人低密度脂蛋白受体的单克隆抗体及其制备和用途

摘要

本发明提供低密度脂蛋白受体(LDLR)的单克隆抗体，其用于纯化和识别低密度脂蛋白(LDL)以及治疗诸如丙型肝炎感染等疾病。

权利要求

1.一种单克隆抗体、嵌合抗体、全人化抗体、抗抗独特型抗体，其特征在于：所述抗体特异性地识别和结合人可溶性低密度脂蛋白受体即hsLDLR及其片段，能抑制丙型肝炎病毒HCV的复制，并且是通过用人可溶性LDLR+291免疫动物获得的，所述人可溶性LDLR+291即包含人可溶性LDLR序列Asp+4至Glu+291区段的人可溶性形式低密度脂蛋白受体形式。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由保藏在CNCM编号为I-2390的杂交瘤细胞克隆12.6表达的单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由保藏在CNCM编号为I-2391的杂交瘤细胞克隆28表达的单克隆抗体。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由保藏在CNCM编号为I-2392的杂交瘤细胞克隆29.8表达的单克隆抗体。

5.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由保藏在CNCM编号为I-2393的杂交瘤细胞克隆30表达的单克隆抗体。

6.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由保藏在CNCM编号为I-2394的杂交瘤细胞克隆50.30表达的单克隆抗体。

7.如权利要求1至6中任何一项所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体属于免疫球蛋白同种型IgG1或IgM。

8.一种人可溶性低密度脂蛋白受体的检测和/或定量方法，其特征在于：所述方法包括使用上述权利要求1至6中任何一项所述的单克隆抗体。

9.杂交瘤细胞克隆12.6，保藏在CNCM，保藏编号为I-2390。

10.杂交瘤细胞克隆28，保藏在CNCM，保藏编号为I-2391。

11.杂交瘤细胞克隆29.8，保藏在CNCM，保藏编号为I-2392。

12.杂交瘤细胞克隆30，保藏在CNCM，保藏编号为I-2393。

13.杂交瘤细胞克隆50.30，保藏在CNCM，保藏编号为I-2394。

14.一种制备单克隆抗体的方法，其特征在于：所述方法包括在液体培养基或哺乳动物腹腔中使一克隆杂交瘤细胞生长以产生和聚积单克隆抗体，所述杂交瘤细胞包括一以高纯化人可溶性LDLR+291免疫的哺乳动物的脾细胞和同种或异种淋巴细胞，所述人可溶性LDLR+291即包含人可溶性LDLR序列Asp+4至Glu+291区段的人可溶性形式低密度脂蛋白受体形式。

15.一种人低密度脂蛋白受体的纯化方法，其特征在于：所述方法包括使含有人低密度脂蛋白受体的物质与如权利要求1至6中任何一项所述的单克隆抗体或与权利要求14所述方法制备的单克隆抗体接触。

16.一种在体外抑制丙型肝炎病毒复制的方法，包括在细胞被丙型肝炎病毒感染前让细胞接触权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体从而抑制丙型肝炎病毒在所述细胞中复制。

17.药物组合物，包含可用于制作治疗丙型肝炎病毒感染的药物的权利要求1至6中任一项所述单克隆抗体作为活性成分。

说明书

人低密度脂蛋白受体的单克隆抗体及其制备和用途

技术领域

[0001] 本 发明 涉 及 特 异 性 地 识 别人 低 密 度 脂 蛋 白 受体 (receptor for low-densitylipoproteins，简称LDLR)的单克隆抗体。这些抗体用于，例如，在制备过程以及识别和治疗诸如丙型肝炎感染(HCV)等疾病中识别和纯化人可溶性低密度脂蛋白受体(human soluble LDLR，简称hsLDLR)。

背景技术

[0002] 胆固醇是所有真核细胞质膜的一种组分，是高级生物的细胞生长和生存必不可少的。然而，胆固醇的血清水平高就会在全身的动脉形成动脉粥样硬化斑块，从而导致生病和死亡。在哺乳动物中合成胆固醇的主要器官是肝脏。在肠内也会形成大量的胆固醇。这些器官形成胆固醇的速度与每天从食物摄取胆固醇的量密切相关。肝脏和肠以外的细胞从原生质获取胆固醇而非自身合成。胆固醇和脂质通过脂蛋白在体液传送，其按递增的密度进行分类。脂蛋白是一种颗粒，由被极性脂质和脱基蛋白质壳体包着的疏水脂质核心构成。这些脂蛋白有两个作用：它们容易溶解高疏水脂质以及它们包含调控在特定靶细胞和组织内外的个别脂质运动的信号。胆固醇通过低密度脂蛋白在体液内传送，而这些低密度脂蛋白与非肝细胞质膜上的特定受体相结合。受体/低密度脂蛋白复合物再由传送机构，也称为受体介导的内吞作用[goldstein等人，(1979)]，内化到细胞中。LDLR是一族结构上相关的细胞表面受体的原始型，而这些细胞受体介导哺乳动物细胞中多配体的内吞作用。

[0003] LDLR由822个氨基酸残基组成，分子量为164000。它由几个区域组成，其中一些区与其它蛋白质共享序列同源性。它的NH2末端配体结合区由292个残基组成，排列在7个富含半胱氨酸的缺陷重复序列中。每个重复序列含有6个半胱氨酸残基，它们是以一与三、二与五及四与六的形式相结合的二硫化物[Bieri等人，(1995)]。在该区之后是四个附加区：第一区由400个氨基酸残基组成，与表皮生长因子受体属同系，第二区由58个富集氧连接的糖的氨基酸残基组成，第三区是22个氨基酸残基组成的单跨膜区，第四区是50个氨基酸残基的细胞质功能区[Sudhof等人，(1985)；Brown等人，(1986)]。

[0004] Brown和Goldstein对家族性高胆固醇血症(FH)的研究揭示了LDLR在生理上的重要性。业已发现，这种疾病是由于分子基因缺陷引致低密度脂蛋白功能受体不存在或不足而造成的[Brown等人，(1976)]。家族性高胆固醇血症(FH)的突变按特性分成几类[Goldstein等人，(1975)]。

[0005] 从由干扰素诱发的细胞[Fischer等人，(1993)]和体液[Fischer等人，(1994)]培养上清液中已识别和分离出具有抗病毒活性的可溶性类LDLR。目前已识别出一些由干扰素诱致的蛋白质，它们有助于干扰素诱导成抗病毒状态。在人羊膜传代细胞培养上清液中可制备和聚集这样一种具有抗病毒活性的蛋白质。该蛋白质可纯化至均一并看作是可溶性LDLR[见欧洲专利EP0553667和Fischer等人，(1993)]。业已发现，这种可溶性LDLR由哺乳动物细胞分泌到培养液，而这些细胞通过应答干扰素而进入抗病毒状态。与干扰素不同的是，可溶性LDLR并不是在细胞中诱发变成抗病毒状态，而是本身变成抗病毒状态。人们发现，可溶性LDLR在病毒复制、成熟和发育的整个过程中明显一直存在，这表明它可能参与抑制病毒组合或发育(未公布数据)的复合过程。最近的研究显示培养细胞上的LDLR可介导丙型肝炎病毒的内吞作用[Agnello等人，(1999)]。这些和其它发现认为这族LDLR可用作病毒受体。因此，对可溶性LDLR所产生的抗体通过与细胞的LDLR结合可阻止病毒粒子的进入和发育。

[0006] 到目前为止，唯一市售的LDLR的单克隆抗体是C7，它是一种对牛LDLR的抗体[Beisiegel等人，(1981)，在美国和英国均有售]，其通过以纯化至均一的牛肾上腺皮层LDLR使小鼠免疫制备。溶解牛肾上腺皮层的膜，并用二乙氨基乙烷(DEAE)纤维素色谱柱使受体洗脱而使其部分纯化[Beisiegel等人，(1981)]。牛LDLR的抗体和人LDLR只起微弱的交叉反应。

