模板固定的β-发夹环模拟物的合成

摘要

通过基于混合固体-和溶液相合成技巧的新方法可制成模板固定的β-发夹环模拟物，其包含对应于结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)之一的模板和在其α-C原子不对称时具有L构型4-20个α-氨基酸残基的模板固定链。如果需要，该方法可改动以得到这些模板固定β-发夹环模拟物的对映异构体。这些对映异构体是新化合物，且所述模板固定β-发夹环模拟物中的许多本身也是新化合物。模板固定β-发夹环模拟物及其对映异构体可模拟蛋白质的平面表面并因此可用于探究大表面蛋白质-蛋白质相互作用。因此，它们可在难以寻找小分子量前导化合物的情况下用作蛋白质靶标的前导化合物寻找工具。

权利要求

1.一种制造具有以下通式的化合物及其盐的方法：其中

Z是n个在其α-C原子不对称时具有L构型的α-氨基酸残基的链，n为整数4-20，所述氨基酸残基在所述链中的位置从N-末端氨基酸开始计数；

是以下式的基团之一：

1

R 是氢或受保护的氨基；

2 10

R 是氢或具有式CH2-COOR 的基团；

3

R 是氨基保护基团；

4

R 是具有最高7个碳原子的烷基或芳基-具有最高7个碳原子的烷基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

5

R 是具有最高7个碳原子的烷基、具有最高7个碳原子的烷氧基或芳基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

6

R 是氢、具有最高7个碳原子的烷基、芳基、Br或NO2，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

7

R 是氢、具有最高7个碳原子的烷基、芳基、Br或NO2，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

8

R 是具有最高7个碳原子的烷基或芳基-具有最高7个碳原子的烷基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

9

R 是具有最高7个碳原子的烷基或芳基-具有最高7个碳原子的烷基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；且

10

R 是氢、具有最高7个碳原子的烷基、芳基、芳基-具有最高7个碳原子的烷基、芳酰基-具有最高7个碳原子的烷基或烯丙基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基，所述的芳酰基是苯甲酰基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯甲酰基，该方法包括：

(a)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与一种来自用二乙烯基苯交联的聚苯乙烯、并通过2-氯三苯甲基接头官能化的固体支持物偶联，其中如果n是偶数，该氨基酸在所n n n n 1需最终产物中处于 /2、/2+1或 /2-1位，如果n是奇数，则该氨基酸相应地处于 /2+/2或n 1/2-/2位，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

(b)从如此得到的产物中去除该N-保护基团；

(c)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联，该氨基酸在所需最终产物中靠近N-末端氨基酸残基一个位置，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

(d)从如此得到的产物中去除该N-保护基团；

(e)如果需要，重复步骤(c)和(d)，直到已引入N-末端氨基酸残基；

(f)将一种具有以下通式的化合物与如此得到的产物偶联；

其中

定义如上且X是N-保护基团，或如果

是以上基团(a)，可替换地

(fa)将具有通式III的化合物与在步骤(d)或(e)中得到的产物偶联：1

其中R 和X定义如上；

(fb)从如此得到的产物中去除N-保护基团；和(fc)将D-脯氨酸的被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联；

(g)从在步骤(f)或(fc)中得到的产物中去除N-保护基团；

(h)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联，该氨基酸在所需最终产物中处于n位，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

(i)从如此得到的产物中去除N-保护基团；

(j)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联，该氨基酸在所需最终产物中远离n位一个位置，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

(k)从如此得到的产物中去除N-保护基团；

(l)如果需要，重复步骤(j)和(k)，直到已引入所有氨基酸残基；

(m)从固体支持物上脱离如此得到的产物；

(n)通过O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(“HATU”)/7-氮杂-1-羟基苯并三唑(“HOAt”)将从固体支持物上分离的产物进行环化；

(o)去除存在于氨基酸残基链的任何成员的官能团上的任何保护基团和，如果需要，该分子中可能还存在的任何保护基团；和(p)如果需要，将如此得到的产物转化成盐或将如此得到的盐转化成相应的式I游离化合物或转化成不同的盐。

2.根据权利要求1的方法，其中X和氨基酸衍生物的N-保护基团是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。

3.制造式I化合物的对映异构体的方法，

其中

Z是n个在其α-C原子不对称时具有L构型的α-氨基酸残基的链，n为整数4-20，所述氨基酸残基在所述链中的位置从N-末端氨基酸开始计数；

是以下式的基团之一：

R1是氢或受保护的氨基；

R2是氢或具有式CH2-COOR10的基团；

R3是氨基保护基团；

R4是具有最高7个碳原子的烷基或芳基-具有最高7个碳原子的烷基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

R5是具有最高7个碳原子的烷基、具有最高7个碳原子的烷氧基或芳基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

R6是氢、具有最高7个碳原子的烷基、芳基、Br或NO2，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

R7是氢、具有最高7个碳原子的烷基、芳基、Br或NO2，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

R8是具有最高7个碳原子的烷基或芳基-具有最高7个碳原子的烷基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；

R9是具有最高7个碳原子的烷基或芳基-具有最高7个碳原子的烷基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基；且

10

R 是氢、具有最高7个碳原子的烷基、芳基、芳基-具有最高7个碳原子的烷基、芳酰基-具有最高7个碳原子的烷基或烯丙基，其中所述的芳基是苯基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯基，所述的芳酰基是苯甲酰基或者被具有最高7个碳原子的烷基或具有最高7个碳原子的烷氧基或卤素原子单-或二取代的苯甲酰基，该方法包括：

(a)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与一种来自用二乙烯基苯交联的聚苯乙烯、并通过2-氯三苯甲基接头官能化的固体支持物偶联，其中如果n是偶数，该氨基酸在所n n n n 1需最终产物中处于 /2、/2+1或 /2-1位，如果n是奇数，则该氨基酸相应地处于 /2+/2或n 1/2-/2位，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

(b)从如此得到的产物中去除该N-保护基团；

(c)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联，该氨基酸在所需最终产物中靠近N-末端氨基酸残基一个位置，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

(d)从如此得到的产物中去除该N-保护基团；

(e)如果需要，重复步骤(c)和(d)，直到已引入N-末端氨基酸残基；

(f)将一种具有以下通式的化合物与如此得到的产物偶联；

其中

定义如上且X是N-保护基团，或如果

是以上基团(a)，可替换地

(fa)将具有通式III的化合物与在步骤(d)或(e)中得到的产物偶联：1

其中R 和X定义如上；

(fb)从如此得到的产物中去除N-保护基团；和(fc)将D-脯氨酸的被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联；

(g)从在步骤(f)或(fc)中得到的产物中去除N-保护基团；

(h)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联，该氨基酸在所需最终产物中处于n位，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

(i)从如此得到的产物中去除N-保护基团；

(j)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联，该氨基酸在所需最终产物中远离n位一个位置，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

(k)从如此得到的产物中去除N-保护基团；

(l)如果需要，重复步骤(j)和(k)，直到已引入所有氨基酸残基；

(m)从固体支持物上脱离如此得到的产物；

(n)通过O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(“HATU”)/7-氮杂-1-羟基苯并三唑(“HOAt”)将从固体支持物上分离的产物进行环化；

(o)去除存在于氨基酸残基链的任何成员的官能团上的任何保护基团和，如果需要，该分子中可能还存在的任何保护基团；和(p)如果需要，将如此得到的产物转化成盐或将如此得到的盐转化成相应的式I游离化合物或转化成不同的盐，其中具有不对称α-碳原子的所有氨基酸以D-型使用，且步骤(f)中使用对应于结构(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的模板或对应于(f)、(g)或(h)的模板的对映异构体，而且相应地，在步骤(fa)中使用式III化合物的对映异构体且在步骤(fc)中使用L-脯氨酸的衍生物。

4.根据权利要求1-3之任一项的方法，其以平行阵列合成实施，产生含许多权利要求1中定义的式I化合物或其对映异构体的库。

5.根据权利要求4的方法，其中该库包含24-192种化合物。

6.根据权利要求5的方法，其中该库包含96种化合物。

说明书

模板固定的β-发夹环模拟物的合成

[0001] 本发明涉及一种合成具有以下通式的模板(template)固定的β-发夹环模拟物(mimetics)或其盐的可靠方法：

[0002]

[0003] 其中

[0004] Z是n个在其α-C原子不对称时具有L构型的α-氨基酸残基的链，n为整数4-20，所述氨基酸残基在所述链中的位置从N-末端氨基酸开始计数；

[0005]

[0006] 是以下式的基团之一：

[0007]

[0008]

[0009] R1是氢或受保护的氨基；

[0010] R2是氢或具有式CH2-COOR10的基团；

[0011] R3是氨基保护基团；

[0012] R4是低级烷基或芳基-低级烷基；

[0013] R5是低级烷基、低级烷氧基或芳基；

[0014] R6是氢、低级烷基、取代低级烷基、芳基、Br或NO2；

[0015] R7是氢、低级烷基、取代低级烷基、芳基、Br或NO2；

[0016] R8是低级烷基、取代低级烷基或芳基-低级烷基；

[0017] R9是低级烷基、取代低级烷基或芳基-低级烷基；且

[0018] R10是氢、低级烷基、取代低级烷基、芳基、芳基-低级烷基、芳酰基-低级烷基或烯丙基。

[0019] 该方法基于一种混合固体-和溶液相合成技巧且包括：

[0020] (a)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与一种合适官能化的固体支持物偶联，其中如果n是偶数，该氨基酸在所需最终产物中处于n/2、n/2+1或n/2-1位，如果n是奇数，则该氨基酸相应地处于n/2+1/2或n/2-1/2位，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

[0021] (b)从如此得到的产物中去除该N-保护基团；

[0022] (c)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联，该氨基酸在所需最终产物中靠近N-末端氨基酸残基一个位置，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

[0023] (d)从如此得到的产物中去除该N-保护基团；

[0024] (e)如果需要，重复步骤(c)和(d)，直到已引入N-末端氨基酸残基；

[0025] (f)将一种具有以下通式的化合物与如此得到的产物偶联；

[0026]

[0027] 其中

[0028]

[0029] 定义如上且X是N-保护基团，或如果

[0030]

[0031] 是以上基团(a)，可替换地

[0032] (fa)将具有通式III的化合物与在步骤(d)或(e)中得到的产物偶联：

[0033]

[0034] 其中R1和X定义如上；

[0035] (fb)从如此得到的产物中去除N-保护基团；和

[0036] (fc)将D-脯氨酸的被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联；

[0037] (g)从在步骤(f)或(fc)中得到的产物中去除N-保护基团；

[0038] (h)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联，该氨基酸在所需最终产物中处于n位，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

[0039] (i)从如此得到的产物中去除N-保护基团；

[0040] (j)将氨基酸的一种被合适N-保护的衍生物与如此得到的产物偶联，该氨基酸在所需最终产物中远离n位一个位置，可能存在于所述被N-保护的氨基酸衍生物中的任何官能团同样被合适保护；

[0041] (k)从如此得到的产物中去除N-保护基团；

[0042] (l)如果需要，重复步骤(j)和(k)，直到已引入所有氨基酸残基；

[0043] (m)从固体支持物上脱离如此得到的产物；

[0044] (n)将从固体支持物上分离的产物进行环化；

[0045] (o)去除存在于氨基酸残基链的任何成员的官能团上的任何保护基团和，如果需要，该分子中可能还存在的任何保护基团；和

[0046] (p)如果需要，将如此得到的产物转化成盐或将如此得到的盐转化成相应的式I游离化合物或转化成不同的盐。

[0047] 本发明的方法可有利地作为平行阵列合成来进行，得到具有以上通式I的模板固定β-发夹环模拟物的库。这种平行合成能够以高产率和规定纯度得到许多(一般24-192，通常96个)具有通式I的环状模板固定肽的阵列，尽量减少二聚和多聚副产物的形成。因此，官能化固体支持物(即，固体支持物加上接头分子)、模板和环化位点的适当选择具有重要作用。

