重组α-L-艾杜糖苷酶,其生产和纯化的方法以及治疗其缺陷导致的疾病的方法

摘要

本发明提供了一种重组人α-艾杜糖苷酶及其生物活性片段和突变物，大规模生产和纯化商业级重组人α-L-艾杜糖苷酶的方法和治疗包括α-L-艾杜糖苷酶缺陷症和I型粘多糖病(MPS I)的某些遗传疾病的方法。

权利要求

1.一种重组α-L-艾杜糖苷酶制备物，其中，该制备物含有SEQ ID NO：2的重组α-L-艾杜糖苷酶，纯度相当或大于99％。

2.如权利要求1所述的重组α-L-艾杜糖苷酶制备物，其特征在于，该酶具有每毫克蛋白大于240,000单位的比活力。

3.如权利要求1所述的重组α-L-艾杜糖苷酶制备物，其特征在于，所述酶是SEQ ID NO：2的残基26-653。

4.如权利要求1所述的重组α-L-艾杜糖苷酶制备物，其特征在于，所述酶具有相当于或大于99.9％的纯度。

5.一种药物组合物，其特征在于，该组合物仅含有权利要求1中所述的重组α-L-艾杜糖苷酶，或还含有药物学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物还含有氯化钠溶液，缓冲液和聚山梨醇酯80。

7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述重组α-L-艾杜糖苷酶以

0.05-0.2毫克/毫升和12500-50000单位/毫升的浓度存在。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述氯化钠溶液浓度是150mM。

9.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲液是浓度为100mM，pH5.4-5.9的磷酸钠缓冲液。

10.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述溶液的pH维持在5.8。

11.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述聚山梨醇酯80维持在

0.001％。

12.如权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述人重组α-L-艾杜糖苷酶以100SI单位/毫升或125,000单位/毫升的浓度存在。

13.权利要求11所述的药物组合物的用途，其特征在于，该组合物用于制备含有稳定化的重组α-L-艾杜糖苷酶蛋白质制备物的药物，所述聚山梨醇酯用于稳定最终产品中的所述重组α-L-艾杜糖苷酶蛋白质。

14.一种将权利要求1所述的α-L-艾杜糖苷酶纯化到纯度等于或大于99％的方法，其特征在于，该方法包括步骤：(a)收集并过滤从被编码所述人重组α-L-艾杜糖苷酶的核酸转化的细胞培养物获得的第一液体；

(b)将该第一液体的pH调节到酸性pH，然后用0.2-0.54微米的滤膜过滤，产生第二液体；

(c)使该第二液体通过蓝色琼脂糖FF柱，来捕获所述人重组α-L-艾杜糖苷酶，产生第三液体；

(d)将该第三液体通过铜螯合琼脂糖柱，来除去污染的蛋白，产生第四液体；

(e)将该第四液体通过苯基琼脂糖柱，来减少从先前的柱带出的剩余的渗漏Cibacron蓝染料和铜离子；和(f)浓缩并渗滤纯化的人重组α-L-艾杜糖苷酶；

所述方法包括在步骤(a)-(f)使用的所有缓冲液中使用10％的甘油。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述蓝琼脂糖FF柱用于将所述人重组α-L-艾杜糖苷酶纯化7-10倍。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)包括将该第一液体的pH调节到pH5.3。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述纯化的人重组α-L-艾杜糖苷酶具有每毫克蛋白大于200,000单位的比活力。

18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述纯化的人重组α-L-艾杜糖苷酶具有每毫克蛋白大于240,000单位的比活力。

19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述纯化的人重组α-L-艾杜糖苷酶含有连接在3-位的甘露糖-6-磷酸残基和6-位的甘露糖-6-磷酸残基。

20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述纯化的人重组α-L-艾杜糖苷酶在细胞内具有约5天的半衰期。

21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述人重组α-L-艾杜糖苷酶具有SEQ ID NO：2的残基26-653的氨基酸序列。

22.权利要求5所述的组合物的用途，其特征在于，该组合物用于制备药物。

23.权利要求5所述的组合物的用途，其特征在于，该组合物用于制备治疗完全或部分由α-L-艾杜糖苷酶缺陷导致的疾病的药剂。

24.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述疾病是粘多糖病。

25.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述疾病是I型粘多糖病。

26.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述疾病选自Hurler氏病、Scheie综合征和Hurler-Scheie综合征。

27.如权利要求23-26任一所述的用途，其特征在于，患病的所述个体显示1％或以下的正常α-L-艾杜糖苷酶活性。

说明书

重组α-L-艾杜糖苷酶，其生产和纯化的方法以及治疗其

缺陷导致的疾病的方法

发明领域

[0001] 本发明提供了一种重组人α-艾杜糖苷酶及其生物活性片段和突变物，大规模生产和纯化商业级重组人α-L-艾杜糖苷酶的方法和治疗包括α-L-艾杜糖苷酶缺陷症和I型粘多糖病(MPSI)的某些遗传疾病的方法。

[0002] 发明背景

[0003] 糖类在活生物体功能中起到许多重要作用。除了其代谢作用，糖类还是人体的结构组分，与许多其它分子，如蛋白质和脂类共价结合(称为糖复合物)。例如，人结缔组织和细胞膜含有蛋白质、糖类和蛋白聚糖基质。该蛋白聚糖基质中的糖类部分对身体结构起到了重要作用。

[0004] 有糖类切割作用的溶酶体酶α-L-艾杜糖苷酶的基因缺陷导致溶酶体储藏异常，称为I型粘多糖病(MPSI)(Neufeld和Muenzer，pp.1565-1587，见：先天性疾病的代谢基础，C.R.Scriver，A.L.Beaudet，M.S.Sly和D.Valle，McGraw-Hi ll编，New York(1989))。MPS I的严重形式通常称为Hurler综合征，伴有多种问题，如智力迟钝、角膜浑浊、粗糙的面部特征、心脏病、呼吸道疾病、肝和脾肿大、疝和关节强直有关。患Hurler综合征的病人通常在10岁前死亡。在称作Hurler-Scheie综合征的中度形式中，智力功能正常，没有被严重影响，但是生理问题可在十几岁-20几岁之间导致死亡。Scheie综合征是MPS I最轻的形式。它可以具有正常的寿命，但是关节强直、角膜浑浊和心脏瓣膜疾病导致严重的问题。

[0005] 根据British Columbia调 查所 有的新 生儿，MPS I的 发病率 估计 是1∶100,000(Lowry等，Human Genetics 85：389-390(1990))，根据一项在爱尔兰的研究是
1∶70,000(Nelson，Human Genetics 101：355-358(1990))。似乎该疾病没有人种偏性。
似乎全球该疾病的诊断都被低估了，因为在诊断前病人就已经由于并发症而死亡或由于较轻的综合征可被误诊为关节炎或完全被忽略。有效的MPSI新生儿筛选将找到一些以前未检测到的病人。

[0006] 除了一些病人适合骨髓移植外，没有对全部MPSI患者都适合的治疗方法。Hobbs等(Lancet 2：709-712(1981))首先报道用骨髓移植成功治疗了一个Hurler病患者。从此，几个不同移植中心的临床研究显示如果早期进行，则可改善机体病症，减缓或稳定进行性衰退(Whitley等，Am.J.Med.Genet.46：29-218(1993)；Vellodi等，Arch.Dis.Child76：92-99(1997)；Peters等，Blood 91：2601-2608(1998)；Guffon等，J.Pediatrics 133：
119-125(1998))。然而，显著的发病率和死亡率，以及需要供体骨髓配型，限制了骨髓移植的利用。另一种对所有患者可行的治疗是提供治疗和看护该疾病中的重要突破。

[0007] 在发现了α-L-艾杜糖苷酶可纠正Hurler细胞的培养物中酶缺陷后，考虑过酶置换治疗作为一种可能的MPS I的疗法，但是开发人治疗方法到现在还是不可行的。在纠正过程中，含有甘露糖-6-磷酸残基的酶通过受体介导的胞吞作用被摄入细胞，并转移到溶酶体处，其清除储藏的底物，硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素。

[0008] 对于MPS I的α-L-艾杜糖苷酶的治疗，需要重组来源的酶来获得治疗上足够来源的酶。在1991年克隆了犬酶的cDNA(Stoltzfus等，J.Biol.Chem.267：6570-6575(1992))，同 年 克 隆 了 人 酶 (Scott 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：
9695-9699(1991)，Moskowitz等，FASEB J 6：A77(1992))。克隆了α-L-艾杜糖苷酶的cDNA后，足量重组α-L-艾杜糖苷酶的产生使得研究犬MPS I的酶替换治疗变为可能(Kakkis等，Protein Expr.Purif.5：225-232(1994))犬MPS I模型中的酶替换研究证明，静脉内施用重组α-L-艾杜糖苷酶分布广泛，并在许多组织中减少溶酶体储藏(Shull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：12937-12941(1994)；Kakkis等，Biochem.Mol.Med.58：
156-167(1996))。

[0009] 发明简述

[0010] 在一个方面，本发明的特征是一种大量生产具有能让病人长期进行酶治疗的大量的有合适纯度的重组α-L-艾杜糖苷酶的方法。在一个广泛实施例中，该方法包括步骤：将编码全部或部分α-L-艾杜糖苷酶的cDNA转染入适合其表达的细胞。在一些实施例中，使用编码完整α-L-艾杜糖苷酶，优选α-L-艾杜糖苷酶的cDNA。然而，在其它实施例中，可使用编码其生物学活性片段或其突变物的cDNA。特别是可产生一个或多个氨基酸取代，同时保留或增强酶的生物活性。在其它优选例中，用表达载体将cDNA转移到合适的细胞或细胞系中，在其中表达。在一个特性的优选例中，cDNA被转染到中国仓鼠卵巢细胞中，建立细胞系2.131。在其它优选例中，生产过程具有下列显示出特别高生产水平的特征：
(a)细胞生长培养液的pH在生产过程中降到6.5-7.0，优选约6.8-7.0，(b)多达2-3.5培养体积的培养液在每24小时中通过连续灌注更换。(c)氧饱和度可优化到约40％，但可以高到80％，(d)在培养液中最初具有约5％血清的大孔纤维素微载体可用于产生细胞团块，然后用快速冲洗，转移到无蛋白质的生产培养液中，(e)无蛋白质或低蛋白质培养液，如JRHBiosciences PF-CHO产物可优化成含有补充量的一种或多种成份，选自谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、核糖核苷和脱氧核糖核苷；(f)搅拌罐悬浮培养液可在连续过程中灌流，产生艾杜糖苷酶。