[0007] 事实上，已经发现，当牛LDLR的C7单克隆抗体用于定量测定重组人LDLR时会有明显缺点：

[0008] a)它对人LDLR的亲合力低；

[0009] b)它与细胞培养液衍生的杂质进行大量的交叉反应。

[0010] 以前，对人LDLR的特定抗体在市面上是买不到的。这看起来使人惊奇，但这是因为经常需要开发新蛋白质的抗体不管其用作纯化、识别以及分析开发的目的。可能因为制备单克隆抗体的一条件需要大量能使小鼠有效免疫的高纯度抗原，所以到目前为止还不能制成这样一些抗体。高纯度抗原在反相高效色谱法(RP-HPLC)中以单一主峰出现。而且在纯化过程中识别和定量抗原的其它方法并不容易研究出来。根据本发明，本文所述的抗病毒活性的测定方法可用于纯化过程中识别LDLR。

[0011] 所以，有需要制备hsLDLR的特定单克隆抗体以便提供改进有效免疫测定法(ELISA)和在蛋白质印迹法中的蛋白质的识别方法的装置。这些抗体要能够在重组蛋白质的制备和纯化过程的进展中监控和定量重组hsLDLR以及检测天然蛋白质。

发明内容

[0012] 本发明可以产生杂交瘤细胞株，其制备能特异性地识别和结合人LDLR及其片段的单克隆抗体。

[0013] 具体地说，本发明可以产生杂交瘤细胞株，其制备能特异性地识别和结合hsLDLR的单克隆抗体。

[0014] 因此，本发明涉及一种单克隆抗体、嵌合抗体、人化抗体、抗抗独特型抗体或其片段，除了单克隆抗体C7外，它们可特异性地识别和结合人LDLR及其片段。

[0015] 本发明提供一些单克隆抗体，其可识别和结合hsLDLR，并满足下列要求：

[0016] 1.单克隆抗体(Mab)，在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中可成对使用，如夹心ELISA法以检测hsLDLR。

[0017] 2.单克隆抗体，在蛋白质印迹法(Werstern Blot analysis)中可用于识别LDLR。

[0018] 3.单克隆抗体，可用于中和hsLDLR的抗病毒生物活性。

[0019] 4.单克隆抗体，可用于抑制病毒感染，如丙型肝炎病毒(HCV)。

[0020] 本发明还提供一种检测和/或定量人LDLR的方法，其包括为该目的以已知方式使用本发明的特异性单克隆抗体。

[0021] 本发明也提供克隆杂交瘤细胞，其包括一以重组人LDLR免疫的哺乳动物的脾细胞以及一均一或不均一的淋巴细胞。

[0022] 用一般方法就可以制备本发明的单克隆抗体，如使一克隆杂交瘤细胞生长，其包括一以hsLDLR免疫的哺乳动物的脾细胞以及一在液体培养液或哺乳动物的腹腔中均一或不均一的淋巴细胞，以使杂交瘤细胞生成和聚集单克隆抗体。

[0023] 另一方面，本发明也提供一种人LDLR的纯化方法，其包括使含有原LDLR的物质与本发明的一种单克隆抗体接触。在重组蛋白质的纯化过程中，用装上吸收LDLR特异性单克隆抗体的色谱柱作为亲合纯化步骤。

[0024] 本发明还提供一种重组人LDLR的检测方法，该方法包括如实施例5所述ELISA法中用本发明的单克隆抗体为抗体。

[0025] 只要是温血哺乳动物的LDLR，则任何LDLR都可以用作免疫动物的LDLR或LDLR的片段。也可用LDLR的突变蛋白。这样一种哺乳动物的hsLDLR的典型例子是可溶性LDLR的+291型，其人LDLR的顺序包括氨基酸顺序，开始位点+4上为氨基酸天冬氨酸(Asp)，末端位点+291上为氨基酸谷氨酸(Glu)，当然也可用其它型式，如+292型等。

附图说明

[0026] 图1所示为对重组人可溶性低密度脂蛋白受体(recombinant human soluble LDLR，简称r-hsLDLR)的单克隆抗体产生的流程图。

[0027] 图2所示为用各条带下标出对应的单克隆抗体的免疫印迹分析，条带1为r-hsLDLR的+291型，条带2为尿液hsLDLR，条带3为作为负调控(r-hTBP-1)的重组人p55肿瘤坏死因子(TNF)受体。图上左边的箭头表示分子量标记物的位置，而图上右边的箭头指向上述各箭头所示的hsLDLR型式的位置。

[0028] 图3所示为单克隆抗体12.6、28和29.8对培养液FT167中丙型肝炎病毒(+)和(-)链的生成的影响。在用单克隆抗体抗LDLR(8或2μg/mg)感染之前先将细胞处理30分钟。然后将细胞用25μl HCV(+)血清[N°42；lb]]感染过夜。感染后当天，洗涤三次，加入新培养液并且每48小时更换一次。感染五天后，收集肝细胞，纯化核糖核酸(RNA)，并用rTth RT-PCR(Perkin Elmer)分析1μg细胞核糖核酸。重复上述试验。

[0029] +SP：正链RNA的检测；-SP：负链RNA的检测；X：空白试验。

具体实施方式

[0030] 制备对hsLDLR的单克隆抗体。利用这些单克隆抗体研究出识别hsLDLR的ELISA法和免疫印迹法以及hsLDLR的抗病毒活性的中和测定法。

[0031] 用hsLDLR的重组+291型免疫的小鼠在小鼠体内产生单克隆抗体，这些单克隆抗体由hsLDLR的N末端配体结合区(从Asp+4到Glu+291)组成。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生成hsLDLR的重组+291型并纯化至均一。

[0032] 免疫小鼠产生大量滴定的特异性抗体。将杂交瘤细胞筛选后，五种克隆(编号为12、28、29、30和50)当作为最高抗体生产者。这些克隆可选择进行进一步亚克隆。在亚克隆之后，将抗体生产能力最高的29种亚克隆分离出来，并将装有母克隆和亚克隆的玻管冷冻保存。

[0033] 挑选一对对r-hsLDLR的单克隆抗体用ELISA法检测。单克隆抗体28用作覆盖抗体，以生物素标记的单克隆抗体29.8用作第二抗体。结果发现单克隆抗体12.6和29.8在免疫印迹分析法(Western Blot analysis)中适合识别天然和重组hsLDLR，单克隆抗体28和30在免疫印迹分析法中适合识别重组hsLDLR，而单克隆抗体12.6和50适用于抑制hsLDLR的抗病毒活性。

[0034] 本发明还发现，单克隆抗体12.6、28和29.8可抑制人肝细胞主培养液中的丙型肝炎病毒(HCV)基因组的复制。因此这些抗体可用于治疗丙型肝炎感染(图3)。

[0035] 确定由克隆产生的亚类同种型单克隆抗体，克隆12.6、28、29.8和30确定为IgG1，而克隆50.30确定为IgM。

[0036] 相对于hsLDLR的+291型产生的单克隆抗体也可识别为hsLDLR的其它型式，即在ELISA法和蛋白质印迹法分析法中，在重组CHO细胞产生的r-hsLDLR的+292型和+331型。+292型包括受体N-末端部分，从氨基酸残基Asp+4到Cys+292，而+331型包括受体N-末端部分，从氨基酸残基Asp+4到Cys+331。

[0037] 用于免疫小鼠产生单克隆抗体的抗原是在CHO细胞内产生的r-hsLDLR的+292型。用稳定期Fibracel矩阵系统在生物反应器产生r-hsLDLR。把该r-hsLDLR纯化至均一，然后用来免疫小鼠。

[0038] 杂交瘤细胞的融合和产生选用反应最好的小鼠的免疫脾细胞。

[0039] 关于本文所指的抗体，术语”单克隆抗体”表示包括由任何一种已知技术，例如，但不局限于，酶分解、肽合成或重组技术提供的，且可以可溶性或结合型式标记的单克隆抗体、嵌合抗体、全人化抗体、对抗独特型抗体的抗体(抗抗独特型抗体)及其片段。