[0048] 具有式I的β-发夹环模拟物可模拟蛋白质的平面表面并因此可用于探究大表面蛋白质-蛋白质相互作用。在明显难以寻找小分子量前导化合物(lead compound)的情况下，它们可用作蛋白质目标的前导化合物寻找工具。由于具有式I的β-发夹环模拟物在结构上和构象的明确结构，关键氨基酸残基或基序可按构象上锁定的排列整合。通过将这些关键氨基酸残基或基序沿着β-发夹结构移动，可以扫描各种构象(对关键序列的构象扫描)。另外，可对蛋白质序列作图以检测β-发夹环基序。

[0049] 总之，这项技术能够迅速确定不仅在其顺序而且在其空间排列上对在大表面和平面蛋白质界面中结合重要的关键氨基酸和基序(热点)。这种信息可最终用于设计小的肽模拟药物候选物(Cunningham，B.C.；Wells，J.A.Curr.Opin.Struct.Biol.1997，7，457；Obrecht，D.；Altorfer，M.；Robinson，J.A.Adv.Med.Chem.Vol.4，1-68，JAI Press Inc.，
1999)。

[0050] 由于基因组科学的巨大进展，可以以纯化形式得到的用于结构和功能研究的生物相关蛋白质(如，受体、酶、转录因子、配体、调制剂、侣伴蛋白)数目不断增加。新生物靶标的这种爆发也产生一种对用于药物和农业化学筛选的新有机分子源以及对更有效筛选技术的需求。近年来已出现了组合和平行化学以满足对新家族的新型化合物不断增加的需求(Obrecht，D.；Villalgordo，J.-M，“Solid-Supported Combinatorial andParallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries”，Tetrahedron Organic Chemistry Series，Vol.17，Pergamon，ElsevierScience，1998)。

[0051] 尽管对小分子量化合物(MG小于550)的一般筛选已成功地产生用于具有明确结合位点和裂缝的靶标如酶和受体的前导化合物，但在配体结合涉及与相应受体的大表面蛋白质-蛋白质相互作用时，这项技术所得的结果相当差。但这些靶标的生物和药物重要性不断增加，而且可得到这些配体、受体、甚至结合到其相应受体上的配体的许多X-射线结构。这些包括例如生长因子家族的成员如血小板衍生生长因子(PDGF)[Oefiier，C；D′Arci，A.；Winkler，F.K.；Eggiinann，B.；Hosang，M.EMBO J.1992，11，3921]、神经生长因子(NGF)[Ihanez，C.F.；Ebendahl，T.；Baibany，G.；Murray-Rust，J.；Blundell，T.；
Perrson，H.Cell，1992，69，320-341]、表皮生长因子(EGF)[Biochemistry 1992，31，236]、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)[Biochemistry 1996，35，2086]、转化生长因子βII(TGF βII)[Schlunegger&Grutter，J.MoL Biol.1993，231，445]、血管内皮生长因子(VEGF)[Muller等人，Proc.Nati.Acad.Sci.1997，94，7192]、和细胞因子家族成员如白介素、肿瘤坏死因子(TNF α和β)[Banner，D.W.；D′Arci，A.；Janes，W.；Gentz，R.；Schonfeld，H.J.；Broger，C.；Lotscher.H.；Lesslauer，W.Cell，1993，73，431-445]。另外，包括CC4家族(如RANTES，MCP-1-4，Eotaxin和其它)、以及CXC家族(如GRO α-γ，白介素8(II
8)和其它)的趋化因子[Tarby，C.M.；Saunders，J.Drug Discovery Today1999，4，80-92；
Ponath，P.D.Exp.Opin.Invest.Drugs 1998，7，1-16)]已作为许多炎症病理学中的关键介质而出现。另外，整联蛋白(integrines)[参见Obrecht，D.；Altorfer，M.；Robinson，J.A.Adv.Med.Chem.Vol.4，1-68，JAI Press Inc.，1999]在细胞粘附、迁移和增殖中起着重要作用。所有这些蛋白质配体结合到涉及一种或几种大表面相互作用的其相应受体上。另外，X-射线结晶学和定点诱变研究增强了在这些相互作用中关键的表面β-发夹环基序的重要性。

[0052] 最近已分析了大表面蛋白质界面的结构且平均接触表面已通常确定为2
600-900A。结合自由能没有均匀地贯穿这些界面而分布；相反，在二聚体界面中，存在由残基的小子集组成的结合能热点。这些热点富含色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和精氨酸(Arg)，且被最适用于从热点遮蔽溶剂的能量上不太重要的残基包围[Bogan，A.A.；Thorn，K.S.J.Mol.Biol.1998，280，1-9]。溶剂的遮蔽据信是高能相互作用的必要条件。提供两个相反β-片层表面(如，疏水和亲水面)用于可能的结合相互作用的β-发夹环基序理想地适用于满足这些表面相互作用条件。

[0053] β-发夹基序有自然界中非常丰富且出现在许多蛋白质配体的表面上和抗体的高变域中。β-发夹基序由两个通过短环或转角连接的反向平行β-链组成且根据H-键接网络而分类[Sibanda，B.L.；Blundell，T.L.；Thornton，J.M.J.Mol.Biol.1989，206，759-777]。同样优异的一个例子存在于抗体的抗原结合位点中[Padlan，E.A.Mol.Immunol.1994，31，169-217]，它由位于6个所谓高变环或互补性决定区(CDR)的氨基酸残基组成，三个分别来自重-和轻-链可变区域(vH和vL)。在Ig族抗体中的6个CDR环中，
4个可划分为连接相邻反平行β-片层的β-发夹，两个来自vL域(L2和L3)，且两个来自vH域(H2和H3)。最近的评估建议，可将大多数的L1、L2、L3、H1和H2超可变区域划分为18种不同典型构象之一[Chothia，C.；Lesk，A.；Gherardi，E.；Tomlinson，I.M.；Walter，G.；
Marks，J.G.；Llewelyn，M.B.；Winter，G.J.Mol.Biol.1992，227，799-817；Martin，A.C.；
Thornton，J.M.J.Mol.Biol.1996，263，800-815；Al-Lazikani，B.；Lesk，A.；Chothia，C.J.Mol.Biol.1997，273，927-948]。

[0054] 本发明提供了一种合成具有通式I的模板固定的环肽的可靠方法，该模板固定环肽能够模拟各种天然存在的β-发夹构象，尤其是存在于生长因子、细胞因子和趋化因子、整联蛋白和抗体中的那些(参见如，图、实施例1)。对应于以上式(a)-(h)的模板结构已显示可稳定存在于β-发夹中的H-键网络[如，对于(a)：Spaeth等Helv.Chim.Acta1998，81，1726；Favre，M.；Moehle，K.；Jiang，L.；Pfeiffer，B.；Robinson，J.A.J.Am.Chem.Soc.1999，121，2679-2685；对于(b)：Emery等，J.Chem.Soc.Chem.Comm.1996，2155；Bisang等J.Am.Chem.Soc.1998，120，7439；对于(c)：Pfefer，M.J.Chem.Soc.Chem.Commun.1998，
1977；对于(d)：Pfeifer等Helv.Chim.Acta 1997，80，1513；对于(e)：Beeli等Helv.Chim.Acta 1996，79，2235；对于(f)和类似物：Müller K.；Obrecht，D.；Knierzinger，A.；
Stankovic，C；Spiegler，C.；Trzeciak，A.；Englert，G.；Labhardt，A.M.；
P.Perspectives in MedicinalChemistry；Testa，B.，Kyburz，E.，Fuhrer，W.，Gyger，R.，Eds.；VerlagHelv.Chim.Acta：Basel，1993；第513-531页；对于(g)和(h)和类似物：
Müller，K.；Obrecht，D.；Knierzinger，A.；Spiegler，C.；Bannwarth，W.；Trzeciak，A.；
Englert，G.；Labhardt，A.； P.Perspectives inMedicinal Chemistry，编者Testa，B.；Kyburz，E.；Fuhrer，W.；Giger，R.，Weinheim，New York，Basel，Cambridge：
Verlag Helvetica ChimicaActa，1993，513-531；Bannwarth，W.；Gerber，F.；Grieder，A.；
Knierzinger，A.；Müller，K.；Obrecht.D.；Trzeciak，A.Can.Pat.Appl.CA2101599]。

[0055] 如上所述，本发明的方法利用了一种混合固体-和溶液相合成途径，它可在如24-192，优选96个反应的平行阵列中进行，并以良好产率和规定纯度提供可用于筛选的具有通式I的模板固定环肽，这样尽量减少了往往在筛选过程中产生假阳性命中的二聚体和多聚体杂质的量。该方法明显优于Bannwarth，W.；Gerber，F.；Grieder，A.；Knierzinger，A.；Muller，K.；Obrecht.D.；Trzeciak，A.Can.Pat Appl.CA2101599的前述环肽合成。树脂和负荷能力、接头分子、模板和环化位点的合适选择是得到高产率和可靠纯度的β-发夹环模拟物的关键。因此，模板不仅稳定最终产物的构象，而且它们最可能通过β-发夹型H-键诱导而明显增加单体的环化速率。

[0056] 由于具有通式I的各种β-发夹环模拟物具有明确的结构，在各种构象中关键氨基酸残基和基序可通过沿着β-发夹骨架移动该序列而锁定(“生物活性序列的构象扫描”)。可替换地，蛋白质序列可通过使用该方法作图以检测β-发夹构象。即，这种β-发夹模拟物方法提供了一项在三维排列上检测蛋白质界面中高能相互作用的热点的技术。这种信息应该最终可转移成小肽模拟分子的设计。

[0057] 本文所用的术语“低级烷基”在单独或组合使用如“芳基-低级烷基”时包括具有最高7，优选最高4个碳原子的直链或支链饱和烃残基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和类似基团。术语“低级烷氧基”包括在上述术语“低级烷基”意义上的烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丁氧基和类似基团。术语“芳基”包括苯基残基和取代的苯基残基，尤其是单-或二取代的苯基残基，其中主要考虑低级烷基或低级烷氧基或卤素原子作为取代基。除非另有所指，术语“卤素”表示4种形式，氟、氯、溴和碘。术语“酰基”包括脂族和芳族羧酸的残基，首先，一方面包括低级烷酰基如乙酰基、丙酰基、丁酰基和类似基团，其可被例如羧基或低级烷氧基羰基取代，例如在4-羧基丁酰基、4-甲氧基羰基丁酰基或类似基团的情况下，另一方面包括芳酰基如苯甲酰基和取代的苯甲酰基，尤其是单-或二取代的苯甲酰基，其中主要考虑低级烷基或烷氧基或卤素原子作为取代基。术10 10
语“取代的低级烷基”包括被受保护的氨基、低级烷氧基、COOR (其中R 如上)、酰胺基或N-低级烷基酰胺基取代的低级烷基，如苯二酰亚氨基甲基、甲氧基甲基、甲氧基乙基和类似基团。术语“受保护的氨基”一方面包括苯二酰亚氨基(“Pt”)之类的残基，另一方面包括
11 11
具有式-NH-R 的残基，其中R 可表示任何合适的N-保护基团如苄基氧基羰基(“Z”)、叔丁基氧基羰基(“Boc”)、9-芴基甲氧基羰基(“Fmoc”)、烯丙基氧基羰基(“Alloc”)、三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(″Teoc″)，三氯乙氧基羰基(″Tcc″)，邻硝基苯基磺酰基(″Nps″)和类似基团。

