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌以及革兰氏阴性菌如大肠杆菌。

[0227] 突变的DNA序列还可包括使得可以表达所述突变DNA序列的编码功能的DNA序列。

[0228] 定位随机诱变

[0229] 随机诱变可有利地定位于所研究的亲本麦芽α淀粉酶的一部分。当已鉴定出所述酶的特定区域对于所述酶的某种性质特别重要时，并且当期望所述区域的修饰可产生具
有改善性质的变体时，这样做可能是有利的。当已阐明了所述亲本酶的三级结构并且与所
述酶的功能有关时，通常可鉴定所述区域。

[0230] 利用上述的PCR产生诱变技术或本领域已知的其他适宜技术可方便地进行定位或区域特异性的随机诱变。或者例如通过插入到适宜的载体中可分离编码被修饰的部分
DNA序列的DNA序列，然后用上述任何诱变方法对所述部分进行诱变。

[0231] 从提高亲本麦芽α淀粉酶的钙结合稳定性的角度，对于区域特异性随机诱变而言，可以合适地定向于对应于SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的下列氨基酸残基的密码子位
置：

[0232] 残基：区域：

[0233] 16-33，35-36，40:16-40

[0234] 46-54，56:46-56

[0235] 73-81:73-81

[0236] 87-89，91，93-96，99-105，109:87-109

[0237] 129-134，(145，150)：129-134

[0238] 167-172，174，177，180-189:167-189

[0239] 196-202，206-210:196-210

[0240] 228-235，237:228-237

[0241] 378

[0242] 637

[0243] 为了通过具有改性的(如更高的)底物特异性和/或改性的(如更高的)对底物裂解(即水解)的特异性的麦芽α淀粉酶来改善底物，即糖(例如直连淀粉或支链淀粉)
的结合，显然，可以特别合适地定向于SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的下列区域中的下列密码子位置用于通过区域特异性诱变进行修饰：

[0244] 70-97、127-143、174-198、226-233、255-270、282-292、324-331、370-376。 [0245] 从改变底物特异性和/或pH依赖性活性分布的角度对于区域特异性随机诱变来说，可以定向于SEQ ID NO：1的下列区域：70-97、174-198。

[0246] 从改善热稳定性的角度来说，可以定向于以下区域：70-109、167-200。

[0247] 利用DOPE程序进行随机诱变的一般方法

[0248] 随机诱变可以通过如下步骤进行：

[0249] 1.在亲本酶中选择用于修饰的重要区域

[0250] 2.在所选的区域中确定突变位点和非突变位点

[0251] 3.例如，根据待构建的变体的所需稳定性和/或性能决定应进行哪一种突变

[0252] 4.选择结构合理的突变

[0253] 5.根据步骤4调整步骤3所选择的残基

[0254] 6.使用适宜的DOPE算法分析核苷酸分布

[0255] 7.如需要，例如，为了避免导入终止密码子，例如，考虑因遗传密码引起的限制，将需要的残基调整成实际的遗传密码；本领域技术人员将会理解，某些密码子组合在实践中不能使用，因此，需要进行调整。

[0256] 8.制备引物

[0257] 9.利用引物完成随机诱变

[0258] 10.通过筛选所需的改善性质来选择所得到的α淀粉酶变体。

[0259] 用于步骤6的适宜DOPE算法是本领域熟知的。其中的一种算法记载于Tomandl，D.等，1997，计算机辅助分子设计杂志(Joumal of Computer-Aided Molecular Design)11：29-38。 另 一 种 算 法 是DOPE(Jensen，LJ，Andersen，KV，Svendsen，A 和Kretzschmar，T(1998)，核酸研究(Nucleic Acids Research)26：697-702)。

[0260] 麦芽α淀粉酶变体的表达

[0261] 通过将含有编码变体之DNA序列的微生物在有利于生产所述变体的条件下进行培养，随后任选地从所得的培养肉汤中回收变体来完成所需变体的构建。以下将进行详细
描述。

[0262] 根据本发明，用通常含有编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号的控制序列以及任选的阻遏基因或各种激活基因的表达载体可以表达蛋白或多肽的形式的用上述方法或本领域已知的其他方法产生的编码变体的DNA序列。

[0263] 携带编码本发明麦芽α淀粉酶变体之DNA序列的重组表达载体可以是任何可以适宜经受重组DNA方法的载体，载体的选择常常取决于它所导入 的宿主细胞。因此，所述
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复
制，例如质粒、噬菌体或者染色体外元件、小染色体或者人工染色体。或者所述载体可以是当导入宿主细胞内时，将整合到宿主细胞基因组中并与其已整合其中的染色体一起复制的
载体。