[0040] 单克隆抗体含有基本均一的对抗原特异的抗体群，这些抗体群含有大致相同的表位结合位。用本领域技术人员已知方法就可以制备单克隆抗体，例如参见本文的引用文献：Kohler和Milstein，”Nature”，256：495-497页，(1975)；美国专利US4,376,110；Ausubel等人，eds.，”Harlow and Lane ANTIBODIES：A LABORATORYMANUAL”，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)；以及Colligan等人，eds.，”CurrentProtocols in Immunology”，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience N.Y.，(1992-1996)。这些抗体可以是任何一种免疫球蛋白类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何一种亚类。制备本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞可在体内、原位或体外培养。目前，高滴度单克隆抗体的制备方法优选在体外或原位制备。

[0041] 嵌合抗体是指那些自不同动物种类衍生出的不同部分的分子，如自一小鼠单克隆抗体以及一人免疫球蛋白稳定区衍生出的具有可变区的一些分子。嵌合抗体主要用于减少应用中的免疫原性以及提高产率，例如，当杂交瘤细胞的小鼠单克隆抗体的产率高，但人的免疫原性不高的时候，就会用人/小鼠嵌合抗体。嵌合抗体及其制备方法在本领域是已知技术[Cabilly等人，“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，81：3273-3277页，(1984)；Morrison等人，“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，81：6851-6855页，(1984)；Boulianne等人，“Nature”，312：643-646页，(1984)；Cabilly等人，欧洲专利EP125034(1984年11月14日公布)；Neuberger等人，“Nature”，314：268-270，(1985)；Taniguchi等人，欧洲专利EP171496(1985年2月19日公布)；Morrison等人，欧洲专利EP173494(1986年3月5日公布)；Neuberger等人，PCT专利WO8601533(1986年3月13日公布)；Kudo等人，欧洲专利EP184187(1986年6月11日公布)；Sahagan等人，“J.Immunol.”，137：1066-1074页，(1986)；Robinson等人，国际专利WO8702671(1987年5月7日公布)；Liu等人，“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，84：3439-3443页，(1987)；Sun等 人，“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，
84：214-218页，(1987)；Better等人，“Science”，240：1041-1043页，(1988)；Riechmann等人，“Nature”，332：323-327页；以及HarlowLane，ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，supra]。本文也引用上述所有文献。

[0042] “全人化抗体”是指既含有人免疫球蛋白的可变区又含有稳定区的分子。全人化抗体有可能用于治疗需要重复治疗的慢性和复发病，如自身免疫病等。一种全人化抗体的制备方法包括小鼠体液免疫系统的”人化”，即通过把人免疫球蛋白(Ig)基因座引入内生lg基因已经失活的小鼠中，以制备能产生人Ig的鼠系(变种小鼠)。Ig基因座的物理结构和基因重排非常复杂，而表达方法要求最终产生范围大的免疫应答。抗体的差异性主要是Ig基因座中的不同V、D和J基因之间组合重排的结果。这些基因座也含有分散布置的调控元素，它们调控抗体表达、等位基因排斥、类型转换及亲合力成熟性。将未重排的人Ig转基因引入小鼠中，结果显示小鼠的重组系统和人的基因兼容。另外，用抗原免疫变种小鼠可以得到分泌各种同种型的抗原特异性人单克隆抗体的杂交瘤细胞。

[0043] 全人化抗体及其制备方法在本技术领域已公知[Mendez等人，”NatureGenetics”，15：146-156 页，(1997)；Buggemann 等 人，”Eur.J.Immunol.”，21：1323-1326页，(1991)；Tomizuka等人，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，97：722-727页，(2000)；专利WO98/24893]。

[0044] 抗独特型抗体是一种识别通常与抗体的抗原结合部位相关的独特决定簇抗体。使与正在制备的抗独特型抗体的单克隆抗体源同种和同基因型(如鼠系)动物免疫可制备独特型抗体。免疫过的动物通过产生对这些独特型决定簇的抗体(抗独特型抗体)来识别和应答免疫抗体的独特型决定簇。例如参照美国专利US4,699,880，其列入参考文献中。

[0045] 抗独特型抗体也可用作诱导另一种动物免疫应答的”免疫原”，产生一种称为抗抗独特型抗体。该抗抗独特型抗体在表位上和诱导抗独特型的原单克隆抗体相同。因此，用对单克隆抗体的独特型决定簇抗体即可识别其它表达同一特异性抗体的克隆。

[0046] 所以，本发明的对LDLR的单克隆抗体及其异构重整体、异质体、片段和衍生物可用于诱导合适动物的抗独特型抗体，如BALB/c小鼠。用这些免疫小鼠的脾细胞制备分泌抗独特型单克隆抗体的抗独特型杂交瘤细胞。另外，抗独特型单克隆抗体可与一载体偶联，如钥孔槭血蓝素(KLH)，并用以使另外一些BALB/c小鼠免疫。这些小鼠的血清含有抗抗独特型抗体，其具有与原单克隆抗体结合的性能，而这些单克隆抗体对上述LDLR蛋白质、或异质体、片段和衍生物的表位具有特异性。

[0047] 因此，抗独特型单克隆抗体各有自己的独特型表位，或者在结构上与待评估的表位相似的独特位。术语”单克隆抗体”也包括完整分子及其片段，例如，Fab和F(ab’)2，它们都能与抗原结合。Fab和F(ab’)2片段没有完整抗体的Fc片段，很快就在循环中清除，而且它们的非特异性组织结合比完整抗体少[Wahl等人，“J.Nucl.Med.”，24：316-325页，(1983)]。

[0048] 值得注意的是，根据本发明揭示的方法，本发明所用的Fab、F(ab’)2及其它片段可检测和定量完整抗体分子的LDLR蛋白质。这些片段一般用酶类，如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)等，通过蛋白水解分解而成。

[0049] 一般认为，如果单克隆抗体能够特异性地与分子反应以使分子与抗体结合，它就是一”可结合”分子。术语”表位”是指能以抗体结合，也可被抗体识别的任何分子部分。表位或”抗原决定簇”通常由分子的化学活性表面基团组成以，如氨基酸或糖侧链，而且具有特定三维结构特征及特异性电荷特征。

[0050] “抗原”是指能以抗体结合的分子或分子一部分，这些抗体的抗原还可诱导一动物产生能与该抗原的表位结合的抗体。一个抗原可有一个或多个表位。上述所指的特异性反应是指抗原以高选择性方式与其相应抗体的表位反应，而不是与大批由其它抗原诱发的其它抗体反应。

[0051] 本发明用的抗体及抗体片段可用于定量或定性检测样本的LDLR蛋白质或者检测有否表达本发明的LDLR蛋白质的细胞。利用与荧光显微镜、流式细胞仪或荧光探测结合的带荧光标记的抗体，通过免疫荧光技术就可以进行上述定量和定性的检测。

[0052] 当使用免疫荧光显微镜或免疫电子显微镜，本发明用的抗体(或其片段)在组织结构上可用于原位检测本发明的LDLR蛋白质。从病人身上抽取一组织样本并将本发明的标记抗体放在该样本中，即可实现原位检测。提供的抗体(或片段)最好把标记抗体(或片段)施加或重叠到生物样本上。利用这样一种处理，不但可确定LDLR蛋白质是否存在，而且可确定其在检后组织上的分布。利用本发明，普通技术人员很容易对任何一种组织学方法(例如染色法)进行改进以实现原位检测。

[0053] 本发明LDLR蛋白质的检测方法一般包括以下步骤：培养一生物样本，例如在能够识别LDLR蛋白质的标记抗体存在下培养生物流体、组织提取液、新鲜收集的细胞，如淋巴细胞或白细胞，或在组织培养液培养的细胞，以及以本技术领域已知的任何一种技术来检测该抗体。

[0054] 生物样本可与固相载体，如硝酸纤维素，或能够固定细胞、细胞粒或可溶性蛋白质的其它固相载体偶联。然后，用适当缓冲液洗涤载体，再如上所述用本发明的标记抗体处理。之后再用缓冲液把固相载体洗涤多一次，以去除游离抗体。用一般方法可以检测在所述固相载体上的结合标记量。