[0058] 作为氨基酸残基，主要考虑衍生自天然α-氨基酸的那些。以下列举出本身或其残基适用于本发明的这些氨基酸，简称对应于一般采用的惯例。

[0059] Ala A L-丙氨酸

[0060] Arg R L-精氨酸

[0061] Asn N L-天冬酰胺

[0062] Asp D L-天冬氨酸

[0063] Cys C L-半胱氨酸

[0064] Glu E L-谷氨酸

[0065] Gln Q L-谷氨酰胺

[0066] Gly G 甘氨酸

[0067] His H L-组氨酸

[0068] Ile I L-异亮氨酸

[0069] Leu L L-亮氨酸

[0070] Lys K L-赖氨酸

[0071] Met M L-甲硫氨酸

[0072] Phe F L-苯丙氨酸

[0073] Pro P L-脯氨酸

[0074] Ser S L-丝氨酸

[0075] Thr T L-苏氨酸

[0076] Trp W L-色氨酸

[0077] Tyr Y L-酪氨酸

[0078] Val V L-缬氨酸

[0079] 本身或其残基适用于本发明的其它氨基酸包括：

[0080] C4al L-3-环丁基丙氨酸

[0081] C5al L-3-环戊基丙氨酸

[0082] C6al L-3-环己基丙氨酸

[0083] aIle L-别异亮氨酸

[0084] Nal L-3-(1-萘基丙氨酸)

[0085] Nle L-正亮氨酸

[0086] Nva L-正缬氨酸

[0087] Orn L-鸟氨酸

[0088] Orn(CHO) N5-甲酰基-L-鸟氨酸

[0089] L-Phg L-苯基甘氨酸

[0090] Tza L-3-(2-噻唑基)丙氨酸

[0091] 可以理解，具有以上通式III的化合物，即，对应于以上式(a)的模板结构的两个L构件之一，是L-脯氨酸(L-Pro，P)的衍生物，而这些构件的第二个是D-脯氨酸(D-Pro，D
P)的残基。

[0092] n(即存在于链Z中的氨基酸残基数)的优选值一般为4-16。特别优选的n值是6、10和14(在模板结构对应于以上式(b)或(c)或(d)的情况下)，以及4、5、6、8、12和
16(在其它的模板结构，即对应于以上式(a)、(e)、(f)、(g)和(h)的那些的情况下)。

[0093] 有利地，链Z由2、3、4、5、6或有时最高10个氨基酸残基的关键序列组成或包含它们，其中，在所有可能的组合或排列中，两个末端成员是“恒定的”(“k”)，而任何其它成员同样是“恒定的”或“可变的”(“x”)。两个末端“恒定的”成员可以相同或不同，这同样适用于任何其余的“恒定的”和/或任何“可变的”成员。

[0094] 特别合适的“恒定的”成员(“k”)是Trp、Arg、Tyr、Ile、Asp、His、Lys、Glu和Thr，其它合适的“恒定的”成员(“k”)是Gln、Phe、Met和Ser，且合适的“可变的”成员(″x″)是Ala、Orn、Leu和Val。

[0095] 2、3、4、5和6个氨基酸残基的关键序列可示意地描绘如下：

[0096] 二肽

[0097] -k1-k2-

[0098] 三肽

[0099] -k1-k2-k3-

[0100] -k1-x1-k2-

[0101] 四肽

[0102] -k1-k2-k3-k4-

[0103] -k1-x1-k2-k3-

[0104] -k1-k2-x1-k3-

[0105] -k1-x1-x2-k2-

[0106] 五肽

[0107] -k1-k2-k3-k4-k5-

[0108] -k1-x1-k2-k3-k4-

[0109] -k1-k2-x1-k3-k4-

[0110] -k1-k2-k3-x1-k4-

[0111] -k1-x1-x2-k2-k3-

[0112] -k1-k2-x1-x2-k3-

[0113] -k1-x1-k2-x2-k3-

[0114] -k1-x1-x2-x3-k2-

[0115] 六肽

[0116] -k1-k2-k3-k4-k5-k6-

[0117] -k1-x1-k2-k3-k4-k5-

[0118] -k1-k2-x1-k3-k4-k5-

[0119] -k1-k2-k3-x1-k4-k5-

[0120] -k1-k2-k3-k4-x1-k5-

[0121] -k1-x1-x2-k2-k3-k4-

[0122] -k1-k2-x1-x2-k3-k4-

[0123] -k1-k2-k3-x1-x2-k4-

[0124] -k1-x1-k2-x2-k3-k4-

[0125] -k1-k2-x1-k3-x2-k4-

[0126] -k1-x1-k2-k3-x2-k4-

[0127] -k1-x1-x2-x3-k2-k3-

[0128] -k1-k2-x1-x2-x3-k3-

[0129] -k1-x1-k2-x2-x3-k3-

[0130] -k1-x1-x2-k2-x3-k3-

[0131] -k1-x1-x2-x3-x4-k2-

[0132] 某些关键序列已知出现在重要的生理活性的肽中，例如

[0133] RGD 在纤连蛋白(FN)、玻连蛋白(VN)、骨桥蛋白、胶原蛋白、血小板反应蛋白、纤维蛋白原(Fg)、冯维勒布兰德因子(vWF)中，参见Obrecht，D.；Altorfer，M.；Robinson，J.A.Adv. Med.Chem.Vol.4，1-68，JAI Press Inc.，1999

[0134] ELR 在CXC趋化因子中，参见Saunders，J.；Tarby，C.M.Drug Discovery Today，1999，4，80-92

[0135] RKK 参见J.Biol.Chem.1999，274，3513

[0136] KGF 参见Prot.Sci.1998，7，1681-1690

[0137] VRKK [SEQ ID NO：1]在血小板衍生生长因子(PDGF)中，参见Ross，R.；Raines，E.W.；Bowden-Pope，D.F.Cell，1986，46，155-159

[0138] KKYL [SEQ ID NO：2]在表现出针对β-淀粉样神经毒性的神经保护性能的VIP(血管活性肠肽)中，参见Proc.Natl.Am.Soc.USA1999，96，4143-4148

[0139] WLDV [SEQ ID NO：3]在整联蛋白α4β1中，参见Europ.J.Biol.1996，242，352-362和Int.J.Pept.Prot.Res.1996，47，427-436

[0140] YIRLP [SEQ ID NO：4]在因子Xa抑制剂中，参见AlObeidis，F.；Ostrem，J.A.Drug Discovery Today 1998，3，223-231

[0141] YIGSR [SEQ ID NO：5]在昆布氨酸中，参见EMBO.J.1984，3，1463[0142] IKVAV [SEQ ID NO：6]参见Cell 1987，88，989

[0143] PPRXXW[SEQ ID NO：7]参见J.Biol Chem.1998，273，11001-11006&11007-11011[0144] IYYKDGALKY [SEQ ID NO：8]参见Biochem Soc.Trans.1997，29，387-392[0145] 如果需要，本发明方法可以改动以得到具有通式I的化合物的对映异构体。为此，具有不对称α-碳原子的所有氨基酸以D-型使用且在步骤(f)中使用对应于结构(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的模板或对应于式(f)、(g)或(h)的模板的对映异构体，而且相应地，在步骤(fa)中使用式III化合物的对映异构体且步骤(fc)中使用L-脯氨酸的衍生物。

[0146] 适用于氨基酸，相应地适用于其残基的保护基团是，例如

[0147] -对于氨基(例如也存在于赖氨酸的侧链中)

[0148] Z 苄基氧基羰基

[0149] Boc 叔丁基氧基羰基

[0150] Fmoc 9-芴基甲氧基羰基

[0151] Alloc 烯丙基氧基羰基

[0152] Teoc 三甲基甲硅烷基乙氧基羰基

[0153] Tcc 三氯乙氧基羰基

[0154] Nps 邻硝基苯基磺酰基；

[0155] Tr 三苯基甲基或三苯甲基

[0156] -对于羧基(例如也存在于天冬氨酸和谷氨酸的侧链中)，用醇组分转化成酯[0157] tBu 叔丁基

[0158] Bn 苄基

[0159] Me 甲基

[0160] Ph 苯基

[0161] Pac 苯甲酰基甲基

[0162] 烯丙基

[0163] 三甲基甲硅烷基乙基

[0164] 三氯乙基；

[0165] -对于胍基(例如存在于精氨酸的侧链中)

[0166] Pmc 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基

[0167] Ts 甲苯磺酰基(即，对甲苯磺酰基)

[0168] Z 苄基氧基羰基

[0169] Pbf 五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

[0170] -对于羟基(例如存在于苏氨酸和丝氨酸的侧链中)

[0171] tBu 叔丁基

[0172] Bn 苄基

[0173] Tr 三苯甲基

[0174] -以及对于巯基(例如存在于半胱氨酸的侧链中)

[0175] tBu 叔丁基

[0176] Bn 苄基

[0177] Tr 三苯甲基

[0178] Mtr 2-甲氧基三苯甲基

[0179] 官能化固体支持物适宜衍生自用优选1-5％二乙烯基苯交联的聚苯乙烯；涂有聚R乙二醇间隔物(spacer)的聚苯乙烯(Tentagel)；和聚丙烯酰胺树脂(也参见Obrecht，D.；
Villagordo，J.-M，“小分子量化合物库的固体承载的组合和平行合成”，四面体有机化学系列(Tetrahedron OrganicChemistry Series)，17卷，Pergamon，Elsevier Science，1998)。

[0180] 固体支持物通过接头，即双官能间隔分子官能化，该分子在一端包含用于连接到固体支持物上的固着基团并在另一端包含用于随后化学转化和分裂步骤的可选择性分裂的官能团。就本发明而言，接头必须设计成最终在不影响存在于各种氨基酸侧链中的任何官能团上的保护基团的温和酸性条件下释放羧基。适用于本发明的接头与氨基酸的羧基形成酸不稳定的酯，通常是酸不稳定的苄基、二苯甲基和三苯甲基酯；这种接头结构的例子包括3-甲氧基-4-羟基甲基苯氧基(Sasrin接头)、4-(2，4-二甲氧基苯基-羟基甲基)-苯氧基(Rink接头)、4-(4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸(HMPB接头)、三苯甲基和2-氯三苯甲基。

[0181] 如果作为平行阵列合成来进行，本发明方法可有利地按如下所述来进行，但如果需要合成一种具有以上式I的单个化合物，本领域熟练技术人员显然立即可看出该工艺步骤必须如何进行修改。

[0182] 将等于待由平行法合成的化合物总数的许多反应容器(一般24-192，通常96个)装载25-1000毫克，优选100毫克的合适官能化固体支持物，优选1-3％交联的聚苯乙烯或Tentagel树脂。

[0183] 所用溶剂必须能够溶胀树脂，且包括(但不限于)二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷二酮(NMP)、二噁烷、甲苯、四氢呋喃(THF)、乙醇(EtOH)、三氟乙醇(TFE)、异丙醇和类似物。包含极性溶剂作为至少一种组分的溶剂混合物(如，25％TFE/DCM、35％THF/NMP)对保证高反应性和树脂键接肽链的溶剂化是有益的(Fields，G.B.，Fields，C.G.，J.Am.Chem.Soc.1991，113，4202-4207)。

[0184] 随着开发出各种能够在不影响保护侧链中的官能团的酸不稳定基团的温和酸性条件下释放C-末端羧酸基团的接头，已在受保护的肽链片段的否成中取得显著进步。2-甲氧基-4-羟基苄醇衍生的接头(SasrinR接头，Mergier等人，Tetrahedron Lett.1988，294005-4008)可用稀三氟乙酸(在DCM中的0.5-1％TFA)分裂且在肽合成过程中对Fmoc去保护条件稳定，基于Boc/tBu的其它保护基团适合该保护方案。适用于本发明方法的其它接头包括超酸不稳定的4-(2，4-二甲氧基苯基-羟基甲基)-苯氧基接头(Rink接头，Rink，H.Tetrahedron Lett.1987，28，3787-3790)，其中肽的去除需要在DCM中的10％乙酸或在DCM中的0.2％三氟乙酸；4-(4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸衍生的接头(HMPB-接头， &Riniker，Peptides 1991，1990131)，其也用1％TFA/DCM分
裂以得到包含所有酸不稳定侧链保护基团的肽链片段；以及，2-氯三苯甲基氯化物接头(Barlos等人，Tetrahedron Lett.1989，30，3943-3946)，它能够使用冰乙酸/三氟乙醇/DCM(1∶2∶7)的混合物30分钟进行肽脱离。