[0264] 在载体中，所述DNA序列应与适宜的启动子序列有效相连。所述启动子可以是在所选择的宿主细胞内有转录活性的任何DNA序列，并可以得自编码与宿主细胞同源或异源
的蛋白质的基因。特别是在细菌宿主中，用于指导编码本发明麦芽α淀粉酶变体之DNA序
列转录的适宜启动子实例是大肠杆菌的lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因
dagA启动子，地衣形芽孢杆菌α淀粉酶基因的启动子(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉
酶基因的启动子(amyM)，解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶(amyQ)的启动子，枯草芽孢杆菌xyIA
和xyIB基因的启动子等。对于在真菌宿主中转录，有用的启动子的实例是得自编码米曲霉
TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸三糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的基因。

[0265] 本发明的表达载体还可含有适宜的转录终止子，在真核细胞中，含有与编码本发明麦芽α淀粉酶变体的DNA序列有效相连的聚腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列可
合适地得自与启动子相同的来源。

[0266] 所述载体还可包括能够使载体在所用宿主细胞中复制的DNA序列。所述序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制原点。

[0267] 所述载体还可包括选择标记，例如其产物可补偿宿主细胞中的缺陷的基因，例如枯草芽孢杆菌或地衣形芽孢杆菌的da1基因，或者赋予抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那
霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。此外，所述载体可包括曲霉选择性标记例如amdS、argB、niaD和sC，产生潮霉素抗性的标记，或者例如按照WO91/17243中所述的共转化完成选择。 [0268] 尽管在某些情况下，例如当用某些细菌作为宿主细胞时，细胞内表达是有利的，但是通常优选细胞外表达。一般来说，本文所述的芽孢杆菌α淀粉 酶包括可以使所表达的
蛋白酶分泌到培养基中的前区域。如果需要，可以通过用不同的前区域或信号序列来取代
该前区域，这是通过取代编码相应前区域的DNA序列来实现的。

[0269] 用于分别连接编码麦芽α淀粉酶变体的本发明DNA构建体、启动子、终止子和其他元件，然后将其插入到含复制所必需信息的适宜载体中的方法是本领域技术人员熟知的
(参见，例如Sambrook等(1989))。

[0270] 在本发明麦芽α淀粉酶变体的重组生产中，最好用含本发明上述DNA构建体或表达载体的本发明细胞作为宿主细胞。通过将所述DNA构建体(一或多拷贝)整合到宿主染
色体中，可以合适地用编码所述变体的本发明DNA构建体转化所述细胞。由于DNA序列更
可能稳定地保持在细胞中，因此通常认为所述整合是有利的。按照常规方法，例如通过同源异源重组可将所述DNA构建体整合到宿主染色体中。或者，就不同类型的宿主细胞而言，可以用上述表达载体转化所述细胞。

[0271] 本发明的细胞可以是高等生物体例如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。

[0272] 适宜细菌的实例是革兰氏阳性菌例如枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌以及革兰氏阴性菌如大肠杆菌。例如通过原生质体转化或者利用本身已知的方式通过感受
态细胞影响细菌的转化。

[0273] 优选从糖酵母属或裂殖糖酵母属的种中，例如啤酒糖酵母中选择酵母生物。丝状真菌可有利地属于曲霉属，例如米曲霉或黑曲霉。以本身已知的方式，通过涉及原生质体形成和原生质体转化随后细胞壁再生的方法可转化真菌细胞。在EP238023中描述了曲霉宿
主细胞转化的适宜方法。

[0274] 在另一方面，本发明涉及生产本发明麦芽α淀粉酶变体的方法，所述方法包括在有利于生产所述变体的条件下培养上述宿主细胞，然后从细胞和/或培养基中回收所述变
体。

[0275] 用于培养所述细胞的培养基可以是适于生长所研究的宿主细胞并获得本发明麦芽α淀粉酶变体表达的任何常规培养基。适宜的培养基可从供应商 处购买或者按照公开
的配方(例如美国典型培养物保藏中心目录中所述的)制备。

[0276] 用熟知的方法可以方便地从培养基中回收从宿主细胞中分泌的麦芽α淀粉酶变体，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，然后用盐例如硫酸铵沉淀培养基
中的蛋白质类组分，然后用色谱方法例如离子交换色谱、亲和色谱等。