[0055] ”固相载体”、”固体载体”、”载体”是指任何一种能够与抗原或抗体结合的载体。公知的载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩、磁铁石。用于本发明目的的载体，其性质可以是部分可溶或不溶。实际上载体材料可为任何可能的结构构造，只要偶联分子能与抗原或抗体结合即可。因此，载体的构造可呈球形，如圆珠形、圆柱形、试管的内表面形、或棒的外表面形。另外，其表面也可以是扁平的，如片状、试纸状等。优选载体包括聚苯乙烯珠粒。本领域技术人员将会知道很多其它适合与抗体或抗原结合的载体，或将能利用普通实验来确定这些适合的载体。

[0056] 根据公知的方法可以确定如上所述的本发明一定量抗体的结合活性。本领域技术人员利用普通实验就可以确定每次试验的操作和最佳试验条件。

[0057] 视具体情况可在试验中加上其它常用或必要步骤，如清洗、搅拌、摇动、过滤等。

[0058] 标记本发明抗体的其中一种方法是把抗体和酶结合，用于酶免疫测定(EIA)。当这种酶受一适当底物作用时，其又将以这样一种方式和底物反应以便产生一能够被，例如分光光度法、荧光法或目测等方法，检测到的化学分子部分。用于可检测标记抗体的酶包括，但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸盐脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶、葡萄糖淀粉酶以及乙酰胆碱酯酶。检测的方法可用比色法，这种方法给酶配一显色底物。也可通过目测法比较底物与用类似方法制备的标准物的酶反应程度，即可进行检测。

[0059] 还可用任何其它免疫测定法作检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，就能用放射免疫测定法(RIA)对R-PTPase进行检测。本文的引用文献
“LaboratoryTechniques and Biochemistry in Molecular Biology”，[by Work，T.S等人，North HollandPublishing Company，NY(1978)]详细叙述了放射免疫测定的方法，具体参考Chard，T.的题为”An Introduction to Radioimmue Assay and Related Techniques”部分。用克计数器或闪烁计数器等方式或放射自显影均可检测到放射性同位素。

[0060] 也可用荧光化合物标记本发明的抗体。当荧光标记的抗体受适当波长的光作用，由于有荧光，因此可检测到抗体的存在。最常用的荧光标记化合物是荧光异硫氰酸酯、若明丹、藻红蛋白、脓青素、别藻蓝蛋白、邻苯二醛及荧光胺。

[0061] 另外，用诸如152E或其它镧系元素等发光金属也可使抗体带检测标记。这些金属通过二亚乙基三胺五乙酸(ETPA)等螯合基黏附到抗体上。

[0062] 将抗体和化学发光化合物偶联也可使抗体带检测标记。检测在化学反应过程中产生的光就可以确定化学发光标记的抗体。特别有用的化学发光化合物是鲁米诺、异鲁米诺、染色吖啶翁酯、咪唑、吖啶盐、草酸酯。

[0063] 同样，本发明的抗体还可用生物发光化合物来标记。生物发光是一种在生物系统中的化学发光，生物系统的催化蛋白质使化学发光反应的效率增加。检测发光就可以确定生物发光蛋白质的存在。用于标记目的的主要生物发光化合物是荧光素、荧光素生产酶、发光蛋白质。

[0064] 本发明的抗体分子适合用于免疫检测，也称为”双位”或”夹心”法检测。在一般免疫检测法中，一定量的未标记抗体(或抗体片段)与固体载体结合，而一定量带检测标记的可溶性抗体加入以检测和/或定量在固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。

[0065] 典型的和优选的免疫检测法包括”正向”检测法，在这些方法中，与固相结合的抗体先与待测样本接触，通过形成二元固相抗体/抗原复合物从样本提取抗原。培养一段合适的时间后，洗涤固体载体以去除剩余样本，也可能包括未反应的抗原，再与含有未知量标记抗体(起”报告分子”的作用)的溶液接触。在培养第二段时间使标记抗体通过未标记抗体与粘附在固体基体或载体的抗原结合之后，第二次洗涤固体载体以去除未反应的标记抗体。

[0066] 在本发明抗原所使用的另一种”夹心”检测法中，采用称为”同步”和”逆转”检测法。同步检测法只包括一培养步骤，即把结合到固体载体的抗体和标记抗体同时加到待测样本中。经过培养之后，洗涤固体载体以去除残余的流体样本和未结合的标记抗体。然后，如一般”正向”夹心检测法一样，确定与固体载体结合的标记抗体的存在。

[0067] 在”逆转”检测法中，首先将标记抗体溶液逐步加入流体样本中，在培养一段适合的时间后，加入与固体载体结合的未标记抗体。再培养一段时间，用一般方法洗涤固相，使其不含有待测样本和未反应标记抗体的溶液。如”同步”和”正向”检测法一样，确定与固体载体结合的标记抗体的存在。

[0068] 以下将通过非限制性实施例对本发明进行详细说明。

[0069] 实施例1 中国仓鼠卵巢(CHO)r-hsLDLR的制备

[0070] 通过以两表达载体共同转变感染二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的CHO-DUKX细胞可生成表达hsLDLR的稳定重组CHO细胞[Urlaub，G.等人，(1980)]，其中一种表达载体：psLDLR01，其含有LDLR的N末端配体结合区，从+4位上的氨基酸残基Asp开始直至+291位上的Glu(+291型)，以及另一种表达载体：pDHFR，其含有DHFR的小鼠基因，这两种向量均由SV40初始区的激活子和转录终止元素调控。根据制造商所订的协议，用LipofectAmine(Gibcr BRL)通过阳离子脂质体进行转变感染。72小时后，将感染细胞转移到不含脱氧和核糖核苷的选择性培养液中，用10％透析过的胎牛血清(FCS)补给。表达DHFR活性的细胞可形成菌落，其通过升起具有胰蛋白酶浸泡纸盘的细胞而分离出来。使细胞生长，并按r-hsLDLR活性筛选细胞。然后，转染细胞经由MTX基因扩大，再使稳定生产者克隆亚克隆并进行选择。

[0071] 在5升CelliGen生物反应器中，以无血清培养液[Gibco CHO-A-SFM Cat.no.95-0091DJ]用编号为#33-10-29-21的稳定的CHO生产者克隆细胞生成重组
hsLDLR(+291型)。经过滤等级为0.8-0.2μ的筒式过滤器[Gelman Cat.No.CSS92DSCCK]过滤澄清原收集液，并在截留分子量为5KD的滤膜上浓缩100倍。以小规模纯化法纯化第一次免疫用的r-hsLDLR的+291型。该方法使用二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖阳离子交换色谱柱以及在Butyl-TSK色谱柱上进行疏水相互作用步骤，再利用高温聚合物(HTP)色谱柱和Sephacryl 100粒度排斥色谱柱。因为粒度排斥色谱法的馏分#27含有特异性抗病毒活性，选取该馏分并用下面实施例9叙述的抗病毒检测法测定其活性为780单位/μg。馏分#27的蛋白质由N末端分析法确定为r-hsLDLR。

[0072] 纯化第二批CHO+291 r-hsLDLR，用于小鼠补强注射。纯化时用可改善产率的重整过程，其包括以下步骤：a)原收集液的澄清和浓缩100倍；b)用HQ POROS阳离子交换色谱柱洗脱；c)二步疏水相互作用(HIC)步骤：在Butyl-TSK色谱柱收集洗脱液以及流过Phenyl 5PW色谱柱。对最后疏水相互作用步骤得到的游离馏分进行透析，并用HQ POROS阳离子交换色谱柱纯化。最后一步采用羟基磷灰石(HTP)色谱柱。所得到的r-hsLDLR纯化至大约90％，在反相高效液相色谱法中以单主峰洗脱出来。

[0073] 实施例2小鼠的免疫

[0074] 从上述实施例1的粒度排斥色谱法洗脱出来的馏分#27是纯r-hsLDLR，取10μg配成100μg/ml的浓度，以完全弗氏佐剂(CFA，50％(体积))使其均一化，并分别注射入五只7个星期大的Balb/C雌性小鼠的脚底。

