一种具有蛋白酶活性的酶

摘要

一种DNA构建体包含编码表现出蛋白酶活性的酶的DNA序列之DNA构建体，其中的DNA序列包含SEQ ID NO.1或2所示的DNA序列或与SEQ ID NO.1或2所示DNA序列具有至少80％同源性的这些序列的任一类似物。由该DNA序列编码的蛋白酶具有酸性的最适pH值。

权利要求

1.一种DNA构建体，包含编码表现出蛋白酶活性的酶的DNA序列，其中该DNA序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种重组表达载体，包含根据权利要求1的DNA构建体。

3.一种细胞，包含根据权利要求1的DNA构建体或根据权利要求2的重组表达载体。

4.根据权利要求3的细胞，它是一种真核细胞。

5.根据权利要求4的细胞，它是真菌细胞。

6.根据权利要求5的细胞，它是酵母细胞或丝状真菌细胞。

7.根据权利要求6的细胞，其中的细胞属于曲霉属(Aspergillus)菌株。

8.根据权利要求7的细胞，其中的细胞属于黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株。

9.一种生产表现出蛋白水解活性的酶的方法，该方法包含在能使酶产生的条件下培养根据权利要求3-8任一项的细胞，并从培养物中回收该酶。

10.一种表现蛋白水解活性的酶，该酶由根据权利要求1的DNA构建体编码或由根据权利要求9的方法生产。

11.可用于降解植物细胞壁成份的酶制品，所说的制品富含根据权利要求10的表现蛋白水解活性的酶。

12.根据权利要求11的酶制品，它还包含一种或多种其它植物细胞壁降解酶。

13.根据权利要求12的酶制品，其中所述其它植物细胞壁降解酶选自下述中的一种或多种果胶裂解酶，果胶酸盐裂解酶，葡聚糖内部裂解酶，阿拉伯聚糖酶，木聚糖酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，α-半乳糖苷酸，鼠李半乳糖醛酸酶，果胶乙酰脂酶，多聚半乳糖醛酸酶，蛋白酶，肽链端解酶或果胶甲酯酶。

14.根据权利要求10的酶在含蛋白质物质的降解或修饰中的应用。

15.根据权利要求10的酶在隐形眼镜清洁中的应用。

16.根据权利要求15的应用，其在H2O2存在的条件下进行。

17.根据权利要求16的应用，其在3％H2O2存在的条件下进行。

18.根据权利要求16或17的应用，其中与过氧化氢酶组合以中和H2O2。

19.根据权利要求10的酶在烘烤产品制备中的应用。

20.根据权利要求10的酶在动物饲料制备中的应用。

21.根据权利要求11-13任一项的酶制品在含蛋白质物质的降解或修饰中的应用。

22.根据权利要求11-13中任一项的酶制品在隐形眼镜清洁中的应用。

23.根据权利要求22的应用，其在H2O2存在的条件下进行。

24.根据权利要求23的应用，其在3％H2O2存在的条件下进行。

25.根据权利要求23或24的应用，其中与过氧化氢酶组合以中和H2O2。

26.根据权利要求11-13任一项的酶制品在烘烤产品制备中的应用。

27.根据权利要求11-13任一项的酶制品在动物饲料制备中的应用。

说明书

一种具有蛋白酶活性的酶

[0001] 本发明是关于一种DNA构建体-它编码一种具有蛋白酶活性的酶、一种生产此酶的方法、一种具有蛋白酶活性的酶以及一种含有此酶的酶制品。

[0002] 蛋白酶是能够分解肽键的酶。发现酸性蛋白酶(即具有酸性最适pH的蛋白酶)由包括哺乳动物和微生物的许多不同生物体产生。例如，发现微生物酸性蛋白酶由细菌菌株，如芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)菌株(JP 01240184)，真菌菌株，如根霉属之种(Rhizopus sp.)(EP 72978)、Schytalidium SP.(JP 48091273)、Sulpholobus sp.和Thermoplasma sp.(WO/9010072)以及曲霉属之种(Aspergillus sp.)(JP 50121486、EP 82395)产生。

[0003] JP 305879公开了一种编码来自雪白根霉(R.niveus)的一种酸性蛋白酶的基因克隆及其重组表达。来自Cryphonectiraparasitica编码一种天冬氨酸蛋白酶的一种基因的克隆和表达被Choi等(1993)、Takahashi等(1991)、Inoue等(1991)描述过。而JP 4075586公开了来自黑曲霉(Aspergillus niger)的编码一种酸性蛋白酶(蛋白酶A)的基因克隆。

[0004] Berka等(1990)公开了编码来自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的天冬氨酸蛋白酶曲霉菌素胃蛋白酶A的基因。编码来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的天冬氨酸蛋白酶曲霉菌素胃蛋白酶O的基因克隆被Berka等(1993)描述过。编码来自米曲霉的酸性蛋白酶(PEPA)的基因克隆被Gomi等(1993)公开了。酸性蛋白酶在工业上被广泛地应用，例如用于制备食品和饲料、制革工业(如给皮革除毛)、蛋白水解物生产、以及酿酒工业。

[0005] 在许多不同的应用上，尤其在食品和饲料工业中，需要单一成份的酸性蛋白酶。

[0006] 本发明的目的是制备单一成份的蛋白酶。

[0007] 因此，首先本发明是有关于编码具有蛋白酶活性的酶的DNA序列的DNA构建体，这段DNA序列含有显示于SEQ ID No.1中的DNA序列或者含有与此序列(SEQ ID No..1)至少有80％同源性的类似序称。

[0008] 其次，本发明是关于含有编码具有蛋白酶活性的酶的DNA序列的DNA构建体、这段DNA序列含有SEQ ID No..2中的DNA序列或者含有与此序列(SEQ ID No..2)至少80％同源性的类似序列。

[0009] SEQ ID No.1中的DNA序列编码一种酶，此酶在以下叙述公开中被称为蛋白酶I。而被SEQ ID No.2中的DNA序列编码的酶被称为蛋白酶II。

[0010] 通过数据库的同源性搜寻，已发现SEQ ID No.1和No.2中的DNA序列通常是新的。发现，SEQ ID No.1中DNA序列与已知蛋白酶基因的最高同源性是与 黑曲霉 酸性蛋白酶A有74.7％的同源性，据测定两者有538个核苷酸的重叠。据测定蛋白酶II基因与 米曲霉 曲霉菌素胃蛋白酶O基因的同源性最高，为75.5％，两者有343个核苷酸重叠。

[0011] 第三本发明是关于含有本发明的DNA构建体的表达载体、一种含有该DNA构建体或表达载体的细胞和一种生产具有蛋白酶活性的酶的方法，此方法包括在允许酶的产生的条件下培养所述的细胞并从培养基中回收酶。

[0012] 第四，本发明是关于一种具有蛋白酶活性的酶，这种酶由上述定义的DNA构建体所编码，或由本发明吉的方法所生产。

[0013] 第五个重要方面，本发明是关于一种具有蛋白酶活性的酶，这种酶在pH值小于7.0和高于3％的过氧化氢存在的条件下具有活性。在本文中，有关这种酶所使用的术语“有活性”是指这种酶在上述条件下能水解底物，如在本实施例五所叙述的那样。

[0014] 本发明的酶是在pH值小于7.0和高于3％的过氧化氢存在条件下有活性，并且它在实施例五所特定的条件下能从透镜中除去至少80％的溶菌酶。在下列公开中本发明的这种酶被叫做“对过氧化氢稳定的蛋白酶”。通常认为这种酶是新的。

[0015] 并且，本发明提供了一种具有蛋白酶活性的酶，它在pH值小于7.0条件下有活性并且它对苯丙氨酸-缬氨酸或者赖氨酸-酪氨酸中的肽键具有专一性。术语“专一性”是指在底物是牛胰高血糖素条件下此酶主要断裂这些肽键。在此叙述的蛋白酶I和蛋白酶II是本发明酶的优选实施例。这些酶已被发现是酸性蛋白酶，即具有酸性最适pH值的蛋白酶。

[0016] 通过本发明就有可能提供高度纯化的蛋白酶，即纯度大于70％，优选大于90％，这正如通过本文的材料与方法部分所叙述的SDS凝胶电泳所测定的那样。

[0017] 最后，本发明是关于含有本发明酶的酶制品和适于不同目的的酶或酶制品的使用，其中对含蛋白质物质的修饰或降解是理想的。

[0018] 本发明的DNA构建体、载体和方法

[0019] 在本文中关于本发明中定义的DNA构建体的术语“类似物”理解为包括任何如下DNA序列：它编码具有蛋白酶活性的酶并且分别与显示于SEQ ID No.1或No.2的DNA序列至少有80％的同源性。类似的DNA序列可以是一段在下列条件下同与编码蛋白酶DNA具有相同序列的探针进行杂交的DNA序列。在5XSSC中预浸泡并在5XSSC、5X Denhardt’s溶液、50mM磷酸钠、pH6.8和5μg变性声处理过的小牛胸腺DNA的溶液中在-55℃下预杂交1小时，然后在添加了50μCi 32-P-dcTP标记探针的上述溶液中于-55℃杂交18小时，接着在2XSSC、0.2％SDS中于55℃洗三次，每次30分钟。类似DNA序列优选地与SEQ ID No.1或No.2所示的序列至少有90％的同源性。而与所棕序列优选地至少有95％的同源性。

[0020] 类似DNA序列可以是从其它生物体中分离的，也可以是在SEQID No.1或No.2中所示DNA序列基础上制备的，例如通过引进不会产生蛋白酶的另一种氨基酸序列的而只相应于宿主生物体选用密码子的核苷酸取代基，或者通过引进会产生不同的氨基酸序列并进而可能产生不同的蛋白质结构，这种结构能产生具有野生的酶所没有的特性的蛋白酶突变型的构建体或核苷酸取代基。其它可能的修饰例子是在序列中插入一个或多个核苷酸、在序列中的两端之一增加一个或多个核苷酸、或者在序列的两端之一或中间缺失一个或多个核苷酸。