[0011] 在第二个方面，本发明提供了一种转染细胞系，它的特征是产生其量能治疗性使用该酶的α-L-艾杜糖苷酶。在优选例中，本发明的特征是一种重组中国仓鼠卵巢细胞系，例如稳定和可靠的产生其量能治疗性使用该酶的α-L-艾杜糖苷酶的2.131细胞系。在一些优选例中，细胞系可含有1个以上的表达构建物拷贝。在甚至更优选的实施例中，细胞系表达重组α-L-艾杜糖苷酶，其量至少是20毫克/107细胞/天。

[0012] 在第三个方面，本发明提供了适合产生其量能治疗使用该酶的α-L-艾杜糖苷酶的新载体。在优选例中，本发明的特征是一种表达载体，它含有巨细胞病毒启动子/增强子元件、由小鼠Cα内含子构成的5’内含子，编码α-L-艾杜糖苷酶全部或片段或突变物的cDNA，和3’牛生长激素聚腺苷酸位点。另外，优选编码α-L-艾杜糖苷酶全部或片段或突变物的cDNA是长约2.2kb。该表达载体可以与任何合适的常用选择载体，例如pSV2NEO以50∶1的比例转染，来增强多拷贝插入。另外，可用基因扩增来引入多拷贝插入物。

[0013] 在第四个方面，本发明提供了根据本发明的方法产生，因此以能治疗使用该酶的量存在的新颖α-L-艾杜糖苷酶。根据本发明，α-L-艾杜糖苷酶的比活力超过200,000单位/毫克蛋白。优选超过约240,000单位/毫克蛋白。本发明α-L-艾杜糖苷酶的分子量是约82,000道尔顿，约70,000道尔顿是氨基酸，约12,000道尔顿是糖类。

[0014] 在第五个方面，本发明的特征是一种纯化α-L-艾杜糖苷酶的新颖方法。根据第一个实施例，细胞团块在含约5％血清的培养液中生长，然后换到改良的无蛋白质生产培养基中，没有任何显著的适应期而生产纯化的高比活力起始材料。在一个优选例中，用三步柱层析纯化酶。这种三步柱层析可包括使用蓝色琼脂糖FF、Cu++螯合琼脂糖层析和苯基琼脂糖HP层析。在另一个优选例中，用酸性pH处理步骤灭活可能的病毒，而不伤害酶。除去伴刀豆蛋白A-琼脂糖、肝素-琼脂糖和Sepahcryl200柱，加入Blue-Sepharose和铜螯合剂，来提高大量纯化过程的能力，减少不适于长期病人使用的不良浸出物，改善产品的纯度。

[0015] 在第六个方面，本发明的特征是治疗全部或部分由α-L-艾杜糖苷酶缺陷导致的疾病的新方法。在一个实施例中，该方法的特征是单独或联合药物学上合适的载体施用重组α-L-艾杜糖苷酶或生物活性片段或其突变物。在其它实施例中，该方法的特征是在体内将编码全部或部分α-L-艾杜糖苷酶的核酸转移到一个或多个宿主细胞中。优选例包括将剂量优化到要治疗的生物，优选哺乳动物或人类的需要，来有效消除疾病症状。在优选例中，疾病是I型粘多糖病(MPS I)、Hurler综合征、Hurler-Scheie综合征或Scheie综合征。

[0016] 在第七个方面，本发明的特征是一种新颖的药物组合物，含有用于治疗全部或部分由α-L-艾杜糖苷酶缺陷导致的疾病的α-L-艾杜糖苷酶。这些组合物可适合以许多方式，例如胃肠外、外用、鼻内、吸入或口腔给药。在该方面的范围内的实施例的特征是编码全部或部分α-L-艾杜糖苷酶的核酸序列，它可以在体内施用而进入患有α-L-艾杜糖苷酶缺陷的细胞。

[0017] 附图简述

[0018] 图1代表了编码α-L-艾杜糖苷酶(SEQID NO：1和2)的cDNA的核苷酸和推测的氨基酸序列。提供了核苷酸1-6200。提供了开发阅读框中第一个甲硫氨酸开始的氨基酸。

[0019] 图2代表根据下文所述获得的洗脱物SDS-PAGE运行的结果。顶部显示纯化的α-L-艾杜糖苷酶(3微克)和来自Kakkis等，Protein Expr.Purif.5：225-232(1994)公开的生产/纯化流程的污染物的SDS-PAGE结果。在底部，来自未出版的先前生产/纯化过程(美国专利申请号09/078,209和09/170,977)，称为Carson法的纯化α-L-艾杜糖苷酶和污染物的SDS-PAGE结果，泳道2(7.5微克α-L-艾杜糖苷酶)和泳道3(5.0微克α-L-艾杜糖苷酶)与本发明称作Galli法的生产/纯化过程的结果(泳道4，5微克α-L-艾杜糖苷酶)比较。泳道1含有分子量标记。图2显示本发明的Galli生产/纯化法得到高度纯化的α-L-艾杜糖苷酶产物，与先前的生产/纯化流程比较，污染物更少。

[0020] 图3显示30天周期内α-艾杜糖苷酶的生产水平，其中细胞在第5天从含血清的培养液切换到无血清培养液中。α-艾杜糖苷酶的产生特征是：(1)当细胞在100200(上图和下图)从含血清的培养液切换到无血清的培养液中时，不存在适应的需要，具有不间断的生产率增加(上图)；(2)无蛋白质培养液(下图)中超过4毫克/升(1000毫升)的高生产水平；和(3)用丁酸诱导事件(下图)增强α-艾杜糖苷酶。

[0021] 图4显示在MPS I病人酶治疗中肝体积的减小。

[0022] 图5显示酶治疗期间尿中GAG排泄。

[0023] 图6显示酶治疗期间HAC002中肘和膝伸展。

[0024] 图7显示在酶治疗中至104周具有最大限制的4个病人中肩膀的弯曲。

[0025] 图8显示治疗6周前后睡眠时呼吸暂停的改善。

[0026] 图9显示用酶治疗的各病人中在睡眠过程中呼吸暂停和呼吸浅慢的改善。

[0027] 图10显示1个病人酶治疗12和52周前后肺功能的改善。

[0028] 图11显示酶治疗提高长高速度。

[0029] 图12显示用(1)Carson法，一种未出版的现有生产/纯化法(美国专利申请系列号09/078,209和09/170/977)和(2)Galli法，本发明的生产/纯化法产生的中国仓鼠卵巢细胞蛋白(CHOP)污染程度和α-L-艾杜糖苷酶纯度。因此，图12显示与Carson法比较，用Galli法生产和纯化的α-L-艾杜糖苷酶具有更高程度的纯度和更低程度的CHOP污染。

[0030] 发明详述

[0031] 在一个方面，本发明的特征是一种产生α-L-艾杜糖苷酶的方法，其数量使得将该酶用于治疗成为可能。通常，该方法的特征是用编码全部α-L-艾杜糖苷酶或生物活性片段或其突变物的cDNA转化合适的细胞系。本领域技术人员可制备除了本文简单描述的那些以外的表达构建物，以优化α-L-艾杜糖苷酶在用其转染的合适细胞系中的生产。另外，熟练技术人员可轻易的设计编码天然存在的α-L-艾杜糖苷酶的生物活性片段和突变物(具有与天然存在的全长酶具有相同或相似的生物活性)的cDNA片段。

[0032] 为了建立α-L-艾杜糖苷酶的重组来源，可构建一大系列的表达载体，测试α- L-艾杜糖苷酶cDNA的表达。基于瞬时转染实验和稳定转染，可鉴定出提供特别高水平表达的表达构建物。在本发明的一个实施例中，通过转染α-L-艾杜糖苷酶表达构建物，选择高表达克隆建立了中国仓鼠卵巢细胞系2.131，提供了特别高水平的表达。本发明该实施例的这种中国仓鼠卵巢细胞系可比正常的分泌多约5,000-7,000倍的α-L-艾杜糖苷酶。可正确加工因此产生的α-L-艾杜糖苷酶，被具有高亲和力的细胞吸收，并对于α-L-艾杜糖苷酶缺陷细胞，例如那些来自患Hurler综合征的病人的细胞具有矫正性。

[0033] 产生能用于治疗的数量的α-L-艾杜糖苷酶的方法的特征是：一种特别设计的生产方法，用于大量产生商业级的酶，其中酶的质量被许多国家的管理机构认为是对人给药可接受的。大量生产商业级的酶必需改变细胞培养规模，微载体系统，和纯化流程。在优选例中，细胞培养规模从45升增加到110升或以上，变成连续灌注。规模的增加是产生足够物质，用于病人长期使用的可能大规模生产。根据该方法的优选例，用微载体作为低成本可测量表面，培养附着的细胞。在具体优选例中，该微载体是大孔，特别含有改性的糖类，如纤维素，例如Pharmacia生产的Cytopore珠。大孔纤维素微载体能够改进细胞附着，并提供更大的附着表面积，预期在培养过程中得到提高的细胞密度。预期更高的细胞密度提高生产率。在优选例中，用Blue-Sepharose和Copper螯合柱代替肝素-Sepharose和Sephacryl200柱，来提高大规模纯化过程的能力，提高产品的纯度。在特定的优选例中，用铜螯合柱将中国仓鼠卵巢细胞蛋白污染物降低到非常低的水平适合大规模销售。用特征是下述改变和诱导的本方法的实施例，可在开始的110升培养系统中每日每升在峰值培养密度下产生约
15mg培养物，或更多。