[0277] 检测麦芽α淀粉酶变体

[0278] 在纯化之前或之后，用测量所述变体降解淀粉之能力的筛选检测方法，可以检测用上述任何方法生产的麦芽α淀粉酶变体的淀粉分解活性。用基于下列过程的过滤试验
可以方便的进行前面提到的本发明随机诱变方法中的步骤10的筛选。在适宜的培养基和
适于分泌所述酶的条件下培养能够表达所研究的突变麦芽α淀粉酶的微生物，用两个滤
器覆盖培养基，蛋白质结合滤器放在有低蛋白质结合能力的第二滤器下。微生物在顶部的
第二滤器上生长。培养后，将含有从微生物分泌的酶的底部蛋白质结合滤器与包含微生物
的第二滤器分开。然后筛选蛋白质结合的滤器的所需的酶活性，鉴定第二滤器上存在的相
应的微生物菌落。用于结合酶活性的第一滤器可以是任何蛋白质结合滤器，例如尼龙或硝
基纤维素。携带表达生物的第二滤器可以是没有结合蛋白质亲和性或较低结合蛋白质亲和
TM
性的任何滤器，例如乙酸纤维素或Durapore 。

[0279] 筛选包括用可以检测α淀粉酶活性的底物处理结合有分泌的蛋白质的第一滤器。通过染料、荧光、沉淀、pH指示剂、IR吸收值或用于检测酶活性的任何已知的检测酶活性的技术可以检测酶活性。可以通过任何固定剂例如琼脂糖、琼脂、明胶、聚丙烯酰胺、淀粉、滤纸、布或者任何固定剂的组合可以固定检测化合物。例如通过Cibacron Red标记的
固定在琼脂糖上的支链淀粉可以检测α淀粉酶活性。在该底物上的α淀粉酶活性在平板
上产生红色强度降低的区域。

[0280] 为了筛选具有改善的稳定性的变体，在上述检测步骤前预处理结合麦芽α淀粉酶变体的滤器，以便使相对于亲本麦芽α淀粉酶不具有改善的稳定性的变体灭活。所述灭
活步骤包括，但不限于：在pH2-12的任何pH下的缓冲溶液和/或在含已知的或认为有助于
改变稳定性的另一化合物例如表面活 性剂、EDTA、EGTA、小麦组分或任何其他有关添加剂的缓冲液存在的条件下在升高的温度下培养。然后将这样处理一段具体时间的滤器在去离
子水中简单漂洗，并放在平板上用于按上述进行活性检测。对条件进行选择以便在检测培
养基上培养后，稳定的变体相对于亲本表现出提高的酶活性。

[0281] 为了筛选具有改变的热稳定性的变体，将结合变体的滤器在给定pH(如pH2-12)在升高的温度(例如50-110℃)下培养一段时间(例如1-20分钟)以便灭活几乎所有的
亲本麦芽α淀粉酶，用水漂洗，然后直接放在含固定的Cibacron Red标记的支链淀粉的检
测平板上，然后一直温育至可以检测活性。同样，通过调整上述灭活步骤中缓冲液的pH从
而使亲本麦芽α淀粉酶灭活，可以筛选pH依赖的稳定性，由此只检测出那些在所述pH下
具有提高的稳定性的变体。为了筛选具有提高的钙依赖稳定性的变体，将钙螯合剂，例如乙二醇-二(β-氨基乙基醚)N，N，N’N’-四乙酸(EGTA)加入到某一浓度的灭活缓冲液中，
以便在进一步定义的条件下例如缓冲液pH、温度或者具体温育时间下使亲本麦芽α淀粉
酶灭活。

[0282] 通过检测变体的淀粉降解活性，例如通过在含淀粉的琼脂糖平板上生长用编码变体之DNA序列转化的宿主细胞并鉴定上述降解淀粉的宿主细胞，可以合适地检测本发明的
变体。按照下文所述的本领域已知的方法，在纯化的变体上进一步检测改变的性质，所述性质包括比活性、底物特异性、裂解模式、热激活、热稳定性、pH依赖活性或最佳值、pH依赖稳定性、温度依赖活性或最佳值、转糖基活性、稳定性以及所需的任何其他参数。

[0283] 用麦芽α淀粉酶降解β极限糊精

[0284] 在评估麦芽α淀粉酶变体的底物特异性时，另一重要的参数是所述酶能够将已用外切糖基酶(exoglycosylase)β淀粉酶彻底处理的淀粉降解到什么程度。为筛选对所
述底物的降解模式与由亲本麦芽α淀粉酶所产生的模式不同的变体，进行如下检测：将25
毫升1％支链淀粉与24μg/mlβ淀粉酶一起在Mcllvane缓冲液(48.5mM柠檬酸盐和193mM
磷酸钠pH5.0)中在30℃下培养过夜来制备β极限(β-limit)糊精。用1体积98％乙醇
沉淀未水解的支链淀粉(即β极限糊精)，洗涤并再溶于水中。将1毫升β极限糊精与
18微升酶(2.2mg/ml)和100微升0.2M柠檬酸盐-磷酸盐pH5.0一起在30℃温育2小时，
然后按上述通过HPLC分析。在95℃2M HCl中进行β极限糊精的总水解。 用本领域已知
的方法测定还原端的浓度。