[0021] 再者，优选地，由类似DNA序列编码的蛋白酶会与针对SEQ IDNo.1或No..2所示DNA编码的纯化蛋白酶而产生的抗体具有免疫交叉反应。

[0022] 能够与SEQ ID No.1所示序列类似的DNA序列杂交的核苷酸

[0023] 探针例如可以根据以下DNA序列之一或其组合制备：

[0024] (a)AATTAAGCAT CCTCCATCTT

[0025] (b)CAAAGCTCAA TCTCGCTAAC

[0026] (c)TCCCGCTCTT CTCTCGATCT

[0027] (d)CATCATCCCA ATAACTCGGA

[0028] (e)CAAAATGAAG ACCTCTGCTC

[0029] (f)TCTTGACCGC TGGCCTGTTG

[0030] (g)GCACCGCTGC TATTGCTGCT

[0031] (h)CCTCTCACCG CGAAGCGCGC

[0032] (i)ACGTGCTCGC GCTGCCAAGC

[0033] (j)TGGCACCAGC CGCAAGAGCA

[0034] (k)AGGGGGGTCT CAAGCCCGGC

[0035] (l)ACCCAGCGAG GCCATAACCT

[0036] (m)GACCGGCTCC AAGAACACCG

[0037] (n)GAGGTACTCG TCCAACTGGG

[0038] (o)CCGGCGCCGT GCCAT

[0039] (p)AATTAAGCAT CCTCCATCTT CAAAGCTCAA TCTCGCTAAC TCCCGCTCTT[0040] CTCTCGATCT CATCATCCCA ATAACTCGGA CAAAATGAAG ACCTCTGCTC[0041] TCTTGACCGC TGGCCTGTTG GCACCGCTGC TATTGCTGCT CCTCTCACCG[0042] CGAAGCGCGC ACGTGCTCGC GCTGCCAAGC TGGCACCAGC CGCAAGAGCA[0043] AGGGGGGTCT CAAGCCCGGC ACCCAGCGAG GCCATAACCT GACCGGCTCC[0044] AAGAACACCG GAGGTACTCG TCCAACTGGG CCGGCGCCGT GCCAT

[0045] 这些序列构成了SEQ ID No.1显示的DNA序列或如此序列的类似物。

[0046] 能够与SEQ ID No.2所示DNA序列类似物杂交的核苷酸探针

[0047] 可以是根据以下DNA序列之一或其组合制备：

[0048] (p1)CTGCTTCTCC TTCTCTTCCT

[0049] (q)CCTCGTGATA TCTGCTTGAA

[0050] (r)CATCTCCTCA TCATGGTCGT

[0051] (s)CCTCAACAAG GTGCAGCCTT

[0052] (t)CTTCTGGGTC TGACCACCGC

[0053] (u)CGCCACTGGT CCCCTGGCCG

[0054] (v)AGCCGCAGGC TTCTGTCCGG

[0055] (w)TCAAGAACTT CTCCGTCAAG

[0056] (x)CAGGTCGAGA AGGCGGGCAG

[0057] y)CAAGGGACGT ACCGTTAACC

[0058] (z)TGCCGGGTCT GTATGCGAAT

[0059] (aa)GCGCTGGCCA AGTATGGCGC

[0060] (bb)CCAGGTGCGG CCAGCGTCAA

[0061] (cc)GGCCGCCGCC GTCAGTGGCA

[0062] (dd)GCGTCGTGAC CACCCGCAGG CCAACGACG

[0063] (ee)CTGCTTCTCC TTCTCTTCCT CCTCGTGATA TCTGCTTGAA CATCTCCTCA[0064] TCATGGTCGT CCTCAACAAG GTGCAGCCTT CTTCTGGGTC TGACCACCGC[0065] CGCCACTGGT CCCCTGGCCG AGCCGCAGGC TTCTGTCCGG TCAAGAACTT[0066] CTCCGTCAAG CAGGTCGAGA AGGCGGGCAG CAAGGGACGT ACCGTTAACC[0067] TGCCGGGTCT GTATGCGAAT GCGCTGGCCA AGTATGGCGC CCAGGTGCGG[0068] CCAGCGTCAA GGCCGCCGCC GTCAGTGGCA GCGTCGTGAC CACCCGCAGG CCAACGACG[0069] 这些序列构成SEQ ID No.2显示的DNA序列或如此序列的类似物。

[0070] 本发明中的DNA序列可以通过有关的一般方法分离出。

[0071] -在合适的载体中克隆来自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)中的DNA文库，[0072] -用所述的载体转化合适的酵母宿主细胞，

[0073] -在合适的条件下培养宿主细胞以表达由DNA文库中克隆所编码的感兴趣的酶，并且

[0074] -通过测定由这些克隆所产生的酶的蛋白酶活性来筛选阳性克隆。

[0075] 有关此筛选方法的更详细的描述在下面的实施例1和WO 93/11249中给出了，其内容在此列入仅供参考。

[0076] 例如编码此酶的DNA序列可以通过筛选 棘孢曲霉-和CBS 101.43菌株，它可公开地从the Centraalbureau voor Schimmel-cultures，Delft，NL得到-的cDNA文库和选择能表达适当酶活性的克隆而分离出(此酶活性如所定义的，也即酶水解蛋白质和肽中的肽键的能力)。因而合适的DNA序列可以通过标准方法从克隆中分离出，正如实施例1中所描述的。

[0077] 可期待的是，编码同源酶的DNA序列，即同源DNA序列可以类似地通过筛选另一微生物尤其是真菌的一个cDNA文库而得到，例如另一种曲霉属菌株尤其是棘孢曲霉或黑曲霉菌株，或者一种木霉属之种(Trichodermasp.)菌株，尤其是T.harzianum或者T.reesie菌株，或者一种镰孢属之种(Fusarium sp.)菌株，尤其是尖镰孢(F.oxyssporum)菌株，或者一种根霉属之种的菌株，例如雪白根霉菌株，或者一种Schytalidiumsp.菌株，或者一种腐质霉属之种(Humicola sp.)菌种。

[0078] 另一选择是，与众所周知的程序一致，本发明的DNA序列可以方便地利用在此说明书中的DNA序列基础上制备的人工合成的寡聚核苷酸探针从合适的生物体的DNA中分离出来。例如，合适的寡聚核苷酸探针可以在上面所示的核苷酸序列之一的基础上制备。

[0079] 随后，该DNA序列可以被插入到重组表达载体中。这可以是任何方便地适于重组DNA程序的载体，并且载体的选择常常依赖于被引入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即以染色体外的实体形式存在并且其复制不依赖于染色体而复制的载体，例如质粒。该载体也可以是当被引入宿主细胞时会整合到宿主细胞基因组中并且随着被整入染色体的复制而复制的载体。

[0080] 在载体中，编码蛋白酶的DNA序列应该合并地连接到一个合适的启动子和终止子序列上。启动子可以是任一在选用的宿主细胞中显示转录活性并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因中得到的DNA序列。分别把编码蛋白酶的DNA序列、启动子和终止子连接起来并把它们插入到合适的载体中的程序是为本领域的技术人员所熟悉的。(例如，参见Sambrook等的分子克隆，一本实验手册，Cold Spring Harbor，NY，1989)。被转化编码本发明酶DNA序列的宿主细胞最好是真核细胞，尤其是真菌细胞例如酵母或丝状真菌细胞。特别地，该细胞可以属于曲霉属的一个种，最好是

[0081] 米曲霉或黑曲霉。真菌细胞可被如下有关过程转化：形成原生质体并转化原生质体，然后以本质上已知的方式再生细胞壁。使用米曲霉作为宿主微生物的方法在EP238 023(在Noro Noridisk A/S中)描述过。其内容在此列入仅供参考。宿主细胞也可以是酶母细胞，例如一种酵母属(Saccharomyces)菌株尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁弗酵母(Saccharomyces Kluyveri)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)，一种裂殖酵母属之种(Schizosaccaromyces sp.)菌株例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，一种汉逊酵母属之种(Hansenula sp.)菌株，毕赤酵母属之种(Pichiasp.)菌株，Yarrowia sp.菌株如Yarrowia lipolytica，或者克鲁维酵母属之种(Kluyreromyces sp.)菌株如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

[0082] 再者，本发明是关于生产具有蛋白酶活性的酶的一种方法，其中被转化编码该酶的本发明吉DNA构建体的合适的宿主细胞是在允许该酶的产生条件下得到培养，并从培养基中回收产生的酶。

[0083] 被用来培养被转化的宿主细胞的培养基可以是适于所研究的宿主细胞生长的任何常规培养基。表达的蛋白酶可以主便地分泌到培养基中并且可以从那通过已知的操作程序回收，这些程序包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞、利用如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质成份、然后再进行层析，如离子交换层析、亲和层析或类似的过程。

[0084] 本发明中的酶

[0085] 本发明中的蛋白酶(如对过氧化氢稳定的蛋白酶或者对肽键赖氨酸-酪氨酸或苯丙氨酸-缬氨酸具有专一性的蛋白酶)的活性范围在pH值为2-7为好，例如在pH值小于6.0，再如在pH值2-6，并且大多数情况下在pH4-6范围内更好。

[0086] 可以理解，两种酸性蛋白酶在0.01-5％的过氧化氢，如0.1-5％、0.5-4％、1-4％或2-3％的过氧化氢存在的条件下具有活性，并且它们可应用于隐形眼镜的清洗。

