用于制备免疫治疗性组合物的慢病毒载体

摘要

本发明涉及包含重组载体的免疫原性组合物，该载体的特点是含有包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的多核苷酸，这些区域是逆转录病毒或逆转录病毒样起源的，所说的载体除此之外还包含确定的核苷酸序列(转基因或感兴趣的序列)和逆转录病毒或逆转录病毒样起源的逆转录、表达和壳体化的调节信号，其中该免疫原性组合物能够诱导或刺激针对一个或几个由载体中的转基因序列编码的表位的细胞介导的反应，例如CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应或CD4反应。

权利要求

1.包含重组载体的免疫原性组合物，在所述载体中插入了能够在逆转录之后采取三链DNA结构(DNA三链体)的包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的DNA片段，所述片段是逆转录病毒或逆转录病毒样起源的，所说的载体除此之外还包含感兴趣的核苷酸序列和逆转录病毒或逆转录病毒样起源的逆转录、表达和壳体化的调节信号，其中该免疫原性组合物能够诱导或刺激针对一个或几个由载体中存在的感兴趣的核苷酸序列编码的表位的细胞介导的反应。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述DNA片段长178bp。

3.权利要求1的免疫原性组合物，其特征在于逆转录病毒来源的序列来自慢病毒基因组。

4.权利要求1的免疫原性组合物，其特征在于感兴趣的核苷酸序列被包含在包括转录和表达的调节信号的表达盒中。

5.包含重组的逆转录病毒颗粒的免疫原性组合物，所述重组逆转录病毒颗粒包含：

1)包含感兴趣的核苷酸序列的重组核苷酸序列，所述感兴趣的核苷酸序列被置于转录和表达的调节信号以及逆转录、表达和壳体化的调节信号的控制下，和2)能够在逆转录之后采取三链DNA结构(DNA三链体)的包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的DNA片段，所述片段是逆转录病毒或逆转录病毒样起源的，或来自转座子，并被以相对于逆转录病毒或逆转录病毒样起源的逆转录调节信号或转座子调节信号有功能的方向和位置插入，其中该免疫原性组合物能够诱导或刺激针对由载体中存在的感兴趣的核苷酸序列编码的一个或几个表位的细胞介导的反应。

6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述DNA片段长178bp。

7.包含重组逆转录病毒载体颗粒的免疫原性组合物，所述载体颗粒包含：

a)相应于慢病毒的核蛋白或功能性衍生多肽的gag多肽(GAG多肽)，

b)由慢病毒的RT、PRO、IN蛋白或功能性衍生多肽构成的pol多肽(POL多肽)，c)包膜多肽或功能性衍生多肽(ENV多肽)，d)重组的核苷酸序列，其包含：感兴趣的核苷酸序列，该感兴趣的核苷酸序列编码一个或几个表位，被置于转录和表达的调节信号控制下；含有逆转录病毒或逆转录病毒样起源的逆转录、表达和壳体化的调节信号的序列；以及能够在逆转录之后采取三链DNA结构(DNA三链体)的包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的DNA片段，所述片段是逆转录病毒或逆转录病毒样起源的，并被以相对于前述的逆转录病毒或逆转录病毒样起源的调节信号有功能的方向和位置插入，其中该免疫原性组合物能够诱导或刺激针对由载体中存在的感兴趣的核苷酸序列编码的一个或几个表位的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应。

8.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述DNA片段长178bp。

9.包含重组的逆转录病毒样颗粒的免疫原性组合物，其中所述重组的逆转录病毒样颗粒包含：a)能够在逆转录之后采取三链DNA结构(DNA三链体)的包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的DNA片段，所述DNA片段起源于反转录转座子并被以相对于反转录转座子调节信号有功能的方向插入，b)相应于反转录转座子的核蛋白或功能性衍生多肽的多肽(GAG多肽)，c)相应于反转录转座子的RT、PRO、IN蛋白或功能性衍生多肽的pol多肽(POL多肽)，d)病毒的包膜多肽，

e)重组的核苷酸序列，其包含感兴趣的核苷酸序列，该感兴趣的核苷酸序列被置于转录和表达的调节信号以及反转录转座子的逆转录、表达和壳体化的调节信号控制下，其中该免疫原性组合物能够诱导或刺激针对由载体中存在的感兴趣的核苷酸序列编码的一个或几个表位的细胞介导的反应。

10.权利要求9的免疫原性组合物，其中所述DNA片段长178bp。

11.权利要求1、5或9的免疫原性组合物，其中所述细胞介导的反应是CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应。

12.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述CTL反应是记忆性CTL反应。

13.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述CTL反应是CD4反应。

14.权利要求1到10中的任意一项的免疫原性组合物，其特征在于逆转录、表达和壳体化的调节信号是慢病毒起源的，并且含有cPPT和CTS区的多核苷酸也是慢病毒起源的。

15.权利要求1到10中的任意一项的免疫原性组合物，其特征在于在载体中的逆转录、表达和壳体化的调节信号和含有cPPT和CTS区的多核苷酸来自从慢病毒CAEV，EIAV，VISNA，HIV，SIV或FIV中选择的病毒。

16.权利要求15的免疫原性组合物，其特征在于逆转录、表达和壳体化的调节信号和含有cPPT和CTS区的多核苷酸来自HIV-1或HIV-2。

17.权利要求1到10中的任意一项的免疫原性组合物，其特征在于载体的多核苷酸是含有HIV-1逆转录病毒基因组的顺式作用中心起始区(cPPT)和终止区域(CTS)的DNA序列。

18.权利要求7到10中的任意一项的免疫原性组合物，其特征在于载体颗粒的gag、pol和env多肽来自HIV逆转录病毒。

19.权利要求18的免疫原性组合物，其中载体颗粒的gag、pol和env多肽来自HIV-1或HIV-2病毒。

20.权利要求7到10中的任意一项的免疫原性组合物，其特征在于gag和pol多肽来自HIV逆转录病毒，而env多肽来自不同的HIV逆转录病毒或来自其它病毒。

21.权利要求20的免疫原性组合物，其特征在于env多肽是双嗜性ENV多肽。

22.权利要求20的免疫原性组合物，其特征在于env多肽是亲嗜性ENV多肽。

23.权利要求20的免疫原性组合物，其特征在于env多肽来自疱疹性口腔炎病毒(VSV)。

24.载体，其特征在于它是pTRIP.TEL/AML-IRES-EGFP质粒，于1999年10月11日按编号I-2326保藏在CNCM；或pTRIP.DES-IRES-GFP，于1999年10月11日按编号I-2331保藏在CNCM。

25.载体，其特征在于它是pTRIP.ILKE-IRES-GFP质粒，该质粒于1999年10月11日按编号I-2327保藏在CNCM.