[0285] 钙结合亲和性

[0286] 暴露于热或与变性剂例如盐酸胍接触而引起的麦芽α淀粉酶的解折叠伴随有荧光的减少，并且钙离子损失导致解折叠。因此，在所述变体(例如浓度为10mg/ml)在缓冲
液(例如50mM HEPES，pH7)与不同浓度钙(例如1mM-100mM)或EGTA(例如1-1000mM)温
育一段足够长的时间(例如55℃下22小时)之前和之后通过荧光测量可测得麦芽α淀粉
酶变体对钙的亲和性。

[0287] 测得的荧光F是由酶的折叠和解折叠的形式组成。可导出以下方程式来描述F对钙浓度([Ca])的依赖性：

[0288] F＝[Ca]/(Kdiss+[Ca])(aN-bNlog([Ca]))+

[0289] Kdiss/(Kdiss+[Ca])(au-bulog([Ca]))

[0290] 其中aN是酶的天然(折叠的)的形式荧光，bN是aN对钙浓度(实验所观察到的)对数值的线性依赖性，aU是解折叠形式的荧光，bU是aU对钙浓度对数值的线性依赖性。Kdiss是如下平衡过程的表观钙结合常数：

[0291] Kdiss

[0292] N-Ca<

[0293] 事实上，解折叠进行得非常缓慢并且是不可逆的。解折叠的速率取决于钙的浓度，给定酶的这种依赖性提供了测量酶对钙结合亲和性的方法。通过定义一套标准的反应条件(例如在55℃下22小时)，就可以对不同麦芽α淀粉酶变体的Kdiss进行有意义的比较。

[0294] 工业实用性

[0295] 本发明的麦芽α淀粉酶变体具有有价值的性质，可有利地用于各种工业领域。具体地讲，所述酶对于延缓或防止例如烘烤工业中常见的退化并由此使淀粉食品变质具有潜
在的应用价值。

[0296] 所述变体可用于按照本领域已知的常规技术制备面包和其他面包产品。

[0297] 据认为通过利用本发明修饰淀粉部分可增加烘烤产品的体积并改善感观质量，例如味道、口感、适口性、芳香和外皮颜色。

[0298] 可用麦芽α淀粉酶变体作为唯一的酶或者与一种或多种其他酶例如木聚糖酶、脂酶、葡萄糖氧化酶和其他氧化还原酶或淀粉分解酶联用作为主要 的酶活性。

[0299] 本发明的酶变体还具有作为洗涤、洗盘子以及硬表面清洁洗涤剂组合物之组分的工业应用。一些变体特别适用于制备线性寡糖的方法，或者从淀粉生产甜味剂和乙醇和/
或用于纺织品的脱浆。在例如US3912590和EP专利申请分开号252730和63909中描述了
常规淀粉转变方法包括淀粉液化和糖化过程的条件。

[0300] 参考下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不以任何方式限制本发明的范围。

[0301] 用MANU确定麦芽淀粉酶

[0302] 1麦芽淀粉酶Novo单位(MANU)是在标准条件下，每分钟裂解1μmol麦芽三糖的酶的量。所述标准条件是10mg/ml麦芽三糖，37℃，pH5.0，反应时间为30分钟。

[0303] 在相同的条件下，但在不同的pH值下，重复所述测量方法可以确定pH依赖性。

[0304] 实施例

[0305] 实施例1：构建具有改变的pH依赖活性的Novamyl变体

[0306] 在枯草芽孢杆菌中从本文称为pLBeiO10的质粒表达Novamyl。该质粒含有其中amyM的表达受其自身启动子指导的amyM和编码Novamyl的完整基因(例如在菌株
DSM11837中所含的)。该质粒含有来自质粒pUB110的复制原点和用于筛选目的的卡那霉
素抗性标记。在图1中示出了pLBeiO10。

[0307] 引物序列

[0308] 基本按照Kammann等(1989)所述的大引物(megaprimer)法构建Novamyl的定点突变体。简而言之，在PCR反应中将诱变的寡核苷酸引物与适宜的反向DNA链末端引物一起
使用以产生初级PCR产物。然后用该产物与另一反向DNA链末端引物一起作为大引物产生
双链DNA产物。通过标准克隆方法，按常规用最后PCR反应的产物代替pLBeiO10质粒中的
- -
相应的DNA片段。将突变体直接转化到枯草芽孢杆菌菌株SHa273中，该菌株是apr、npr、
- -
amyE、amyE2 并按本领域已知的方法制备的枯草芽孢杆菌168的衍生物。

[0309] 下文列出了在所述变体构建中所用的寡核苷酸引物：

[0310] 变体序列(5’→3’)