[0087] 本发明中对过氧化氢稳定的蛋白酶的一个优选实施例是被SEQID No..1所示DNA序列或者上述的与其具有至少80％同源性的同源序列所编码的酶。

[0088] 本发明中对赖氨酸-酪氨酸或苯丙氨酸-缬氨酸具有专一性的蛋白酶的优选实施例是被SEQ ID No..2所示序列或上述的与其至少具有80％同源性的同源序列所编码的酶。

[0089] 本发明中的酶更好地是与针对来自棘孢曲霉，CBS101.43并且被SEQ ID No..1或No..2所示的DNA序列所编码的纯化蛋白酶而培育的抗体具有免疫反应。本文中术语“来自”不仅指蛋白酶由CBS 101.43菌株产生，而且指蛋白酶被从CBS 101.43菌株分离的DNA序列所编码并且在被转化了该DNA序列的宿主体中产生。

[0090] 尽管本发明中对过氧化氢稳定的蛋白酶和对赖氨酸-酪氨酸或苯丙氨酸-缬氨酸有专一性的蛋白酶都是从真菌种棘孢曲霉

[0091] 中的一种菌株中获取，但是要考虑到这些酶也可以从其它生物体，尤其是微生物中获取。

[0092] 因此，本发明中的酶最好从细菌中或真菌如曲霉属、根霉属、木霉属(如T.reesei或T.harzianum)、青霉属、镰 孢属、Schytalidium或腐质霉属( 如H.insolens或H.lanuginosa)等菌株或者芽孢杆菌属菌株中获取。

[0093] 曲霉属之种的例子包括黑曲霉、米曲霉或棘孢曲霉如棘孢曲霉CBS 101.43。

[0094] 再者，本发明是关于一种用来降解或修饰包括材料的蛋白酶的酶制品，该酶制品经浓缩而富含上述具有蛋白酶活性的酶。

[0095] 已被浓缩而富含本发明酶的酶制品可以含有多种酶活性，尤其是含有多种降解植R R物细胞壁的酶如Pectinex、Pectinex Ultra SP、Gamanase、Celluclast、纤维素水解酶或R R R
者蛋白酶和/或者含外肽酶的酶制品如Neutrase、Alcalase 或者Havourzyme(这些都可从Novo Nordisk A/s获取)。在本文，术语“浓缩而富含”是指酶制品的蛋白酶活性已经增强了，如具有至少1.1的浓缩因子，这可方便地加入经上述方法制备的本发明酶的加入而达到。

[0096] 作为选择富含具有蛋白酶活性的酶的酶制品可以是含有作为主要酶成份的本发明中的一种酶，如单一成份酶制品。

[0097] 酶制品可以根据本领域中已知的方法制备而且可以制成液体形式干制品。例如，酶制品可制成颗粒状或微小颗粒状。酶制品所含的酶可以根据本领域已知的方法而稳定化。

[0098] 根据本发明而得的酶制品可以作为用来降解或改变植物细胞壁的试剂。象伸展蛋白之类的某些蛋白是组成植物细胞壁的成份。蛋白酶因而会加速植物细胞壁的降解和改变。象这样的含蛋白酶的植物细胞壁降解酶制品能应用于许多不同的方面，如林橄榄和油菜之类的植物材料中提炼油或者从不同水果如苹果、梨、柠檬等中生产果汁。

[0099] 酶制品另外还可含有一种或多种其它降解植物细胞壁的酶，如pectin lyase、pectate lyase、endoglucanase、arabinanase、xylanase、glu-canase、galactanase、mannanse、α-galactosidase、rhamnogalacturonase、pectin acetylesterase.polygalacturonase、蛋白酶、肽链端解酶或果胶甲基酯酶。酶制品甚至可以含有一种或多种具有针对上述内切酶所起作用的底物而起作用的外切酶活性的酶。根据本发明，蛋白酶在与许多其它细胞壁降解酶起作用的相同的pH值和温度条件下起作用，因而特别适用于上面应用。

[0100] 其它酶也通过曲霉属，最好是黑曲霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉或米曲霉或者木霉属的微生物生产出来。

[0101] 本发明的酶制品也可在酿酒工业中被用来防止酒霾或者溶解酒霾，因为蛋白质常参与讨厌的酒霾的形成。本发明的蛋白酶在发酵和成酒的条件下具有活性，因而在此方面特别有用。

[0102] 本发明中的酶或酶制品可应用于烤制行业中如用来弱化面粉中的面筋成份以便从所谓的硬面粉中得到软化面粉。软化面粉在需具有很大伸展性但无弹性的生粉制作中是重要的，例如在对外烤制品、饼干和其它在运输和烤制中必须保持其本来形状的产品等的制作中。本发明蛋白酶优选地被通常用来软化面粉的试剂如焦亚硫酸钠(SMS)，作为理想的选择。因为SMS对健康有潜在的危害性，SMS的使用被认为是不理想的。

[0103] 蛋白酶制品也可在食品和饲料工业中被用来提高蛋白质的可消化率。例如，酶或酶制品可被加入动物饲料中或者被用来加工动物饲料，尤其是仔猪或禽类饲料。因而，饲料成份的可消化率可被提高，进而动物的生长速度和其对饲料的利用效率都被提高。参见Brenes等(1993)。

[0104] 而且，本发明的酶或酶制品可用来从蔬菜蛋白如大豆、花生、羽扇豆或油菜籽蛋白、牛奶如酪蛋白、肉蛋白或鱼类蛋白等中制作蛋白水解产物。蛋白酶可被用来制作蛋白水解产物以便提高可溶性、稠度、口味或发酵能力，降低抗原性，或因其它目的而制作食品、饲料或医用产品。本蛋白酶可单独使用，也可与其它蛋白酶或象外肽酶之类的其它酶共同使用。本发明的蛋白酶与富含外肽解酶的酶制品共同使用会提高蛋白质水解产物的品味。

[0105] 本蛋白酶制品也可用来改变蛋白质，如减少全部或部分由蛋白质引起的粘性。这种粘性问题已闻名于对象大豆、花生之类的植物材料所含蛋白质的加工行业中。

[0106] 甚至，本酶或酶制品可用于对鱼肉或兽肉的加工中以改变其结构和/或者粘性。

[0107] 本蛋白酶制品也可用来加速发酵过程，例如为了生产啤酒而对大麦、麦芽及其它原料进行的酵母发酵。

[0108] 再者，本发明的酶或酶制品可用在制革工业中从毛皮中除毛。由于随后的鞣革是在酸性条件下进行，因此本蛋白酶的低最适pH值是一大优点。本蛋白酶制剂有助于从蛋白质中生产肽，在此它的优点是使用克隆的酶而不受其它蛋白水解活性的影响。

[0109] 而且，本蛋白酶制品能用于降解蛋白质以利于提高不同产品的纯度或质量，如提高guar gum、Xanthan gum之类橡胶的纯度和质量，给丝脱胶或者提高毛物质量。

[0110] 由于它们对过氧化氢的稳定性，本发明的两种蛋白酶在清洗隐形眼镜或其它涉及过氧化氢又必须去除含蛋白物质的应用方面都特别有用。

[0111] 针对以上各种用途，本发明的酶制品的使用量和其它使用条件可以在本领域已知方法的基础上确定下来。

[0112] 本发明也在进一步附图中加以描述，其中，

[0113] 图1分别说明了蛋白酶I和II的pH值活性曲线，

[0114] 图2分别为蛋白酶I和II的温度一活性曲线，

[0115] 图3和图4分别为蛋白酶I和II对pH值的稳定性曲线，

[0116] 图5和图6分别为蛋白酶I和II对温度的稳定性曲线，

[0117] 图7表示各种蛋白酶在隐形眼镜清洗中的作用，

[0118] 图8表示本发明的一种酶对面筋伸展的效应。

[0119] 在下列实施例中更为详细地加以描述了本发明，但无论如何，不只限于权利要求书的本发明范围。

[0120] 材料和方法：

[0121] 供体生物体：mRNA从 棘孢曲霉 CBS 101.43中分离，后者生长在常搅拌以保证足够氧气的含大豆的发酵培养基中。生长3至5天后收集菌丝体，立即在液氮中冰冻并保存于-80℃。

[0122] 酵母菌株：使用的 酿酒酵母 菌株是yNG231(MATalpha，leu2，ura 3-52，his +4-539，pep4-delta 1，Cir) 或 者 JG 169(MATα；ura 3-52；leu2-3，112；his 3-D200；
+
pep4-113；prc 1HIS 3；prb1 LUE2；cir)。

[0123] 质粒：含酵母TPI启动子的表达质粒pYH17是从市面上可买到的pYES II质粒(Invitrogen)中制备的。这种质粒及其构建在WO 93/11249中描述了，在此其内容列入仅供参考。

[0124] 曲霉表达载体pHD 414是质粒p775的衍生物(在EP 238 023中被描述)。pHD414还在WO 93/11249中被描述。pHD414含有A.-niger葡萄糖淀粉酶终止子和A.oryzae TAKA淀粉酶启动子。

[0125] 总RNA提取：先用硫氰酸胍(guanidinium thiocyanate)抽提，然后通过5.7M CsCl垫超速离心而得，这正如Chirgwin等，1979和WO 93/11249中所描述的一样。