26.已用权利要求1到10之任意一项中定义的重组载体或逆转录病毒颗粒或逆转录病毒样颗粒转导的重组细胞。

27.权利要求26的重组细胞，其是抗原提呈细胞，或是从肺细胞、脑细胞、上皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞(mycroglia)、少突胶质细胞、神经元、肌细胞、肝细胞、树突细胞、神经元细胞、骨髓细胞株、巨噬细胞、成纤维细胞、造血细胞中选择的细胞。

28.权利要求1到10中的任意一项的免疫原性组合物，用于肿瘤或传染病的治疗性处理。

29.权利要求1到10中的任意一项的免疫原性组合物，其中感兴趣的核苷酸序列编码的所述一个或几个表位来自肿瘤细胞或感染性因子。

30.权利要求29的免疫原性组合物，其中所述表位来自于黑素瘤细胞。

31.权利要求1到10中的任意一项的组合物或权利要求1到10中的任意一项所定义的载体或载体颗粒，其中cPPT和CTS区域定位在载体序列的中心。

32.权利要求1到10中的任意一项的组合物或权利要求1到10中的任意一项所定义的载体或载体颗粒，其中感兴趣的核苷酸序列被插入在逆转录调节信号的U3区中。

33.重组载体，其中插入了能够在逆转录之后采取三链DNA结构(DNA三链体)的包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的DNA片段，所述片段是逆转录病毒或逆转录病毒样起源的，所说的载体另外包含感兴趣的核苷酸序列，该核苷酸序列是致病因子的基因序列；以及逆转录病毒或逆转录病毒样起源的逆转录、表达和壳体化的调节信号，其中该免疫原性组合物能够诱导或刺激针对由载体中存在的感兴趣的核苷酸序列编码的一个或几个表位的细胞介导的反应。

34.权利要求33的重组载体，其中所述细胞介导的反应是CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应或CD4反应。

35.权利要求33的重组载体，其中所述DNA片段长178bp。

36.权利要求33的重组载体，其中感兴趣的核苷酸序列是编码细菌的抗原的基因。

37.权利要求33的重组载体，其中感兴趣的核苷酸序列是编码分枝杆菌的抗原的基因。

38.权利要求33的重组载体，其中感兴趣的核苷酸序列是编码病毒的抗原的基因。

39.权利要求38的重组载体，其中感兴趣的核苷酸序列是编码逆转录病毒的抗原的基因。

40.权利要求24的载体，其中TEL/AML表位被全部或部分的致病因子基因所取代。

41.权利要求25的载体，其中ILKE表位被全部或部分的致病因子基因所取代。

42.权利要求37、40或41的载体，其中所述分枝杆菌或致病因子是结核分枝杆菌。

43.权利要求1到10中的任意一项的免疫原性组合物，其能够诱导或刺激载体的基因组在靶细胞中的向核内输入。

44.权利要求24或25或33到41之任意一项的载体在权利要求1到23之任意一项的免疫原性组合物中的用途。

45.能够在逆转录之后采取三链DNA结构(DNA三链体)的、包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的DNA片段制备用于在细胞或患者中诱导细胞反应的药物的用途。

46.权利要求26或27的重组细胞，用于肿瘤或传染病的治疗性处理。

说明书

用于制备免疫治疗性组合物的慢病毒载体

[0001] 本发明涉及逆转录病毒载体，尤其是慢病毒载体在制备如下组合物中的用途，所述组合物能诱导或促进针对该载体中存在之核苷酸序列编码的表位的体外(在优选实
施方案中，体内)免疫反应的出现或增强。

[0002] 本发明人已经表明：按照本发明制备的载体可以产生针对表位的细胞介导的免疫反应，尤其是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。

[0003] 他们还进一步获得了数据，表明该细胞介导的免疫反应可以是特异性的反应，产生的是针对一个或几个由包含在载体中的核苷酸序列编码的表位的免疫反应。

[0004] 因此，本发明提供可以用于抗肿瘤和癌症的治疗程序的工具，尤其是可以用于抗肿瘤的免疫疗法或接种疫苗疗法的工具。

[0005] 本发明也公开了可以用于治疗或预防传染病，尤其是与例如逆转录病毒感染等病毒感染有关的疾病的工具。

[0006] 本发明人进一步获得的结果表明：由本发明组合物诱导的与治疗有关的细胞介导的免疫反应，尤其是CTL反应，对肿瘤抗原、病毒抗原或被病毒感染的细胞的抗原是
特异性的，并且也可受MHC(主要组织相容性复合物)的特定分子的限制。

[0007] 本发明特别涉及载体在免疫原性组合物中的用途，以便产生受MHC复合物I类分子-例如HLA-A2或B7分子-限制的细胞介导的免疫反应。

[0008] 因此，本发明与包含重组载体的免疫原性组合物有关，该重组载体中包括多核苷酸，该多核苷酸包含顺式作用的中心起始区(cPPT)和顺式作用的终止区(CTS)。 在
反转录期间，cPPT和CTS序列诱导三链DNA结构的形成，该结构在此被称作DNA三链
体。 DNA三链体刺激载体DNA基因组的向核内输入，这些区域是逆转录病毒或逆转录
病毒样起源的，所说的载体还包含确定的核苷酸序列(转基因或感兴趣的序列) 和逆转录
病毒或逆转录病毒样起源的逆转录、表达和壳体化的调节信号，其中所说的组合物能够
诱导或刺激针对一个或数个由载体中的转基因序列编码的表位的CTL(细胞毒性T淋巴细
胞)或CD4反应。

[0009] 在本发明的优选实施方案中，针对一个或数个表位的细胞介导的免疫反应，尤其是CTL反应或CD4反应，是记忆性CTL或CD4反应。

[0010] 需要强调的是，正是由于cPPT和CTS区域在载体中的存在，使得三链体DNA结构得以形成，并因此影响了、尤其是提高了在被所说的载体重组的细胞中载体基因组
的向核内输入。

[0011] 本发明的免疫原性组合物诱导、或增强记忆性CTL反应的能力或概括地来说是与记忆性CTL反应的出现有关的能力，使得该免疫原性组合物能够被用于抗肿瘤治疗或
抗病毒治疗或抗病原体治疗的程序中，包括当需要诱导长期持续的免疫反应的时候，或
在某段时间需要寻找可长期诱导的反应的时候，在该免疫原性组合物给药后至少可以诱
导这样的反应。 换句话说，通过诱导或刺激或参与细胞介导的免疫反应的出现，尤其是
CTL反应或记忆反应的出现，该免疫原性组合物可以被用来制备治疗性组合物，以治疗
肿瘤性疾病或传染性疾病，例如细菌性或病毒性疾病。

[0012] 需要强调的是：由于在载体和载体颗粒中存在cPPT和CTS区域，导致在载体序列中存在三链体结构，这使得本发明的免疫原性组合物能够在靶细胞中刺激载体基因组
的向核内输入。 在载体中诱导的表位可以是自身或非自身的。

[0013] 本发明也包括含有逆转录病毒的或合成来源的cPPT和CTS序列的核苷酸序列在增加核苷酸序列或多肽序列进入靶细胞或受体细胞的核中的用途。

[0014] 作为实例，可以理解，上述的三链体序列包含对受体细胞来说是外源的序列或自身序列。

[0015] 因此，本发明披露了可以在与接种疫苗程序类似的治疗性程序中使用的组合物，以用于肿瘤的治疗，特别是抗癌或抗感染性疾病的治疗。

[0016] 我们很有兴趣地注意到：根据本发明，转基因或感兴趣的序列可能 是编码一个或数个肿瘤细胞的一个或数个表位(例如已经被确认为诱导针对肿瘤的细胞介导免疫反
应的潜在靶抗原的表位)的序列

[0017] 数个表位形成多表位(polyepitope)，其可能由本发明的转基因所编码。 在具体的实施方案中，它们可来自已经在肿瘤中被识别出来的靶抗原，并可被以这样的方式选
择：即当它们的编码序列联合形成转基因的时候，可以产生针对所有的表位或针对它们
中的大部份表位的细胞介导的免疫反应。 细胞介导的免疫反应可以在体外测定，或在优
选实施方案中在体内检测。 在实施例中描述了能够完成这样的检测的程序。