[0311] F188H：SEQ ID NO：3

[0312] F188E：SEQ ID NO：4

[0313] F284E：SEQ IDNO：5

[0314] F284D：SEQ ID NO：6

[0315] F284K：SEQ ID NO：7

[0316] N327D：SEQ ID NO：8

[0317] 变体序列(3’→5’)

[0318] T288K：SEQ ID NO：9

[0319] T288R：SEQ ID NO：10

[0320] 用引物A189(SEQ ID NO：11)和B649(SEQ ID NO：12)作为末端引物得到F284、T288和N327的天冬氨酸变体。

[0321] 用引物A82(SEQ ID NO：13)和B346(SEQ ID NO：14)作为末端引物得到F188-变体F188L、T189Y。

[0322] 将具有所需修饰的PCR产物纯化，用适宜的酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离并提取，在存在糖原的条件下乙醇沉淀，重悬在水中，与已用相同适宜酶消化的pLBeiO10连
接，然后转化到枯草芽孢杆菌SHa273中。通过菌落PCR检测转化体的大小，通过限制酶消
化检测特异性限制位点的插入或除去。按本领域所述DNA测序方法证实阳性菌落。

[0323] 发酵

[0324] 在37℃，在LB-Kana(10μg/ml)-淀粉平板上使枯草芽孢杆菌SHa273突变克隆生长过夜。将来自平板的菌落重悬在10毫升Luria肉汤中。将1/6各种悬浮液接种到含100
毫升PS-1培养基、黄豆粉/蔗糖-基培养基、终浓度为10μg/ml的卡那霉素和100μl5M
NaOH的500毫升摇瓶中。接种前用氢氧化钠将pH调整到7.5。30℃将培养物在270-300rpm
振荡下培养5天。

[0325] 酶纯化

[0326] 在 亲 和 层 析 前，通 过 絮 凝 作 用 从 培 养 基 中 除 去 大 颗 粒。 用SuperflocC521(American Cyanmide Company) 作 为 阳 离 子 絮 凝 剂， 用SuperflocA130(American Cyanmide Company)作为阴离子絮凝剂。

[0327] 将培养悬浮液以1∶1用去离子水稀释，然后将pH调节到约7.5。在搅拌过程中，加入0.01ml50w/w％CaCl2/ml稀释的培养物。用20％甲酸滴定0.015 ml20w/w％铝酸钠/
ml稀释的培养物，同时保持pH在7-8之间。搅拌的同时加入0.025ml10v/v％C521/ml稀
释的培养物，然后加入0.05ml1w/v％A130/ml稀释的培养物，或直到观察到絮凝作用。将溶液以4500rpm离心30分钟。用0.45μm孔大小的滤器进行过滤除去大颗粒和任何剩余的
细菌。将过滤的溶液在-20℃贮存。

[0328] 将α环糊精固定到DSV-琼脂糖上

[0329] 将100毫克分子量为972.86g/mol(Fluka28705)的α环糊精溶解于20毫升偶合缓冲液(0.5M Na2CO3，pH11)中。将10毫升DSV-琼脂糖(Mini-Leak，培养基10-20mmol/l
二乙烯砜激活的琼脂糖(Kem-En-Tec))用去离子水彻底洗涤，然后抽吸干燥并转移到α环
糊精溶液中。在室温将混合物搅拌24小时后，用去离子水、然后用0.5M KHCO3洗涤凝胶。
将凝胶转移到封闭缓冲液(blocking buffer)(20毫升0.5M KHCO3+1毫升巯基乙醇)中，
在室温搅拌2小时，然后用去离子水洗涤。

[0330] 亲和色谱

[0331] 用Pharmacia FPLC系统通过亲和色谱纯化所述变体。将0.04体积1M乙酸钠pH5-10
加到通过絮凝作用得到的滤液中以调整pH，加入氯化钙达到10 M的终浓度。将溶液过滤
并脱气。用10毫升固定的α环糊精制备Pharmacia XK16柱，然后通过以柱体积约10倍
洗涤将所述柱用平衡缓冲液(25mM乙酸钠pH5)平衡。将滤液加到XK16柱上，然后用平衡
缓冲液洗涤所述柱，直到在洗涤缓冲液中检测不到蛋白质为止。用含0.5M NaCl的平衡缓
冲液洗涤柱以洗脱非特异性物质，然后用2-3倍柱体积的平衡缓冲液进行另一次洗涤。所
有洗涤均以10ml/分钟的流速进行。用2％α环糊精的洗涤缓冲液溶液洗脱特异性结合的
物质，然后以5ml/分钟的流速用PharmaciaChromatography Collector LCC-500Plus来收
集。