[0185] 9-芴基甲氧基羰基-(Fmoc)保护的氨基酸衍生物优选用作构件以构建具有式I的模板固定的β-发夹环模拟物。对于去保护，即，Fmoc基团的分裂，可以使用在DCM中的20％哌啶或在DMF中的2％DBU/2％哌啶。

[0186] 反应物(即氨基酸衍生物)的量通常为1-20当量，基于原始称重到反应管中的官能化固体支持物的毫当量/克(meq/g)加载量(通常0.1-2.85meq/g聚苯乙烯树脂)。如果需要在合理时间内驱动反应至完成，可以使用外加当量的反应物。将反应管以及夹具部件和歧管重新插入储集部件中并将该装置固定在一起。气体开始流过歧管以提供受控环境，例如氮气、氩气、空气和类似物。气流也可在流过歧管之前受热或冷却。反应孔的加热或冷却通过加热反应部件或用异丙醇/干冰和类似物进行外冷却而实现，获得所需的合成反应。搅拌通过振荡或磁力搅拌(在反应管内)而实现。优选的工作台(但不限于此)是Labsource′s Combi-chem工作台和MultiSynTech′s-Syro合成仪。

[0187] 酰胺键形成需要活化α-羧基以用于酰基化步骤。如果这种活化通过常用的碳二亚胺如二环己基碳二亚胺(DCC，Sheehan&Hess，J Am.Chem.Soc.1955，77，1067-1068)或二异丙基碳二亚胺(DIC，Sarantakis等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1976，73，336-342)来进行，所得二环己基脲是不溶性的，而二异丙基脲相应地可溶于一般使用的溶剂。在碳二亚胺方法的一个变型中，1-羟基苯并三唑(HOBt， &Geiger，Chem.Ber 1970，103，788-798)作为一种用于偶联混合物的添加剂而包括在内。HOBt防止脱水、抑制活化氨基酸的外消旋化并用作催化剂以促进缓慢的偶联反应。已经使用某些鏻试剂作为直接偶联试剂，如苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)(Castro等人，Tetrahedron Lett.1975，14，1219-1222；Synthesis，1976，751-752)、或苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐(Py-BOP，Coste等人，Tetrahedron Lett.1990，31，205-208)、或2-(1H-苯并三唑-1-基-)1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)四氟硼酸盐(TBTU)、或六氟磷酸盐(HBTU，Knorr等人，TefrahedronLett.1989，30，
1927-1930)；这些鏻试剂也适合与受保护的氨基酸衍生物原位形成HOBt酯。更新近的是，还使用二苯氧基磷酰基叠氮化物(DPPA)或O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TATU)或O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)/7-氮杂-1-羟基苯并三唑(HOAt，Carpino等人，Tetrahedron Lett.1994，35，2279-2281)作为偶联试剂。

[0188] 由于近定量偶联反应是关键的，需要具有反应完成的实验证据。可在每次偶联步骤之后容易并迅速地进行茚三酮试验(Kaiser等人，Anal.Biochemistry 1970，34，595)，其中对树脂结合肽的等分试样的阳性比色响应定性地表示伯胺的存在。Fmoc化学能够分光光度检测Fmoc发色团，当该发色团被碱释放时(Meienhofer等人，Int.J.Peptide ProteinRes.1979，13，35-42)。

[0189] 每个反应管内的树脂结合中间体利用以下两种方法之一，通过重复暴露于清洁溶剂而洗净过量的保留试剂、溶剂、和副产物：

[0190] 1)用溶剂(优选5毫升)填充反应孔，将反应管以及夹具部件和歧管浸渍并搅拌5-300分钟，优选15分钟，然后利用重力，随后利用通过歧管入口(关闭出口的同时)施加的气压进行排放以排出溶剂；

[0191] 2)将歧管从夹具部件中取出，将溶剂的等分试样(优选5毫升)由反应管的顶部分配并利用重力通过一个过滤器排放到一个接收容器如试管或小瓶中。

[0192] 以上两种洗涤步骤都重复最高约50次(优选约10次)，利用TLC、GC、或洗涤滤液的视觉检测之类的方法监控试剂、溶剂、和副产物去除的效率。

[0193] 每次连续转化时都重复上述将树脂结合化合物与试剂在反应孔内反应并随后去除过量试剂、副产物和溶剂的步骤，直到制备出最终的树脂结合化合物。

[0194] 全部保护的线性肽通过将反应管以及夹具部件和歧管浸渍在包含分裂试剂溶液(优选3-5毫升)的反应孔中而从固体支持物上脱离。气流、温度控制、搅拌、和反应监控如上所述进行并根据需要进行脱离反应。反应管以及夹具部件和歧管从储集部件上拆开并升高到溶液液位之上但低于反应孔的上唇，然后通过歧管入口(同时关闭出口)施加气压以有效地将最终产物溶液排出到储集井中。留在反应管中的树脂随后如上所述用3-5毫升的合适溶剂洗涤2-5次以提取(洗出)尽可能多的脱离产物。合并如此得到的产物溶液，小心以避免相互混合。单个溶液/提取物随后根据需要进行处理以分离最终化合物。典型的处理包括(但不限于)蒸发、浓缩、液/液提取、酸化、碱化、中和或其它溶液反应。

[0195] 将包含已从固体支持物上分裂并用碱中和的全部保护线性肽衍生物的溶液进行蒸发，随后使用DCM、DMF、二噁烷、THF之类的溶剂在溶液中进行环化。可以使用较早提及的各种偶联试剂用于环化。环化的持续时间为约6-48小时，优选约24小时。反应进程例如通过RP-HPLC(反相高效液相色谱)进行跟踪。然后蒸发去除溶剂，将该全保护环肽衍生物溶解在一种不与水混溶的溶剂如DCM中，然后用水或水混溶性溶剂的混合物萃取该溶液以去除所有的过量偶联试剂。

[0196] 该全保护环肽衍生物用95％TFA、2.5％H2O、2.5％TIS或另一用于分裂保护基团的清除剂的组合进行处理。分裂反应时间通常为30分钟至12小时，优选2小时。然后蒸发掉大多数TFA并用醚/己烷(1∶1)或其它适用于此的溶剂沉淀该产物。在小心去除溶剂之后，可以分离作为最终产物得到的环肽衍生物。根据其纯度，该肽衍生物可直接用于生物分析，或必须进一步例如通过制备型HPLC进行纯化。

[0197] 一旦分离和表征，最终产物，即具有式I的化合物可单独测试生物活性。例如，可进行以下的固相分析。

[0198] 血小板衍生生长因子β(PDGFR-β)的直接固定通过在4℃下使用在100微升pH值9.6的15mM Na2CO3、35mM碳酸氢钠中的100ng纯化蛋白质在免疫吸附96-孔板(Nunc)中孵育过夜而进行。该板用tris缓冲盐水(TBS，20mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH值7.4)洗涤一次，然后通过与TBS加上1％牛血清白蛋白孵育至少1小时来封闭非特异吸附。在125
用TBS加上0.1％Tween洗涤之后，将3000cpm的 1-PDGF-BB和增加量的未标记PDGF-BB或具有式I的肽衍生物加入相同两个孔中并在室温下在0.1％Tween、1mM CaCl2、lmM MgCl2和1％BSA中孵育3小时。这些板用TBS加上0.1％Tween洗涤三次，然后用0.1M柠檬酸(pH值2.5)去除结合配体，之后在γ计数器上计数。

[0199] 已经描述了通式I所包括的某些化合物，但其余的这些化合物是新的并构成本发明的一部分，即具有式I的那些，前提是，如果

[0200]

[0201] 是

[0202] (i)基团(a)且R1是氢，那么Z不是：

[0203] -Val-Lys-Asn-Tyr-Gly-Val-Lys-Asn-Ser-Glu-Trp-Ile-[SEQ ID NO：9]，[0204] -Val-Lys-Asn-Tyr-Gly-Val-Lys-Asn-Ser-Glu-Trp-Thr-[SEQ ID NO：10]，[0205] -Gly-Arg-Gly-Asp-[SEQ ID NO：11]，

[0206] -Arg-Gly-Asp-Gly-[SEQ ID NO：12]，

[0207] -Phe-Tyr-Thr-Gly-Thr-[SEQ ID NO：13]，

[0208] -Tyr-Arg-Asp-Ala-Met-[SEQ ID NO：14]，

[0209] -Asn-Thr-Tyr-Ser-Gly-Val-[SEQ ID NO：15]，

[0210] -Trp-Asp-Asp-Gly-Ser-Asp-[SEQ ID NO：16]和

[0211] -Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-[SEQ ID NO：17]；

[0212] (ii)基团(b)且R2是氢或CH2-COOH，或基团(c)且R3是苯甲酰基，或基团(d)，或基团(e)，那么Z不是-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Ala-[SEQ IDNO：18]；

[0213] (iii)基团(b)且R2是氢，那么Z不是-Ala-Arg-Gly-Asp-[SEQ IDNO：19]；

[0214] (iv)基团(f)，R4是甲基，R5是甲氧基且R6和R7分别为氢，那么Z不是[0215] -Val-Ala-Ala-Phe-Leu-Ala-Leu-Ala-[SEQ ID NO：20]，

[0216] -Arg-Gly-Asp-Val-[SEQ ID NO：21]，

[0217] -Ala-Thr-Val-Gly-[SEQ ID NO：22]，

[0218] -Glu-Arg-Gly-Asp-Val-Tyr-[SEQ ID NO：23]，

[0219] -Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Asp-[SEQ ID NO：24]，

[0220] -Ala-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Asp-Asp-Arg-[SEQ ID NO：25]，[0221] -Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-[SEQ ID NO：26]，

[0222] -Arg-Gly-Asp-Phe-[SEQ ID NO：27]和

[0223] -Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Asp-Asp-[SEQ ID NO：28]；

[0224] (v)基团(g)、R8是甲基且R9是甲基或正己基，或基团(h)、R8是乙基且R9是乙基，那么Z不是-Arg-Gly-Asp-Val-[SEQ ID NO：21]；

[0225] (vi)基团(g)，R8是甲基且R9是甲基或苄基，那么Z不是-Gly-Gly-Ala-Gly-[SEQ ID NO：29]；

[0226] (vii)基团(g)，R8是甲基且R9是甲基，那么Z不是-Gly-Asp-Gly-Gly-[SEQ ID NO：30]；和

[0227] (viii)基团(g)，R8是甲基且R9是正己基，那么Z不是-Val-Arg-Lys-Lys-[SEQ ID NO：1]。

[0228] 具有式I的所有化合物的对映异构体是新的，而且也构成本发明的一部分。

[0229] 引入结构(a)-(h)的式II化合物和具有式III的化合物可按照以下的反应方案所示来制备。在整个这些反应方案中，存在于具有式II和III的化合物中的N-保护基团X表示为Fmoc，这是X的优选值，但可以理解，携带其它N-保护基团作为X的相应化合物可以类似方式制备。

[0230] 反应方案1

[0231]

[0232] IV→V

[0233] i：用脱氢试剂如亚硫酰氯(在甲醇中)在高温下，最好在回流下处理IV。

[0234] ii：Boc的引入，例如使用在合适溶剂如二氯甲烷中的二碳酸二叔丁基酯和三乙胺；任何其它的合适的N-保护基团(未在反应方案I中示出)可以类似方式引入。