[0018] 在几个类型的肿瘤中，特别是在黑素瘤或在包括肾癌，膀胱癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，白血病和淋巴瘤等在内的癌中，已经鉴别出靶抗原。

[0019] 依照本发明的另外方面，该免疫原性组合物可以被用在传染病中获得细胞介导的免疫反应，这些传染病包括与病毒有关的感染，或与任何类型的病原体(包括分枝杆
菌(Mycobacteria)，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis))有关的感染。

[0020] 在此，可以鉴定出能够引起细胞介导的免疫反应的特异性抗原，它们的编码序列插入载体中用于该免疫原性组合物中。 作为实例，结核分枝杆菌的des基因就可以这
样用。

[0021] 此外，根据本发明，用于免疫原性组合物中的载体可能表达肿瘤细胞或受病毒感染的细胞上鉴定为靶抗原的蛋白质(包括糖蛋白或其他蛋白质来源的化合物)上存在的
表位。

[0022] 除此之外，我们还注意到：表位、以及用来提供表位的多肽或蛋白质可以通过例如突变、缺失或插入而被修饰，例如为了提高它们的稳定性而对其进行修饰。

[0023] 本发明也涉及包含重组逆转录病毒颗粒的免疫原性组合物，该病毒颗粒包含：

[0024] 1)包含确定的核苷酸序列(转基因)的重组核苷酸序列，所述确定的核苷酸序列被置于转录和表达的调节信号以及逆转录、表达和壳体化的调节信号的控制下，和

[0025] 2)包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的多核苷酸，这些区域是逆转录病毒或逆转录病毒样起源的，或来自转座子，并被以相对于逆转录病毒或
逆转录病毒样起源的逆转录调节信号或转座子调节信号有功能的方向和位置插入，

[0026] 其中该免疫原性组合物能够诱导或刺激针对由载体中存在的转基因序列编码的一个或数个表位的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应。

[0027] 包含cPPT和CTS顺式作用序列的DNA片段能够在反向转录之后采取三链DNA结构，即“DNA三链体”，并刺激载体DNA的向核内输入。

[0028] 依照具体的实施方案，能够诱导或者刺激针对一个或数个由存在于载体中的转基因序列编码的表位的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应的免疫原性组合物，包含重组的
逆转录病毒载体颗粒，这些颗粒包含：

[0029] a)相应于慢病毒的核蛋白或功能性衍生多肽的gag多肽(GAG多肽)，

[0030] b)由慢病毒的RT、PRO、IN蛋白或功能性衍生多肽构成的pol多肽(POL多肽)，

[0031] c)包膜多肽或功能性衍生多肽(ENV多肽)。

[0032] d)重组的核苷酸序列，其包含：确定的核苷酸序列(转基因或感兴趣的序列)，该序列编码一个或数个表位，被置于转录和表达的调节信号控制下；含有逆转录病毒或
逆转录病毒样起源的逆转录、表达和壳体化的调节信号的序列；以及含有顺式作用中心
起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的多核苷酸，这些区域是逆转录病毒或逆转录病
毒样起源的，并被以相对于前述的逆转录病毒或逆转录病毒样起源的调节信号有功能的
方向插入。

[0033] 依照另外的实施方案，能够诱导或刺激针对一个或数个由存在于载体中的转基因序列编码的表位的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应的免疫原性组合物包含重组的逆转
录病毒样颗粒，这些颗粒包含：

[0034] a)包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的多核苷酸，这些区域来自反转录转座子并被以相对于反转录转座子调节信号有功能的方向插入，

[0035] b)相应于反转录转座子的核蛋白或功能性衍生多肽的多肽(GAG多肽)，

[0036] c)相应于反转录转座子的RT、PRO、IN蛋白或功能性衍生多肽的 pol多肽(POL多肽)，

[0037] d)病毒的包膜多肽，

[0038] e)重组的核苷酸序列，其包含确定的核苷酸序列(转基因或感兴趣的序列)，该序列被置于转录和表达的调节信号和反转录转座子的逆转录、表达和壳体化的调节信号
的控制下。

[0039] 存在于对应一个或其它上述定义的免疫原性组合物中的重组逆转录病毒载体颗粒，在优选实施方案中能够诱导、增强记忆细胞介导的免疫反应尤其是记忆性CTL反应
的出现，或与记忆细胞介导的免疫反应尤其是记忆CTL反应的出现有关。

[0040] 根据上述披露的包含载体或载体颗粒的免疫原性组合物的定义，该组合物可以根据几个可能的实施方案而制备。

[0041] 在本发明的优选实施方案中，免疫原性组合物是以这样的方法制备的：即逆转录病毒起源的序列来自于慢病毒基因组。

[0042] 依照另外的实施方案，这些序列是逆转录病毒样起源的而且来自于反转录转座子。

[0043] 在本发明的另外的实施方案中，或除了上述定义的特征以外，包含在重组载体中的转基因或感兴趣的序列包含在包括转录和表达的调节信号的表达盒中。

[0044] 或者，载体的逆转录、表达和壳体化的调节信号是慢病毒来源的，并且包含cPPT和CTS区的多核苷酸也是慢病毒来源的。

[0045] 依照另外的实施方案，在载体中的逆转录、表达和壳体化的调节信号和含有cPPT和CTS区的多核苷酸，起源于HIV型逆转录病毒，特别是HIV-1或HIV-2。

[0046] 其他的病毒尤其是慢病毒可以被用来设计逆转录、表达和壳体化的调节信号，也可以用来获得含有cPPT和CTS区的多核苷酸。 特别是：可以使用慢病毒CAEV、
EIAV、VISNA、HIV、SIV或FIV。

[0047] 为了获得本发明的免疫原性组合物的重组逆转录病毒颗粒，编码载体的反式互补所必需的多肽或蛋白质的序列是：例如来自慢病毒，尤其是来自HIV，包括HIV-1和
HIV-2逆转录病毒，的GAG、POL和ENV蛋白质。

[0048] 或者，GAG和POL序列可以来自与ENV序列不同的病毒。例如：GAG和POL序列可能来自HIV逆转录病毒，而ENV序列可能来自另外的病毒或逆转录病毒，而且可
以是双嗜性或亲嗜性ENV序列。

[0049] 在另外的实施方案中，ENV序列起源于疱疹性口腔炎病毒(VSV)。

[0050] 依照本发明的特别的实施方案，能够诱导或刺激针对由存在于载体中的转基因序列编码的一个或数个表位的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应的免疫原性组合物包含重
组逆转录病毒样颗粒，该颗粒包含：

[0051] a)包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)的多核苷酸，这些区域起源于反转录转座子并被以相对于反转录转座子调节信号有功能的方向插入，

[0052] b)相应于反转录转座子的核蛋白或功能性衍生多肽的多肽(GAG多肽)，

[0053] c)相应于反转录转座子的RT、PRO、IN蛋白质或功能性衍生多肽的 pol多肽(POL多肽)，

[0054] d)病毒的包膜多肽，

[0055] e)重组的核苷酸序列，其包含确定的核苷酸序列(转基因或感兴趣的序列)，该序列被置于转录和表达的调节信号和反转录转座子的逆转录、表达和壳体化的调节信号
控制下。

[0056] 根据上述披露的特点，包含重组的逆转录病毒样颗粒的本发明的免疫原性组合物在优选实施方案中能够产生记忆细胞介导的反应，尤其是记忆性CTL反应。

[0057] 本发明也与载体结构有关，这些载体结构于1999年10月11日被保藏于CNCM(国立微生物保藏中心，Collection Nationale de Culture deMicroorganismes at Institut Pasteur in Paris，法国)。