[0332] 实施例2：变体的pH依赖活性

[0333] 按下文所述检测上述实施例中制备的变体在不同pH下的活性。

[0334] 使用用于从麦芽三糖或支链淀粉中释放葡萄糖的比色葡萄糖氧化酶-过氧化物酶检测方法来确定所述酶变体的pH活性分布 Method，Boehringer
Mannheim，Indianapolis IN)。在pH值为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和
8.6的25mM柠檬酸 盐-磷酸盐，0.1mM CaCl2缓冲液中检测活性。用氢氧化钠调整缓冲液
的pH，用25mM柠檬酸盐-磷酸盐pH5稀释酶。以一式两份取测量值以得到平均值。所有值
均是在观察到最高活性水平的pH下的值。

[0335] 下表中所列的结果表明与亲本Novamyl相比时，每个变体具有改变的pH依赖活性分布。将每个变体的最高活性水平指定为100％，在其他指定的pH下测量到的变体的活性
是该最大值的相对百分比。

[0336] 表1

[0337]

[0338] 此外，检测许多Novamyl变体在pH4.0和5.0的活性，以相同pH时Novamyl的活性为100％。通过在60℃，水解50mM乙酸钠，1mM CaCl2中的麦芽三糖(10mg/ml)来确定活
性。将结果表示为在pH5.0和4.0的活性比：

[0339] 表2

[0340]修饰 pH5.0/pH4.0
N131D 0.24
I174Q 0.31
G397P 0.40
H103Y 0.40
Δ262-266 0.47
S32Q 0.53
S32D 0.55
T142A+D261G 0.62
G370N+N371G 0.66
S32N 0.68
N176S 0.79
D17E 0.80
无(亲本) 1
Δ191 1.39
192-A-193 1.6l
I174E 1.80
192-A-G-193 1.90
Δ192 2.22

[0341] 结果表明按照本发明可以得到具有较高或较低最佳pH值的变体。

[0342] 实施例3：变体的热稳定性

[0343] 在80℃温育

[0344] 通过在80℃和pH4.3的水溶液中温育并在不同时间检测残留的淀粉酶活性来检测多种Novamyl变体的热稳定性。用亲本酶，NoVamyl进行比较。将结果表示为不同时间
时残留活性占起始活性的百分比：

[0345] 表3

[0346]修饰 0 5分钟 10分钟 15分钟 20分钟 25分钟
无(亲本) 100 23 9 3 1 0
F188L+V336L+T525A 100 63 49 48 52 47
F188I+Y422F+I660V 100 71 60 51 43 38
N115D+F188L 100 73 60 51 44 39
A30D+K40R+D261G 100 38 24 15 13 10
T142A+N327S+K425E+K520R 100 47 39 25 19 11
+N595I
F188L+D261G+T288P 100 60 67 66 63 67
K40R+F188L+D261G+A483T 100 56 48 40 36 30
T288K 100 64 30 18 7 4 [0347] [0347] 上述数据表明与亲本淀粉酶相比，所述变体有明显改善的热稳定性。

[0348] 在85℃与钙温育++

[0349] 通过与1mM Ca 在85℃一起温育15分钟来检测Novamyl变体S32E。所述变体有48％的残留活性，而亲本酶(Novamyl)在相同的条件下有32％的残留活性。

[0350] DSC

[0351] 此外，在pH4.3或5.5通过DSC(示差扫描量热计)检测一些Novamy变体的热稳定性。另外，用亲本酶进行比较。将结果表示为变性温度(Tm)：

[0352] 表4

[0353]修饰 在pH4.3下的Tm 在pH5.5下的Tm
无(亲本) 79℃ 88℃
N115D+F188L 86℃ 92℃
T142A+N327S+K425E+K520R+N595I 未测定 93℃

[0354] 结果表明两种变体有改善的热稳定性。

[0355] 实施例4：变体的比活性

[0356] 在pH5.0和60℃，对Phadebas片剂作用后，通过比色测量确定淀粉酶活性。下文列出了两种Novamyl变体，相对于Novamyl的结果：

[0357] 表5

[0358]修饰 相对淀粉酶活性
无(亲本) 100
192-A-193 110
Δ(191-195) 300

[0359] 用上述MANU方法，通过在pH4.0和60℃下对麦芽三糖的作用进一步检测比活性。结果表明与Novamyl相比，变体G370N、N371G有106％的麦芽三糖比活性。

[0360] 实施例5：退化的抑制作用

[0361] 按下列方法确定Novamyl和Novamyl变体抑制退化的效力：

[0362] 将730毫克在所选pH(3.7，4.3或5.5)下的0.1M乙酸钠中的50％(w/w)支链淀粉浆与20微升酶样品混合，然后将混合物在40℃密封的安瓿中温育1小时，然后在100℃
温育1小时以使样品明胶化。然后在室温下将样品老化7天以使支链淀粉再结晶。包括不
含酶的对照物。