[0126] poly(A)+RNA的分离：poly(A)+RNA是经寡聚dT-纤维素亲和层析(Aviv&Leder，1972)而分离出。典型地，0.2g寡聚dT纤维素(Boehringer Mannheim)预溶胀于10ml lx柱填充缓冲液(20mMTris-Cl，pH7.6，0.5M NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)中，装入经DEPC处理的、塞好的塑料柱(Poly Prep层析柱，Bio Rad)并用20mllx填充缓冲液平衡。总RNA在65℃加热8分钟，在冰上冷却5分钟，加入1体积2X柱填充缓冲液到RNA样品中后装入柱中。收集洗脱物并重装2-3次，但装样前要象上面一样给样品加热并在冰上冷却。寡聚dT柱先用10体积lX填充缓冲液，再用了体积培养基盐缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.6，0.1M NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)洗，然后用3体积洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl，pH7.6，1mMEDTA，+
0.05％SDS)洗脱poly(A)RNA，预热至+65℃，每次收集500μl洗脱物。测定每次收集的洗脱物的OD260值，将各次含mRNA洗脱物合并并且在-20℃用乙醇沉淀12小时。离心收集+
poly(A)RNA，重新悬浮于DEPC-DIW中并以5-10μg等分试样形式在-80℃贮存。

[0127] Northern印迹分析：从各种菌丝体分离的poly(A)+RNA(5μg/样品)在1.2琼脂糖-2.2M甲醛胶(Sambrook等，1989)中电泳，并以10XSSC(Sambrook等，1989)作为转移缓冲液将其印迹到尼龙膜(Hybond-N，Amersham)上。在各次杂交中使用了三种随机引32
物(Feinberg和Vogelstein，1983) P-标记的cDNA探针：1)来自棘孢曲霉的多聚半乳糖苷酶I的1.3kb的Not I-SpeI片段，2)来自棘孢曲霉编码葡萄糖内切酶I的1.3kb Not i-Spe片段，3)来自棘孢曲霉编码半乳聚糖酶I的1.2kb Eag I片段。Northern杂交是在
5XSSC(Sambrook等，1989)、5X Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS(W/V)和
100μg/ml变性鲑精子DNA中与浓度为Ca.2ng/ml的探针在65℃杂交16小时，在65℃杂交16小时，在65℃用5XSSC漂洗二次，每次15分钟，在2XSSC、0.5％SDS中漂洗一次30分钟，在0.2XSSC、0.5％SDS中漂洗一次30分钟，再用5XSSC漂洗2次每次15分钟。在-80℃放射自显影12小时，之后根据制造商的说明书将1号探针从滤膜上除掉，重新与2号探针杂交，最后与3号探针杂交。以来自Bethesda研究实验室的梯度RNA作为分子量大小标记物。

[0128] cDNA合成：

[0129] 第一条链的合成：使用发夹修饰用RNA聚合酶H方法(Gubler和Hoffman +1983，Sambrook等1989)从5μg来自棘孢曲霉的poly(A)RNA中合成双链cDNA。
+
poly(A)RNA(5μg溶于5μlDEPC处理过的水中)在70℃加热8分钟，在冰上冷却，然后与如下试剂混合，最终体积为50μl：含有1mM每种dNTP(Pharmacia)的逆转录酶缓冲液(50mM Tris-Cl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mMDTT、Bethesda研究实验室)、40单位的人胎盘核糖核酸酶抑制因子(RNasin，Promega)、10μg位寡聚(dT)12-18引物(Pharmacia)和1000单位SuperScript II RNase H-逆转录酶(Bethesda研究实验室)。反应混合物在
45℃保温1小时即可合成第一条链cDNA。

[0130] 第二条链的合成：待合成后，加入30μl 10mM Tris-Cl、pH 7.5、1mM EDTA，加入40μg糖原载体(Boehringer Mannbeim)、0.2体积10M NH4Ac和2.5体积96％EtoH(乙醇)让mRNA：cDNA杂交分子经在-20℃乙醇沉淀12小时。离心回收杂交分子，用70％的乙醇洗涤，干燥，并且重悬浮于含有100μM各种dNTP、44单位大肠杆菌DNA聚合酶I(Amersham)、
6.25单位核糖核酸酶H(Bethesda研究实验室)和10.5单位大肠杆菌DNA连接酶(New EnglandBiolabs)的250μl第二条链缓冲液(20mM Tris-Cl、pH7.4、90mM KCl、4.6mM +
MgCl2、10mM(NH2)2SO4，16μM BNAD)中。在16℃将上述反应管温育3小时，加入EDTA使终浓度为20mM就可中止反应，然后用酚抽提即可合成第二条链cDNA。

[0131] Mung菜豆核酸酶处理：加入2体积96％乙醇、0.1体积3MNaAc、pH5.2，在-20℃用乙醇沉淀双链cDNA 12小时，经离心回收，70％乙醇洗涤，干燥(真空干燥)，并重新悬浮于30μl Mung菜豆核酸酶缓冲液(30mM NaAc、pH4.6、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT，2％甘油)内含36单位Mung菜豆核酸酶(Bethesda研究实验室)中。将该反应物在30℃温育30分钟，然后经加入70μl10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTA、酚抽提物，并用2体积96％乙醇、0.1体积3M NaAc、pH5.2在-20℃下乙醇沉淀12小时，这样就可对单链发夹DNA进行修剪。

[0132] 用T4DNA聚合酶平末端化：将含有0.5mM各种dNTP和7.5单位T4DNA聚合酶(Invitrogen)的50μl T4DNA聚合酶缓冲液(20mMTris-乙酸、pH7.9、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT)于+37℃温育反应混合物15分钟，就可将双链cDNA平末端化。加EDTA使最终浓度为20mM即可终止反应，然后用酚抽提和乙醇沉淀。

[0133] 连接接头的连接和大小筛选：将含有600pmol BstX I连接接头和含5单位T4连接酶(Invitrogen)的30μl连接缓冲液(50mM Tris-Cl、pH7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、25μg/ml小牛血清蛋白质)在+16℃温育12小时，在此填充反应之后，cDNA就被连接到非回文的BstX I接头(1μg/μl，Invitrogen)上。在+70℃加热5分钟使反应终止，用琼脂糖胶(0.8％HSB-琼脂糖，FMC)电泳将被连接的cDNA按大小分开以便分离没有连接上的接头和小的cDNA。切T.0.7kb对cDNA进行大小筛选，并在10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTA中，100伏将琼脂糖胶电洗脱1小时，用酚抽提并同上面一样于-20℃经乙醇沉淀12小时。

[0134] cDNA文库的构建：被连接的双键cDNA经离心回收、用70％乙醇洗涤并重新悬浮于25ml DIW中。在大规模文库连接之前，4种检测连接在各含如下物质的10μl连接缓冲液(同上)中进行：每种含1μl双链DNA(1-3号反应管)、2单位T4连接酶(Invitrogen)和50ng(1号管)、100ng(2号管)和200ng(3号和4号管)BstXI切割的酵母表达载体(或Invitrogen的PYES 2.0载体或yHD17)。将上述反应物在+16℃温度12小时，在70℃加热五分钟即完成连接反应，1μl各种连接液经电穿孔(200Ω，2.5KV，25μF)进入40μl感受态大肠杆菌1061细胞(OD600＝0.9，每升LB-broth，在冷DIW中洗二次，20ml 10％甘油中洗一次，重悬于2ml 10％甘油)。在每种转化混合物中加入1ml SOC后，让细胞在+37℃生长1小时，取50μl涂市于LB+ampicillin平板上(100μg/ml)并在+37℃生长12小时。

[0135] 使用上述实验中的最佳条件，大量连接在含有9单位T4连接酶的40μl连接缓冲液中进行，并且反应液在+16℃温育12小时。在70℃加热5分钟以终止连接反应，在-20℃经乙醇沉淀12小时，经离心回收并重悬于120μl DIW中。使用同上的电穿孔条件将1μl分装的各样品转化到电感受态的大肠杆菌1061细胞中，测定转化细胞的滴度并将文库涂布于LB+ampicillin平板上(5000-7000c.f.u./平板)。每个平板加3ml培养基。到下细菌，加1ml甘油并一起在-80℃贮存作为贮存库。余下的2ml用作DNA分离。如果DNA的数量不足以产生所需数量的酵母转化体，大量DNA从已接种上50μl-80℃贮存的过夜繁殖了的细菌贮存液的500ml培养基(TB)中制备。

[0136] 酵母文库的构建：为了保证所有细菌克隆在酵母中被检测，酵母转化体的数量要五信倍于原库中的细菌克隆数，以此作为最低限度。

[0137] 来自贮备库中的各1μl分装的纯化的质粒DNA(100mg/μl)经电穿孔转化(200Ω1，.5KV，25μF)gc 40μl感受态S.cerevisiae JG 169细胞中(OD600＝1.5，每500ml YPD，在冷DIW中洗二次，在冷的1M山梨醇中洗一次，重悬于0.5ml 1M山梨醇中，Becker和Guarate，1991)。加入1ml 1M冷的山梨醇后，80μl分装的样品辅板于SC+葡萄糖-尿嘧啶培养基上以达到250-400c.f.u/板，并在30℃培育3-5天。

[0138] 在曲霉菌中表达的cDNA基因的分离：一个或多个产生蛋白酶的菌溶接于20ml含YNB-1肉汤培养基的50ml玻璃试管中。在30℃摇荡2天。以3000rpm离心10分钟收集细胞。

[0139] 细胞被重悬于1ml 0.9M山梨醇、0.1M EDTA、pH7.5的溶液中。将其沉淀物转移到一个Eppendorf管中，全速旋转30秒。将细胞沉淀重悬于0.4ml 0.9M山梨醇、0.1M EDTA、14mMβ-巯基乙醇中。加入100μl 2mg/ml Zymolase将其在37℃温育30分钟并离心30秒。
沉淀物(球芽)被重悬于0.4ml TE中。加入90μl溶液(1.5ml0.5M EDTA pH8.0、0.6ml
2M Tris-Cl pH8.0、0.6ml 10％SDS)并在65℃温育30分钟。加入80μl 5M KOAc并冰育至少60分钟，全速离心15分钟。将上清液转移到装满乙醇(室温)的新试管中，然后轻轻地使其充分混匀，离心30秒。用70％的冷乙醇洗涤沉淀，离心30秒并在室温下干燥。将沉淀重悬于50μl TE中并离心15分钟。将上清转移到一新试管中。加入2.5μl 10mg/ml的核糖核酸酶，然后在37℃温育30分钟并缓缓加入500μl异丙醇，轻轻将其混匀。离心30秒，弃去上清。用96％乙醇洗涤沉淀并于室温干燥。该DNA溶于50μl水中使其终浓度约为100μl/ml。