[0058] 第一个载体是pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP，于1999年10月11日 按编号I-2326保藏。 第二个载体被指定为pTRIP-ILKE-IRES-GFP，并于1999年10月11日按编号
I-2327保藏。

[0059] 第三个载体是pTRIP.DES-IRES-GFP，于1999年10月11日按编号I-2331保藏在CNCM。

[0060] 存在于上述结构中的编码抗原的序列可以被任何其他的感兴趣的抗原或表位所取代，包括上面提到的结核分枝杆菌的完整DES基因。

[0061] 依照本发明的另外的方面，载体、载体颗粒和包含它们的免疫原性组合物，是以这样的方式设计的：即cPPT和CTS区位于载体的序列的中心。

[0062] “位于中心”意谓着cPPT和CTS区处在载体序列的中心，或大约在该序列的中心。尤其是：cPPT和CTS区域可以位于逆转录的线性载体DNA的中间三分之一之内。

[0063] 由于cPPT和CTS序列存在的结果，在病毒的逆转录期间所形成的三链体序列的中心定位，使得接触了该载体或载体颗粒的细胞的转导水平得到了提高。

[0064] 或者，依照该载体的一个变体，载体的转录单位，包括转基因，可以被插入在LTR区域的U3区域里面。因此，不论转基因的大小，在逆转录之后，转基因都会被复制
并因此出现在三链体序列的两侧，因此使得三链体序列能位于载体的中心位置。

[0065] 本发明也涉及与本发明的免疫原性组合物接触过的细胞，并且尤其涉及被该免疫原性组合物的载体或载体颗粒所转导的重组细胞。

[0066] 有利的是这些细胞是抗原提呈细胞，例如，这些细胞可以从肺细胞、脑细胞、上皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞(mycroglia)、少突胶质细胞、神经元、肌细胞、
肝细胞、树突细胞、神经元细胞、骨髓细胞株、巨噬细胞、成纤维细胞、造血细胞中选
择。

[0067] 本发明的免疫原性组合物可以因此被用于肿瘤特别是癌症的治疗程序，或制备肿瘤特别是癌症的治疗性疗法的治疗组合物，以产生初次(primary)细胞介导的免疫反
应，尤其是CTL反应，有利的是该反应是记忆性CTL反应。或者，它也可以作为另外已
知的抗癌治疗的辅助性 治疗来使用。

[0068] 例如，本发明的免疫原性组合物可以与化学疗法或免疫化学疗法或另外的抗癌治疗方法联合使用。

[0069] 根据本发明，“抗癌治疗”的表述意味着抑制肿瘤的生长或肿瘤的潜在生长或抑制恶性细胞的扩散，包括控制转移形成的可能性，或两者皆有。

[0070] 因此，依照本发明，“抗癌治疗”的表述涉及用来控制肿瘤的恶性生长和扩散，以及预期该疾病的复发的程序，尤其是考虑到该免疫原性组合物能够诱导或增强，
一般地说，能够参与，记忆细胞介导的反应的事实。

[0071] 可能用本发明的组合物治疗的肿瘤有：例如黑素瘤或包括(肺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌)以及淋巴增生在内的癌。

[0072] 可能被治疗的肿瘤也包括所有表达肿瘤特异性抗原的肿瘤，肿瘤特异性抗原包括突变的自身蛋白质和/或过量表达的自身蛋白质。

[0073] 本发明的免疫原性组合物的每个可能的可接受的给药方式都是我们所感兴趣的，包括含离体步骤的给药程序，例如离体转导靶细胞，继而将处理过的细胞输给将要
接受治疗的患者。

[0074] 或者，本发明的免疫原性组合物可以通过常用的给药途径直接对患者给药，这些途径包括全身性(IV)、局部性、或经皮肤的、皮内的、例如肿瘤内给药等给药途径。

[0075] 在具体的实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以通过这样的方式直接对患者给药，即它将会在体内诱导、增强或参与细胞介导的免疫反应，尤其是CTL介导的免
疫反应。

[0076] 在另外的实施方案中，可以使用该免疫原性组合物以使它们能够诱导出现长期的记忆性细胞介导的反应。

[0077] 需要强调的是：本发明的免疫原性组合物具有特别的益处，这是因为存在于载体和载体颗粒中的cPPT和CTS序列具有诱导或刺激靶细胞中载体基因组的向核内输入的
性质。

[0078] 本发明的免疫原性组合物特别的优点是它们可以用来引发或刺激 针对由存在于载体或载体颗粒中的感兴趣的核苷酸序列或转基因编码的多个表位的细胞介导的免疫反
应，而且它们也能用来引发或刺激针对基因(例如致病因子的基因)全序列或上述基因能
够编码至少8到15个氨基酸、优选9到12个氨基酸的片段的产物的细胞介导的反应。本
发明也包括含有如下核苷酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码上述诱导细胞反应
的氨基酸序列的多个重复(至少两个同样的序列)和/或包含至少两个对应于不同病原体
或肿瘤抗原两个表位的不同序列的氨基酸序列。

[0079] 本发明的其他特性或优点在下列各项实施例和附图中展示。

[0080] 附图说明

[0081] 图1：编码黑素瘤多表位的、来自HIV-1的三链体DNA阳性重组载体。

[0082] 图2：用TRIP-mel-IRES-GFP载体免疫后的HHD小鼠的CTL反应。

[0083] 图3：HIV-1来源的中DNA三链体阳性或阴性载体转导人细胞5天后在人细胞中的GFP表达。

[0084] 图4：使用人树突细胞的体外CTL反应。

[0085] 图5：pHR.MEL-IRES-GFP载体的限制性酶切图谱黑素瘤特异性CTLs的单一或多个表位的序列。

[0086] HR.MEL-IRES-GFP的构建。

[0087] 为了要构造HL.MEL-IRES-GFP质粒，按编号I-2185于1999年4月20日保藏在CNCM的TRIP.MEL-IRES-GFP的NdeI/XhoI片段，其包含CMV启动子的一部分、多
表位MEL和IRES-GFP，代替包含CMV启动子一部份和GFP的HR GFP NdeI/XhoI片
段。

[0088] 图6：pTRIP.ILKE-IRES-GFP载体的限制性酶切图谱

[0089] HIV特异性CTLs单个或多个表位的序列，I9V.(ILKE)；(RT476-484)的表位。

[0090] TRIP.ILKE-IRES-GFP的构建(1999年10月11日存放在CNCM，巴黎，法国，编号是I-2327)

[0091] TRIP.ILKE-IRES-GFP是通过将ILKE的PCR产物插入TRIP ΔE IRES-GFP内，并位于CMV启动子和IRES之间而构建出来的。从ILKE开始的围绕CTL表位的区域通
过PCR方法在pLAI模板上用下列引物扩增：

[0092] 5 ILKE：5’TCAGATCTGCCACCATGGCACTAACAGAAGTAATACCAC 3’

[0093] 3 RIILKE：5 ‘CGGAATTCTTATTGGCCTTGCCCCTGCTTC 3’.