[0075] 第一次免疫后四星期，进行补强注射，即将含有10μg纯r-hsLDLR的同一馏分，且浓度为50％(体积)的CFA溶液注入小鼠肌肉内。

[0076] 第二次注射后两星期，用下述实施例3所述的ELISA法测试小鼠血清的r-hsLDLR抗体。

[0077] 第二次注射后十星期，小鼠M-1和M-2的r-hsLDLR特异免疫反应性最显著，将10μg由上述实施例1所述的重整纯化过程制成的纯r-hsLDLR补强注入该两只小鼠中。

[0078] 十四星期后，从小鼠抽取血液，测试其r-hsLDLR抗体。另外再向这两只小鼠补强注射含有50μg r-hsLDLR的磷酸盐缓冲盐水(PBS)二次：第一次注射腹膜内，二天后，第二次再注射腹膜和静脉内。

[0079] 第二次注射后两星期，再次从小鼠抽取血液，用以下实施例3所述的直接ELISA法测试抗血清的抗r-hsLDLR活性。每种抗血清依次稀释至1∶100-1∶32,000，并以双份施加到96孔板中，该孔板覆有上述实施例1所述的重整纯化过程纯化的r-hsLDLR，每孔为10U。每排第一个孔加入测试缓冲液和含有PBS+1％牛血清蛋白(BSA)或明胶+0.05％Tween
20+0.05％Thimerosal的DMEM+10％同种血清(HS)作空白试验。在最后两排孔中加入同一稀释范围的正常鼠血清作为负调控。用ELISA读数器在492和405纳米处测量酶反应的吸收率。

[0080] 本测试结果显示小鼠M-1的血清具有较高r-hsLDLR特异性免疫反应性，故而被舍弃并且收集与骨髓瘤融合的脾细胞[Eshhar Z.，(1985)]。

[0081] 实施例3用于抗血清测试和杂种瘤细胞克隆筛选的直接酶联免疫吸附测定法(ELISA)

[0082] 筛选阳性抗血清的直接ELISA法的步骤如下：用含有100μl r-hsLDLR(用上述实施例1的重整纯化过程纯化)100单位/ml(10U/孔)pH5.6的PBS+1％明胶(Sigma，Cat.+2 +2No.G-7765)+0.9mM Ca 和0.5mM Mg ，下文称为检测缓冲液，覆盖90孔板90分钟并在37℃摇动。用PBS+0.05％Tween 20溶液(聚氧乙烯山梨糖醇酐一月桂酸盐-σP-1379)洗6次，下文称为洗涤液。

[0083] 免疫小鼠的抗血清样本依次稀释至1∶100-1∶32,000，或把杂交瘤细胞培养上清液加入孔板中，在37℃摇动培养90分钟，再用洗涤液洗6次。

[0084] 取100μl与山羊抗体(Sigma-Cat.NO.4601-1)共轭的辣根过氧化物酶(HRP)-APA稀释至1∶1,200，并加入孔中，在37℃摇动培养90分钟，再用洗涤液洗6次。

[0085] 把100μl底物溶液(通过在20ml水中溶解一片OPD和一片双氧水而制成)加入孔中，在室温下培养30分钟。每孔加入100μl 4N的盐酸使酶反应中止。

[0086] 用ELISA读数器在492和405nm处读出96孔板的吸收率，并通过连接到ELISA读数器的个人计算器中的Multicalc软件以4参数逻辑算法计算结果。

[0087] 实施例4融合、杂交瘤细胞的制备、克隆的选择、腹水抗体的纯化

[0088] 融合过程和杂交瘤细胞的制备均按Eshhar Z在1985年的协议进行。简单地说，在融合前2-4天已补加注射的小鼠M-1的脾细胞在聚乙二醇(PEG)培养一段短时间与骨髓瘤细胞融合。先用DMEM缓慢稀释PEG，再以离心完全去除PEG。细胞重新悬浮于DMEM-HAT-4培养液中，并分布在浓度为3.4×10 细胞/孔的96孔板上，在37℃8％的二氧化碳培养箱中培养10-14天。在10天内将所有杂交瘤细胞孔中的培养液换成以10％马血清(HS)补给的DMEM。用实施例3所述的直接ELISA法筛选含有r-hsLDLR的单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清液样本。用检测缓冲液和DMEM+10％HS作空白试验，用单克隆抗体C7(Amersham有售)和小鼠M-1抗血清作正调控，而可溶性p55肿瘤坏死因子(TNF)受体的单克隆抗体
2
则作负调控。将培养上清液中检测到有抗体的孔中细胞转移到24孔板，再转到25cmT瓶中。监视膨胀的培养液分泌r-hsLDLR单克隆抗体的情况。将阳性培养液的细胞玻瓶冷冻保存在液氮中。

[0089] 筛选大约1000个培养液用以检测r-hsLDLR的抗体。对54个免疫活性最高的培养液重复检测多次。其中五个免疫活性最高的培养液(12、28、20、30和50)在96孔板中通过限制稀释进行克隆。用直接ELISA法多次检测生长克隆上清液中的r-hsLDLR抗体。

[0090] 阳性杂交瘤克隆细胞在组织培养瓶含有15％马血清的DMEM中生长，冷冻一部分培养液玻管。同时，向2-4只小鼠各注射不同杂交瘤克隆细胞以获得腹水。用硫酸铵沉淀法或蛋白质G色谱柱洗脱从腹水纯化抗体。简单地说，在20mM pH7的磷酸盐缓冲液中将7.5ml腹水稀释至1∶3，并装入5ml蛋白质G色谱柱(C10/10)中。用20mMpH7的磷酸盐缓冲液洗涤色谱柱，用100mM pH2.7的甘氨酸洗脱出单克隆抗体。洗脱馏分的pH值用1M pH9.3的Tris缓冲液调节至7-7.5。

[0091] 实施例5ELISA中待用的单克隆抗体对的筛选和ELISA参数的优化

[0092] 从实施例4的腹水纯化的单克隆抗体用于进行一组矩阵格式实验以选出最适合于下面实施例6所述的夹心ELISA法中用作第一和第二r-hsLDLR抗体的单克隆抗体对。简单地说，用以硫酸铵沉淀法或蛋白质G色谱柱纯化的五种杂交瘤细胞(编号为12，、28.28、29.08、30和50.05)衍生而来的腹水覆盖96孔板。以在CHO细胞中产生的r-hsLDLR的+291型、+292型(从+4位上的氨基酸残基Asp至+292位上的Cys)以及+331型(从+4位的
氨基酸残基Asp至+331位上的Cys)作为抗原筛选抗体。上述部分纯化的单克隆抗体各取
1ml，用生物素标记，以其适合性快速筛选为夹心ELISA法的第二抗体。简单地说，用30μl
0.5M碳酸氢钠溶液将以硫酸铵沉淀纯化的1.5mg单克隆抗体的pH值调至8.5。向抗体溶液加入0.75mg生物素-OSu N-羟基丁一二亚氨-生物素(生物素-OSu，Sigma，Cat.#H1759，将5mg溶于200μl DMSO而制成的溶液)，在室温下轻轻摇动培养2小时，再置于2-8℃培养过夜。把反应溶液装入SephadexG-25M(Pharmacia Cat.#17-0851-01)PD10色谱柱以分离当中生物素化的单克隆抗体和过量未反应的生物素-OSu。

[0093] 初步实验显示单克隆抗体29.08和30用作ELISA法的第二抗体时，可在以上背景产生最强信号。

[0094] 将作为第二抗体的抗体12、28、29.08和50用于孔板的覆盖，再测试其反应。实验结果清楚显示抗体28最适合用作覆盖。

[0095] 以信号强度和特异性而言，用单克隆抗体28覆盖在微滴定孔板上，用以生物素标记的单克隆抗体29.08作为第二抗体所得的结果为最好。利用这些单克隆抗体，r-hsLDLR的三种型式(+291、+292和+331)得到的信号强度和特异性非常好。所有型式的吸收率在492/405nm处为1.3光密度(OD)。