[0034] 根据本发明产生α-L-艾杜糖苷酶的方法的其它优选例，优化了培养系统。在第一个实施例中，培养pH在生产过程中低至约6.5-7.0，优选约6.7-7.0。这种pH的一个优点是增强在酸性pH下更加稳定的溶酶体酶的累积。在第二个实施例中，连续灌注的每24小时可更换多至2-3.5倍培养物体积的培养液。该方法的一个优点是增强重组α-L-艾杜糖苷酶的分泌速度，和收获活力更高的酶。在第三个实施例中，氧饱和度优化到约40％。在第四个实施例中，用最初在培养液中具有约5％血清的多孔微载体产生细胞团块，然后迅速冲洗到生产用的无蛋白培养液中(图3)。在第五个实施例中，可优化无蛋白的生长培养液，例如JRH Biosciences PF-CHO产物，来诱导补充量的一种或多种成份，这些成份选自：
谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、核糖核苷和脱氧核糖核苷。在第六个实施例中，连续灌注的每
24小时可更换多至2-3.5倍培养物体积的培养液。这种诱导过程可使产量约增加2倍，而不明显改变翻译后加工。

[0035] 本发明生产α-L-艾杜糖苷酶的方法的特别优选例的特征是：本文所述的一种，多种或全部优化可如下文更详细所述的使用。本发明的生产方法因此可以提供具有下列特征的生产培养过程：

[0036] 1.用改性纤维素或其等价物制成的大孔微载体的基于微载体的培养优选在具有顶置搅拌或其等价物的大规模培养瓶中进行。细胞与这些珠的附着可由5％胎牛血清的培养实现，胎牛血清可加到DME/F121∶1或用成份改良的无蛋白质的培养液中，这些成份包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、丙酮酸、非必需氨基酸和HEPES。在该培养液中约3-6日后，开始洗出过程，其中无蛋白培养液根据葡萄糖含量和培养条件以不断提高灌注速率下取代含血清的培养液。随后在整个剩余的培养期中，在无蛋白培养液中培养细胞。在酶生产中使用无蛋白质培养液对于减少用该酶治疗的病人与牛海绵状脑病(BSE)和其它感染性生物媒介，例如病毒接触是有益的，其中BSE或其它有害因子的危险性由可能的血清接触量决定。在先前出版的研究中，用来生长细胞的载体是牛明胶微载体，每升使用1克或产物浓度的100倍。1％的明胶蛋白从微载体中泄漏代表100％的相对污染度，因此引起了BSE的危险。因此，新载体基于葡聚糖或纤维素，由糖类构成，不是动物衍生的物质。

[0037] 图3显示了细胞在含5％血清的培养液中生长到一定密度，不需任何适应就转移到无蛋白培养液。图3特别显示：1)当不经过适应就转移时，细胞存活并继续产生艾杜糖苷酶。相反，其它研究将提出对无蛋白培养液的适应是必需的。在本发明的方法中，酶生产保持在与含血清培养液相当的水平上。2)在无蛋白培养液中产生的α-L-艾杜糖苷酶保留一定水平的生产，超过4毫克/升或1,000单位/毫升。3)在无蛋白培养液中产生的α-L-艾杜糖苷酶具有高吸收，表明培养液的转换，由此补给给细胞的糖的切换对酶的高吸收特征没有不良影响。生产了8批α-L-艾杜糖苷酶，以该方式释放，在所有批中具有小于2nM的释放半最大值。

[0038] 2.优选培养条件维持在溶解氧为40％空气饱和度，pH约6.8-7.0，温度约35-37℃。这可以用控制元件，监测元件和合适的探头，例如 或 实现。
然而，熟练技术人员不难理解这可以用其它厂商生产的等价控制系统实现。约40％的空气饱和度导致改善的α-L-艾杜糖苷酶分泌，虽然可用达80％空气饱和度。然而，进一步将氧增加到例如90％空气饱和度与80％空气饱和度相比并不显著增强分泌。可用5微米不锈钢或更大的开口喷射器或其等价物通过间断或连续的氧喷射提供溶解氧。pH约6.8-7.0是α-L-艾杜糖苷酶累积最佳的。该酶在约7.0以上的pH特别不稳定。在pH6.7以下，分泌速率会下降，特别在pH约6.5以下。因此培养物最佳维持在pH约6.8-7.0之间。

[0039] 3.生产培养基可以是JRH Biosciences的商业可得的专利培养液，称为ExcellPF CHO的改良形式。在使用如2.131细胞等的一种细胞系时，该培养液支持与使用例如细胞系，如2.131细胞系的血清等价的分泌水平。优选的改良使其产生约6.8-7.0(±0.1)的酸性pH，用7.5mM或15mM的HEPES缓冲。该培养液可含有0.05-0.1％的Pluronics F-68(BASF)，非离子表面活性剂或其等价物，其特征是保护细胞不受与喷射相关的剪切力的伤害。该培养液还可以含有可提高培养液的产率超过其它目前可得的无蛋白培养液的专利补充物。本领域技术人员不难理解培养液的选择可根据在特定时间点可得的特定的商品实施例连续优化。这些改变不超越常规实验，应在本发明的范围内。

[0040] 4.可用氨基酸分析仪比较用过的培养液和起始培养液来分析生产培养液。这种分析显示2.131细胞系消耗起始浓度约10％水平的甘氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的标准PF CHO培养液。补充这些氨基酸到更高的水平将导致培养密度和产率增强，可导致比基线高2-3倍。熟练技术人员应理解本发明范围内的其它细胞系根据本方法产生α-L-艾杜糖苷酶也同样有用。因此，可需要更多或更少的补充营养来生产α-L-艾杜糖苷酶。这些优化在本发明的范围内，并不需过度实验来进行。

[0041] 5.可用四种核糖核苷和四种脱氧核糖核苷各10毫克/升补充培养液，来支持二氢叶酸还原酶缺陷型细胞系2.131。熟练技术人员将理解本发明范围内的其它细胞系对于根据本发明生产α-L-艾杜糖苷酶是同样有用的。因此，可需要更多或更少的核糖核苷和脱氧核糖核苷优化培养液，以及可用用于核酸合成的嘌呤和嘧啶的其它来源，例如次黄嘌呤和胸腺嘧啶。这些优化在本发明的范围内，并不需过度实验来进行。

[0042] 6.约培养3-6天达到汇合后，连续灌注的速率开始提高。可实现培养液的改变，例如构建和安装倾斜进料管，使得在搅拌培养物时也可以吸收培养液，而不需要除去微载体。用这种方法，可从含有酶的上清液中分离出具有细胞团块的微载体。

[0043] 7.通过产率研究显示了培养液迅速和频繁周转能使从细胞培养物中所收集酶的量的提高。培养液周转少导致每日生产的酶总量少。每日用2-3.5倍培养物体积灌注，可将细胞维持在良好的情况下，具有高存活率和高生产率。

[0044] 8.可用基因表达诱导的丁酸钠增强α-L-艾杜糖苷酶的生产(图3)。用丁酸盐在2nM浓度下诱导，诱导后每12小时2/3冲洗，每48小时重新诱导，生产期是21天，产生了20批α-L-艾杜糖苷酶。在图3中，底部的垂直箭头表明丁酸盐诱导事件。每次诱导引发培养液中α-L-艾杜糖苷酶浓度的上升。

[0045] 系统性研究2.131细胞显示可加入约2mM丁酸盐，导致约2倍或以上的酶生产，对糖加工具有最小的影响。较低水平的丁酸盐不显示诱导，更高水平可导致更高的诱导，但是患α-L-艾杜糖苷酶缺陷的病人细胞产生的酶亲和力下降。体外用2mM丁酸盐诱导24小时，或5mM(更常用的浓度)导致超过3nM或40U/ml的吸收，或在产物批中观察到的值的平均三倍。另外，常用的时间24小时或以上，和5mM的浓度对于α-L-艾杜糖苷酶的生产细胞是有毒的，导致脱落和细胞团块消失。

[0046] 结果提示2倍或更高的诱导导致糖类加工减少，在酶上加上磷酸减少，以及毒性增加。对于糖类加工和磷酸基团的加入，除去两种溶酶体酶、葡糖苷酶和氨基半乳糖4-硫酸酯酶导致吸收下降的观察结果证明磷酸酶置换治疗中甘露糖-6-磷酸的重要性(Van derPloeg 等，J.Clin.Invest.87：513-518(1991)；Crawley 等，J.Clin.Invest.97：
1864-1873(1996))。另外，具有低磷酸酯的酶(Van Hove等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：
65-70(1996))需要1,000单元/毫升用于吸收实验(接近艾杜糖苷酶所用的100倍)，动物模型中有效剂量需要14毫克/公斤，或与含艾杜糖苷酶的高磷酸酯所用的剂量的28倍(Kikuchi等，J.Clin.Invest.101：827-833(1998))。

[0047] 本发明方法的一个特别的优选方面每隔48小时在培养系统中加入2mM丁酸。该实施例用该方法得到酶生产的约2倍诱导，而对于酶的吸收亲和力没有显著影响(K-吸收小于30U/ml或2.0mM)。

[0048] 9.在第二个方面，本发明提供了转染的细胞系，它具有产生能够在治疗上使用该酶所需量的α-L-艾杜糖苷酶的独特能力。在优选例中，本发明的特征是重组中国仓鼠卵巢细胞系，例如2.131细胞系，其稳定可靠的产生大量α-L-艾杜糖苷酶。在优选例中，细胞系可含有1个以上拷贝的表达构建物，该构建物含有CMV启动子、Cα内含子、人α-L-艾杜糖苷酶αDNA和牛生长激素聚腺苷酸序列。在甚至更优选的实施例中，细胞系表达其量7
至少每日约20-40微克/10 个细胞的α-L-艾杜糖苷酶，它是正确加工，适合酶置换治疗的高吸收形式。