[0235] iii：所形成的产物与邻苯二甲酰亚胺、重氮二甲酸二乙酯和三苯基膦(triphenyl phoshine)在标准Mitsunobu条件下反应(Mitsunobu，O.；Wada，M.；Sano，T.J.J.Am.Chem.Soc.1972，94，672)，适宜地生成V。

[0236] V→VI

[0237] iv：合适地通过用水合肼在合适溶剂如乙醇中，在高温下，最好在约80℃下处理V，分裂出邻苯二甲酰亚胺基团。

[0238] v：对3-氨基的标准保护。

[0239] vi：使用例如在甲醇和水中合适的碱性试剂如氢氧化锂将甲基酯基团皂化。

[0240] vii：叔丁氧基羰基随后使用试剂如在二氯甲烷中的三氟乙酸或在二噁烷中的4N氢氯酸分裂下来。

[0241] viii：所形成的氨基酸适宜地在合适溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护，生成VI。

[0242] 反应方案2

[0243]

[0244]

[0245] V→VII

[0246] i：用在二氯甲烷中的三氟乙酸处理V。

[0247] VII→VIII

[0248] ii：VII在标准肽偶联条件下，在DMF中，使用试剂如HBTU和1-羟基苯并三唑(HOBt)，使用碱如二异丙基乙基胺，与Z-Asp(tBu)OH进行偶联，生成VIII。

[0249] VIII→IX

[0250] iii：便利地通过使用H2和催化剂如在活性炭上的钯，在溶剂如乙醇、DMF和乙酸乙酯中进行氢化，去除Z-基团。

[0251] iv：便利地通过在合适溶剂如乙醇中，在高温下，最好在约80℃下用肼进行处理，从所得产物中分裂出邻苯二甲酰亚胺基团。

[0252] v：所形成的氨基酸适宜地在合适的溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护，生成IX，见例如Bisang，C.；Weber，C.；Robinson，J.A.Helv..Chim.Acta1996，79，1825-1842。

[0253] 反应方案3

[0254]

[0255] IV→X

[0256] i：用在合适溶剂如甲醇中的脱水试剂如亚硫酰氯，在高温下，最好在回流下处理IV。

[0257] ii：所得氨基酸酯在用于引入Z基团的标准条件下，例如使用在合适溶剂如二氯甲烷中的苄基氧基羰基氯和三乙胺进行N-保护。

[0258] iii：这种Z-保护的氨基酸甲酯用氯化三甲基硅烷和碱如三乙胺在溶剂如四氢呋喃中处理，冷却，最好至约-78℃，然后与强碱如二异丙基氨基化锂或六甲基二甲硅烷基叠氮化锂和溴乙酸叔丁基酯反应生成X，一种非对映异构体混合物，例如描述于Bisang，C.；Jiang，L.；Freund，E.；Emery，F.；Bauch，C.；Matile，H，；Pluschke，G.；Robinson，J.A.J.Am.Chem.Soc.1998，120，7439-7449；Emery，F.；Bisang，C.；Favre，M.；Jiang，L.；Robinson，J.A.J.Chem.Soc.Chem.Commun.1996，2155-2156。

[0259] X→XI

[0260] iv：将X与邻苯二甲酰亚胺、重氮二甲酸二乙酯和三苯基膦在标准Mitsunobu条件下反应(Mitsunobu，O.；Wada，M.；Sano，T.J.J.Am.Chem.Soc.1972，94，672)。

[0261] v：所得产物使用H2和合适的催化剂如在活性炭上的钯，在溶剂如乙酸乙酯、DMF或乙醇中进行氢化；随后分离非对映异构体。

[0262] XI→XII

[0263] vi：XII用Fmoc-Asp(烯丙基)OH在标准肽偶联条件下，使用试剂如HATU、HOAt和碱如二异丙基乙基胺，在合适溶剂如DMF中偶联。

[0264] vii：环化，最好使用在DMF中的DBU。

[0265] XII→XIII

[0266] viii：邻苯二甲酰亚胺基团最好通过肼解，例如用在合适溶剂如DMF中的甲基肼进行处理，而从所得产物中分裂出来。

[0267] ix：所形成的产物便利地在合适溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护。

[0268] XIII→XIV

[0269] x：使用例如钯(0)作为催化剂对烯丙基酯基团进行标准去除。

[0270] 反应方案4

[0271]

[0272] XV→XVI

[0273] i：XV(可得自维生素C，例如描述于Hubschwerlen，C.(synthesis1986，962))用邻苯二甲酰亚胺、重氮二甲酸二乙酯和三苯基膦在标准Mitsunobu条件下(Mitsunobu，O.；Wada，M.；Sano，T.J.J.Am.Chem.Soc.1972，94，672)处理。

[0274] ii：邻苯二甲酰亚胺基团方便地通过肼解，例如用在合适溶剂如DMF中的甲基肼进行处理，而从产物中分裂。

[0275] iii：氨基通过用苯甲酰基化试剂如苯甲酸酐或苯甲酰氯和碱如三乙胺或4-二甲基氨基吡啶，在合适溶剂如二氯甲烷或DMF中进行处理而保护。

[0276] iv：例如使用K2S2O8和Na2HPO4在乙腈水溶液中，在高温，例如在约80℃下，去除2，4-二甲氧基苄基。

[0277] v：使用例如二叔丁基氧基羰基二碳酸酯、三乙胺和催化量的4-二甲基氨基吡啶在合适溶剂如二氯甲烷中引入叔丁基氧基羰基。

[0278] vi：与含水碳酸钠在四氢呋喃中反应，随后酸化。

[0279] vii：方便地在合适溶剂如二乙醚中使用重氮甲烷对羧酸基团进行酯化。

[0280] viii：方便地通过使用H2在催化剂如在活性炭上的钯存在下，在溶剂如DMF中进行氢化，去除Z-基团，生成XVI，见例如Pfeiffer，M.；Robinson，J.A.J.Chem.Soc.Chem.Commun.1998，1977。

[0281] XVI→XVII

[0282] ix：XVI在标准肽偶联条件下，在DMF中，使用试剂如HBTU和1-羟基苯并三唑，使用碱如二异丙基乙基胺，与Z-Asp(tBu)OH进行偶联，生成XVII，见例如Pfeiffer，M.；Robinson，J.A.J.Chem.Soc.Chem.Commun.1998，1977。

[0283] XVII→XVIII

[0284] x：例如通过使用H2和催化剂如在活性炭上的钯，在标准条件下进行氢化，去除Z-基团，生成XVIII，例如描述于Pfeiffer，M.；Robinson，J.A.J.Chem.Soc.Chem.Commun.1998，1977。

[0285] XVIII→XIX

[0286] xi：方便地使用在二氯甲烷中的三氟乙酸或在二噁烷中的4N氢氯酸，分裂出叔丁基酯和叔丁基氧基羰基。

[0287] xii：所形成的中间体游离氨基酸适宜地在合适的溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护，生成XIX，例如描述于Pfeiffer，M.；Robinson，J.A.J.Chem.Soc.Chem.Commun.1998，1977。

[0288] 反应方案5

[0289]

[0290] XX→XXI

[0291] i：用在合适溶剂如甲醇中的脱水试剂如亚硫酰氯，在高温下，最好在回流下处理XX。

[0292] ii：该中间体用强碱如二异丙基氨基化锂或六甲基二甲硅烷基叠氮化锂在合适溶剂如四氢呋喃中在低温下，并用溴乙酸叔丁基酯进行处理，例如描述于Pfeifer，M.；Linden，A.；Robinson，J.A.Helv.Chim.Acta 1997，80，1513-1527。

[0293] iii：在水和合适溶剂如甲醇中，使用碱如氢氧化锂进行皂化。

[0294] XXI→XXII

[0295] iv：在标准肽偶联条件下，例如使用试剂如HBTU和HOBT和作为碱的二异丙基乙基胺，在合适溶剂如DMF中将XXI与(2S，4R)-Z-羟基脯氨酸偶联，例如描述于Pfeifer，M.；Linden，A.；Robinson，J.A.Helv.Chim.Acta 1997，80，1513-1527。

[0296] XXII→XXIII

[0297] v：例如通过使用H2和催化剂如在活性炭上的钯，在合适溶剂如乙酸乙酯中进行氢化，去除Z-基团。

[0298] XXIII→XXIV

[0299] vi：XXIII按照标准方法，例如通过与对-甲苯磺酰氯在吡啶中反应而转化成相应的甲苯磺酸酯。

[0300] vii：中间体甲苯磺酸酯例如通过用叠氮化钠在合适溶剂如DMF中，在高温下，方便地在约80℃下处理，而转化成相应的叠氮化物。

[0301] viii：叠氮化物基团方便地用H2和催化剂如在活性炭上的钯，在合适溶剂如乙酸乙酯中，或用三苯基膦而还原成氨基。

[0302] ix：该中间体游离氨基酸叔丁酯方便地在合适的溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护。

[0303] x：使用例如在二氯甲烷中的三氟乙酸进行酸解，方便地得到XXIV，例如描述于Pfeifer，M.；Linden，A.；Robinson，J.A.Helv.Chim.Acta 1997，80，1513-1527。

[0304] 反应方案6

[0305]

[0306] XXV→XXV

[0307] i：用XXV在标准肽偶联条件下，使用试剂如HBTU和HOBT和例如作为碱的二异丙基乙基胺，在合适溶剂如DMF中偶联VII。

[0308] ii：通过使用H2和催化剂如在活性炭上的钯，在溶剂如乙酸乙酯、DMF和乙醇中进行氢化，生成XXVI，例如描述于Beeli，R.；Steger，M.；Linden，A.；Robinson，J.A.Helv.Chim.Acta 1996，79，2235-2248。

[0309] XXVI→XXVII

[0310] iii：使用试剂如吡啶-三氧化硫络合物、Jones试剂或Dess-Martinperiodinane试剂进行OH基团的氧化。

[0311] iv：用(MeO)2POCH2COOMe和碱如六甲基二甲硅烷基叠氮化钠在溶剂如四氢呋喃或二甲氧基乙烷中，对中间体酮进行Wittig-Horner缩合，例如描述于Beeli，R.；Steger，M.；Linden，A.；Robinson，J.A.Helv.Chin.Acta 1996，79，2235-2248。

[0312] v：使用例如H2和催化剂如在活性炭上的钯，在溶剂如乙醇、DMF和乙酸乙酯中，对双键进行立体选择氢化。

[0313] vi：使用例如肼，在合适溶剂如乙醇中，在高温下，方便地在约80℃下，对中间体邻苯二甲酰亚胺进行肼解。

[0314] vii：例如通过用合适的碱性试剂如氢氧化锂，在水和甲醇中对甲基酯基团进行皂化。

[0315] viii：所形成的中间体游离氨基酸方便地在合适的溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护，生成XXVII，例如描述于Beeli，R.；Steger，M.；Linden，A.；Robinson，J.A.Helv.Chim.Acta 1996，79，2235-2248。

[0316] 反应方案7

[0317]

[0318] XXVIII→XXIX

[0319] i：XXVIII可按照P.Waldmeier的“用于合成β-转角稳定化环肽库的高度取代呫吨衍生模板的固体承载合成”(博士论文，Zurich大学，1996)进行合成。为了分裂出邻苯二甲酰亚胺基团，将XXVIII适宜地进行肼解，例如用水合肼在合适溶剂如乙醇中在高温下，例如在约80℃下进行处理。

[0320] ii：中间体氨基腈方便地在碱性条件下，例如用含水氢氧化钠在合适溶剂如乙醇中，在高温下，方便地在回流下进行皂化，生成XXIX。

[0321] XXIX→XXX

[0322] iii：所形成的中间体游离氨基酸适宜地在合适的溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护，生成XXX，例如描述于P.Waldmeier的“用于合成β-转角稳定化环肽库的高度取代呫吨衍生模板的固体承载合成”(博士论文，Zurich大学，1996)。