[0363] 老化后，以90℃/小时恒定的扫描速率从5℃-90℃扫描对样品进行DSC。取在热图中第一吸热峰下的面积代表退化的支链淀粉量，将退化的相对抑制作用表示为相对不含
酶的对照物面积的减小(％)。

[0364] 在下表中，将酶的效力表示为退化的相对抑制作用与酶剂量的比(以MANU/ml计)：

[0365] 表6

[0366]pH 修饰 MANU/ml 相对抑制 效力
3.7 A30D+K40R+D261G 0.23 0.38 1.7
3.7 T142A+N327S+K425E+K520R+N595I 0.07 0.29 4.1
3.7 无(亲本) 0.27 0.38 1.4
4.3 N115D+F188L 0.01 0.18 18
4.3 无(亲本) 0.27 0.43 1.6
5.5 Δ(191-195)+F188L+T189Y 0.02 0.12 6
5.5 Δ(191-195) 0.02 0.14 7
5.5 Δ(191-195) 0.05 0.31 6.2
5.5 N115D+F188L 0.01 0.39 39
5.5 T142A+D261G 0.14 0.53 3.8
5.5 无(亲本) 0.27 0.49 1.8

[0367] 结果表明就抑制退化而言，许多变体均比亲本淀粉酶更有效。

[0368] 实施例6：变体的抗变质作用

[0369] 用European Straight Dough方法或者用加有或不加酶的酸性生面制造面 包，在有盖的盘中烘烤长面包以避免体积效应。使面包冷却2小时，然后分析纹理。然后将剩余
的长面包包裹在塑料袋中并在室温下贮存1、4和7天后分析纹理。

[0370] 将每个长面包切成4片进行纹理分析；在压缩25％(P1)、压缩40％(P2)和保持压缩40％恒定30秒(P3)后测量力。取P1为硬度，取比例(P3/P2)为面包屑的弹性。按实
施例7所述通过DSC确定贮存7天后的退化程度。

[0371] European Straight Dough(pH5.5-6.0)

[0372] 以0-2mg酶/kg面粉的剂量检测Novamyl变体(T142A+N327S+K425E+K520R+N595I)，用亲本酶(Novamyl)作比较。

[0373] 结果表明在相同的剂量下，2小时和1天后，变体比亲本酶有更好的弹性(P3/P2)。7天后的结果表明1-2mg/kg剂量的变体比相同剂量的亲本酶产生明显较软的面包屑(较低
的硬度，P1)。因此，在7天的贮存期内，变体有更好的抗变质作用。

[0374] 酸性生面(pH约4.5)

[0375] 在酸性生面检测Novamyl变体(F188L+D261G+T288P)，用亲本酶(Novamyl)作比较。7天后得到有关硬度(P1)的结果，4天和7天后得到弹性(P3/P2)的结果，7天后得到
退化的结果：

[0376] 表7

[0377]酶 剂量mg/kg面粉 7天后的硬度(P1)
无 0 2590
亲本 1 2031
3 1912
13 1570
变体 1 1436
3 1226

[0378] [0378] 表8

[0379]酶 剂量mg/kg面粉 4天后弹性 7天后弹性
无 0 0.49 0.47
亲本 1 0.51 0.52
3 0.53 0.51
13 0.53 0.51
变体 1 0.59 0.57
3 0.57 0.58

[0380] 表9

[0381]酶 剂量mg/kg面粉 7天退化(相对于对照物)
无 0 100％
亲本 1 100％
3 63％
13 32％
变体 1 46％
3 20％

[0382] 结果表明在pH4.5的酸性生面中，所述变体对评估为硬度和弹性的纹理有显著的改善作用。对于所有检测的参数，1-3mg/kg剂量的变体优于13mg/kg的亲本酶，在任何剂量下，用变体得到的弹性是亲本酶无法匹敌的。

[0383] 实施例7：变体的裂解模式

[0384] 比较两种变体和亲本酶Novamyl的淀粉水解的裂解模式。

[0385] 下列结果表明在50℃，用50mM乙酸钠、1mM CaCl2，pH5.0在1％(w/v)淀粉中温育24小时后形成的各寡糖(G1-G8)的重量百分比。用HPLC鉴定并定量分析所述寡糖。

[0386] 表10

[0387]寡糖 亲本 Δ(191-195) N115D+F188L
G8 - 1.7 -
G7 - 2.6 -
G6 - 7.5 1.4
G5 - 10.1 2.1
G4 - 21.1 11.3
G3 - 28.7 10.7
G2 96.5 28.3 61.9
G1 3.5 - 12.6