[0094] Kozak序列被插进上游引物内，而终止密码子被插进下游引物内。

[0095] 在用BglII/Eco RI消化后，PCR产物被插进TRIP ΔE IRES-GFP的BamHI/EcoRI位点内。

[0096] 该载体表达编码GFP和VIH的RT基因区的双顺反子信使，其对应于表位簇，尤其包含受HLA.A2.1限制的I9V表位(RT 476-484)(Walker B.D.，1989 PNASS 86
p.9514-9518)。

[0097] 图7：pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP载体的限制性图谱。

[0098] 转移(translocation)TEL/AML序列

[0099] TRIP.TEL/AML-IRES-GFP是通过将TEL/AML的PCR产物插入TRIP ΔEIRES-GFP之内，并位于CMV启动子和IRES之间而构建出来的。 在TEL和AMI之间
围绕转移的区域通过PCR方法用下列引物扩增：

[0100] 5 Bgl TA：5’GAAGATCTG CCACCATGAAGCCCATCAACCTCTCTCAT 3’

[0101] 3 RITA：5’CGGAATTCTTACCCAGCGCAACGCCTC 3’

[0102] Kozak序列被插进上游引物内，而终止密码子被插进下游引物内。

[0103] 在用BglII/EcoRI消化后，PCR产物被插进TRIP ΔE IRES-GFP的BamHI/EcoRI位点内。

[0104] 图8：来自HIV的DNA三链体阳性载体转导小鼠树突细胞的能力，该载体编码I9V表位肽(来自于HIV 1pol)和GFP，该细胞是通过使用来自HHD转基因小鼠的骨髓
细胞而制备出来的。

[0105] 约80％的小鼠树突细胞被来自HIV的三链体阳性重组载体所转导。这已经通过细胞内部的GFP表达的FACS分析所证明。

[0106] 图9：编码结核分枝杆菌的DES基因的TRIP-des-IRES-GFP载体免疫后，HHD小鼠中的CTL反应的评价。

[0107] 图10：pTRIP.DES-IRES-GFP的限制性酶切图谱，该载体于1999年10月11日保藏在CNCM。

[0108] 实施例

[0109] 慢病毒载体有转导包括非分裂细胞在内的细胞的能力，而且人们逐渐打算将其用于基因治疗。最近，我们显示了包含多嘌呤区段顺式作用序列(中心DNA三链体)的
慢病毒载体比那些缺失了中心DNA三链体的载体对人和鼠的细胞表现出更高的转导效率
(Chameau P.等，J.Mol.Biol.1994，241，651-662)。 现在已经检测了包含或不包含中心
DNA三链体和编码相同的HLA-A2.1限制性黑素瘤CTL多表位的慢病毒载体诱导CTL反
应的能力。 包含中心DNA的慢病毒载体直接体内给药可以在HHD(HLA-A2.1纯)小鼠
中诱导针对由多表位序列编码的所有表位多肽的强烈的CTL反应。 含有DNA三链体的
慢病毒载体已经清楚地显示了它的优点。此外，我们表明包含了DNA三链体的慢病毒载
体转导人的树突细胞的效率比不包含三链体的载体高7倍。 这些被离体转导的树突细胞
引发了针对大部份黑素瘤表位多肽的有效的特异性初次CTL反应。 由于对修饰过的慢病
毒载体的安全性的关心已经被解决，我们打算将该载体不只是用于人的体内基因治疗，
而且还要用于癌症患者的免疫疗法。

[0110] 介绍

[0111] 逆转录病毒的慢病毒亚科能感染包括非分裂细胞在内的大多数细胞类型。 这个性质使慢病毒对基因治疗来说是具有吸引力的。 几个复制缺陷的人重组慢病毒载体已
经被不同的小组构建了(Naldini PNAS93，11382-8，Science，1996)。 这些经过重新设
计和去毒的慢病毒载体被提议作为最有效的和安全的基因治疗载体(Zufferey R，& Kim
V.N.JVirol，72，9873-80，1998)。我们发展了以人的慢病毒(HlV)为基础的 带有疱疹性
口腔炎病毒G糖蛋白(VSVG)的假型载体(Burns J.C.，1993PNAS 90，8033-7)。这个载
体缺失了大部份非必需的病毒蛋白质，但是含有多嘌呤区段顺式作用序列(cPPT，中心
DNA三链体)。中心DNA三链体在相当程度上提高了逆转录的HIV-DNA分子的向核内
输入。而且，观察到包含中心DNA三链体的慢病毒载体比不包含三链体的载体对鼠和人
细胞表现出更有效的体外转导。

[0112] HHD(HLA-A2.1 纯 )转 基 因 小 鼠 (Pascolo 等，J.Exp.Med，1997，185：2043-2051)允许对表位多肽和不同的免疫策略的免疫原性潜力进行实验性受控评估。 使
用这些HHD小鼠，由不同的重组载体编码的黑素瘤多表位在单个动物中同时诱发CTL反
应的能力已经被报道了。首先研究了包含或不包含中心DNA三链体和编码相同的黑素瘤
多表位的慢病毒载体在HHD转基因小鼠体内诱导CTL的能力。 进而研究了由相同的重
组慢病毒载体转导的人树突细胞(hDC)是否可以离体诱导针对黑素瘤多表位基序的初次
CTL反应。 目前的结果证明：通过重组载体体内直接给药或离体使用转导的树突细胞，
DNA三链体明显提高了慢病毒载体诱导特异性CTL反应的能力。

[0113] 结果

[0114] 实施例1：黑素瘤多表位免疫。

[0115] 证明了注射编码来自黑素瘤的多表位基序的重组DNA可以在HHD小鼠中同时诱发针对数个黑素瘤表位的CTL反应之后，我们检测了编码相同的黑素瘤多表位基序的
慢病毒载体(图1)的免疫原性能力。TRIP-mel-IRES-GFP载体(CNCM 1-2185，于1999
年4月20日保藏)按每只小鼠1.25μg/p24经静脉内、腹膜内、或皮下给药。 每组至少
使用3只小鼠。

[0116] 针对十个黑素瘤表位中的大部份表位的多个特异性CTL反应同时被诱导出来。不论何种给药途径，观察到针对负载多肽和TRIP-mel-IRES-GFP转导的HHD-转染的
HeLa细胞两者的CTL反应相类似(数据未显示)。 然而，腹膜内注射可诱导略微好
些的CTL反 应。 针对NA17-A.nt38和gp100.154表位多肽引发了强烈的反应。 针对
gp100.457、MART.1.27、Mage-3和酪氨酸酶.368-D的明显反应也被观察到了。 针对
gp100.209、gp100.280、MART-1.32和酪氨酸酶.1的CTL反应是很弱的。 当使用其他的
非慢病毒载体给药时，TRIP-mel-IRES-GFP载体免疫后能引发弱CTL反应的表位都不能
再诱导CTL反应。

[0117] 诱导体内可检测的CTL反应所需要的慢病毒载体的最小剂量

[0118] 使用六个不同剂量的TRIP-mel-IRES GFP载体腹膜内注射以确定能够在HHD小鼠中引发明显的CTL反应的慢病毒载体的最低剂量，每个剂量使用4只小鼠。 共进行了
51
两次实验，其中两只小鼠的效应细胞在 Cr实验之前被混合以具有类似的E/T比。 在大
多数的实验中，研究人员检测了针对所有的黑素瘤表位多肽的CTL反应。 因为结果高
度地类似并且非常平均，所以为了使结果变得清楚和简单，只有针对NA17/A表位肽的
CTL反应被考虑用来比较“量-效”关系。 每只小鼠使用的剂量在500ng到2500ng/p24
之间时可以获得最好的CTL反应。 虽然产生了针对某些黑素瘤表位的可检测的CTL反
应，但是慢病毒的高剂量并不比低剂量诱导更好的CTL反应。 每只小鼠500ng/p24以下
的剂量是不足以诱导有效的CTL反应的，即便证实了该剂量可以诱导某些针对某些黑素
瘤表位多肽的特异性CTL反应。 值得注意的是在每只小鼠1250ng/p24的剂量时，一些
小鼠产生了针对包括在多表位基序10个表位中的所有10个表位的CTL反应(图3)。