[0049] 根据本发明该方面的优选例，适合于生产数量上能满足治疗使用的α-L-艾杜糖苷酶的转染细胞系具有一个或多个下列特征：

[0050] 1.优选例的细胞系衍生自母细胞系，其中细胞在培养物中传代，直到它们获得更小的尺寸和更快的生长速度，直到它们不难与底物结合。

[0051] 2.优选例的细胞系是用表达载体转染的，该表达载体含有巨细胞病毒启动子/增强子元件、5′内含子(包含外显子2和3之间的小鼠Cα内含子)、长约2.2kb的人cDNA，和3′牛生长激素聚腺苷酸位点。该表达载体可以以例如50∶1的比例与任何合适的常用选择载体如pSV2NEO一起转染。选择载体pSV2NEO反过来对成功转染的细胞赋予G418抗性。在特定优选例中，用约50∶1的比例，因为该比例增强多拷贝数目插入的获得。根据一个提供了中国仓鼠卵巢细胞系2.131的实施例，有至少1个α-L-艾杜糖苷酶表达载体拷贝。显示这种细胞系能产生大量α-L-艾杜糖苷酶(最少每天每10,000,000个细胞20微克)。特别的优选例例如2.131细胞系能产生正确加工的酶(含有N-连接的寡糖)，含有用磷酸在6位修饰的足量高甘露糖链，能产生具有高亲和力的酶(K-吸收小于3nM)。

[0052] 3.本发明的细胞系，例如中国仓鼠卵巢细胞系2.131产生的酶迅速被细胞吸收，消除糖胺聚糖储藏，在患有α-L-艾杜糖苷酶缺陷的病人细胞内具有约5天的半衰期。

[0053] 4.优选例的细胞系，例如2.131细胞系适应大规模培养，在这些条件下稳定产生人α-L-艾杜糖苷酶。优选例的细胞能在约6.6-7.0的酸性pH下生长并分泌α-L-艾杜糖苷酶，这增强了α-L-艾杜糖苷酶的聚集。

[0054] 5.本发明细胞系特别优选的实施例，例如2.131细胞系能每日收集超过2次，每毫升2,000单位(8mg/ml)，或用特定配置的无蛋白质培养液每日培养分泌超过15mg/l人α-L-艾杜糖苷酶。

[0055] 在第三个方面，本发明提供了适合生产其数量能满足治疗上使用的α-L-艾杜糖苷酶的新颖载体。重组α-L-艾杜糖苷酶足量生产是研究酶和酶置换治疗的关键前提。本发明的细胞系能生产大量的恰当加工以吸收的重组α-L-艾杜糖苷酶。对于三种其它溶酶体酶描述了在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中用各种启动子(在一种情况下，扩增)的过度表达：α-半乳糖苷酶(Ioannou等，J.Cell.Biol.119：1137-1150(1992))、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(Bielicki等，Biochem.J.289：241-246(1993))、和N-乙酰氨基半乳糖4-硫酸酯酶(Amson等，Biochem.J.284：789-794(1992))。本发明的特征是二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞系，但根据本发明的优选例，扩增不是必需的。另外，本发明用CMV立即早期基因启动子/增强子提供了高水平的人α-L-艾杜糖苷酶表达。

[0056] 本发明在优选例中是特征是一种表达载体，它含有巨细胞启动子/增强子元件，由衍生自小鼠长链免疫球蛋白Cα基因外显子2和3之间的小鼠Cα内含子构成的5′内含子，长约2.2kb的人cDNA，和3′牛生长激素聚腺苷酸位点。该表达载体可以以例如50∶1的比例和任何合适的常用选择载体，例如pSV2NEO一起转染。选择载体pSV2NEO反过来对成功转染的细胞赋予G418抗性。在特定优选例中，用约50∶1的表达载体对选择载体的比例，因为该比例增强多拷贝数目插入的获得。根据一个提供了中国仓鼠卵巢细胞系2.131的实施例，有至少10个左右的α-L-艾杜糖苷酶表达载体拷贝。显示这种细胞系能在合适的细胞系，例如中国仓鼠卵巢细胞系2.131中产生大量α-L-艾杜糖苷酶(最少每天每10,000,000个细胞20微克)。

[0057] 在第四个方面，本发明提供了根据本发明的方法产生的，并在数量上满足治疗性使用的新颖α-L-艾杜糖苷酶。本发明的方法产生正确加工和高吸收形式的基本纯的α-L-艾杜糖苷酶，适合酶置换治疗，在体内治疗有效。

[0058] 本发明α-L-艾杜糖苷酶的比活力超过每微克细胞约200,000单位。优选用活性和蛋白质浓度的原始试验方法，超过每微克蛋白240,000单位。表示成微摩尔/分钟的相同酶的新确证试验显示100单位/ml(范围是70-130)的活力，280nM吸光度表示的蛋白质浓度为0.7mg/ml(0.6-0.8)，平均比活力数均143单位/毫克。本发明全长α-L-艾杜糖苷酶的分子量是约82,000道尔顿，含有70,000道尔顿的氨基酸和12,000道尔顿的糖类。本发明的重组酶被胞吞后更比先前报道的作为部分纯化的脲酶制备物更有效。本发明的重组酶有效减少α-L-艾杜糖苷酶缺陷型成纤维细胞中放射性S-标记的GAG的聚集，表明它被运输到溶酶体，GAG的储藏位点。这种矫正所需的惊人低的α-L-艾杜糖苷酶(半数最大矫正在0.7pM)对于酶置换治疗的成功是非常重要的。

[0059] 人α-L-艾杜糖苷酶的cDNA预测是653氨基酸的蛋白，在信号肽切割后具有预计分子量70,000道尔顿。氨基酸测序揭示N-末端的丙氨酸26得到预计的629个氨基酸的蛋白质。人重组α-L-艾杜糖苷酶在成熟蛋白质的8位具有组氨酸。预测的蛋白质序列具有6个可能的N-连接的寡糖修饰位点。所有这些在重组蛋白内可被修饰。证明了第三和第六位点含有一个或多个甘露糖6-磷酸残基，负责细胞的高亲和力吸收。下列肽对应人重组α-L-艾杜糖苷酶的氨基酸26-45，具有N-末端的丙二酸和下列序列(SEQ ID NO：2)：

[0060] ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg

[0061] 本发明α-L-艾杜糖苷酶的过度表达不导致广义上其它溶酶体酶分泌，它们依赖于甘露糖-6-P靶向。分泌的重组α-L-艾杜糖苷酶在许多方面与正常分泌的酶类似。其分子大小在许多次脲矫正性因子发现的测定结果中是77、82、84和89kDa，相当于87kDa(Barton等，J.Biol.Chem.246：7773-7779(1971))，对于培养的人成纤维细胞分泌的酶中发现的是76kDa和82kDa(Myerowitz等，J.Biol.Chem.256：3044-3048(1991)；Taylor等，Biochem.J 274：263-268(1991))。研究内和之间的区别在于测量条件的不精确性。重组酶胞内加工的情况，分子大小的缓慢减小和最终出现一条小于9kDa的额外条带标记与人成纤维细胞酶相同。该更快的条带是由80N-末端氨基酸蛋白酶解切割产生的。

[0062] 在第五个方面，本发明的特征是一种新的纯化α-L-艾杜糖苷酶的方法。在优选例中，本发明的特征是一种纯化重组α-L-艾杜糖苷酶的方法，它已经被优化，能用确认的层析树脂和简单上样，洗涤和洗脱操作快速有效的纯化。本发明纯化α-L-艾杜糖苷酶的方法涉及一系列柱层析步骤，从无蛋白质的培养液中获得高产率的酶纯化。特别是，伴刀豆蛋白A-琼脂糖、肝素-琼脂糖和Sepahcryl 200柱被Blue-Sepharose和铜螯合剂柱代替，提高大规模纯化过程的能力，减少浸出物，改善产品的纯度。在现在出版的研究中，伴刀豆蛋白A凝血素常用于在最初纯化步骤中结合酶，是一种衍生自植物的蛋白质凝血素。已知伴刀豆蛋白A从柱上浸出，污染溶酶体酶制备物。这种浸出能导致治疗病人中的T细胞活化，因此认为是人给药不适合的(Furbi sh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：3560-3563(1977))。因此，在本纯化流程中避免伴刀豆蛋白A的使用。在现有研究中，人肝脏α-L-艾杜糖苷酶不能从不含高浓度去污剂(1％Triton X100)变性的苯基柱上回收。因此，在该酶出版的纯化流程中不使用苯基柱(Clements等，Eur.J.Biochem.152：
21-28(1985))。内源人肝脏酶在溶酶体内被除去唾液酸和磷酸残基水解酶，和对酶造成缺口的蛋白酶高度修饰。相反，重组α-L-艾杜糖苷酶的过度表达导致50％酶被分泌，而不是运输到溶酶体(Zhao等，J.Biol.Chem.272：22758-22765(1997))。因此，重组艾杜糖苷酶具有完全的唾液酸和磷酸残基阵列，导致更高程度的水溶性和与苯基柱较低的亲和力。亲水性的提高使酶能在非变性条件下用约150-700mM NaCl的低盐浓度洗脱出来。重组酶的该特征使其能大量纯化，而不用去污剂。

[0063] 重组α-L-艾杜糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系过度表达，在3-步柱层析过程后纯化到接近均质。第一柱涉及用Blue Sepharose 6FF的亲和层析步骤。然后Blue Sepharose 6FF进一步通过用Cu++螯合Sepharose FF的另一个亲和层析步骤洗脱纯化。高度纯化的酶的高纯度水处理是用苯基琼脂糖高效(HP)疏水作用层析进行的。总产率是
45-55％，最终产物的纯度大于99％。该方法对于大规模制造是强的，可重复，并且是可升级的。用基于荧光的底物确定了纯化的酶关于酶活性的特征，用成纤维细胞确定其功能性吸收特征。还确定了酶的底物特异性、糖类情况、等电聚焦(IEF)情况的特征。