[0140] 米曲霉或黑曲霉的转化(一般步骤)：

[0141] 在100ml YPD(Sherman等，酵母遗传学方法，冷泉港实验室，1981)中接种上A.oryzae或A.niger的孢子并在37℃摇荡培育约2天。用细布(miracbth)过滤收集菌丝体并用200ml 0.6M MgSO4洗涤。将菌丝体悬浮于15ml1.2M MgSo4、10mM NaH2PO4、pH＝5.8R溶液中。将悬浮在冰上冷却，加入1ml含有120mg Novozym 234、批号1687的缓冲液。5分钟后，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma型号H25)并在37℃下轻轻摇荡温育1.5-2.5小时，直至经检查的样品在显微镜下可见到大量原生质体。

[0142] 用细布过滤悬浊液，将滤液转移到一个灭菌过程的试管中并加上一层5ml 0.6M山梨醇、100ml Tris-Cl、pH＝7.0。在100g离心15分钟，收集MgSO4上层的原生质体。加工体积的STC(1.2M山梨醇、10mM Tris-HCl、pH＝7.5、10mM CaCl2)于原生质体悬浮液中并在1000g离心5分钟。将原生质沉淀重悬于3ml STC并重新离心沉淀，再重复一次。最后将原生质体悬浮于0.1-2ml的STC中。

[0143] 100μl原生质体悬液与含有5-25μg合适DNA的10μl STC相混合。原生质体与p3SR2(一种携带构巢曲霉amds基因的质粒)相混合。混合物于室温放置25分钟。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH29576)、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH＝7.5的溶液并仔细混匀(2次)，最后加入0.85ml如上溶液并仔细混匀。混合物在温室放置25分钟、2500g离心15分钟并将沉淀重悬于2ml 1.2M山梨醇中。再沉淀一次后，涂布原生质体于合适的平板上。原生质体被涂布于含有1.0M蔗糖、pH7.0、10mM作为氮源的乙酰胺和20mM用来抑制背境生长的氯化铯的小平板上[Cove Biochem.Biophys.Acta113(1966)51-56]。于37℃培育4-7天后，收集和涂市孢子以获取单菌落。重复此步骤并将第二次重复分离后的单菌落孢子作为指定的转化体而贮存起来。

[0144] 免疫交叉反应：利用纯化的蛋白酶可制备用来检测免疫交叉反应的抗体。更具 体 地，根 据N.Axelson等 在 A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，第二十三章或者A.Johnstone或R.Thorpe的Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications，1982( 尤 其第27-31页)中所描述的步骤，抗本发明蛋白酶的抗血清可经免疫兔(或其它啮齿动物)培育出。从这些抗血清中可获取纯化免疫球蛋白，例如通过盐沉淀((NH4)2SO4)，然后经透析和离子交换层析如DEAE-葡聚糖层析等制备。可通过如下方法之一来分析蛋白的免疫化学特性：Outcherlony双扩散分析法[0.Ouchterlony：Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir编辑)，Blackwell Scientific Publications，1967，第655-706页]、交叉免疫电泳法(N.Axelsen等，同上，第3、4章)和火箭免疫电泳法(N.Axelsen等，第2章)。

[0145] 培养基：

[0146] YPD：10g酵母提取物、20g胰蛋白胨、加水至810ml，高压灭菌，加入90ml 20％葡萄糖(灭菌过滤)。

[0147] 10X基础盐：66.8g酵母氮基质、100g琥珀酸、60g NaOH、加水至1000ml，灭菌过滤。

[0148] SC-URA：90ml 10X基础盐、22.5ml 20％酪蛋白氨基酸、9ml1％胰蛋白胨、加水至806ml、高压灭菌、加3.6ml 5％苏氨酸、和90ml 20％葡萄糖或者20％半乳糖。

[0149] SC-H肉汤培养基：7.5g/l无氨基酸的酵母氮基质、11.3g/l琥珀酸、6.8g/l NaOH、5.6g/l无维生素的酪氨酸、0.1g/l胰蛋白胨。在121℃高压灭菌20分钟。高压后每100ml培养基中加入10ml 30％半乳糖溶液、5ml 30％葡萄糖溶液和0.4ml 5％苏氨酸溶液。

[0150] SC-H琼脂：7.5g/l去氨基酸的酵母氮基质、11.3g/l琥珀酸、6.8g/l NaOH、5.6g/l无维生素的酶氨酸、0.1g/l胰蛋白胨和20g/l琼脂(Bact)。于121℃高压灭菌20分钟。高压后，每450ml琼脂加入55ml 22％半乳糖溶液和1.8ml 5％苏氨酸溶液。

[0151] YNB-1琼脂：3.3g/l KH2PO4、16.7g/l琼脂、调pH值至7.0，在121℃高压灭菌20分钟。高压后，每450ml琼脂胶加入25ml13.6％无氨基酸的酵母氮基质、25ml 40％葡萄糖溶液、1.5ml 1％L-亮氨酸溶液和1.5ml 1％组氨酸溶液。

[0152] YNB-1肉汤：组成同YNB-1琼脂一样，但无琼脂。

[0153] FG-4-琼脂：35g/l琼脂、30g/l大豆粉、15g/l麦芽糖糊精(Glucidex 6)、5g/L细菌蛋白胨、pH7.0，在121℃下高压灭菌40分钟。

[0154] FG-4培养基：30g/L大豆粉、15g/L麦芽糖糊精(Glucidex 6)、5g/L细菌蛋白胨。在121℃高压灭菌40分钟。

[0155] MDU-2培养基：45g/L麦芽糖、1g/L MgSO4·7H2O、1g/L NaCl、2g/L K2SO4、12g/L KH2PO4、0.1ml/L Pluronic 61L、0.5ml/L微量金属溶液，pH5.0，在121℃高压灭菌20分钟高压后加入15ml/L 50％灭菌过滤的尿素。

[0156] 酪蛋白薄胶：1％琼脂糖、0.5％的溶于pH值为5.5缓冲液中的酪蛋白。将胶煮沸，冷却至55℃，再将薄胶倒在琼脂平板上。

[0157] 原料批量发酵

[0158] 从A.Oryzae获取蛋白酶I和II的原料批量发酵所用的培养基是由作为碳原的麦芽糖糊精、作为氮源的尿素和酵母提取物组成。

[0159] 原料批量发酵是这样进行的：把一摇瓶有关米曲霉宿主细胞的培养物接种在含有3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中。在pH5.0和34℃条件下培养，每24小时后重新补充碳源和氮源。以碳源作为限制因子而保证氮的充分供应。原料批量培养持续4天之后即可回收所需酶。

[0160] 酶的特性

[0161] 蛋白水解活性

[0162] 1个血红蛋白酶单位(hpu)是指在如下描述的标准条件下释放1毫摩尔基本氨基(通过与丝氨酸标准比较来测定)所需的酶量：

[0163] 用Britton和Robinson在J.Chem.Soc，1931中第1451页所描述的通用缓冲液调节pH值至5.5从而制备2％(W/V)血红蛋白(牛的，由Sigma供应)溶液。将2ml底物溶液在25℃水浴预培育10分钟，相应加入1ml含6g/ml酶制品的酶溶液-于约0.2-0.3hpu/ml通用缓冲液(pH5.5)。在25℃培育30分钟后，加入一种冷却剂(将5ml含17.9克三氯乙酸、29.9克乙酸钠和19.8克乙酸的溶液，用去离子水稀释至500ml)终止反应。空白对照溶液的制备与检测溶液基本一致，只是要先加冷却剂再加酶溶液。将反应物在水浴中保持20分钟。此后用Whatman 42滤纸过滤。

[0164] 基本氨基可通过它们与O-phthaldialdehyde(OPA)的颜色反应来测定。方法如下：将7.62克disodium tetraborate decahydrate和2.0克Sodium dodecylsulfate溶于150ml水中。同时加入溶于4ml甲醇的160mg OPA溶液和400μlβ-巯基乙醇，之后加水至200ml。每3mlOPA反应物加入400μl上面所获的滤液，混匀。约5分钟后测定340nm处光密度(OD)。OPA检验也可在含10mg苏氨酸的100ml通用缓冲液(pH5.5)制成的苏氨酸标准液中进行。不含苏氨酸的通用缓冲液用作空白对照。根据如下公式，蛋白酶的活性可由OD测量值算出：

[0165] hpu/每毫升酶溶液：

[0166] hpu/每克酶制品＝hpu/ml∶b

[0167] 其中，OD1、OD6、ODser和ODB分别是检测溶液、对照溶液、丝氨酸标准液和缓冲液的光密度值，Cser是标准液中丝氨酸浓度(mg/ml)(在此处为0.1mg/ml)，MWser是丝氨酸的分子量(105.0g)，Q是酶溶液的稀释因子(在此处为8)，而ti是培养时间的分钟数(在此为30分钟)。

[0168] 抑制

[0169] 检测下列抑制因子：

[0170] Pepstatin(天冬氨酸抑制因子)(1mM)PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制因子)(0.1％)[0171] PEFABLOC(丝氨酸蛋白酶抑制因子)(0.1％)