[0119] 长期记忆性CTL的诱导

[0120] 用TRIP-mel-IRES-GFP载体注射8只小鼠。 免疫12天或5个月后处死小鼠。用黑素瘤表位多肽体外刺激5天后，再用10％TCGF处理2天，混合4只小鼠的效应细
胞，测定其针对负载在HHD-转染的RMAS细胞上的多肽的活性。 证明了在12天前免
疫的小鼠中存在针对除了gp100.209和Mart1.32以外的所有黑素瘤表位多肽的特异 CTL反
应。 在TRIP-mel-IRES-GFP注射后的5个月，所有初次CTL诱导表位仍然诱导强烈的
CTL反应(图2)。 在免疫小鼠后的12天或5个月，令人惊讶的是CTL反应的水平仍然
是可比较的。 这提示体内被慢病毒载体转导的细胞并没有被免疫系统消灭，而是在继续
制造所编码的黑素瘤多表位。

[0121] 中心DNA三链体在体内免疫中的作用

[0122] HMD小鼠分别同时被TRIP-meL-IRES-GFP和HR-mel-IRES-GFP载体单独免疫，每只小鼠腹膜内给药剂量分别为800ng，200ng，50ng，12ng和3ng/p24。 在两个单
独的实验中，每个剂量至少检测4只小鼠。 在被合成多肽体外刺激之后，使用肽反复刺
激的(pulsed)RMAS-HHD靶细胞检测脾细胞的溶细胞能力。因为结果高度地均一，为了
使结果清楚和简单，只检测了针对NA17/A，Mart-1.27，gp100.154和酪氨酸酶.368-D表
位多肽的CTL反应。

[0123] 大体上，用TRIP-LV载体以每只小鼠800ng，200ng和50ng/p24免疫的小鼠与用HR-LV载体免疫的小鼠相比，可以诱导出更好的CTL反应。 无论使用何种载体，每
只小鼠12ng/p24以下的剂量没有产生可检测的CTL反应(数据未显示)。 这证实了包
含中心DNA复合物的慢病毒载体与那些缺乏该复合物的载体相比，其转导能力得到了提
高。

[0124] 用慢病毒载体转导树突细胞

[0125] 最初观察到：与使用缺乏中心DNA三链体的载体相比，使用包含中心DNA三链体的慢病毒载体转导肿瘤细胞，例如MT4和HeLa细胞，可以提高转导效率达30倍。
随即在来自健康的供体或HHD小鼠的树突细胞(DC)中检测了这两种慢病毒载体在不同
浓度的转导能力。 树突细胞表达GFP的百分率和它们的平均荧光强度被FACS测量，而
且被当作这两个慢病毒载体转导树突细胞的水平。

[0126] 在所有的载体浓度上，TRIP-GFP载体都比HR-GFP载体更有 效地转导细胞。被TRIP-GFP载体转导的鼠和人树突细胞的GFP表达分别比那些被HR-GFP载体转导的
表达高3和7倍(图3)。

[0127] 使用被TRIP mel IRES-GFP载体转导的人树突细胞的初次CTL诱导

[0128] 使用来自被TRIP mel-IRES-GFP转导的健康HLA-A2.1供体的树突细胞，体外刺激来自同一供体的单核细胞(MNC)，每星期一次。 在树突细胞中出现的GFP表达用
FACS分析以证实有效的转导。 在三个星期之后，在无胎牛血清(FCS)的培养条件下，
51
使用肽反复刺激的T2细胞作为靶细胞，在 Cr实验中检测单核细胞的细胞毒性能力。

[0129] TRIP-mel-IRES-GFP载体转导的人树突细胞(hDC)可以诱导针对除了Mart1.31之外的所有黑素瘤表位肽的明显的CTL反应，而未转导的人树突细胞仅能诱导平常的背
景反应(图4)。

[0130] 讨论

[0131] 最近的报告显示来自复制缺陷慢病毒的载体能转导多种非分裂细胞(Naldini，1996，Kafri，1997)。 慢病毒能够通过非分裂细胞的完整的核膜而进入(Case，1999)。
我们现在有证据表明这个步骤很大程度上是由被命名为中心DNA三链体的多嘌呤区段顺
式作用序列配合完成的。 将该序列引入慢病毒来源的载体内，可能会使几个细胞类型在
体内和体外的稳定转导提高达30倍，这些细胞包括神经元、肝细胞和造血干/祖细胞。

[0132] 最近，在解决慢病毒来源的载体的安全性考虑方面以及它们在基因治疗中的用途已经取得了进步(Narry Kim V等1988，Zufferey，1999)。 然而，在已经成功使用鼠
逆转录病毒载体和非逆转录病毒载体所进行的免疫治疗应用方面从来没有研究使用慢病
毒载体(Condon，1996；Song，1997；Specht，1997)。 为了发展有力的疫苗策略，检
测了包含中心DNA三链体并编码黑素瘤多表位的慢病毒载体的免疫原性能力。 首先
研究了该载体的直接注射以测定它是否能在体内引发针对黑素瘤表位的特异性CTL反
应。 先在HHD HLA-A2.1(纯)转基因小鼠中比较了几个免疫策略。 使用了重组的
pCMV-B10(HBs)DNA或编码相同的黑素瘤 多表位的重组疫苗，可能同时在单个小鼠中
诱导针对包含在黑素瘤多表位中的4到6个不同肽的CTL反应。 在与由其他的编码相同
的多表位基序的载体进行比较时，在特异性溶解以及引起CTL反应的多肽的数量方面，
我们在编码相同的黑素瘤多表位的TRIP mel IRES-GFP载体中获得明显更好的结果。 特
别是腹膜内和皮下注射该载体在一些小鼠中诱导出针对由TRIP mel IRES-GFP载体编码
的所有表位的CTL反应。

[0133] 几个小组报告：被转导的树突细胞或负载的多肽可以被用作针对多种癌细胞的有力的免疫方法(Mayardomo，JI，1995，Song W，1997，Specht，JM，1997)。 就本发
明来说，因此需要研究是否鼠和人的树突细胞能被有效转导并且在体外诱导初次CTL反
应。现在的结果清楚地表明这些细胞可以很容易地被转导。 此外，这些转导细胞提呈所
有由重组慢病毒载体编码的表位。有趣的是：人树突细胞可能最容易被转导。细胞的体
外转导可以避免慢病毒载体将它们的基因组以危险的方式整合到多种宿主细胞。 由于这
个原因，体外转导的细胞应该构成适当的和安全的递送方法以便进行初次临床应用。

[0134] Warner等首先表明逆转录病毒载体在几个动物模型以及HIV患者中具有诱导有效的CTL反应的能力，他们使用的是表达HIV-1蛋白质的鼠逆转录病毒载体转导的成
纤维细胞(Warner，1998年的综述)。 将载体直接注射进入小鼠体内，可以在有效提呈
抗原的树突状的细胞中检测到前病毒DNA(Song，1997)。 然而，与慢病毒载体相反，
鼠逆转录病毒载体不能转导例如树突细胞这样的非分裂细胞，所编码的基因的体内表达
时常遭遇“关闭”。 因此，这些逆转录病毒载体对人的免疫治疗来说不是最好的候选者
(Kafri)。