[0064] 本发明纯化α-L-艾杜糖苷酶的方法的特别优选例的特征是具有下列特定优选例的优化条件。本发明的纯化方法可提供具有本文所述的特征的纯化α-L-艾杜糖苷酶。

[0065] α-L-艾杜糖苷酶纯化方法的概述

[0066]

[0067] 1.pH调节/过滤：过滤收集液(HF)的pH用1M H3PO4调节到5.3，用0.45μ滤膜过滤(例如Sartoclean，Sartorius)。

[0068] 2.Blue琼脂糖FF层析：该亲和层析步骤起到捕获艾杜糖苷酶，减少体积并起到纯化艾杜糖苷酶约7-10倍的作用。

[0069]加样量： 4mg/ml(总蛋白/ml树脂)
平衡缓冲液： 10mMH3PO4，pH5.3
洗涤缓冲液： 400mMNaCl，10mMNaPO4，pH5.3
洗脱缓冲液： 0.8MNaCl，10mMNaPO4，pH5.3
再生缓冲液： 2MNaCl，10mMNaPO4，pH5.3
纯化倍数 7-10
产率 70-85％

[0070] 3.Cu++螯合琼脂糖FF层析：Cu++螯合亲和层析步骤对于除去一些污染的CHO蛋白是非常有效的。在所有缓冲液中加入10％甘油对于定量回收艾杜糖苷酶是关键的。

[0071]加样量： 2mg/ml
平衡缓冲液： 1MNaCl，25mMNaAc，pH6.0，10％甘油
洗涤缓冲液： 1MNaCl，25mMNaAc，pH4.0，10％甘油
洗脱缓冲液： 1MNaCl，25mMNaAc，pH3.7，10％甘油
再生缓冲液： 1MNaCl，50mMEDTA，pH8.0
纯化倍数 2-5
产率 80％

[0072] 4.苯基琼脂糖HP层析：用苯基琼脂糖作为最后一步，进一步纯化产物，并减少残++余浸出的Cibacron蓝染料和先前的柱携带的Cu 。

[0073]加样量： 1mg/ml
平衡缓冲液： 2MNaCl，10mMNaPO4，pH5.7
洗涤缓冲液： 1.5MNaCl，10mMNaPO4，pH5.7
洗脱缓冲液： 0.7MNaCl，10mMNaPO4，pH5.7
再生缓冲液： 0MNaCl，10mMNaPO4，pH5.7
纯化倍数 1.5
产率 90％

[0074] 5.超滤(UF)/渗滤(DF)/最终配制：将纯化的艾杜糖苷酶用切向流过滤(TFF)系统(如Sartorius的Sartocon Slice)浓缩并渗滤到最终浓度为配制缓冲液(150mM NaCl，100mM NaPO4，pH5.8)中1mg/ml。然后滤过0.2微米滤膜(如乙酸纤维素或聚砜)对酶灭菌，并装填入无菌指管中。

[0075] 6.纯化艾杜糖苷酶的特征确定：用考马斯蓝或银染色进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析分析酶纯度。用4MU-硫酸酯作为底物分析酶活性。用成纤维细胞试验分析功能性吸收。用FACE分析糖类。分析IEF情况。

[0076] 显示用该方法纯化的酶在N-连接的糖3位和6位具有足量的甘露糖-6-磷酸残基，得到小于30单位/毫升(小于2nM)酶的酶吸收亲和力。酶能充分矫正艾杜糖苷酶缺陷引起的糖胺聚糖储藏异常，具有约5天的细胞内半衰期。

[0077] 先 前 α-L-艾 杜 糖 苷 酶 纯 化 流 程(Kakkis 等，Protein Expr.Purif5：225-232(1994)；Kakkis等，Biochem.Mol.Med.58：156-167(1996)；美 国 专利 申 请 号
09/078,209和09/170,977)产生纯化程度在90％-99％之间，不是人长期给药最适合的(见图12)(本文中的这些和其它美国专利在此完整引入以供参考)。用最小纯度97％的人重组α-L-艾杜糖苷酶治疗与一些临床反应有关，特别是5个病人中的荨麻疹(hive)，4个病人中补体活化。所有病人显示与作为α-L-艾杜糖苷酶痕量污染物的蛋白质反应(图
2)。因为该蛋白质同时存在于最终产物和无血清的空白CHO细胞系上清液中，外源蛋白最可能起源于CHO细胞。看来激活临床过敏反应的一般蛋白质分别是约60kD和50kD左右，与重组人艾杜糖苷酶相比太小。4个病人至少瞬间对α-L-艾杜糖苷酶，也对中国仓鼠卵巢细胞系产生免疫反应。清楚的是即使用于治疗病人的酶被高度纯化，纯化的程度对于减少对污染物的免疫应答是重要的。图2(SDS-PAGE)和图12(CHOP试验)显示本发明的生产/纯化流程生产和纯化的α-L-艾杜糖苷酶与现有的生产/纯化方法比较，具有更高的纯度和更低的CHOP污染。因此，97％以上的纯度适合病人使用，更高的纯度水平是理想和优选的。如图12所示，上述优化的纯化流程实现大于99％的纯度，重要的是将中国仓鼠卵巢细胞宿主蛋白减少到1％，如中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)试验确定的。

[0078] 在第六个方面，本发明的特征是治疗完全或部分由α-L-艾杜糖苷酶缺陷导致的疾病的新颖方法。重组α-L-艾杜糖苷酶在犬MPS I模型中提供了酶置换治疗。该犬模型由于基因突变具有α-L-艾杜糖苷酶缺陷，与人MPS I类似。将纯化，正确加工的α-L-艾杜糖苷酶静脉施给11只犬。在每周每公斤用25,000-125,000单位剂量治疗0.5，3，6或13个月的犬中，酶被吸收入各种组织，减少许多组织中的溶酶体储藏。疾病的长期治疗与行为改善，关节强直，毛皮和生长有关。高剂量的治疗(每公斤每周125,000单位)得到更好的效力，包括使脲GAG排泄正常化，行为，关节强直和毛发的临床改善更迅速。

[0079] 甚至小剂量25,000单位(0.1mg/kg/wk)的酶治疗导致一些组织中显著的酶分布和GAG储藏的减少。如果持续超过1年，关于活动力增加，大小和整体健康表现的一些临床效果是明显的。该剂量的治疗不改进其它作为疾病的重要位点的组织，例如心脏和大脑。在2周后5次提供更高剂量的125,000单位(0.5mg/kg)显示可实现改进的组织渗透，在2周内就实现组织水平的治疗作用。该增加剂量的研究在两只15个月的犬中完成。这些MPS I犬显示显著的临床改进和尿GAG排泄大大下降到接近正常的水平。除了改进的给药激素控制的免疫反应外，酶治疗不显示显著的临床或生物化学毒性。该高每周剂量水平的酶治疗对于改进MPS I的一些临床特征是有效的，减少储藏而且没有显著毒性。

[0080] 在本发明的第七个方面，本发明的特征是一种新颖药物组合物，含有用于治疗α-L-艾杜糖苷酶缺陷的人α-L-艾杜糖苷酶。该重组的酶可用许多方法，例如胃肠外、外用、鼻内、吸入或口腔给药。本发明的另一个方面通过将其与药物学上可接受的载体(可以是固态，半固态或可消化的胶囊)一起配制，以施用该酶。通常重组酶是组合物总量的0.01％-99％或0.01-99％，用于注射是组合物0.01-20％，用于口腔给药是0.1-50％。

[0081] 为了产生该口腔给药剂量单位形式，含有治疗性酶的药物组合物，将酶和固态粉末状载体，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇，淀粉(如马铃薯淀粉、玉米淀粉)，支链淀粉，昆布粉末或柑橘渣粉末，纤维素衍生物或明胶混合，还可以包含润滑剂，例如硬脂酸镁或钙或 或其它聚乙二醇石蜡，压成片剂或糖衣丸剂的核心。如果需要糖衣丸剂，可用浓缩糖溶液包裹核心，该核心可含有阿拉伯胶、滑石和/二氧化钛，或另选的含有溶于易挥发有机溶剂或有机溶剂混合物中的薄膜形成剂。可在这些糖衣中加入颜料，例如来区别活性物质的不同含量。对于含有明胶和例如甘油作为增塑剂的软明胶，或类似的胶囊的组成，可将活性成份与 或合适的油，例如芝麻油、橄榄油或花生油混合。硬明胶胶囊可含有活性物质的颗粒和固态的粉末状载体，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇，淀粉(如马铃薯淀粉、玉米淀粉)，或支链淀粉，纤维素衍生物或明胶，还可以包含硬脂酸镁或钙或硬脂酸作为润滑剂。

[0082] 本发明的治疗性酶还可胃肠外，例如皮下，肌肉内，或静脉内注射，或通过皮下植入物缓释给药。在皮下、肌肉内和静脉内注射中，治疗性酶(活性成份)可溶于或分散于液态载体中。对于胃肠外给药，活性物质可合适的与可接受的载体，优选各种植物油，例如花生油、棉籽油等混合。还可使用其它胃肠外载体例如使用solketal、甘油、缩甲醛的有机组合物和水相胃肠外制剂。

[0083] 对于通过胃肠外注射给药，组合物可含有一种可溶于水的药物学可接受的本发明活性酸的盐的水溶液，需要在0.01-10％，在水溶液中可任选还有稳定剂和/或缓冲物质。可将溶液的剂量单位密封在安瓿中。

[0084] 当治疗性酶以皮下移植物形式施用时，组合物悬浮或溶于本领域技术人员已知的缓慢分散物质中，或在通过使用恒定驱动力如渗透泵的缓慢释放活性物质的装置中施用。就此，可以在一段持续的时间内给药。