[0096] 将r-hsLDLR抗原的三种型式依次稀释至浓度为0.9-1000ng/ml，并加以分析。以单克隆抗体28用于覆盖和以用生物素标记的单克隆抗体29.08作为第二抗体得到一剂量应答曲线。这种组合得到的是一条浓度范围在1-10ng/ml的r-hsLDLR的线性应答曲线。

[0097] 影响ELISA检测法的参数包括试剂浓度、培养时间、缓冲液和孔板的选择等，通过测试得出各种最佳参数：

[0098] ·用5-10μg/ml单克隆抗体28的PBS溶液覆盖在微滴定培养板的孔上

[0099] ·缓冲液的组成

[0100] a)PBS+Tween 20

[0101] b)Tris+Ca+2+NaCl+Tween 20

[0102] ·封闭溶液：

[0103] a)含1％明胶的PBS，0.05％Tween，0.005％Thimerosal

[0104] b)含1％BSA的PBS，0.05％Tween，0.005％Thimerosal

[0105] c)含1％FBS的PBS，0.05％Tween，0.005％Thimerosal

[0106] d)含1％牛奶的PBS，0.05％Tween，0.005％Thimerosal

[0107] e)I Block，Hy Pep和Hy酵母

[0108] ·以生物素标记的第二单克隆抗体29.08的浓度：1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶10,000，相当于浓度10.74-0.537μg/ml。

[0109] ·外亲合素的浓度：1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶10,000，相当于浓度4-0.2μg/ml。

[0110] 根据这些实验，建立了下面实施例6所述的夹心ELISA法的最后步骤。

[0111] 实施例6r-hsLDLR夹心ELISA法的建立

[0112] 用单克隆抗体28和29.08建立r-hsLDLR的夹心ELISA法。简单地说，在2-8℃用100μl蛋白质G纯化的单克隆抗体28(5μg/ml)把96孔板覆盖过夜或在37℃3小时。孔板用PBS+0.05％Tween洗5次，然后在37℃用200μl封闭溶液(PBS+1％BSA或明胶+0.05％Tween 20+Thimerosal0.05％)培养1小时或在4℃培养过夜，然后用PBS+0.05％Tween洗5次，把100μl样本或校准曲线抗原(CHO的+291 r-hsLDLR，在封闭溶液中稀释至0.5-32ng/ml)加入孔中，在37℃摇动培养90分钟。孔板再用PBS+0.05％Tween 20洗
5次。

[0113] 加入含有100μl/孔生物素化的单克隆抗体29.08(0.69μg/ml)的封闭溶液，在37℃摇动培养1小时。孔板用PBS+0.05％Tween 20洗5次。取100μl市售的外亲合素/过氧化物酶共轭物(Extravidin TM-Peroxideas Biomakor Cat.#0645-1)稀释至
1∶10,000，并加入孔中，在37℃摇动培养1小时。孔板用PBS+0.05％Tween 20洗5次。
向每个孔加入125μl上述底物溶液，培养约10分钟，直至颜色变成所需的深浅度。加入
125μl4N盐酸使反应中止。用ELISA读数器在492和405nm波长时读出96孔板的吸收率，并用连接到ELISA读数器的个人计算器中的MultiCale软件计算所得结果。

[0114] 实施例7同种型单克隆抗体

[0115] 根据制造商的检测程序用市售同种型试剂盒(PharMingen International)确定同种型单克隆抗体免疫球蛋白(Ig)。克隆12.6、28、29.8和30确定为IgG1，而克隆50.30是IgM类。

[0116] 实施例8SDS-PAGE免疫印迹分析法

[0117] 用成为r-hsLDLR的单克隆抗体通过免疫印迹分析法分析纯化的r-hsLDLR的+291型以及从人尿液纯化的天然LDLR。简单地说，在还原条件下(0.04M白喉破伤风类毒素(DTT))把12％SDS Poly Acrylamide凝胶和浓度为100ng/条的r-hsLDLR的CHO+291型，或天然尿液的hsLDLR或TBP-1原收集液一起装入色谱柱(作为负调控)。每条带也装上低分子量标记物(LMW)。将这组样本洗脱5次。通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜。该滤膜在含有10％低脂奶、0.1％Tween 20的PBS中培养16小时。将滤膜剪成条状，每条条带用5种选出来的单克隆抗体：12.6、30、50.30、28或29.08(腹水稀释至1∶4000)中的其中一种在室温下培养2小时。

[0118] 用含有0.1％Tween 20(3×15分钟)的PBS洗涤膜带，并用第二抗体-与辣根过氧化物酶/醶性磷酸酶共轭的山羊抗鼠(稀释至1∶10,000，Biomakor)在室温下培养2小时。

[0119] 用含有0.1％Tween 20(3×15分钟)的PBS洗涤这些膜带。用增强式化学发光法(ECL，Amersham)检测正谱带。

[0120] 在免疫印迹分析法(图2)中单克隆抗体12.6和29.8用于识别尿液和纯化的r-hsLDLR的+291型。单克隆抗体28和30用于识别纯化的r-hsLDLR的+291型。

[0121] 实施例9用单克隆抗体抑制r-hsLDLR的抗病毒活性

[0122] 通过VSV/WISH系统的细胞病效应(CPE)抑制分析法，在体外测试能特异地与r-hsLDLR反应的单克隆抗体抑制r-hsLDLR(+291型)抗病毒活性的能力。

[0123] 把WISH细胞(来源于人羊膜)放在以10％FBS和0.04M谷氨酰胺补给的甲氧基乙基汞(MEM)中，并置于37℃5％的二氧化碳培养箱中培养。在检测开始前24小时把指数型增长的细胞接种在96孔组织培养板中，分布密度为40,000细胞/孔。稀释待测样本和标准样本，并施于孔板的细胞中。立即将VSV加入孔中，感染倍数(MOI)为0.5pfu/孔。孔板在37℃培养16-18小时，用乙醇洗涤。用Gram Crystal Violet stain法观察单层存活细胞。将彩色密度和标准样本浓度的关系作成曲线，定量地作出相对标准样本的细胞病变效应。

[0124] 为了分析抗体的中和效应，将r-hsLDLR在37℃预培养30分钟，其间逐渐增加待测单克隆抗体的腹水浓度。将这些溶液加入96微滴定孔板的WISH细胞培养液中，再加入水疱性口炎病毒(VSV)。培养18小时后，用结晶紫染在剩余细胞上确定由VSV介导的细胞溶解性。将彩色密度(由ELISA读数器确定)和标准样本浓度的关系作成曲线，半定量地作出相对标准样本的细胞病变效应。

[0125] 提高r-hsLDLR浓度测试单克隆抗体效应。结果发现两种单克隆抗体(12.6和50.30)具有中和活性，如表1所示。

[0126] 在表1所示的实验中，在腹水的稀释浓度为1∶40时测试该两种单克隆抗体的抑制效应。在这种稀释浓度下，单克隆抗体12.6的活性比单克隆抗体50.30稍高。这可能是由于单克隆抗体本身的性质以及它们在腹水的浓度差异所引起的。

[0127] 相对单克隆抗体的浓度增加r-hsLDLR可克服单克隆抗体的抑制效应。事实上，当r-hsLDLR的浓度等于62.5U/ml时，在待分析的抗体浓度中没有一种单克隆抗体对r-hsLDLR的活性有任何影响。

[0128] 表1克隆12.6和50.30对r-hsLDLR抗病毒活性的抑制作用①

[0129]

[0130]

[0131] ①r-hsLDLR的抗病毒活性抑制WISH细胞中由VSV介导的细胞溶解性

[0132] 单克隆抗体的抑制效应是在腹水的浓度为1∶40时测定的。存活细胞的数目在表中以光密度(OD)值表示。括号内的数字表示LDLR的浓度为0和12.5U/ml时所进行的复制。