[0172] EDTA(金属蛋白酶抑制因子)(0.1M)

[0173] PEFABLOC可从Pentapharm，Basel，瑞土买到，其它的都可以Sigma公司买到。

[0174] 残余活性可通过pH5.5下的HPU/L来测定。

[0175] pH值活性曲线是由不同pH值下的HPU/L值来确定。

[0176] 对pH值的稳定性是按下方式测定：在50℃和各种不同pH值(4-5-6-7-8)下分别让酶溶液停留30分钟、60分钟和120分钟，并测定放置前后酶的水解蛋白质活性。

[0177] 温度活性曲线是由不同温度(15-70℃)下的HPU/l来确定。

[0178] 温度稳定性按如下方式测定：在pH值为5.0和各种不同温度下(25-40-50-60℃)分别让酶溶液(0.3HPU/l)放置30分钟、60分钟和120分钟，并测定放置前后其水解蛋白质活性。

[0179] SDS凝胶电泳和等电聚焦是根据制造商的说明书分别在8-25浓度梯度的来自Pharmacia公司的Phast系统和IEF 3-9上进行。

[0180] 专一性

[0181] 本发明蛋白酶的专一性按如下方式测定：

[0182] 0.5ml 1mg/ml人胰岛素或牛胰高血糖素的通用缓冲液，pH5.5(参考上文)分别和75μl的蛋白酶I和II(0.6hpu/l)的同样通用缓冲液溶液在37℃温育120分钟。加50μl
1N盐酸可使反应中止。

[0183] 人胰岛素分子或牛胰高血糖素被切为许多肽片段。利用合适的C-18柱(Hibar Lichrosorb RP-18，Merck AG，Darmstadt，FRG提供了5μm颗粒)反相HPLC分离提取各片段。这些片段可通过下列溶液：

[0184] A.0.2M硫酸钠和0.1M磷酸，pH2.5；

[0185] B.乙腈/水，50％；

[0186] 在从90％A/10B到80％A/20％B的线性梯度上先洗脱0-5分别再用80％A/20％B洗脱50分钟。使用Applied Biosystems(FosterCity，CA，USA)Model 470A气相测序仪通过自动Edman降解对分离提取的片段进行测序，并且这些乙内酰苯硫脲(PTH-)氨基酸再通过高效液相色谱进行分析，这正如L.Thim等的“通过转化酶母细胞分泌人胰岛素”，FEBS Letters 212(2)，1987，第307页所描述的那样，据此胰岛素或胰高血糖素分子的酶切位点加以确定。

[0187] 实施例1

[0188] 在150个库中构建了由大约1.5×106个单一克隆组成的A.ac-uleatus文库。

[0189] 从文库的20个单一克隆中分离DNA并分析其cDNA插入。发现插入频率＞90％且平均插入子大小大约为1400bp。

[0190] 将一些库中的DNA转化进酵母中，从每个库中获得含200-500个酵母菌落的50-100个平板。生长3-5天后，琼脂板复制涂布到几组琼脂板上。然后，一组平板在30℃培养2-4天并用一层酪蛋白覆盖凝胶覆盖以检测蛋白酶活性。30℃培养过夜后，鉴定蛋白酶阳性菌落，为被白色晕圈包围的菌落。

[0191] 涂布酶阳性菌落的细胞使在其琼脂上分布成单个菌落。挑选生产酶的单个菌落，用于鉴定每个生产蛋白酶的菌落。

[0192] 以单个菌落的形式获得阳性克隆，使用生物素标记的多聚接头引物直接从酵母菌落中扩增cDNA插入子，用磁珠(Dynabead m-280，Dynal)系统纯化，并使用链末端终止法(Sanger et al.，1977)和测序酶系统(United states Biochemical)分别对每个cDNA克隆的5’端测序来鉴定。两个酶基因的DNA序列分别在SEQ ID Nos.1和2中显示。

[0193] 接着，按上面所述分离用于在曲霉中表达的编码蛋白酶的cDNA并使用标准程序转化进大肠杆菌中。 每次转化中分离2个大肠杆菌菌落并用剪切DNA插入子的限制性酶Hind III和XbaI分析。将这些克隆中的一个的DNA重新转化进酵母菌株JG 169中。

[0194] 测定了几个阳性克隆的DNA序列。编码蛋白酶的2个DNA序列分别在SEQ ID Nos.1和2中显示。

[0195] 实施例2

[0196] 为了在曲霉中表达基因，使用上述程序，经用HindIII/XbaI或其它合适的限制性酶消化，在凝胶上进行大小分离和纯化从每个家族的一个或多个代表物中分离cDNA，接着连接到pHD414上，产生质粒pA1P1和pA1P2。在大肠杆菌中扩增后，根据上面所述的一般程序将质粒转化进米曲霉或黑曲霉中。

[0197] 米曲霉 转化子试验：

[0198] 将每个转化子接种到含FG-4琼脂的培养皿中央。30℃下培养5天后，用木栓旋孔装置从菌落中心取出4mm直径的琼脂栓，将琼脂栓包括于含0.5％酪蛋白和1％琼脂糖，溶于pH5.5的缓冲液中的酪蛋白覆盖凝胶中，40℃下培养过夜。按上面所述鉴定蛋白酶活性。有些转化子的晕圈明显要比 米曲霉 背景大。这证实了蛋白酶在 米曲霉 中的有效表达。
挑选具有最高蛋白酶活性的8个转化子并在YPG琼脂上接种和保存。

[0199] 分别将8个选出的转化子从YPG琼脂斜面接种到含FG-4和MDU-2培养基的500ml摇瓶中。充分搅拌以保证通气良好，发酵3-5天后，以2000g将培养液离心10分钟并分析上清液。

[0200] 从每份上清液中取15μl的体积加入在酪蛋白覆盖凝胶(25ml铺于13cm直径的培养皿中)上挖出的4mm直径的孔中。以培养后白色晕圈的形成来鉴定蛋白酶活性。

[0201] 饲养批量发酵：

[0202] 随后，使用上面所述的程序经过对表达酶的米曲霉进行饲养批量发酵来分别生产蛋白酶I和II。

[0203] 实施例3

[0204] 蛋白酶I和II的鉴定：

[0205] 从上面饲养批量发酵产生的上清液用于接上面材料和方法部分所述进行鉴定。使用上面所述程序在pH5.5的条件下测定蛋白水解活性(HPU/l)。

[0206] 抑制试验得到下面的结果：

[0207]

[0208] 胃酶抑制剂对蛋白酶II的抑制表明它是一种胃蛋白酶型天冬氨酸蛋白酶。蛋白酶I不受胃酶抑制剂的抑制，因此不能鉴定为天冬氨酸蛋白酶阳性。另一方面，它在pH5的最佳活性表明它是一种酸性蛋白酶。

[0209] 图1显示了pH活性曲线。可见两种酶都在pH5具有最佳活性，并且蛋白酶I比蛋白酶II在更窄的范围内有活性。因此，蛋白酶I在pH4-6的范围内表现出超过60％的活性，而蛋白酶II在pH4-7的范围内表现出超过60％的活性。

[0210] 以SDS凝胶分析分别估计了蛋白酶I和II的分子量，分别为23,000和37,000KD。经过IEF分析，估计两种酶的PI都大约为4。

[0211] 图2显示了温度活性曲线。两种酶非常相似，但最适温度略有区别、蛋白酶I为50℃，蛋白酶II为45℃。

[0212] 图3和4显示了pH稳定性。对于每个pH，假定零时活性为100％，因此获得的绝对值是不同的。两种蛋白酶在pH4和5都稳定，在pH6时，蛋白酶I不稳定，而蛋白酶II具有一定程度的稳定性(30分钟后保留40％的活性)。两种酶在pH7都不稳定。

[0213] 图5和图6显示了温度稳定性。对于每一温度、假定零时活性为100％，且获得的绝对值是不同的。两种蛋白酶在50℃仍稳定，但在60℃不稳定。

[0214] 根据蛋白酶I和蛋白酶II水解胰岛素和胰高血糖素获得的结果发现：蛋白酶II不与胰岛素反应，而两种蛋白酶都水解胰高血糖素。可得出结论：蛋白酶I是一种相当无特异性的蛋白酶，而蛋白酶II具有更高的特异性。发现蛋白酶II能分解在中胰高血糖素中发现的Lys-Tyr和Phe-Val键(这一序列见Bromer，Sinn，and Behrens，J.Amer.Chem.Soc.，Vol.79，P2807，1958)。

[0215] 实施例4

[0216] 本发明的蛋白酶用于降低粘度

[0217] 将大豆粉(脱脂和去皮的大豆制成)在95℃做成小球并随后磨碎。将大豆粉悬浮于去离子水中使含15％的干物质。向豆浆中分别加入5mg蛋白酶I的酶蛋白质/每克干物质和5mg蛋白酶II的酶蛋白质/每克干物质。豆浆在40℃和pH5-6的条件下培养。培养1，2和24小时后使用带转轴#31的小样品接合器在Brookfield LV DVIII粘度计上以250rpm测定豆浆的粘度。剩下的粘度如下：

[0218] 蛋白酶I 蛋白酶II

[0219] 1小时 73％ 47％

[0220] 2小时 59％ 38％

[0221] 实施例5

[0222] 本发明的蛋白酶用于清洁隐形眼镜

[0223] 在隐形眼镜清洁领域中，一般对隐形眼镜具有有效的清毒和清洁作用是必须的。消毒隐形眼镜最有效的方法之一是将它们浸入含3％H2O2，pH3.5的溶液中至少20分钟。在将透镜插入眼中前用例如过氧化氢酶或铂片中和H2O2。令人遗憾的是到现在为止没有令人感兴趣的商用蛋白酶在这些苛刻的条件下表现出有良好的效果，因此在H2O2中和后需要有较麻烦的第二步，即经加入蛋白酶来去掉隐形眼镜上的蛋白沉积物。猪胃蛋白酶优于目前使用的丝氨酸蛋白酶(Subtilisin carlsberg)。但讨厌的是病毒常与哺乳动物产物相联。