[0085] 对于外用，药物组合物适合软膏、凝胶、悬液、霜等形式。活性物质量可在例如0.05-20％活性物质重量之间变化。可用已知的方法，通过将活性物质与已知载体物质，例如异丙醇、甘油、煤油、硬脂醇、聚乙二醇等混合，制备外用给药的这种药物组合物。药物学上可接受的载体还可包括已知的化学吸收促进剂。吸收促进剂的例子是二甲基乙酰胺(美国专利号3,472,931)、三氯乙醇或三氟乙醇(美国专利号3,891,757)、某些醇及其混合物(英国专利号1,001,949)。在英国专利说明书No.1,464,975中还描述了不破碎皮肤的外用给药的载体物质，它公开了一种由溶液组成的载体物质，含有40-70％(v/v)的异丙醇和
0-60％(v/v)的甘油，如果存在平衡剂，是稀释剂的惰性成份，不超过总溶剂体积的40％。

[0086] 含治疗性酶的药物组合物的给药剂量可以在很大范围内变化，应取决于许多因素，例如疾病的严重程度、病人年龄等，可以根据个人调节。每日给药的治疗性酶的可能剂量是约0.1毫克-2000毫克，或约1毫克-2000毫克。

[0087] 含有治疗性酶的药物组合物可以适当配制，从而能以单剂单位或多剂单位提供这些范围内的剂量。除了含有一种治疗性酶(或多种治疗性酶)，该制剂可含有组合物中治疗性酶催化的反应的一种或多种底物或辅助因子。含治疗性酶的组合物还可含有一种以上的治疗性酶。

[0088] 该方法和组合物中使用的重组酶还可以用编码重组α-L-艾杜糖苷酶的核酸转化病人细胞的方法施用。如此编码的核酸序列可以掺入载体，转化要治疗的个体的细胞。本文描述了这些载体的优选例。载体可设计成整合入个体的染色体，例如反转录病毒载体，或在宿主细胞内自身复制。含有编码α-L-艾杜糖苷酶的核苷酸序列的载体可设计成提供连续或受调控的酶表达。另外，编码酶的遗传载体可以设计成稳定整合入细胞基因组或仅瞬时存在。常规基因治疗的通用方法可用于编码α-L-艾杜糖苷酶的多核苷酸序列。常规基因治疗技术已有广泛综述(Friedman，Science244：1275-1281(1989)；Ledley，J.Inherit，Metab.Dis 13：587-616(1990)；Toshev等，Curr Opinions Biotech 1：55-61(1990))。

[0089] 施用重组酶的特别优选方法是静脉内。特别的优选组合物含有重组α-L-艾杜糖苷酶、生理盐水、磷酸缓冲液(将pH维持在约5.8)和人白蛋白。这些成份以下列量提供：

[0090]α-L-艾杜糖苷酶 0.05-0.2mg/ml或12,500-50,000单位/ml
氯化钠溶液 150mM在IV袋中，50-250cc总体积
磷酸钠缓冲液 10-50mM，pH5.8
人白蛋白 1mg/ml

[0091] 描述了本发明，提供下列实施例是为了通过说明阐明本发明，不是为了限制。

[0092] 实施例1

[0093] 产生重组α-L-艾杜糖苷酶

[0094] Sambrook 等 (Molecular Cloning：A Laboratory Manual， 第 二 版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1987))所述的标准技术可用于克隆编码人α-L-艾杜糖苷酶的cDNA。先前克隆的人α-L-艾杜糖苷酶cDNA可作为HindIII-XbaI片段从bluescriptKS亚克隆中亚克隆入PRCCMV(InVitrogen)。PCR扩增克隆pRIR14.5(Turker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：7684-7688(1991))碱基788-1372构建了衍生自小鼠免疫球蛋白外显子2和3之间的Cot内含子的内含子表达盒(Kakkis等，Nucleic Acids Res.16：7796(1988))。表达盒包括外显子2的3′末端的136bp和外显子3的5′末端的242bp，它们将留在正确剪接的cDNA中。在内含子表达盒的编码区中不存在ATG序列。将内含子表达盒克隆入α-L-艾杜糖苷酶cDNA的HindIII位点5′。

[0095] 冻融工作细胞库的一个指管，置于三个T225烧瓶的DME/F12或PF-CHO plus补充物和5％FBS和500微克/毫升G418中。2-5天后，用胰蛋白酶-EDTA将细胞转移到1升旋转烧瓶中的相同培养基中，传代2-5天。将8升旋转烧瓶中的接种物加到两个110升搅拌罐生物反应器中，其具有80-90升的工作体积。用具有船用叶轮的架空驱动器搅拌。监测培养物的搅拌速度、温度、DO和pH探头，用具有PC界面的 控制系统控制。根据培养条件，35℃-37℃，40％空气饱和度，pH6.95，通过加热夹层、氧气喷射6
器和总泵将参数控制在指定点或范围。培养物培养3-5日，此时培养物在1-3x10 细胞/毫升的对数期生长开始上升。然后，用PF-CHO培养液(具有定制改良，JRH Biosciences)以递增速度开始灌注。丢弃开始4天(范围3-5天)的收集物作为“冲出物”。然后的收集作为生产运行的开始。每天改变2-3.5倍体积的培养液继续生产20-36天。培养可延伸40天或更长。连续培养40天或更长。酶的纯化如上进行。然后将收集的含有艾杜糖苷酶的生产培养液酸化到pH5.3，0.2微米滤膜过滤，用Blue-Sepharose层析纯化。然后合并多轮Blue-Sepharose层析的纯化酶，加到铜螯合柱上，用甘油在pH3.7中洗脱。将酶保持在酸性pH下，灭活可能的细菌。然后将铜柱洗脱液调节到pH5.7，加到苯基琼脂糖柱上。以0.7M NaCl洗脱酶。浓缩洗脱液，将其渗滤入150mM NaCl、100mMNaPO4，pH5.8的制剂缓冲液。将酶滤过40纳米滤膜，除去可能的病毒，将滤液调节到0.001％聚山梨醇酯80中。将配制的酶无菌原液填充到无菌聚乙烯容器中。然后过滤酶原液，装入适合可注射药物的5cc 1型玻璃指管中，塞住并加盖。

[0096] 实施例2

[0097] 为了使用单细胞悬液的生物反应器，如实施例1中所述制备接种系列。用单细胞悬液简化生物反应器制备和接种。用DEMEM/F12培养液(25％反应器体积)和JRH325改良(25％反应器体积)接种生物反应器。48小时后加入等于50％工作反应器体积的培养液。6
当细胞密度达到1.0e 时，开始灌注(和收集)，灌注培养液如上所述。

[0098] 实施例3

[0099] 对9只MPS I犬和6只MPS I猫短期静脉施用纯化的人重组α-L-艾杜糖苷酶，已显示酶在各种组织中显著吸收，单剂后24小时估计在组织中回收50％或以上。虽然肝脏和脾脏吸收了最大量的酶，具有最好的病理性改善，在许多但不是全部组织中观察到了病理性和糖胺聚糖含量的改善。具体说，软骨、大脑和心脏没有显著的改善。临床改善在1只犬中长期治疗13个月发现，但其它研究限制到6个月或更短。接受重组人酶的全部犬和全部猫对人产物产生抗体。IgG抗体(可能是犬IgG等价物)可能是补体激活型。还在至少13％用糖脑苷酶治疗的Gaucher病人中观察到该现象。在1只犬中观察到蛋白尿，可能与免疫复合物疾病有关。在其它治疗的动物中未观察到其它抗体的影响。未观察到特别的毒性，临床实验室研究(全血计数，电解质，BLJN/肌酐，肝酶，尿分析)都是正常的。

[0100] 以甚至25,000单位(0.1mg/kgwk)的小剂量酶治疗得到酶在一些组织中显著分布和GAG储藏减少。如果持续超过1年，在活动力、大小和健康的总体表现中治疗的显著临床效果是明显的。该剂量的治疗不改善其它作为疾病重要位点的组织，例如软骨和大脑。两周内提供5次125,000单位(0.5mg/kg)的更高剂量显示可实现改善的组织渗透，可在短至2周内就实现组织水平的疗效。迄今对2只犬进行了6个月对该增加剂量的研究。这些MPS I犬显示显著的临床改善，尿GAG排泄基本降低到正常范围。除了改变给药技术控制了免疫反应，酶治疗不显示显著的临床或生物化学毒性。该更高的周剂量的酶治疗有效改善了一些MPS I临床特征，减少了储藏而没有显著毒性。

[0101] 这些对MPS I犬的各种研究和MPS I猫的1个研究的结果显示，人重组α-L-艾杜糖苷酶是安全的。虽然这些相同结果提供了该重组酶应在治疗α-L-艾杜糖苷酶缺陷中有效的重要原理，它们不预计对人类酶治疗的临床益处或可能的免疫学危险。

[0102] 实施例4

[0103] α-L-艾杜糖苷酶的人cDNA预计得到653个氨基酸的蛋白质，在信号肽切割后具有70,000道尔顿的预计分子量。氨基酸测序揭示N-末端的丙氨酸26得到预计的629个氨基酸的蛋白质。人重组α-L-艾杜糖苷酶在成熟蛋白质的8位具有组氨酸。预测的蛋白质序列具有6个可能的N-连接的寡糖修饰位点。所有这些在重组蛋白内可被修饰。证明了第三和第六位点含有一个或多个甘露糖6-磷酸残基，导致细胞的高亲和力吸收。

[0104] 该肽对应人重组α-L-艾杜糖苷酶的氨基酸26-45，具有N-末端的丙氨酸和下列序列(SEQ ID NO：2)：

[0105] ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg

[0106] 重组酶在SDS-PAGE上由于糖修饰具有明确的82,000道尔顿的分子量。UCLA蛋白质测序研究所对纯化的人重组α-L-艾杜糖苷酶进行了测序。优选静脉内施用该重组酶。提供在10毫升聚丙烯试管中的浓度为100,000-200,000单位/毫升的人重组α-L-艾杜糖苷酶。在临床试验中使用的酶的最终剂量包括人重组α-L-艾杜糖苷酶，生理盐水和100mMpH5.8的磷酸缓冲液。这些制备在生理盐水袋中。在制剂中加入最终浓度为0.001％的山梨醇酯80，来稳定蛋白质抵抗剪切，从而避免最终产物指管中的沉淀。