[0135] 我们的结果清楚地表明：包含中心DNA三链体的来自慢病毒的载体与那些不包含中心DNA三链体的载体相比，在HHD小鼠体内可以诱导更强的CTL反应。此外，包
含中心DNA三链体的慢病毒载体可以在体外很容易地转导人树突细胞，其可以随即用于
临床的免疫疗法。

[0136] 材料和方法

[0137] 慢病毒载体的构建

[0138] 载 体 质 粒：pTRIP-EGFP 起 源 于HR’CMVLacZ(Naldini等，PNAS93，11382-8，1996)。LacZ报道基因被EGFP基因(Clontech公司)所取代。 在TRIP-EGFP
中，EGFP基因被插入含有cPPT和CTS序列的HIV-1 LAI的中心片段的Clal位点。

[0139] 通过PCR方法从pEGFP-N1质粒中扩增EGFP基因，使用的是Pfu聚合酶(Stratagene公司)，并分别在5’和3’端增加BamHI和XhoI限制性位点。 PCR引物
如下：

[0140] Bam GFP 5’CC GGATCC CCA CCG GTC GCC ACC 3’

[0141] Xho GFP 5’CC CTCGAG CTA GAG TCG CGG CCG 3’

[0142] HR GFP载体是通过将这个PCR片段克隆回pHR’CMVLacZ的BamHI和XhoI位点，用EGFP取代LacZ ORF而构建出来的。

[0143] pLAI3(4793到4971)的一个包含cPPT和CTS的178bp片段通过PCR方法扩增出来。 NarI限制性位点被添加在引物的5’端，目的是将这个片段插进HR GFP的单一
Cla I位点之内：

[0144] Nar TRIP+：5’GTC GTC GGCGCC GAATTC ACA AAT GGC AGT ATT CATCC3’

[0145] Nar TRIP-：5’GTC GTC GGCGCC CCA AAG TGG ATC TCT GCT GTC C3’

[0146] 将该三链体序列以正确的方向插入，产生TRIP GFP质体载体，以反向方向插入得到TRIPinv GFP。 或者，从pcPPT-AG、pcPPT-D、pcPPT-225和pCTS质粒中扩增同
样的三链体片段以产生在cPPT或CTS中含有相同突变的载体，作为相应的病毒。

[0147] 首先，在TRIP GFP载体或TRIP-EGFP(1998年4月15日保藏在 CNCM，编号I-2005)中存在的EcoRI位点被补平，产生TRIP GFP ΔE载体。 然后包含小RNA病
毒的内部核糖体进入位点(IRES)的1.2KbBamHI/XhoI片段被克隆到EGFP的上游，取
代TRIP GFPΔE载体中 的0.7kb BamHI/XhoI EGFP，产生cTRIP AE IRES GFP载体。在
CMV启动子和IRES GFP序列之间存在的位点是BamHI-BstXI-SnaBI和EcoRI。 一个
CTL多表位黑素瘤(mel)片段通过PCR方法在pBS Melpoly上产生，并将kozac共有序列
插在引物5BglMlu Mel之内：

[0148] 5’CCAGATCTACGCGTGCCACCATGGCTGCTGGT 3’

[0149] 3RIMel：5’CGGAATTCGACCTAAACGCAACGGATG3’.

[0150] mel PCR片段被BglII/EcoRI消化并插在TRIP ΔE IRES GFP的BamHI/EcoRI位点，产生TRIP ΔE mel IRES GFP，它也被称作TRIP melIRES GFP。

[0151] HR mel IRES GFP是通过将包含TRIP mel IRES GFP的黑素瘤多表位和IRES GFP的NdeI/XhoI片段与HR GFP的同样片段进行互换而产生的。 NdeI位点位于CMV启动
子的末端。

[0152] 病毒载体的制备

[0153] 慢病毒载体按先前描述过的方法(Naldini I.M.PNAS 1996和Science，1996)通过使用磷酸钙技术瞬时tree-质粒转染293T细胞来制备。 简而言之，293T细胞被20μg
VSV包膜质粒(pMDG)和40μg不同的包装质粒(8.2或8.91)和慢病毒载体质粒所转染。
转染后60小时和84小时收集条件培养基。 然后浓缩病毒，dNTPs按先前的描述处理
(Naldini，Science 1996)。 HeLa P4.2细胞和MT4细胞上的病毒滴度通过连续稀释和p24
ELISA检测法来确定(Naldini，Science，1996)。

[0154] 在存在20μM DEAE-葡聚糖的情况下，通过用等量的颗粒(每孔1ngp24病毒抗原)感染96孔板中的一式三份的P4细胞来进行病毒的一个周期滴定。 整个实验添加
1μM蛋白酶抑制剂Saquinavir(Roche公司)，以限制对单一感染周期的分析。 感染的前
一天用8μM aphicolin处理以抑制细胞有丝分裂。 使用化学发光的β-Gal报道基因测定
法(Boehringer公司)在感染后48小时检测β-半乳糖苷酶的活性。

[0155] 一式三份的HeLa细胞被等量的载体颗粒(每孔5ng P24)所感染。 在转导后48小时，用200μl TNB(Tris 50mM PH7.5，NaCl 150mM)替换培养基，使用微量反应板荧
2
光计(Victor，Wallac公司)和适合EGFP的滤光器(激发：485nm，发射：520nm)测定
活细胞的荧光。

[0156] 小鼠

[0157] HHD小鼠已经在先前被描述过了(Pascolo，1997)。 它们表达转基因的单链组织相容性I类分子，其中人b2m的C末端通过肽臂(GGGGS)x3共价连接到嵌合的重链
b b
(HLA-A2.1 a1-a2，H-2D a3-跨膜，和胞内域)的N末端。 这些小鼠的H-2 D 和小鼠
b2m基因被同源重组进一步打乱，导致完全缺乏血清学上可检测的小鼠组织相容性I类分
子在细胞表面的表达。

[0158] 人树突细胞的产生和初次CTL诱导

[0159] 从HLA-A2.1单倍型(IDM，巴黎，法国)的健康供体的细胞提取物中获得了人树突细胞。 使用针对CD3、CD14、CD80、CD83、HLA-ABC和HLA-DR的单克隆抗
体对这些树突细胞进行的FACS分析显示其具有不成熟的树突细胞表现型。 人树突细胞
6
在1ml AMV-5培养基中被慢病毒载体转导10天，浓度为每1×10 细胞600ng，300ng，
150ng和150ng/p24。 用FACS(Becton Dickinson，BD，美国)测量在被两个慢病毒载体
转导的人树突细胞中GFP表达的百分率和平均荧光强度。

[0160] 用人树突细胞或被转导的人树突细胞按1个人树突细胞对4个单核细胞的比例在体外刺激来自相同的供体的单核细胞(MNC)。使用同样的低温贮存的转导过的人树突细
51
胞对单核细胞再刺激两次，然后在4小时 Cr释放实验中检测细胞溶解活性，使用负载了
6
相关肽或阴性对照(Inf.m.58)肽的T2细胞作为靶细胞(10μg/ml，5×10 个细胞/ml，在
无胎牛血清的RPMI培养基中，室温下2小时)。