[0224] 分别试验了本发明的蛋白酶I和II在去掉隐形眼镜上的变性蛋白质方面的能力。将它们与目前所用的丝氨酸蛋白酶及猪胃蛋白酶进行了比较，尽管猪胃蛋白酶从技术前景上而不是商用前景上令人感兴趣。

[0225] 实验方案如下：

[0226] 材料：母鸡溶菌酶(Hen Lysozyme)、L-6878，来自Sigma；“Rythmic”隐形眼镜来自Essilor(II型透镜，高水，无离子)；蛋白酶I按上述生产；蛋白酶II按上述生产；猪胃蛋白R酶，P-6887来自Sig-ma；枯草杆菌蛋白酶carlsberg，清洁透镜蛋白酶(clear-Lens pro)(Novo Nordisk A/S)

[0227] 标准缓冲液：0.05M Na2HPO4，0.9％NaCl，pH7.5。

[0228] 试剂缓冲液：0.05M Na2HPO4，0.9％NaCl，3％H2O2，pH3.5。

[0229] 闪烁液：Optiphase“Hisafe III”。

[0230] 来自Sigma的母鸡溶菌酶通过还原甲基化用14C来标记并纯化。

[0231] 配制含0.05M Na2HPO4，0.9％NaCl和0.2mg/ml溶菌酶pH7.5的溶液。加入一定14
量的 C标记的溶菌酶，使CPM(每分钟计数值)大约为200,000。将1.0ml溶液转移到向烁玻璃管中，加入隐形眼镜并将玻璃管放入85℃水溶中处理30分钟。

[0232] 然后将隐形眼镜在3×3ml的试剂缓冲液中漂洗。用解剖刀将它切成四块，每块转移到含3ml试剂缓冲液的新闪烁玻璃管中。加入不同量的试验蛋白酶使终浓度为0.1，0.5，2.5，5，12.5，50和200μg酶蛋白/ml试剂缓冲液。

[0233] 反应在25℃进行超过4小时。在2×3ml标准缓冲液中清洗1/4的透镜。加入12ml闪烁液并在Packard 2500TR液闪计数器中测量CPM。

[0234] 每种蛋白酶需要4个透镜来评估：在2天内进行2次测量，每个透镜需要一个空白对照。

[0235] 计算质量相等的每个1/4块透镜中，在消毒/清洁过程中去掉的溶菌酶相对量。图7给出了不同蛋白酶的效果图。

[0236] 两种蛋白酶都非常适于隐形眼镜的清洁目的。发现蛋白酶I与其它蛋白酶相比非常优越。蛋白酶II的效果与猪胃蛋白酶非常相近，而目前使用的比氨酸蛋白酶表现出较差的效果。本发明的酸性蛋白酶的进一步的优势在于在泪液中发现的中性pH下活性较低。这降低了由于消毒/清洁后未完全洗净时透镜引起刺激的危险。

[0237] 实施例6

[0238] 本发明的蛋白酶在烘烤中的应用

[0239] 程序：

[0240] 向10克糕粉中加入5.9g水。水中含有不同浓度的蛋白酶I、蛋白酶II和RNeutrase(从Novo Nordisk A/S获得)。将生面在Glutamic22000混合器中混合一分钟。
然后将它放入塑料代中在32℃下温育25分钟。

[0241] 然后使用Glutamic混合器以2％NaCl(水溶液)洗涤生面以去掉淀粉并留下生面中的面筋。

[0242] 用手滚动面筋团直到匀质并将它压入一个大约0.5cm高、直径为2.5cm、中央有一孔的环形模子中。面筋团在25℃压30分钟使成形。接着，将面筋环悬挂在钩上并在孔中放入2g砝码。所有物质放入25℃的水下。

[0243] 然后每15分钟测量面筋环的伸展直到断裂。

[0244] 酶的用量根据Anson单位(AU)开始尝试为7.5mAU/kg粉，这一用量是NeutraseR的最佳剂量。(在用于测定蛋白水解活性的An-son-血红蛋白方法中，在温度为25℃、pH7.5，反应时间为10分钟的条件下消化变性的血红蛋白。用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白，用酚试剂测定TCA可溶性产物的量，酚试剂与酪氨酸和色氨酸产生蓝色。1AU是指以起始速率消化血红蛋白时每分钟释放的TCA可溶产品的量与酚试剂产生的颜色和1毫当量的酪氨酸相同时的酶量)。

[0245] 图8显示了不含酶和含有NeutraseR，蛋白酶I及蛋白酶II的面筋的伸长曲线。曲线意味着用相同剂量的酶测定6-7次，正如所见，所有3种蛋白酶的加入都导致面筋伸长得更快。

[0246] 7.5mAU/kg粉剂量的蛋白酶I使面筋脆弱的程度不及相同剂量的Neutrase R。在它断裂前，面筋环伸得更长且伸长速率较慢。

[0247] 2.3mAU/kg粉的蛋白酶II的加入(在这一系统中这是可能的最大量)使面筋脆弱R的程度几乎与7.5mAU/kg的Neutrase 一样。面筋断裂稍迟，且曲线的形状不同。这表明R
蛋白酶II在使面筋脆弱中，其以AU为基础的效力大约是Neutrase 的3倍。

[0248] 总之，对于通常用于使面筋脆弱的化学制剂(广泛使用的一个例子是SMS(Sodium netabisulphite))而言，本发明的蛋白酶是理想的选择。

[0249] 实施例7

[0250] 本发明的蛋白酶在动物饲料中的应用

[0251] 在下面所述条件下将基本上脱脂的饲料规格大豆与去离水混合。水解分两步进行以模拟胃和小肠的pH条件。比较了本发明的蛋白酶II与Bio-Feed Pro的效果，后者由Brenes等1993证突当用于烤焙饮食时引起重量收益改进和饲料效率提高。

[0252] 水解条件：

[0253] 水解混合物：70g基本上脱脂的大豆

[0254] 330g去离子水

[0255] 温度：40℃

[0256] pH：第一步4.0

[0257] 第二6.5

[0258] 时间：第一步180分钟

[0259] 第二步180分钟

[0260] 酶：第一步：I)胃蛋白酶1.92g(Merckart.7190)

[0261] II)I+Bio-Feed Pro 3.0L 5.5AU/kg大豆

[0262] III)I+蛋白酶II 0.19AU/kg大豆

[0263] 第二步：I)胰酶6g(Sigma P1750)

[0264] II)I+Bio-Feed Pro 3.0L 5.5AU/kg大豆

[0265] III)I+蛋白酶II 0.19AU/kg大豆

[0266] Bio-Feed ProR可从Novo Nordisk A/S获得。蛋白酶II按上面所述获得。

[0267] 酶在开始0分钟时加入。在水解过程中，随着反应的进程测定白利糖度(Brix)和渗透压。根据Adler-Nissen(1986)，渗透压值可用于以下面的等式计算水解程度(DH)：

[0268]

[0269] 其中Δ是渗透压mOSM的增加，s％是蛋白质浓度，ω是渗透压计的校准系数，htot是蛋白质底物中肽键的总数(mequv/g蛋白质)，fosm是将％转化为g/kg H2O的系数。

[0270]

[0271] 进一步分析了90分钟(第一步)和0.15和180分别(第二步)后水解混合物N-成份磺基水杨酸可溶相的平均分子量。用下面方法进行分子量分析：

[0272] 1.原理：

[0273] 样品经稀释，过滤并注射到液相色谱系统中，以凝胶透过色谱(GPC)的方式操作。这种分离技术使液体流过填有孔直径被精确限定的多孔颗粒的柱子。当具有不同分子大小的肽溶液通过柱时，小肽能流进孔中而大肽被孔排除。于是，由于大肽从柱中洗脱比小肽快，因此根据分子大小(和重量)将溶液中的肽分离。用检测器在柱的出口连续测量流出物，用具有已知分子量的肽来校准色谱系统。

[0274] 2.色谱装置

[0275] 2.1HPLC系统由下列部分组成：

[0276] 高压泵，WATERS M 510，流速为0.7ml/分钟。

[0277] 注射器，Waters WISP M 710

[0278] 检测器，Waters M 440，波长延伸到214nm。

[0279] 2.2.GPC柱，3×TSK G 2000SWXL，7.8mm×300mm，以一系列相连并在环境温度下操作。

[0280] 2.3.综合/数据处理，选择810/820GPC的Waters 820MAximASIM色谱数据系统。

[0281] 3.试剂

[0282] 3.1.磷酸盐缓冲液，NaH2PO4·2H2O

[0283] 3.2.氯化铵，NH4Cl

[0284] 3.3.三氟乙酸(TFA)，CF2COOH

[0285] 3.4：乙腈，CH2CN

[0286] 3.5移动相：

[0287] 0.05M磷酸盐缓冲液/含0.1％TFA和25％乙腈的0.5M氯化铵溶液。

[0288] 4.描述

[0289] 4.1.校准：

[0290] 经注射已知分子量的为数众多的多肽标准品的方法来校准色谱系统。给出每个标准品分子量对为从柱上洗脱该多肽观察到的所需移动相体积的半对数。经计算最小值平方计算最适第3项多项式。曲线代表校准曲线。

[0291] 4.2.分析

[0292] 样品稀释/溶解于移动相中达到大约5mg/ml。通过22μm滤膜过滤溶液并取20μl用于注射到色谱中。记录检测器读数与洗脱体积。记录的曲线(色谱图)表示了样品实际分子量的分布。为了便于计算(如计算累加的重量分布和平均分子量)，将色谱图分成小的时间(和洗脱体积)片段，每个片段的特征为具有洗脱体积和在该时间间隔内的色谱图面积。