[0107] 目前使用的最终指管制剂

[0108]成份 组成
α-L-艾杜糖苷酶 标示值是0.7mg/ml或100(新)单位/ml
氯化钠溶液 150mM
磷酸钠缓冲液 100mM，pH5.8
聚山梨醇酯80 0.001％

[0109] 病人治疗中所用的最终剂量形式

[0110]成份 组成
α-L-艾杜糖苷酶产品 5-12倍稀释的指管浓度
氯化钠溶液 50mM磷酸钠缓冲液100-250ccIV袋
人白蛋白 lmg/ml

[0111] 实施例5

[0112] 在I型粘多糖病人中静脉施用α-L-艾杜糖苷酶的效果

[0113] 基于克隆编码α-L-艾杜糖苷酶的cDNA的研究(Scott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9625-99(1991)；Stoltzfus等，J.Biol.Chem.267：6570-75(1992))和 显 示α-L-艾杜糖苷酶减少许多组织中溶酶体储藏的效果的动物研究(Shull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：12937-41(1994)；Kakkis等，Biochem.Mol.Med.58：156-67(1996))，进行52-周的研究，评估静脉内施用高度纯化的α-L-艾杜糖苷酶对10个患I型粘多糖病(MPS I)的病人的安全和临床效力。

[0114] 生产了重组人α-L-艾杜糖苷酶，纯化到高于97-99％。病人显示疾病的典型临床表现，生物化学确定淋巴细胞中的α-L-艾杜糖苷酶缺陷确定诊断。

[0115] 以125,000单位/公斤(用原始实验和单位限定)对病人静脉内施用重组人α-L-艾杜糖苷酶(用含有0.1％人血清白蛋白的生理盐水稀释物)；在第一个小时内给予3,000单位/公斤，在接下来的2个小时内各给予61,000单位/公斤。125,000单位/公斤的剂量用新实验相当于100SI单位/公斤。灌注在具有超敏反应的病人中延长到4-6小时。

[0116] 在根据评估的基线和6、12、26和52周时，由专家对病人进行包括病历、生理测验，超声心动图、EKG、MRI、多导睡眠描记法(0和26周)、骨骼调查(0、26和52周)、运动范围测量、角膜照像和皮肤切片(0周)，建立酶测定和基因定型的成纤维细胞培养物。用测角仪进行运动范围测定，对每个动作记录最大运动范围(病人起动的)。肩屈曲是肘部从体侧向前运动，肘和膝伸展代表关节伸直。限制的程度代表该年龄的正常最大运动范围和测量值之间的差异。根据美国胸科协会指南进行多导睡眠描记法，测定呼吸暂停事件(口-鼻气流停止10秒钟或以上)、呼吸浅慢事件(口鼻气流减少50％或以上，减饱和2％或以上，或有觉醒的证据)、所需的标准测量值中记录的89％氧饱和度以下的分钟数和总睡眠时间。从这些数据，通过将呼吸暂停和呼吸浅慢时间总数除以睡眠小时数，计算呼吸暂停/呼吸浅慢指数。生物化学研究包括测量淋巴细胞中的酶活性和颊粘膜的刷下物，糖胺聚糖水平，测试针对重组人α-L-艾杜糖苷酶血清的血清抗体(ELISA和蛋白质印迹)。用GeneralElectric的Advantage Windows工作站软件分析MRI数字图像数据，测定器官体积。器官体积以毫升记，转化成重量，假定密度为每毫升1克。配合出版的方法测试尿糖胺聚糖排泄。用标准方法进行蛋白质印迹分析和ELISA分析重组人α-L-艾杜糖苷酶的抗体。用苔黑酚、咔唑和MBTH法，通过电泳分离分析糖醛酸和尿糖胺聚糖的N-硫酸酯。

[0117] 所有病人每周接受重组人α-L-艾杜糖苷酶灌注52周。在治疗前淋巴细胞中α-L-艾杜糖苷酶的平均活力是0.04单位/毫克，当在一次灌注后平均7日(即就在下一次灌注前)测量是4.98单位/毫克，或正常的15％。治疗前在颊粘膜刷下物中检测不到酶活性，但在灌注7日后达到正常的1％。

[0118] 52周时，在9个病人中肝脏体积从基线下降了19-37％，在1个病人中下降了5％；平均下降是25.0％(n＝10，P＜0.001)。26周时，8个病人中对于体重和年龄是正常的(图1)。在基线具有最大相对肝脏大小的2个病人(病人6和9)中，肝脏大小在52周时接近正常(分别是体重的3.2和3.3％)。脾脏大小在8个病人中从基线下降了13-42％(在10个病人中平均下降20％，P＜0.001)。

[0119] 尿糖胺聚糖排泄在3-4周时迅速下降，在8-12周时以下降到基线的60-80％。在52周时，平均下降是63％(范围53-74；p＜0.001)。10个病人中8个超过该年龄正常上限的尿糖胺聚糖基线量下降了75％以上。用尿酸和N-硫酸酯(特别针对乙酰肝素的试验)的试验肯定结果。尿的电泳研究检测到硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素排泄的显著减少，但是在所有病人中仍存在一些过量的硫酸皮肤素排泄。

[0120] 6个青春期前的病人身高平均增加了6.0cm(5.2％)(表2)，平均身高生长速度在治疗过程中从2.8cm/年增加到5.2cm/年(P＝0.011)。对于全部10个病人，平均体重增加了3.2kg(8.8％)，对于6g青春期前病人平均增加了4.2kg(17.1％)。在这6个病人中，治疗前平均体重增长速度从1.7kg/年在治疗过程中提高到3.8kg/年(P＝0.04)。

[0121] 肩屈曲(肘部从体侧向前运动)在8个病人中的6个中评估，右肩和左肩对于基线平均改善为28°和26度(P＜0.002，图2)。肘伸展和膝伸展在10个病人中分别平均增加了7.0°(P＜0.03)和3.2°(P＝0.10)(图2)。

[0122] 在各病人中分析改善揭示，最受限制的关节具有最大的改善。例如在基线时，病人5、9和10不能屈曲他们的肩膀(肘部从体侧向前运动)超过100°，而在治疗后从21°增加到51°。类似的，病人2和9膝盖伸展也大大增加。运动范围的改变伴有病人报告生理活动增加，比如能够洗头，正常握持汉堡包，挂在单杠上，和更好的进行体育运动。

[0123] 7个病人在治疗后每晚呼吸暂停和呼吸浅慢事件从155减少到60(减少61％)，同时平均呼吸暂停/呼吸浅慢指数(每小时事件总数)从2.1下降到1.0。三个病人在临床上具有显著的睡眠呼吸暂停，所有三人在治疗中都获得了改善。在病人2中，呼吸暂停/呼吸浅慢指数从基线的4.5下降到26周时的0.4，总氧不饱和事件从每晚48分钟下降到1分钟。病人6在治疗前由于严重的不饱和需要每晚连续强制气道压力治疗(368分钟睡眠中用连续强制气道压力，在89％饱和度下有61分钟)，但在52周时，病人不用CPAP就通过了睡眠研究，在332分钟睡眠中89％饱和度下仅8分钟。病人9具有9.5的呼吸最大指数，在26周时下降到4.0。具有0.1的呼吸暂停/呼吸浅慢指数的病人8恶化，在26周时增加到3.1，在52周时增加到9.3，原因尚不清楚。10个病人中有8个或他们的家人报告呼吸改善，7个中5个注意到更安静的夜间呼吸，改善的睡眠质量和日间嗜睡减少。

[0124] 用系列病人访问确定了纽约心脏协会功能分类。全部10个病人报道1或2类改善，但是从超声心动图研究无非常客观的数据证实直接的心脏益处。改善功能评分可能反映了MPS I其它方面的改善而不是心脏功能上的改善。比较基线和52周的治疗，超声心动图显示三尖瓣或肺部逆流在4个病人中减少，但是2个病人(病人2和7)二尖瓣逆流恶化。在基线时，病人6具有心房扑动和心力衰竭的临床症状，包括平静时呼吸困难和外周性水肿。12周时，他具有正常的实性心律和第一程度的阻滞，平静时的呼吸困难和指凹性水肿消除。

[0125] 全部10个病人报道在治疗前日常活动不能持久和有限，但未正式测试运动负荷。在治疗中，所有病人改善，在26周时，许多能够更多的走动、跑步和进行运动。病人3、4和
5报道治疗6-12周后使其丧失能力的严重头痛得到了解决。

[0126] 几个病人报道畏光或结膜刺激减少。1个病人的视觉敏锐度上升(1只眼睛20/100到20/200)，在另两个中轻微改善。

[0127] 该研究的结果表明本发明高度纯化的人α-L-艾杜糖苷酶静脉内给药在患有I型粘多糖病的病人中导致临床和生物化学上的改善。肝脏大小的正常化和尿糖胺聚糖排泄的接近正常化与患有I型粘多糖病的犬的研究数据一致，显示在短至2周内肝脏储藏的清除和尿糖胺聚糖排泄的减少。

[0128] 对重组人α-L-艾杜糖苷酶灌注的超敏反应比在犬中预计的较不严重。虽然对于一些病人是重要的，复发荨麻疹可以通过预先给药和调节灌注速率来治疗。在4个病人中检测到针对α-L-艾杜糖苷酶的抗体和正常的亚临床互补激活，这些抗体和互补激活都随事件减少。类似的IgG介导的免疫应答之前在用葡糖脑苷脂酶治疗的Gaucher病人中注意到，虽然事件在我们的病人中更常见。具有缺对基因型的粘多糖I病人可能比这10个病人具有更强的免疫应答，而这10个病人没有一个是缺对基因型的。