[0133] 提高单克隆抗体12.6和50.30的浓度测定对r-hsLDLR抗病毒活性的抑制作用。在稀释浓度为1∶40(腹水)时，单克隆抗体12.6抑制r-hsLDLR的抗病毒活性大约有
60％，在稀释浓度为1∶20,500时，大约只有35％。而单克隆抗体50.30抑制r-hsLDLR的抗病毒活性大约有45％，在稀释浓度为1∶20,500时，大约只有15％。

[0134] 用两种单克隆抗体得到的剂量应答曲线以及过量r-hsLDLR会减弱其抑制作用的观察结果均认为单克隆抗体与r-hsLDLR结合才会发挥其作用。

[0135] 实施例10用单克隆抗体抑制丙型肝炎病毒(HCV)的复制

[0136] 测试r-hsLDLR的特异性单克隆抗体在主培养液的人肝细胞中抑制丙型肝炎病毒复制的能力。FT167细胞培养液取自一个57岁男病人，他出于医治要求作肺叶切除手术(结肠肿瘤的转移，肺右叶)。

[0137] 人肝细胞的主培养液由两步胶原酶融合法制备[Maurel P.“Adv.Drug Del.Rev.”22：105-132 页，(1996)；Pichard L.等 人，“Mol.Pharmacol.”，41：1047-1055 页，(1992)；Ferrini JB.等人，“ChemBiol Interactions”，107：31-45页，(1997)]。用锥虫蓝排斥试验法确定平皿接种前细胞的存活率。将含有400万个细胞的3ml培养液放在60mm用胶原预覆盖的塑料盘中。长期无血清培养液由Williams’E组成，按公布的方法进行补给[Lanford R.等人，“In Vitro Cell Dev.Biol.”，25：174-182页，(1989)]。随后每48小时更新一次培养液。在湿空气和5％二氧化碳的环境中37℃下保持培养液。在这些培养条件下，人肝细胞不同的表型至少可保持35天[Ferrini JB.等人，“Chem-BiolInteractions”，107：31-45页，(1997)]，它们对丙型肝炎病毒感染敏感，同时又可使病毒基因组进行复制[Fournier C.等人，“J.Gen Virol”，79：2367-2374页，(1998)]。

[0138] 丙型肝炎病毒(HCV)阳性血清样本：建立一个人血清库，这些人血清均来自由EIAHCV3.0和Chiron RIBA HCV 3.0 SIA测试其抗HCV抗体呈阳性的病人。所有病人没有一个感染了乙型肝炎病毒(HBV)或人免疫缺损病毒(HIV)。在每个血清样本中，由Roche监测器定量HCV RNA以及由直线探针检测法(Line Probe assay)确定基因型[Inno-Lipa HCV II，Innogenetics]。为了避免反复进行冷冻和解冻，将血清样本分装于-80℃保存。这些实验均采用样本S42(基因型lb；病毒数量：410,000个/ml)。

[0139] 为了进行感染和下一步处理，在无菌条件下把肝细胞培养液转移到P3实验室(严格限制人感染微生物)。平皿接种三天后，当细胞从分离的损伤中复原时，以25μl丙型肝炎病毒阳性血清样本(S42)在3ml培养液中培养过夜在体外使肝细胞感染。感染后，细胞用3ml新鲜培养液洗涤，在正常条件下使长期培养液继续培养。

[0140] 用三种不同r-hsLDLR的单克隆抗体12.6、28和29.8处理细胞。感染前30分钟，将细胞与2或8μg/ml的不同单克隆抗体接触。然后如上所述使细胞感染。

[0141] 在相似条件下感染调控细胞，但不进行抗病毒处理。在平行实验中，实验条件相似的情况下，用5000U/ml干扰素α(IFNα)对同一培养液进行处理以作比较(IFNα显著抑制细胞中丙型肝炎病毒的复制)。所有处理均重复一次。

[0142] 感染后5天，取出培养液，用冻磷酸盐缓冲盐水洗涤3次。然后用异硫氰酸6
鈲盐/酸性苯酚提取法从4×10 个肝细胞纯化核糖核酸(RNA)[Chomczynske PN.和
SacciN.，”Analyt.Biochem.”，162：156-159页，(1987)]。将沉淀的RNA溶解在50μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水中，再进行定量。取1μg细胞的核糖核酸用strand-specific rTthRT-PCR检测法分析。

[0143] 为了防止可能出现的感染，strand-specific rTth RT-PCR检测法依次在三种不同环境下进行：分别是预PCR环境、PCR环境以及后PCR环境。溶解在10μl焦碳酸二乙酯处理水中的RNA以矿物油覆盖，并在95℃加热1分钟。将温度降至70℃，加入10μl预热的cDNA反应混合物。然后将温度降至60℃，退火2分钟，在70℃cDNA与rTth DNA聚合酶(Perkin-Elmer)反应20分钟。使温度保持在70℃，加入40μl含有EGTA的预温2+
缓冲液作为Mn 螯合剂以抑制rTth RT活性。反应试管保持在70℃，加入40μl预温的PCR混合物。在Gene Amp PCR系统9600(Perkin-Elmer)进行的PCR条件包括在94℃
初次循环1分钟，在94℃和15秒内循环50次，在58℃循环30秒，在72℃循环30秒，最后还要在72℃循环7分钟。在正链HCV RAN检测法中，反引物P3的核苷酸序列是：
5’-TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTC-3’，(nt：38-56)，[Laskus T.等人，“J.Gen.Virol.”，78：
2747-2750页，(1997)]。将同一引物的次序倒转，检测负链。用琼脂糖(2％)凝胶电泳法分析十分之一扩增的产物，再用BET法染色和在紫外光下摄影。在所有实验中，稀释合成的丙型肝炎病毒(HCV)RNA正和负链，加入总量为1μg的肝RNA以仿真培养肝细胞分析的条件。这些混合物用作RT-PCR检测和分析的正调控。

[0144] 图3显示在LDLR单克隆抗体存在下FT167培养液中HCV负链的制备被完全抑制。由此可见，病毒基因组的复制也被显著抑制。这些结果与LDLR可能是HCV受体的观点吻合。

[0145] 实施例11LDLR嵌合抗体的制备

[0146] 从产生LDLR的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系纯化mRNA。

[0147] 利用纯化的mRNA作为模板，以寡核苷酸与重链可变区(oligo 1)的外显子CH1 5’端和轻链可变区(oligo 2)的Cκh外显子CH1 5’端互补合成特异性cDNA。

[0148] 这样可得到两种cDNA，其中一种编码重链可变区(LDLR特异性)，而另一种编码轻链可变区(LDLR特异性)。将cDNA进行克隆和排序。

[0149] 为构成嵌合重链，只要将克隆人Ig重链的可变区换成(用遗传操作)编码小鼠重链可变区(LDLR特异性)的克隆DNA即可。遗传操作包括利用特异性限制酶和小鼠可变区结合从而激活人Ig的可变区。以同样方法，可构成嵌合轻链。

[0150] 构成成两种哺乳动物表达质体，其中一种包括嵌合重链基因，而另一种包括嵌合轻链基因。同时用这两种媒介物感染杂交瘤细胞系(SP6)。

[0151] 以转染细胞的培养汤作为第二抗体，由ELISA法或免疫印迹法测试LDLR特异性Ig的形成。用Biacore测定嵌合抗体对其配体的亲合力。

[0152] 实施例12具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠(变种小鼠)的制备及hLDLR的单克隆抗体的制备

[0153] WO98/24893和Mendez M.J.等人[“Nature Genetics”，15：146-56页，(1997)]对变种小鼠的制备进行了叙述。

[0154] 在人酵母人造染色体(YAC)库中筛选选出含有人重链可变区(约1000kb)的酵母人造染色体(YAC的克隆方法是需要插入尺寸大于100kb时所选择的方法)。

[0155] DNA印 迹 分 析 法 (Southern blot) 和 脉 冲 场 电 泳 法 (Pulse Field Electrophoresis)的特征在于YACs。这些YACs应该包括在生殖细胞系构作中的Cμ、Cδ、Dh和Vh区。