[0323] XXXIX→XXXI

[0324] iv：优选用溴在乙酸和二氯甲烷中对XXIX进行立体选择溴化。以类似方式，R6＝6
NO2可通过用在乙酸中的HNO3进行处理而引入，且R ＝CH2-NPt可通过用在H2SO4中的羟基甲基邻苯二甲酰亚胺进行处理而引入。

[0325] v：氨基适宜地使用试剂如苄基氧基羰基氯或琥珀酰亚胺，在合适溶剂如二噁烷中，在碱如含水氢氧化钠的存在下进行Z-保护。

[0326] vi：羧酸基团优选用DBU和甲基碘在DMF中进行酯化。

[0327] XXXI→XXXII

[0328] vii：适宜地利用钯(0)-催化的Stille-(Stille，J.K.Angew.Chem.1986，68，504)和Suzuki-偶联(Oh-e，T.；Mijaura，N.；Suzuki，A.J.Org.Chem.1993，58，2201)，引入低级6
烷基、取代低级烷基和芳基取代基(R)。

[0329] viii：例如通过使用H2和催化剂如在活性炭上的钯，在合适溶剂如乙醇、DMF和乙酸乙酯中进行氢化，去除Z-基团。

[0330] ix：方便地在酸性条件下，例如用25％含水氢氯酸，在合适溶剂如二噁烷中，在高温下，优选在约100℃下对酯基进行水解。

[0331] x：所形成的中间体游离氨基酸适宜地在合适的溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护，生成XXXII。

[0332] 反应方案8

[0333]

[0334] XXIX→XXXIII

[0335] i：双邻位溴化优选用过量溴在乙酸和二氯甲烷中进行。以类似方式，R6＝R7＝NO26 7
可通过用在乙酸中的HNO3进行处理而引入，且R ＝R ＝CH2-NPt可通过用在H2SO4中的羟基甲基邻苯二甲酰亚胺进行处理而引入。

[0336] ii：氨基适宜地使用试剂如苄基氧基羰基氯或琥珀酰亚胺，在合适溶剂如二噁烷中，在碱如含水氢氧化钠的存在下进行Z-保护。

[0337] iii：羧酸基团优选用DBU和甲基碘在DMF中进行酯化，生成XXXIII。

[0338] XXXIII→XXXIV

[0339] iv：例如利用钯(0)-催化的Stille-(Stille，J.K.Angew.Chem.1986，68，504)和Suzuki-偶联(Oh-e，T.；Mijaura，N.；Suzuki，A.J.Org.Chem.1993，58，2201)，引入低级烷6 7
基、取代低级烷基和芳基取代基(R ＝R)。

[0340] XXXIV→XXXV

[0341] v：例如通过使用H2和催化剂如在活性炭上的钯，在合适溶剂如乙醇、DMF和乙酸乙酯中进行氢化，去除XXXIV的Z-基团。

[0342] vi：适宜地在酸性条件下，例如用25％含水氢氯酸，在合适溶剂如二噁烷中，在高温下，优选在约100℃下对酯基进行水解。

[0343] vii：所形成的中间体游离氨基酸适宜地在合适的溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护，生成XXXV。

[0344] 反应方案9

[0345]

[0346] XXVIII→XXXVI

[0347] i：优选通过用过量三溴化硼在合适溶剂如二氯甲烷中进行处理，分裂出XXVIII的甲氧基。

[0348] ii：在酸性条件下，优选用25％含水氢氯酸，在合适溶剂如二噁烷中，在高温下，方便地在约100℃下对氰基进行水解。

[0349] iii：所得酸用脱水剂如亚硫酰氯在合适溶剂如二噁烷中进行处理，生成XXXVI。

[0350] XXXVI→XXXVII

[0351] iv：用合适的三氟化试剂(triflating reagent)，优选三氟磺酸酐，在碱如2，6-二叔丁基吡啶的存在下，在合适溶剂如二氯甲烷中处理XXXVI。

[0352] v：适宜地在合适溶剂如甲醇中加热该中间体。

[0353] XXXVII→XXXVIII4

[0354] vi：通过烷基化，引入低级烷基或芳基-低级烷基(R)。

[0355] XXXVIII→XXXXIX

[0356] vii：适宜地利用钯(0)-催化的Suzuki-偶联(Oh-e，T.；Mijaura，N.；Suzuki，5
A.J.Org.Chem.1993，58，2201)，引入低级烷基或芳基(R)。

[0357] XXXIX→XL

[0358] viii：在酸性条件下，适宜地用25％含水氢氯酸，在合适溶剂如二噁烷中，在高温下，优选在约100℃下对酯基进行水解。

[0359] ix：适宜地通过肼解，例如用水合肼在合适溶剂如乙醇中进行苯二甲酰亚氨基的分裂。

[0360] x：所形成的中间体游离氨基酸适宜地在合适的溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护，生成XL。

[0361] 反应方案10

[0362]

[0363] XXXVI→XLI

[0364] i：使用试剂如溴，在乙酸和二氯甲烷的混合物中，在约0℃至室温的温度下进行XXXVI的溴化。

[0365] ii：使用合适的酰基化试剂如苯甲酰氯或苯甲酸酐、碱如吡啶或三乙胺和合适溶剂如二氯甲烷进行羟基的苯甲酰基化。

[0366] XLI→XLII

[0367] iii：XLI用甲醇和催化量的酸性催化剂如樟脑磺酸(campher sulfonicacid)在加热下进行处理。

[0368] iv：在溶剂如四氢呋喃、二甲氧基乙烷或DMF中使用碱如氢化钠或叔丁醇钾，通过4
烷基化，引入低级烷基或芳基-低级烷基(R)。

[0369] XLII→XLIII

[0370] v：例如利用钯(0)-催化的Stille-(Stille，J.K.Angew.Chem.1986，68，504)和Suzuki-偶联(Oh-e，T.；Mij aura，N.；Suzuki，A.J.Org.Ch em.1993，58，2201)，引入低级7
烷基、取代低级烷基和芳基取代基(R)。

[0371] vi：为了分裂苄基氧基，将该中间体适宜地与吸附在氧化铝上的氰化钠和甲醇加热。

[0372] vii：用合适的三氟化试剂，优选三氟磺酸酐，在碱如2，6-二叔丁基吡啶存在下，在合适溶剂如二氯甲烷中进行处理。

[0373] viii：例如利用钯(0)-催化的Stille-(Stille，J.K.Angew.Chem.1986，68，504)和Suzuki-偶联(Oh-e，T.；Mijaura，N.；Suzuki，A.J.Org.Chem.1993，58，2201)，引入低级5
烷基和芳基取代基(R)。

[0374] XLIII→XLIV

[0375] ix：在标准条件下，例如使用溴，在乙酸和二氯甲烷中，在约0℃至室温的温度下进行溴化。

[0376] XLIV→XLV

[0377] x：例如利用钯(0)-催化的Stille-(Stille，J.K.Angew.Chem.1986，68，504)和Suzuki-偶联(Oh-e，T.；Mijaura，N.；Suzuki，A.J.Org.Chem.1993，58，2201)，引入低级烷6
基、取代低级烷基和芳基取代基(R)。

[0378] XLV→XLVI

[0379] xi：在酸性条件下，方便地用25％含水氢氯酸，在合适溶剂如二噁烷中，在高温下，优选在约100℃下对酯基进行水解。

[0380] xii：例如通过肼解，方便地用水合肼在合适溶剂如乙醇中分裂该苯二甲酰亚氨基。

[0381] xiii：所形成的中间体游离氨基酸适宜地在合适的溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、或二氯甲烷中使用碱如碳酸钠或三乙胺，用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺进行保护，生成XLVI。

[0382] 反应方案11

[0383]

[0384] XLVII→XLVIII

[0385] i：制备3，7-二甲氧基吩噻嗪，然后按照Müller，K.；Obrecht，D.；Knierzinger，A.；Spiegler，C.；Bannwarth，W.；Trzeciak，A.；Englert，G.；Labhardt，A.；P.Perspectives in Medicinal Chemistry，Editor Testa，B.；Kyburz，
E.；Fuhrer，W.；Giger，R.，Weinheim，NewY0rk，Basel，Cambridge：Verlag Helvetica Chimica Acta，1993，513-531；Bannwarth，W.；Gerber，F.；Grieder，A.；Knierzinger，A.；
Müller，K.；Obrecht.D.；Trzeciak，A.Can.Pat.Appl.CA2101599(131页)转化成XLVII。苄基适宜通过氢化，例如在合适溶剂如乙醇、DMF或乙酸乙酯中使用H2和催化剂如在活性炭上的钯，从XLVII中分裂出来。

[0386] ii：使用合适的烷基化试剂(R9-X’；X’＝OTf、Br、I)和强碱如在液氮中的氨基钠或处于四氢呋喃、二噁烷或DMF中的氢化钠，在相转移催化剂如TDA-I的存在下，通过烷基9 9 9
化而引入低级烷基(R)。按照类似方式，可以引入取代的低级烷基(R)；这样，例如R ＝
10 10
CH2COOR 和CH2CH2COOR 可通过用合适的2-卤代乙酸和相应3-卤代丙酸衍生物进行处理而引入。

[0387] XLVIII→IL

[0388] iii：适宜地通过用过量三溴化硼在合适溶剂如二氯甲烷中，在约-20℃至约室温的温度下进行处理，分裂出XLVIII的甲氧基。

[0389] iv：为了引入低级烷基、取代低级烷基或芳基-低级烷基取代基(R8)，中间体双酚8
衍生物适宜地与式R-X’(X’＝OTf、Br、I)的试剂在强碱如氢化钠的存在下，在四氢呋喃、二噁烷或DMF中，在相转移催化剂如TDA-I的存在下进行反应。

[0390] XLVIII→L IL→LI

[0391] v：XLVII和相应IL的氰基适宜地在酸性条件下，例如用25％含水氢氯酸，在合适溶剂如二噁烷中，在高温下，例如在约100℃进行水解。

[0392] vi：此中间体的邻苯二甲酰亚胺基团适宜地通过肼解，例如在合适溶剂如乙醇中使用水合肼而分裂。

[0393] vii：游离的氨基适宜地用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺，使用碱如碳酸钠或三乙胺，在合适溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、二氯甲烷中进行保护，生成L和相应的LI。

[0394] 反应方案12

[0395]

[0396] LIII→LIV

[0397] i：LII可由市售试卤灵制备并按照Müller，K.；Obrecht，D.；Knierzinger，A.；Spiegler，C.；Bannwarth，W.；Trzeciak，A.；Englert，G.；Labhardt，A.；
P.Perspectives in Medicinal Chemistry，Editor Testa，B.；Kyburz，E.；Fuhrer，W.；
Giger，R.，Weinheim，NewYork，Basel，Cambridge：Verlag Helvetica Chimica Acta，1993，
513-531；Bannwarth，W.；Gerber，F.；Grieder，A.；Knierzinger，A.；Müller，K.；Obrecht.D.；Trzeciak，A.Can.Pat.Appl.CA2101599(131页)转化成LIII。为了分裂出苄基，LIII适宜地氢化，例如在合适溶剂如乙醇、DMF和乙酸乙酯中使用H2和催化剂如在活性炭上的钯。

[0398] ii：使用强碱如在液氮的氨基钠或处于四氢呋喃、二噁烷或DMF中的氢化钠，在9
相转移催化剂如TDA-I的存在下，通过用R-X’(X’＝OTf、Br、I)烷基化而引入低级烷基
9 9 9 10
(R)，生成LIV。按照类似方式，可以引入取代的低级烷基(R)；这样，例如R ＝CH2COOR 和
10
CH2CH2COOR 可通过用合适的2-卤代乙酸和相应3-卤代丙酸衍生物进行处理而引入。