[0293] 5.计算：

[0294] 以重量和数目平均分子量形式给出结果。

[0295]

[0296] 其中

[0297] Mw：重量平均分子量

[0298] Mn：数目平均分子量

[0299] Ai：每片段色谱图的面积，以在每段时间间隔内累加的检测器读数来测量[0300] Mw.i：每个片段相应的分子量。以校准曲线的方法使用该时间间隔内的平均洗脱体积来计算该值。

[0301] 结果：

[0302] OBrix，mOSM和％DH的值在下面表中列出：

[0303]

[0304]

[0305]

[0306]

[0307] 下面列出了分子量分析的结果：

[0308]

[0309] 由于未消化的大豆蛋白质在pH6.5的可溶性比在pH4.0时更强，因此当pH调到6.5时表观分子量增加。

[0310] 可见蛋白酶II与Bio-Feed Pro相比释放更多的蛋白质和多肽，并降解更多的蛋白质，因此可得出结论：蛋白酶II优于Bio-FeedPro。

[0311] 由于本发明的蛋白酶II在酶性pH范围具有最佳活性，因而该酶在动物胃中已开始作用，因此当它用于幼年动物饲料中时，与Bio-Feed Pro相比会使饲料效率得到综合提高。上面结果证实了这一结论。

[0312] 序列描述

[0313] (1)一般资料

[0314] (i)申请人：

[0315] (A)姓名：NOVO NOROISK A/S

[0316] (B)街道：NOVO Alle

[0317] (C)城市：Bagsvaerd

[0318] (E)国家：丹麦

[0319] (F)邮编(邮编号)：DK-2880

[0320] (G)电话：[phone]

[0321] (H)电传：[phone]

[0322] (I)电报：37304

[0323] (ii)发明题目；棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)蛋白酶

[0324] (iii)序列数：2

[0325] (iv)计算机可读形式

[0326] (A)媒体类型：Floppy disk

[0327] (B)计算机：IBM PC兼容性

[0328] (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

[0329] (D)软件：Patent In Release #1.0.Version # 1.25(EPO)

[0330] (2)SEQ ID NO：1：资料：

[0331] (i)序列特征：

[0332] (A)长度：1124碱基对

[0333] (B)类型：核酸

[0334] (C)链型：单链

[0335] (D)拓扑：线型

[0336] (ii)分子类型：cDNA

[0337] (iii)假定的：非

[0338] (iv)反义：非

[0339] (v)原始来源：

[0340] (A)微生物：棘孢曲霉

[0341] (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

[0342] AATTAAGCAT CCTCCATCTT CAAAGCTCAA TCTCGCTAAC TCCCGCTCTT CTCTCGATCT 60[0343] CATCATCCCA ATAACTCGGA CACAATGAAG ACCTCTGCTC TCTTGACCGC TGGCCTGTTG 120[0344] GCCACCGCTG CTATTGCTGC TCCTCTCACC GAGAAGCGCG CAGCTGCTCG CGCTGCCAAG 180[0345] CGTGGCACCA GCCGCAAGAG CAACCCCCCT CTCAAGCCCG GCACCAGCGA GGCCATCAAC 240[0346] CTGACCGGCT CCAAGAACAC CGAGTACTCG TCCAACTGGG CCGGCGCCGT GCTCATCGGC 300[0347] ACCGGCTACA CTGCCGTCAC CGCCGAGTTC ACCATTCCCA CCCCCTCTCT CCCCTCCGGT 360[0348] GCCTCCAGCC GCGAGCAGTA CTGTGCCTCC GCCTGGGTCG GTATCGACGG TGACACCTGC 420[0349] GACACCGCCA TCCTGCAGAC CGGTCTCGAC TTCTGTATCG AGGGCAGCAC CGTTAGCTAC 480[0350] GACGCCTGGT ACGAGTGGTA CCCCGACTAT GCCTACGACT TCAGCGGCAT CAGCTTCTCC 540[0351] GCCGGCGACG TTGTCAAGGT CACCGTCGAC GCCACCAGCA AGACCGCCGG TACCGCCACC 600[0352] GTCGAGAACG TCACCAAGGG CACCACCGTC ACCCACACCT TCAGCGGTGG TGTTGATGGT 660[0353] GATCTCTGCG AGTACAACGC CGAGTGGATC GTCGAGGACT TCGAGGAGAA CTCCTCCCTC 720[0354] GTCCCCTTCG CCGACTTCGG CACCGTCACC TTCTCCAGCG CCTACGCCAC CAAGAGCGGC 780[0355] TCCACCGTTG GTCCCTCCGG CGCCACCATC ATCGACATCG AGCAGAACAA CAAGGTTCTC 840[0356] ACCTCCGTCT CGACCTCCAG CAGCTCCGTC ACCGTCGAGT ATGTTTGAAG GGGACTCCTG 900[0357] GGGATGTGAA GCGAGAATGC GGCTTGGGTG GTTGGAGGTC CTTTGGGACG TCGAACGCCT 960[0358] AGGATTCAAC GGGATGAGAT CATTGGAAAT GAAGACGAGA ATGAGCGAAT ACTGTCACTG 1020[0359] ATTGAGATTG TGCTTTGTTG ATTGTGTTAG GGGCTTGCCT CTGAAAATTG AGCTTAGTGT 1080[0360] TGCTGCAATA TGATTGCTGT GGTTGAGAAA AAAAAAAAAA AAAA 1124[0361] (2)SEQ ID NO：2：

[0362] (i)序列特征：

[0363] (A)长度：1425碱基对

[0364] (B)类型：核酸

[0365] (C)链型：单链

[0366] (D)拓扑：线型

[0367] (ii)分子类型：cDNA

[0368] (iii)假定的：非

[0369] (iii)反义：非

[0370] (vi)原始来源：

[0371] (A)棘孢曲霉

[0372] (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

[0373] CTGCTTCTCC TTCTCTTCCT CCTCGTGATA TCTGCTTGAA CATCTCCTCA TCATGGTCGT 60[0374] CCTCAACAAG GCTGCAGCCC TTCTTCTGGG TCTGACCACC GCCGCCACTG CGGCTCCCCT 120[0375] GGCCGAGAAG CAGGCTTCTG TCCCGGTCAA GAACTTCTCC GTCAAGCAGG TCGAGAAGGA 180[0376] GGGCAGCAAG GGACGTACCG TTAACCTGCC GGGTCTGTAT GCGAATGCGC TGGCCAAGTA 240[0377] TGGCGCCCAG GTGCCGGCCA GCGTCAAGGC CGCCGCCGTC AGTGGCAGCG TCGTGACCAC 300[0378] CCCGCAGGCC AACGACGTCT CCTACCTGAC CCCCGTCACC GTGGGCAGCT CGACCTTGAA 360[0379] CCTGGACTTC GACACCGGAT CCGCCGATCT CTGGGTCTTC TCCTCGGAGC TGGCCGCCTC 420[0380] CTCGCGCACC GGCCACAGCA TCTACACCCC CGGCAGCACC GCCCAGAAGC TGTCCGGCTA 480[0381] CAGCTGGAGC ATCTCCTACG GCGACGGCAG CTCCGCCAGC GGCGACGTCT ACAAGGACAA 540[0382] GGTCACCGTC GGCACGGTGA CGGCCAGCAG CCAGGCCGTC GAGGCCGCCA GCCGCATCAG 600[0383] CTCCGAGTTC GTCCAGGACA CCGACACCGA CGGTCTGTTG GGTCTGGCCT TCAGCTCGAT 660[0384] CAACACGGTC TCCCCCCGGG CCCAGACCAC CTTCTTCGAC ACCGTCAAGT CCAGCCTGGA 720[0385] CAGCCCCCTC TTCGCCGTCG ACCTGAAGTA CCACGCCGCC GGTACCTACG ATTTCGGGTT 780[0386] CATCGACTCC TCCAAGTACA CCGGCTCCCT GACCTACGCC AACGTCGACG ACTCCCAGGG 840[0387] CTTCTGGCAA TTCACCGCCA GCGGCTACAG CGTGGGCTCG GCCTCCCACT CCTCCTCTTT 900[0388] CTCCGCCATT GATGACACCG GCACCACCCT CATCCTCCTC GACGACTCCA TCGTCTCCAC 960[0389] CTACTACAAG AGCGTCAGCG GCGCCTCCTA CAGCTACAAC TACGGCGGCT ACGTCTTCTC 1020[0390] CTGCTCCGCC AGCCTGTCCA ACTTCAGCGT CAAGATCGGC TCCTACACCG CCGTCGTCCC 1080[0391] CGGCAAGTAC ATCAACTACG CCCCCATCTC CACCGGCAGC TCCACCTGCT ACGGCGGCAT 1140[0392] CCAGTCCAAC GAGGGCCTCG GTCTGTCCAT CCTGGGTGAT GTCTTCCTCA AGAGCCAGCA 1200[0393] CGTGGTCTTT GACTCGCAGG GTCCGAGAAT CGGGTTCGCC GCGCAGGCCT AGATCGTTTG 1260[0394] ATTGGGGTTG TGGATGTGGG TGATGCTTGG TGGTGGTCTG AGTCGTGGTC TATGTGGGCG 1320[0395] TGAATATAGT ACTGTATATA GTACTGTACA TAGGGGGGTG GTGAACATAT GGTCTGGTCG 1380[0396] ATGAATATAT GTCTTTGATG TTATGCTTCT GTGGAAAAAA AAAAA 1425[0397] 参考文献

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