[0388] 结果表明有明显改变的裂解模式。24小时后，Novamyl主要产生麦芽糖，基本上没有更高级的寡糖。相反，两种变体产生显著量的麦芽三糖和更高级的寡糖。

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[0415]

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[0418]

[0419]

[0420]

[0421]

[0422]

[0423]

[0424]

[0425]

[0426]

[0427]

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[0429]

[0430]

[0431]

[0432]

[0433]

[0434]

[0435]

[0436]

[0437]

[0438]

[0439]

[0440]

[0441]

[0442]

[0443]

[0444]

[0445]

[0446]

[0447]

[0448]

[0449]

[0450]

[0451]

[0452]

[0453]

[0454]

[0455]

[0456]

[0457]

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[0459]

[0460]

[0461]

[0462]

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[0464]

[0465]

[0466]

[0467]

[0468]

[0469]

[0470]

[0471]

[0472]

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[0474]

[0475]

[0476]

[0477]

[0478]

[0479]

[0480]

[0481]

[0482]

[0483]

[0484]

[0485]

[0486]

[0487]

[0488]

[0489]

[0490]

[0491]

[0492]

[0493] 序列表

[0494] <110> NOVONORDISK A/S

[0495] <120> 麦芽α-淀粉酶变体

[0496] <130> 5443-wO，SLK

[0497] <140>

[0498] <141>

[0499] <160> 14

[0500] <170> patontIn Vor.2.0

[0501] <210> 1

[0502] <211> 2160

[0503] <212> DNA

[0504] <213> 芽孢杆菌属

[0505] <220>

[0506] <221> CDa

[0507] <222> (1)..(2160)

[0508] <220>

[0509] <221> mat_肽

[0510] <222> (100)..(2157)

[0511] <400> 1

[0512]

[0513]

[0514]

[0515]

[0516]

[0517] <210> 2

[0518] <211> 719

[0519] <212> PRT

[0520] <213> 芽孢杆菌属

[0521] <400> 2

[0522]

[0523]

[0524]

[0525]

[0526] <210> 3

[0527] <211> 38

[0528] <212> DNA

[0529] <213> 人工序列

[0530] <220>

[0531] <223> 人工序列的描述：F188H引物

[0532] <400> 3

[0533]

[0534] <210> 4

[0535] <211> 38

[0536] <212> DNA

[0537] <213> 人工序列

[0538] <220>

[0539] <223> 人工序列的描述：F188E引物

[0540] <400> 4

[0541]

[0542] <210> 5

[0543] <211> 36

[0544] <212> DNA

[0545] <213> 人工序列

[0546] <220>

[0547] <223> 人工序列的描述：F284E引物

[0548] <400> 5

[0549]

[0550] <210> 6

[0551] <211> 36

[0552] <212> DNA

[0553] <213> 人工序列

[0554] <220>

[0555] <223> 人工序列的描述：F284D引物

[0556] <400> 6

[0557]

[0558] <210> 7

[0559] <211> 36

[0560] <212> DNA

[0561] <213> 人工序列

[0562] <220>

[0563] <223> 人工序列的描述：F284K引物

[0564] <400> 7

[0565]

[0566] <210> 8

[0567] <211> 35

[0568] <212> DNA

[0569] <213> 人工序列

[0570] <220>

[0571] <223> 人工序列的描述：N327D引物

[0572] <400> B

[0573]

[0574] <210> 9

[0575] <211> 34

[0576] <212> DNA

[0577] <213> 人工序列

[0578] <220>

[0579] <223> 人工序列的描述：T288K引物

[0580] <400> 9

[0581]

[0582] <210> 10

[0583] <211> 34

[0584] <212> DNS

[0585] <213> 人工序列

[0587] <220>

[0588] <223> 人工序列的描述：T288R引物

[0589] <400> 10

[0590]

[0591] <210> 11

[0592] <211> 22

[0593] <212> DNA

[0594] <213> 人工序列

[0595] <220>

[0596] <223> 人工序列的描述：A189引物

[0597] <400> 11

[0598]

[0599] <210> 12

[0600] <211> 20

[0601] <212> DNA

[0602] <213> 人工序列

[0603] <220>

[0604] <223> 人工序列的描述：B649引物

[0605] <400> 12

[0606]

[0607] <210> 13

[0608] <211> 20

[0609] <212> DNA

[0610] <213> 人工序列

[0611] <220>

[0612] <223> 人工序列的描述：A82引物

[0613] <400> 13

[0614]

[0615] <210> 14

[0616] <211> 22

[0617] <212> DNA

[0618] <213> 人工序列

[0619] <220>

[0620] <223> 人工序列的描述：B346引物

[0621] <400> 14

[0622]