[0399] LIV→LV

[0400] iii：适宜地通过用过量三溴化硼在二氯甲烷中，在约-20℃至约室温的温度下进行处理，分裂出LIV的甲氧基。

[0401] iv：中间体双酚衍生物优选与R8-X’(X’＝OTf、Br、I)在强碱如氢化钠的存在下，在四氢呋喃、二噁烷或DMF中，在相转移催化剂如TDA-I存在下进行反应。

[0402] LIV→LVI LV→LVII

[0403] v：LIV和相应的LV的氰基在酸性条件下，例如用25％含水氢氯酸，在合适溶剂如二噁烷中，在高温下，方便地在约100℃进行水解。

[0404] vi：邻苯二甲酰亚胺基团适宜地通过肼解，例如在合适溶剂如乙醇中使用水合肼而分裂。

[0405] vii：游离的氨基适宜地用试剂如9-芴基甲氧基羰基氯或9-芴基甲氧基羰基琥珀酰亚胺，使用碱如碳酸钠或三乙胺，在合适溶剂或溶剂混合物如二噁烷和水、二氯甲烷中进行保护，生成LVI和相应的LVII。

[0406] 以下实施例更详细地举例说明本发明，而无意于以任何方式限定其范围。

[0407] 实施例1

[0408] 式I的单个化合物的制备

[0409] 将1.4克2-氯三苯甲基氯树脂(1.25毫摩尔/克，1.75毫摩尔)装到三颈烧瓶中。该树脂悬浮在DCM(14毫升)中并在室温下在恒定搅拌下溶胀。树脂用在DCM(10毫升)中的1.25克(1.077当量)Fmoc-Arg(Pmc)-OH和0.898毫升二异丙基乙基胺(DIPEA)处理，将该混合物在25℃下振荡15分钟，倒入预溶胀树脂中并在25℃下搅拌18小时。树脂颜色变成紫色且溶液保持微黄色。将树脂充分洗涤并在40℃下真空干燥4小时。

[0410] 产量：2.379克，加载率：84％

[0411] 该酯化树脂随后进行以下合成周期→40毫克/每个反应容器。

[0412] 步骤 试剂 时间

[0413] 1 DCM，溶胀和洗涤 3×1分钟

[0414] 2 20％哌啶/DMF 1×15分钟

[0415] 3 DMF，洗涤和溶胀 5×1分钟

[0416] 4 4当量Fmoc氨基酸/DMF

[0417] +4当量1-苯并三唑-1-基-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

[0418] (HBTU)

[0419] +4当量1-羟基苯并三唑(HOBt) 1×120分钟[0420] +6当量二异丙基乙基胺

[0421] 5 DMF，洗涤 3×1分钟

[0422] 6 异丙醇，洗涤 2×1分钟

[0423] 7 DCM，洗涤 2×1分钟

[0424] 每个步骤使用5毫升溶剂。按照以上方案偶联Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-D-Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH。

[0425] 全保护的肽片段的分裂

[0426] 在完成合成之后，肽树脂悬浮在5毫升1％TFA(在DCM中，体积/体积)并搅拌10分钟，然后过滤掉树脂并用吡啶(1当量)中和滤液。该步骤重复2次以保证分裂完成。
滤液蒸发至干燥，然后进行反相(RP)-HPLC分析以监控线性肽合成的效率。

[0427] H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Ile-D-Pro-L-Pro-Glu(OtBu)-Ile-Val-Arg(Pmc)-OH线性肽[SEQ ID NO：31]的环化

[0428] 将50毫克(0.0294毫摩尔)全保护的线性肽溶解在DMF(50毫升，浓度1毫克/毫升)中。然后加入将33.5毫克(0.0882毫摩尔，3当量)HATU、12.0毫克(0.0882毫摩尔，3当量)HOAt和5毫升DIPEA(1％体积/体积)并将该混合物在20℃下搅拌16小时，随后进行真空浓缩。残余物在二氯甲烷(DCM)和H2O/CH3CN(90∶10)之间分配。DCM相蒸发得到纯的全保护环肽。

[0429] 环肽的去保护：

[0430] 将所得无定形粉末溶解在2毫升包含95％三氟乙酸、2.5％水和2.5％三异丙基硅烷(TIS)的分裂混合物中。该混合物在20℃下放置2小时并随后真空浓缩。残余物用二乙醚研磨，然后得到20毫克的化合物1[SEQID NO：32]，一种白色粉末。

[0431]

[0432] C55H95N15O12，MW 1158.5

[0433] MS(ESI)：580.02(M+2H+)2+，387.02(M+3H+)3+

[0434] HPLC-RT(min.)：7.51

[0435] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成100％乙腈；
保持恒定5分钟，然后在5分钟内返回至5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0436] 实施例2

[0437] 式I的单个化合物的制备

[0438] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Val-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，L DFmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物2[SEQ ID NO：33]：

[0439]

[0440] C62H95N15O14，MW 1274.5

[0441] MS(ESI)：638.4(M+2H+)2+，424.8.02(M+3H+)3+

[0442] HPLC-RT(min.)：8.59

[0443] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成100％乙腈；
保持恒定5分钟，然后在5分钟内返回至5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0444] 实施例3

[0445] 式I的单个化合物的制备

[0446] 通 过 类 似 于 实 施 例 1所 述 的 步 骤，将 Fmoc-Val-OH，Fmoc-Trp-OH，L DFmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc- Pro-OH，Fmoc- Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物3[SEQ ID NO：34]：

[0447]

[0448] C66H97N17O12，MW 1320.6

[0449] MS(ESI)：1321.6(M+H+)+

[0450] HPLC-RT(min.)：9.04

[0451] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成100％乙腈；
保持恒定5分钟，然后在5分钟内返回至5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0452] 实施例4

[0453] 式I的单个化合物的制备

[0454] 通 过 类 似 于 实 施 例 1所 述 的 步 骤，将 Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ala-OH，L DFmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc- Pro-OH，Fmoc- Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH 和Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物4[SEQ ID NO：35]：

[0455]

[0456] C50H87N15O12，MW 1090.5

[0457] MS(ESI)：546.15.4(M+2H+)2+，364.3(M+3H+)3+

[0458] HPLC-RT(min.)：12.51

[0459] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成100％乙腈；
保持恒定5分钟，然后在5分钟内返回至5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0460] 实施例5

[0461] 式I的单个化合物的制备

[0462] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ser(OtBu)-OH，L DFmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ser(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物5[SEQ ID NO：36]：

[0463]

[0464] C50H87N15O14，MW 1122.3

[0465] MS(ESI)：562.15(M+2H+)2+，375.3(M+3H+)3+

[0466] HPLC-RT(min.)：5.74

[0467] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成100％乙腈；
保持恒定5分钟，然后在5分钟内返回至5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0468] 实施例6

[0469] 式I化合物文库的合成，用于在二脯氨酸模板上模拟PDGF-环-III并在固相分析中对其进行测试

[0470] 1.目的肽

[0471] x1-x4：可变氨基酸残基(x)

[0472] ValArgLysLys(VRKK[SEQ ID NO：1]：恒定氨基酸残基

[0473] DProLPro：模板

[0474]

[0475] [SEQ ID NO：37]

[0476] x11-4：Glu，Tyr，Trp，Ala

[0477] x21-6：Ile，Tyr，Trp，Ala，Ser，Lys

[0478] x31-6：Pro，Tyr，Trp，Ala，Ser，Lys

[0479] x41-4：Ile，Tyr，Trp，Ala

[0480] 表1.24个目的环肽的序列(头5个对应于按照实施例1-5得到的那些)

[0481]

[0482] 2.实验步骤：

[0483] 2.1.受保护的线性肽的合成

[0484] 在DCM中用3当量DIEA将第一氨基酸Fmoc-Arg(Pmc)-OH(1当量)连接到2-氯三苯甲基氯树脂(Polyphor，1.25毫摩尔/克)上过夜，连接率为约85％。使用标准Fmoc化学组装线性肽，其中使用分别为4当量的氨基酸、HBTU和HOBT和6当量的DIEA(在DMF中)且偶联时间为1.5-2小时。受保护的线性肽用在DCM中的1％TFA(2×10分钟)从树脂上分裂出并用吡啶(1当量)中和，随后蒸发溶剂。

[0485] 2.2.受保护的线性肽的环化

[0486] 将受保护的线性肽(无需纯化)直接以1.0毫克/毫升(在DMF中)的浓度，使用HATU(3当量)、HOAt(3当量)和DIEA(1％体积/体积)环化16小时。然后蒸发DMF和DIEA，残余物溶解在DCM中，溶液用H2O/CH3CN(90∶10)萃取，随后去除DCM。

[0487] 2.3.环肽的去保护

[0488] 环化产物用95％TFA、2.5％H2O和2.5％TIS处理2小时，然后蒸发掉大多数的TFA。加入二乙醚以沉淀出产物。在离心处理之后，小心去除醚，然后在减压干燥之后得到最终产物。根据其纯度，该产物通过制备型HPLC纯化。

[0489] 2.4.固相分析

[0490] 血小板衍生生长因子β受体(PDGFR-β)的直接固定通过在4℃下使用在100微升pH值9.6的15mM Na2CO3、35mM碳酸氢钠中的100ng纯化蛋白质在免疫吸附96-孔板(Nunc)中孵育过夜而进行。板用Tris缓冲盐水(TBS，20mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH值7.4)洗涤一次，然后通过用TBS加上1％牛血清白蛋白孵育至少1小时来封闭非特异吸附。
125
在用TBS加上0.1％Tween洗涤之后，将3000cpm的 I-PDGF-BB和增加量的未标记PDGF-BB或待测的肽加入相同两孔并在室温下在TBS加上0.1％Tween、1mM CaCl2、1mM MgCl2和1％BSA中孵育3小时。这些板用TBS加上0.1％Tween洗涤三次，然后用0.1M柠檬酸(pH值
2.5)去除结合的配体，之后在γ计数器上计数。

[0491] 3.结果

[0492] 通过制备型HPLC(具有Waters RCM-μBondapakTM-C18-盒的双泵Pharmacia系统，10μm 300A 25×100mm(用于制备)和8×100mm(用于分析)，流速分别为8和2毫升/分钟；在226和278纳米处UV检测)、MS、NMR(600MHz，1H)和CD分析和纯化环肽。按照2.4所述进行固相分析。

[0493] 4.讨论

[0494] 4.1.线性肽通过HPLC进行分析，所有24种化合物证明是纯的，＞95％，表示氨基酸的组装能够可靠地进行。

[0495] 4.2.环肽

[0496] a)线性肽从树脂上分裂，用吡啶中和以形成吡啶盐，其在环化之前无需纯化。

[0497] b)比较不同浓度的用于环化的肽(1毫克、2毫克、5毫克、10毫克、20毫克/毫升DMF)，1毫克/毫升的浓度得到最佳结果。

[0498] c)粗品的纯度在表2中给出。

[0499] 4.3.固相分析

[0500] IC50值在表2中给出。粗肽和纯化肽之间在IC50值上的差异仅为最低限度。

[0501] 表2.实施例1-24的汇总

[0502]目标肽 分子式 ESI-MS HPLC的 粗品的 分析
分子量 [M+H+]+；[M+2H+]2+； 停留时间 纯度 I50(μM)
[M+3H+]3+ (分钟)
1 C55H95N15O12 580.02；387.02 7.51 95％ 2200
1158.5
2 C62H95N15O14 1274.8；638.01；425.75 8.59 95％ 2000
1274.5
3 C66H97N17O12 1320.81；661.06；441.11 9.04 80％ 1500
1320.6
4 C50H87N15O12 1090.54；545.83；364.26 12.5 90％ ＞2500
1090.3
5 C50H87N15O14 1122.71；562.07；375.05 5.74 95％ 2500
1122.3
6 C56H101N17O12 1205.7；603.18；402.58 9.90 95％ ＞2500
1204.5
7 C62H95N15O12 621.90；414.89 9.14 95％ 1500
1242.5
8 C69H95N15O14 679.82；453.61 9.42 95％ 800
1358.6
9 C73H97N17O12 1404.83；703.08；469.16 9.71 65％ 500
1404.7
10 C57H87N15O12 1174.73；587.97；392.39 9.09 90％ 2000
1174.4
11 C57H87N15O14 1206.75；604.02；403.01 9.10 90％ 2000
1206.4
12 C63H101N17O12 1288.92；645.06；430.47 8.59 90％ 1500
1288.6
13 C66H97N17O10 1288.82；645.08；430.47 8.27 95％ 260
1288.6