[0161] 鼠树突细胞的产生

[0162] 骨髓来源的树突细胞按先前描述的方法[43，51]产生。 骨髓单核细胞被培养在-5
补充了10％胎牛血清，2mM L谷氨酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素、5×10 M
2-巯基乙醇(完全RPMI培养基)的RPMI培养基中，进一步补充了20ng/ml重组的小鼠
GM-CSF和100ng/ml重组的小鼠IL4(两者均来自GENZYME公司，Cambridge，MA)。
在第2天和第6天，非贴壁细胞被小心地移动，而且加入补充了10ng/ml小鼠GM-CSF
和50ng小鼠IL4的新鲜的完全RPMI培养基。 在第7天，该培养基被1ml补充了慢病毒
6
载体的完全RPMI培养基所替代，慢病毒载体的浓度是每1×10 个细胞600ng，300ng，
150ng和150ng/p24。 在第9天收集的、用适当的单克隆抗体评估的树突细胞的纯度超
b+ + - + + +
过95％(IA ，HHD，CD3，33D1，NDL145，以及CD11c)。 然后在第9和12天用
FACS测量鼠树突细胞中的GFP表达的百分率和平均荧光强度。

[0163] 载体免疫作用和体外再刺激和细胞溶解测定

[0164] 用慢病毒载体经腹膜内、静脉内或皮下注射HHD小鼠12天。 然后将致敏小鼠的脾细胞在完全RPMI培养基中分别用每个表位肽再刺激7天。 最后两天，培养的细胞
51
被10％TCGF再刺激。 在第7天，按已经描述过的方法(Pascolo，1997)在4小时 Cr
释放测定试验中检测培养细胞的细胞溶解活性，使用HHD-转染的、负载了有关的或阴
6
性对照(Inf.m.58)肽(10μg/ml，5×10 个细胞/ml，在无胎牛血清的RPMI培养基中，
室温下2小时)的TAP-RMA-S细胞作为靶细胞。 TRIP-mel-IRES-GFP转导的或非转导
的HHD-转染的HeLa细胞可以被当作平行靶细胞来使用。 特异性溶解百分率依下列公
式计算：(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)×100。

[0165] 实施例2：编码结核分枝杆菌DES基因的TRIP-des-IRES-GFP载体免疫后的HHD小鼠CTL反应的评价。

[0166] DES基因公开在WO 98/04711中。

[0167] 实验步骤

[0168] 第一步，用TRIP-des-IRES-GFP载体转导HeLa-HDD细胞。 转导和通过有限51
稀释法克隆这些细胞。 表达较高水平的GFP的克隆被选择出来用于在经典的 CrCTL试
验中充当靶细胞。

[0169] 第二步，使用每只小鼠1.2micg/p24的TRIP-des-IRES-GFP载体颗粒腹膜内注射HDD小鼠。 这些小鼠的脾细胞在注射后的12天在体外被0.2micg或1micg/p24/
6
ml(2×10 个细胞/ml)的载体颗粒刺激，或用被TRIP-des-IRES-GFP转导的、1micg/
6
p24/ml/2×10 细胞/ml的LPS刺激同源母细胞刺激。 在体外刺激6天之后，使用被des
51
转导的HeLa-HDD靶细胞在 Cr试验中检测细胞的细胞溶解能力。 对照靶细胞是被黑素
瘤多表位(TRIP-mel-IRES-GFP)转导的HeLa-HDD细胞。

[0170] 结果

[0171] 这些已经完成的实验的目的是研究编码整个基因的、HIV来源的三链体阳性载体是否能够转导细胞，以及诱导针对表达相同的基因的靶细胞的特异性CTL反应。 正如
图9中所说明的那样，在所有的情况下都获得特异性溶解。 被转导的LPS母细胞诱导弱
的CTL反应。 使用1micg/p24/ml的载体颗粒获得了最好的结果。 这些结果表明全基因
可以被导入宿主细胞的基因组中，而且它的产物被加工、提呈并诱导明显的CTL反应。
这些结果也表明des基因包含至少一个或多个HLA-A2.1限制的CTL表位肽。

[0172] 参考文献

[0173] 1.Naldini，L.，Blomer，U.，Gage，F.H.，Trono，D.& Verma，L.M.Efficient transfer，integration，and sustained long-termexpression of the transgene in adult rat brains injected witha lentiviral vector.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 93，11382-8(1996).

[0174] 2.Naldini，L.Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells，Current Opinion in Biotechnology 9，457-63(1998).

[0175] 3.Zufferey，R.，Dull，T，Mandel R.J.，Bukovsky，A.，Quiroz，D.，Naldini，L.，等，Self-inactivating lentivirus vector for safeand efficient in vivo gene delivery.Journal of Virology 72，9873-80(1998).

[0176] 4.Burns，J.C，Friedmann，T.，Driever，W.，Burrascarro，M.& Yee，J.K.Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotypedretroviral vectors：concentration to very high titer andefficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells[see comments].Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America
90，8033-7(1993).

[0177] 5.Charneau，P.，Mirambeau，G.，Roux，P.，Paulous，S.，Buc，H.& ClavelF.HIV-1 reverse transcription.A termination stepat the center of the genome.Journal of Molecular Biology 241，651-62(1994).

[0178] 6.Pascolo，S.，Bervas，N.，Ure，J.M，Smith.A.G.，Lemonnier，F.A.&+
Perarnau.B.HLA-A2.1-restricted education andcytolytic activity of CD8 T lymphocytes from β2microglobulin(β2m)HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Dbβ2m double knockout mice.J.Exp.Med.185，2043-2051(1997).

[0179] 7.Koenig，S.，Gendelman，H.E.，Orenstein，J.M.，Dal Canto，M.C，Pezeshkpour，G.H.，Yungbluth，M.et al.Detection ofAIDS virus in macrophages in brain tissue from AIDS patientswith encephalopathy.Science 233，1089-93(1986).

[0180] 8.Roe，T.，Reynolds，T.C，Yu，G.& Brown，P.O.Integration ofmurine leukemia virus DNA depends on mitosis.EMBO Journal12，2099-108(1993).

[0181] 9.Michel M.L，Davis，H.L.，.Schleef，M.，Mancini，M.，Tiollais，P.&Whalen，R.G.DNA-mediated immunization to the hepatitisB surface antigen in mice：aspects of the humoral responsemimic hepatitis B viral infection in humans.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 92，5307-11(1995).

[0182] 10.Giovannangeli，C.，Diviacco，S.，Labrousse，V.，Gryaznov，S.，Charneau，P.& Helene，C.Accessibility of nuclear DNA totriplex-forming oligonucleondes：
the integrated HIV-1provirus as a target.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 94，79-84(1997).

[0183] 11.Kim，V.N.，Mitrophanous，K.，Kingsman，S.M.& Kingsman，A.J.Minimalrequirement for a lentivirus vector based on humanimmunodeficiency virus type 1.Journal of Virology 72，811-6(1998).

[0184] 12.Fox，J.L.Researchers wary of fear-based ban on lentivirusgene therapy[news].Nature Biotechnology 16，407-8(1998).

[0185] 13.Dull，T.，Zufferey，R.，Kelly，M.，Mandel，R.J.，Nguyen，M，Trono，D. 等，A third-generation lentivirus vector with aconditional packaging system.Journal of Virology 72，8463-71(1998).

[0186] 14.Arya，S.K.，Zamani，M.& Kundra，P.Human immunodeficiencyvirus type 2 lentivirus vectors for gene transfer：expressionand potential for helper virus-free packaging.Human GeneTherapy 9，1371-80(1998).