[0156] 利用YACs中的重叠序列，以一步一步重组的方法在酵母重组YACs。在重组之前，3’端YAC(具有V区)与HPRT选择标记物结合。用PFGE法和DNA印迹分析法(在人重链基因座存在下，其生殖细胞系构作从C区到Vh区)确定重组YAC的结构。

[0157] 用含有完整γ2稳定区、小鼠增强子、新霉素抗性基因的介质对准YAC的偏心臂以产生最终含有完整可变区的重链，即82个Vh基因、6个Jh基因以及三种具有相应调整序列的不同稳定区Cμ、Cδ、Cγ。这种YAC称为yH2。该结构用于制备异种小鼠。

[0158] 用与以上所用的相似策略，重建kappa基因痤，不同之处在于：新霉素选择标记物与含有完整kappa基因痤的重组YAC结合。这种YAC称为yK2。

[0159] 将含有酵母原生质球的YAC与HPRT缺失的E14.TG3B小鼠胚胎干细胞融合，使YAC引入胚胎干细胞。选择HPRT阳性细胞。增殖阳性克隆，并用Southern blots和CHEF blot分析法对阳性克隆进行分析。选择含有完整yH2的YAC。

[0160] 如yH2酵母人造染色体一样，在胚胎干细胞中加入和选择yK2的YAC。

[0161] 将含有胚胎干细胞的yH2显微注射入小鼠C57BL/6J的胚细胞。评估所制成的嵌合雄性小鼠的生殖细胞系遗传给下一代的情况。

[0162] 用DI小鼠培育yH2和yK2转基因小鼠(使基因目标/失活的小鼠重链和kappa链基因座纯合)。每条yH2；DI转基因链均与yK2；DI转基因链一起培育以产生异种小鼠链。

[0163] 用流式细胞仪和ELISA法评估异种小鼠B细胞发育的重建和抗体的制备。

[0164] 按实施例2的方法使异种小鼠免疫。

[0165] 按实施例3和4的方法制备杂交瘤细胞和筛选阳性克隆。

[0166] 杂交瘤细胞克隆12.6、28、29.8、30和50.30在布达佩斯条约(the Budapest Treaty)下保藏在巴黎的Collection Nationale de Culture de Microorganismes(CNCM)，InstitutPasteur，保藏编号分别为I-2390、I-2391、I-2392、I-2393和I-2394。

[0167] 参考文献

[0168] 1.Agnello，V.，Abel，G.，Elfahal，M.，Knight，G.B.，and Zhang，Q X.(1999).“Hepatitis C virusand other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor[In ProcessCitation].”Proc Natl Acad Sci USA，96(22)，12766-71.

[0169] 2.Beisiegel，U.，Schneider，W.J.，Goldstein，J.L.，Anderson，R.G.，and Brown，M.S.(1981).“Monoclonal antibodies to the low density lipoprotein receptor as probes for study of receptor-mediated endocytosis and the genetics of familial hypercholesterolemia.”J Biol Chem，256(22)，11923-32.

[0170] 3.Bieri，S.，Djordjevic，J.T.，Daly，N.L.，Smith，R.，and Kroon，P.A.(1995).“Disulfide bridgesof a cysteine-rich repeat of the LDL receptor ligand-binding domain.”Biochemistry，34(40)，13059-65.

[0171] 4.Brown，M.S.，and Goldstein，J.L.(1976).“Familial hypercholesterolemia：A genetic defect inthe low-density lipoprotein receptor.”N Engl J Med，294(25)，
1386-90.

[0172] 5.Brown，M.S.，and Goldstein，J.L.(1986).“A receptor-mdeiated pathway for cholesterolhomeostasis.”Science，232(4746)，34-47.

[0173] 6.Chomczynski，P.N.，And Sacchi，N.(1987).“Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium phiocyanate-thenol-chloroform extraction”.Analyt.Biochem.162：156-9.

[0174] 7.Eshhar Z，1985“Monoclonal Antibody Strategy andTechniques”in“Hybridoma technology inthe bioscience and medicine”，Edited by Timothy A.Springer(Plenum Publishing Corporation，1985；Chapter 1).

[0175] 8.Fischer，D.G.，Tal，N.，Novick，D.，Barak，S.，and Rubinstein，M.(1993).“An antiviral solubleform of the LDL receptor induced by interferon”.Science，262(5131)，250-3.

[0176] 9.Fischer，D.G.，Novick，D.，Cohen，B，Rubinstein，M.(1994).“Isolation and characterization ofa soluble form of the LDL receptor，an interferon-induced antiviral protein”.Proc Soc Exp BiolMed 206(3)，228-32.

[0177] 10.Ferrini，J.B.，Pichard，L.，Domergue，J.，and Mautel，P.(1997).“Long-term primary cultures ofadult human hepatocytes”.Chem-Biol Interactions 107：31-45.[0178] 11.Fournier，C.，Sureau，C.，Coste，J.，Ducos，J.，Pageaux，G.，Larrey，D.，Domergue，J.，andMaurel，P.(1998).“In vitro infection of adult normal human hepatocytes in primary culture byhepatitis C virus”.J.Gen Virol.79：2367-74.[0179] 12.Goldstein，J.L.，Anderson，R.G.，and Brown，M.S.(1979)，“Coated pits，coated vesicles，andreceptor-mediated endocytosis.”Nature，279(5715)，679-85.[0180] 13.Goldstein，J.L.，Dana，S.E.，Brunschede，G.Y.，and Brown，M.S.(1975).“Geneticheterogeneity in familial hypercholesterolemia：evidence for two different mutations affectingfunctions of low-density lipoprotein receptor.”Proc Natl Acad Sci USA，72(3)，1092-6.

[0181] 14.Lanford R.E.，Carey，K.D.，Estlack，L.E.，Smith，G.C.，and Hay，R.V.(1989).“Analysis ofplasma protein and lipoprotein synthesis in long-term primary cultures of baboon hepatocytesmaintained in serum-free medium”In Vitro Cell Dev.Biol.25：174-82.

[0182] 15.Laskus T.，Radkowski，M.Wang，L.F.，Cianciara，J.，Vargas，H.，and Rakela，J.(1997).“Hepatitis C virus negative strand RNA is not detected in peripheral blood mononuclear cellsand viral sequences are identical to those in serum：a case against extrahepatic replication”.J.Gen.Virol.78：2747-50.

[0183] 16.Maurel P.(1996)“The use of adult human hepatocytes in primary culture and other in vitrosystems to investigate drug metabolism in man”.Adv.Drug Del.Rev.，22：105-132.

[0184] 17.Mendez，M.M.，Green，L.L.，Corvalan，J.R.F.，Jia X-C.，Maynard-Currie，E.E.，Yang，X-D.，Gallo，M.L.，Louie，D.M.，Lee，D.V.，Erickson，K.L.，Luna，J.，Roy，C.M-N.，Abderrahim，H.，Kirshenbaum，F.，Noguchi，M.，Smith，D.M.，Fukushima，A.，Hales，J.F.，Finer，M.H.，Davis，C.G.，Zsebo，K.M.，and Jakobovits，A.(1997).“Functional transplant of megabasehuman immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice”.Nature Genetics，15，146-56.

[0185] 18.Pichard，L.，Fabre，I.，Daujat，M.，Domergue，J.，Joyeux，H.，and Maurel，P.(1992).“Effect ofcorticosteroids on the expression of cytochromes P450 and on cyclosporin a oxidase activity inprimary cultures of human hepatocytes”Mol.Pharmacol.41：1047-55.

[0186] 19.Riachmann，L.，Clark，M.，Waldmann，H.，and Winter，G.(1988).“Reshaping humanantibodies for therapy.”Nature，332，323-37.

[0187] 20.Sudhof，T.C.，Goldstein，J.L.，Brown，M.S.，and Russell，D.W.(1985).“The LDL receptorgene：a mosaic of exons shared with different proteins.”Science，228(4701)，815-22.

[0188] 21.Urlaub，G.and Chasin，L.A.(1980)Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient inDihydrofolate Reductase Activity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220.