[0503]14 C73H97N17O12 1405.0；703.09；469.08 9.26 90％ 170
1404.7
15 C77H99N19O10 1451.06；726.06；484.42 10.35 20％
1450.8
16 C61H89N17O10 1220.87；611.03；407.74 9.81 90％ 800
1220.5
17 C61H89N17O12 1252.85；627.03；418.46 9.84 90％ 800
1252.5
18 C67H103N19O10 1334.78；668.15；445.80 9.10 90％ 500
1334.7
19 C50H87N15O10 1058.84；530.03；353.69 7.86 95％ ＞2500
1058.3
20 C57H87N15O12 1174.71；588.11；392.41 8.20 60％ 2500
1174.4
21 C61H89N17O10 1220.91；611.16；407.78 8.85 30％ 2000
1220.5
22 C45H79N15O10 495.7 6.77 85％ ＞2500
990.2
23 C45H79N15O12 511.94 7.12 85％ 2500
1022.2
24 C51H93N17O10 553.12 6.86 90％ 2500
1104.4

[0504] 分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect 1(系列号8111346，批号8023)；梯度：5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成100％乙腈；保持恒定5分钟，然后在5分钟内返回至5％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0505] 实施例25-40

[0506] 以下实施例描述了该方法在合成引入三种不同模板和一个共同关键基1 1 2 2
序-k-x-模板-x-k-[SEQ ID NO：57]的6-聚体、8-聚体、10-聚体、12-聚体、14-聚体、和
1 2 1 2
16-聚体β-发夹环模拟物中的应用，其中x ＝Y、F、K或W，x ＝Y，k ＝K且k ＝E。由
1 2
于β-发夹结构，x 和x 位于β-折叠的相同侧并构成疏水碎片。这些基序存在于例如各种趋化因子中(Tarby，C.M.；Saunders，J.Drug Discovery Today 1999，4，80-92；Ponath，P.D.Exp.Opin.Invest.Drugs 1998，7，1-16)。

[0507] 1.(2S，6S，8aS)-8a-{[(叔 丁 基 )氧 基 羰 基] 甲 基 } 全 氢 -5，8-二 氧杂-{[(9H-芴-9-基)甲氧基羰基]氨基}-吡咯并[1，2-a]吡嗪-6-乙酸(模板b1)的合成：

[0508] 在氩气下，向250毫克(0.414毫摩尔){(2S，6S，8aS)-8a-[(叔丁基)氧基羰基]甲基}全氢-5，8-二氧杂-{[(9H-芴-9-基)甲氧基羰基]氨基}-吡咯并[1，2-a]吡嗪-6-乙酸烯丙基酯在二氯甲烷/甲醇(9∶1，3毫升)的脱气混合物中的搅拌溶液内加入25毫克(0.0216毫摩尔)四(三苯基膦)钯、0.05毫升乙酸和0.025毫升N-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌48小时并倾倒至水和二氯甲烷上。将有机相干燥(MgSO4)、蒸发并将残余物在SiO2上用二氯甲烷/甲醇(9∶1)色谱处理，得到180毫克(77％)(2S，
6S，8aS)-8a-{[(叔丁基)氧基羰基]甲基}全氢-5，8-二氧杂-{[(9H-芴-9-基)甲氧基羰基]氨基}-吡咯并[1，2-a]吡嗪-6-乙酸(模板b1)，一种白色粉末。

[0509] 1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：8.30(s，1H)；7.88(d，J＝7.2，2H)；7.67(d，J＝7.4，2H)；7.62(br.s，1H)；7.41(t，J ＝ 7.2，2H)；7.33(t，J ＝ 7.4，2H)；4.35-4.2(m，5H)；
3.55(br.d，J ＝ 6.3，2H)；2.8-2.55(m，3H)；2.45-2.25(m，2H)；2.1-1.95(m，1H)；1.35(s，+ +
9H)；MS(ESI)：586.1(M+Na)，564.1(M+H).

[0510] 2.线性肽的合成

[0511] 在DCM中用3当量DIEA将第一氨基酸Fmoc-Arg(Pmc)-OH(1当量)连接到2-氯三苯甲基氯树脂(Polyphor，1.25毫摩尔/克)上过夜，连接率为约80％。使用标准FmocL化学组装线性肽，其中使用分别为4当量的氨基酸和模板(或，如果适当，Fmoc-Pro-OH和D
Fmoc-Pro-OH)、分别为4当量的HBTU和HOBt、以及6当量的DIEA(在DMF中)且偶联时间为1.5-2小时。受保护的线性肽用在DCM中的1％TFA(4×10分钟)从树脂上分裂出并用吡啶(1当量)中和，随后蒸发溶剂。

[0512] 3.线性肽的环化

[0513] 将受保护的线性肽(无需纯化)直接以1.0毫克/毫升(在DMF中)的浓度，使用HATU(3当量)、HOAt(3当量)和DIEA(1％体积/体积)环化16小时。然后蒸发DMF和DIEA，残余物溶解在DCM中，溶液用H2O/CH3CN(90∶10)萃取，随后去除DCM。

[0514] 4.环肽的去保护

[0515] 环化产物用95％TFA、2.5％H2O和2.5％TIS处理2小时，然后蒸发掉大多数的TFA。加入二乙醚以沉淀出产物。在离心处理之后，小心去除醚，然后在减压干燥之后得到最终产物。根据其纯度，该产物通过制备型HPLC纯化。

[0516] 使用以下模板：

[0517]

[0518] 实施例25

[0519]

[0520] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，L DFmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物25[SEQ ID NO：58]：

[0521] MW： C57H85N17O14，[1232.30]

[0522] MS(ESI)： 616.72[M+2H+]2+

[0523] HPLC-RT(min.)： 10.83

[0524] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0525] 实施例26：

[0526]

[0527] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，L DFmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc- Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物26[SEQ ID NO：59]：

[0528] MW： C57H85N17O13，[1216.41]

[0529] MS(ESI)： 608.8[M+2H+]2+

[0530] HPLC-RT(min.)： 8.27

[0531] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0532] 实施例27：

[0533]

[0534] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，L DFmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物27[SEQ ID NO：60]：

[0535] MW： C54H88N18O13，[1197.4]

[0536] MS(ESI)： 599.4[M+2H+]2+

[0537] HPLC-RT(min.)： 8.85

[0538] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0539] 实施例28：

[0540]

[0541] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-LPro-OH，Fmoc-DPro-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物28[SEQ ID NO：61]：

[0542] MW： C59H87N18O13，[1256.4]

[0543] MS(ESI)： 628.50[M+2H+]2+，419.20[M+3H+]3+

[0544] HPLC-RT(min.)： 9.16

[0545] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0546] 实施例29：

[0547]

[0548] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，LFmoc-Tyr(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc- Pro-OH，D
Fmoc-Pro-OH，，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物29[SEQ ID NO：62]：

[0549] MW： C86H122N22O22，[1816]

[0550] MS(ESI)： 908[M+2H+]2+，606.2[M+3H+]3+

[0551] HPLC-RT(min)： 8.40

[0552] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0553] 实施例30：

[0554]

[0555] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，LFmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc- Pro-OH，D
Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物30[SEQ ID NO：63]：

[0556] MW： C83H125N23O21，[1781]

[0557] MS(ESI)： 594.6[M+3H+]3+

[0558] HPLC-RT(min.)： 9.04

[0559] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0560] 实施例31：

[0561]

[0562] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，LFmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc- Pro-OH，D
Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物31[SEQ ID NO：64]：

[0563] MW： C83H125N23O21，[1721]

[0564] MS(ESI)： 891.15[M+2H+]2+，594.85[M+3H+]3+

[0565] HPLC-RT(min.)：9.84

[0566] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0567] 实施例32：

[0568]

[0569] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，L DFmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH， 和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物32[SEQ ID NO：65]：

[0570] MW： C110H150N26O26，[2252.4]

[0571] MS(ESI)： 751.93[M+3H+]3+

[0572] HPLC-RT(min.)： 9.42

[0573] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0574] 实施例33：

[0575]

[0576] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-LPro-OH，Fmoc-DPro-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物33[SEQ ID NO：66]：

[0577] MW： C104H156N28O26，[2214.5]

[0578] MS(ESI0： 738.10[M+3H+]3+

[0579] HPLC-RT(min.)： 13.46

[0580] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0581] 实施例34：

[0582]

[0583] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，模 板 f1，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物34[SEQ ID NO：67]：

[0584] MW： C67H91N16O16，[1376.5]

[0585] MS(ESI)： 689.02[M+2H+]2+

[0586] HPLC-RT(min.)： 9.87

[0587] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0588] 实施例35：

[0589]

[0590] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH， 模 板 f1，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH， 和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物35[SEQ ID NO：68]：

[0591] MW： C67H91N16O15，[1360.14]

[0592] MS(ESI)： 681.44[M+2H+]2+，454.77[M+3H+]3+

[0593] HPLC-RT(min.)：9.68

[0594] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0595] 实施例36：

[0596]

[0597] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，模板f1，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH， 和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物36[SEQ ID NO：69]：

[0598] MW： C93H131N22O23，[1925.19]

[0599] MS(ESI)： 643.28[M+3H+]3+

[0600] HPLC-RT(min.)： 8.85min.

[0601] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0602] 实施例37：

[0603]

[0604] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，模 板 b1，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH 和 Fmoc-Arg(Pmc)-OH 偶 联 至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物37[SEQ ID NO：70]：

[0605] MW： C54H74N17O14，[1185.18]

[0606] MS(ESI)： 593.83[M+2H+]2+

[0607] HPLC-RT(min.)： 11.23

[0608] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0609] 实施例38：

[0610]

[0611] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH， 模 板 f1，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH 和Fmoc-Arg(Pmc)-OH 偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物38[SEQ ID NO：71]：

[0612] MW： C96H129N21O22，[1929.23]

[0613] MS(ESI)： 644[M+3H+]3+，483.11[M+4H+]4+

[0614] HPLC-RT(min.)： 9.22

[0615] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0616] 实施例39：

[0617]

[0618] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH， 模板 b1，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物39[SEQ ID NO：72]：

[0619] MW： C105H138N25O29，[2214.3]

[0620] MS(ESI)： 737.76[M+3H+]3+

[0621] HPLC-RT(min.)： 13.26

[0622] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。

[0623] 实施例40：

[0624]

[0625] 通过类似于实施例1所述的步骤，将Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，模板f1，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH 和Fmoc-Arg(Pmc)-OH偶联至Fmoc-Arg(Pmc)-OH加载树脂上，分裂，环化并去保护，生成化合物40[SEQ ID NO：73]：

[0626] MW： C93H131N22O23，[1926.22]

[0627] MS(ESI0： 643.01[M+3H+]3+，482.35[M+4H+]4+

[0628] HPLC-RT(min.)： 8.99

[0629] 条件：分析性HPLC的条件：柱CC 250/4Nucleosil 100-5Protect1(系列号8111346，批号8023)；梯度：10％乙腈/90％水(包含0.1％三氟乙酸)在15分钟内变成
100％乙腈；保持恒定4分钟，然后在4分钟内返回至10％乙腈/水(0.1％三氟乙酸)。