[0129] 因此，重组人α-L-艾杜糖苷酶可减少溶酶体储藏，改善I型粘多糖病临床疾病的一些方面。

[0130] 本发明和制备和使用它的方法和过程现在已完整、清楚、精确和确切的进行了描述，使得任何所涉及领域的熟练技术人员能够制造和使用它。应理解上面描述的是本发明的优选例，可从其产生修改，而不违背本发明在权利要求中所列出的精神或范围。为了特别指出和明确限定作为发明的主题，权利要求总结了该说明书。

[0131] 序列表

[0132] <110>生物马林药物公司(BIOMARIN PHARMACEUTICALS)

[0133] 加州大学洛杉矶分校港口研究和教育院(HARBOR-UCLA REI)

[0134] <120>重组α-L-艾杜糖苷酶，其生产和纯化的方法以及治疗其缺陷导致的疾病的方法

[0135] <130>08000051US00

[0136] <140>pct/us00/31293

[0137] <141>2000-11-9

[0138] <150>09/439,923

[0139] <151>1999-11-12

[0140] <160>2

[0141] <170>FastSEQ for Windows Version 3.0

[0142] <210>1

[0143] <211>6200

[0144] <212>DNA

[0145] <213>人(Homo sapiens)

[0146] <220>

[0147] <221>CDS

[0148] <222>(1558)…(3516)

[0149] <400>1

[0150] gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60[0151] ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120[0152] cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180[0153] ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240[0154] gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300[0155] tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360[0156] cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420[0157] attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480[0158] atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540[0159] atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600[0160] tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660[0161] actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720[0162] aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780[0163] gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840[0164] ctgcttaact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttcgcag 900[0165] aattcctgcg gctgctacag tgtgtccagc gtcctgcctg gctgtgctga gcgctggaac 960[0166] agtggcgcat cattcaagtg cacagttacc catcctgagt ctggcacctt aactggcaca 1020[0167] attgccaaag tcacaggtga gctcagatgc ataccaggac attgtatgac gttccctgct 1080[0168] cacatgcctg ctttcttcct ataatacaga tggtcaacta actgctcatg tccttatatc 1140[0169] acagagggaa attggagcta tctgaggaac tgcccagaag ggaagggcag aggggtcttg 1200[0170] ctctccttgt ctgagccata actcttcttt ctaccttcca gtgaacacct tcccacccca 1260[0171] ggtccacctg ctaccgccgc cgtcggagga gctggccctg aatgagctct tgtccctgac 1320[0172] atgcctggtg cgagctttca accctaaaga agtgctggtg cgatggctgc atggaaatga 1380[0173] ggagctgtcc ccagaaagct acctagtgtt tgagccccta aaggagccag gcgagggagc 1440[0174] caccacctac ctggtgacaa gcgtgttgcg tgtatcagct gaaagcttga tatcgaattc 1500[0175] cggaggcgga accggcagtg cagcccgaag ccccgcagtc cccgagcacg cgtggcc atg 1560[0176] Met[0177] 1[0178] cgt ccc ctg cgc ccc cgc gcc gcg ctg ctg gcg ctc ctg gcc tcg ctc 1608[0179] Arg Pro Leu Arg Pro Arg Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ser Leu[0180] 5 10 15

[0181] ctg gcc gcg ccc ccg gtg gcc ccg gcc gag gcc ccg cac ctg gtg cat 1656[0182] Leu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Glu Ala Pro His Leu Val His[0183] 20 25 30

[0184] gtg gac gcg gcc cgc gcg ctg tgg ccc ctg cgg cgc ttc tgg agg agc 1704[0185] Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp Pro Leu Arg Arg Phe Trp Arg Ser[0186] 35 40 45

[0187] aca ggc ttc tgc ccc ccg ctg cca cac agc cag gct gac cag tac gtc 1752[0188] Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro His Ser Gln Ala Asp Gln Tyr Val[0189] 50 55 60 65[0190] ctc agc tgg gac cag cag ctc aac ctc gcc tat gtg ggc gcc gtc cct 1800[0191] Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn Leu Ala Tyr Val Gly Ala Val Pro[0192] 70 75 80[0193] cac cgc ggc atc aag cag gtc cgg acc cac tgg ctg ctg gag ctt gtc 1848[0194] His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg Thr His Trp Leu Leu Glu Leu Val[0195] 85 90 95

[0196] acc acc agg ggg tcc act gga cgg ggc ctg agc tac aac ttc acc cac 1896[0197] Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg Gly Leu Ser Tyr Asn Phe Thr His[0198] 100 105 110

[0199] ctg gac ggg tac ctg gac ctt ctc agg gag aac cag ctc ctc cca ggg 1944[0200] Leu Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Glu Asn Gln Leu Leu Pro Gly[0201] 115 120 125

[0202] ttt gag ctg atg ggc agc gcc tcg ggc cac ttc act gac ttt gag gac 1992[0203] Phe Glu Leu Met Gly Ser Ala Ser Gly His PheThr Asp Phe Glu Asp[0204] 130 135 140 145[0205] aag cag cag gtg ttt gag tgg aag gac ttg gtc tcc agc ctg gcc agg 2040[0206] Lys Gln Gln Val Phe Glu Trp Lys Asp Leu Val Ser Ser Leu Ala Arg[0207] 150 155 160[0208] aga tac atc ggt agg tac gga ctg gcg cat gtt tcc aag tgg aac ttc 2088[0209] Arg Tyr Ile Gly Arg Tyr Gly Leu Ala His Val Ser Lys Trp Asn Phe[0210] 165 170 175

[0211] gag acg tgg aat gag cca gac cac cac gac ttt gac aac gtc tcc atg 2136[0212] Glu Thr Trp Asn Glu Pro Asp His His Asp Phe Asp Asn Val Ser Met[0213] 180 185 190

[0214] acc atg caa ggc ttc ctg aac tac tac gat gcc tgc tcg gag ggt ctg 2184[0215] Thr Met Gln Gly Phe Leu Asn Tyr Tyr Asp Ala Cys Ser Glu Gly Leu[0216] 195 200 205

[0217] cgc gcc gcc agc ccc gcc ctg cgg ctg gga ggc ccc ggc gac tcc ttc 2232[0218] Arg Ala Ala Ser Pro Ala Leu Arg Leu Gly Gly Pro Gly Asp Ser Phe[0219] 210 215 220 225[0220] cac agg cca ccg cga tcc ccg ctg agc tgg ggc ctc ctg cgc cac tgc 2280[0221] His Arg Pro Pro Arg Ser Pro Leu Ser Trp Gly Leu Leu Arg His Cys[0222] 230 235 240[0223] cac gac ggt acc aac ttc ttc act ggg gag gcg ggc gtg cgg ctg gac 2328[0224] His Asp Gly Thr Asn Phe Phe Thr Gly Glu Ala Gly Val Arg Leu Asp[0225] 245 250 255

[0226] tac atc tcc ctc cac agg aag ggt gcg cgc agc tcc atc tcc atc ctg 2376[0227] Tyr Ile Ser Leu His Arg Lys Gly Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ile Leu[0228] 260 265 270

[0229] gag cag gag aag gtc gtc gcg cag cag atc cgg cag ctc ttc ccc aag 2424[0230] Glu Gln Glu Lys Val Val Ala Gln Gln Ile Arg Gln Leu Phe Pro Lys[0231] 275 280 285

[0232] ttc gcg gac acc ccc att tac aac gac gag gcg gac ccg ctg gtg ggc 2472[0233] Phe Ala Asp Thr Pro Ile Tyr Asn Asp Glu Ala Asp Pro Leu Val Gly[0234] 290 295 300 305[0235] tgg tcc ctg cca cag ccg tgg agg gcg gac gtg acc tac gcg gcc atg 2520[0236] Trp Ser Leu Pro Gln Pro Trp Arg Ala Asp Val Thr Tyr Ala Ala Met[0237] 310 315 320[0238] gtg gtg aag gtc atc gcg cag cat cag aac ctg cta ctg gcc aac acc 2568[0239] Val Val Lys Val Ile Ala Gln His Gln Asn Leu Leu Leu Ala Asn Thr[0240] 325 330 335

[0241] acc tcc gcc ttc ccc tac gcg ctc ctg agc aac gac aat gcc ttc ctg 2616[0242] Thr Ser Ala Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Asp Asn Ala Phe Leu[0243] 340 345 350

[0244] agc tac cac ccg cac ccc ttc gcg cag cgc acg ctc acc gcg cgc ttc 2664[0245] Ser Tyr His Pro His Pro Phe Ala Gln Arg Thr Leu Thr Ala Arg Phe[0246] 355 360 365

[0247] cag gtc aac aac acc cgc ccg ccg cac gtg cag ctg ttg cgc aag ccg 2712[0248] Gln Val Asn Asn Thr Arg Pro Pro His Val Gln Leu Leu Arg Lys Pro[0249] 370 375 380 385[0250] gtg ctc acg gcc atg ggg ctg ctg gcg ctg ctg gat gag gag cag ctc 2760[0251] Val Leu Thr Ala Met Gly Leu Leu Ala Leu Leu Asp Glu Glu Gln Leu[0252] 390 395 400[0253] tgg gcc gaa gtg tcg cag gcc ggg acc gtc ctg gac agc aac cac acg 2808[0254] Trp Ala Glu Val Ser Gln Ala Gly Thr Val Leu Asp Ser Asn His Thr[0255] 405 410 415

[0256] gtg ggc gtc ctg gcc agc gcc cac cgc ccc cag ggc ccg gcc gac gcc 2856[0257] Val Gly Val Leu Ala Ser Ala His Arg Pro Gln Gly Pro Ala Asp Ala[0258] 420 425 430

[0259] tgg cgc gcc gcg gtg ctg atc tac gcg agc gac gac acc cgc gcc cac 2904[0260] Trp Arg Ala Ala Val Leu Ile Tyr Ala Ser Asp Asp Thr Arg Ala His[0261] 435 440 445

[0262] ccc aac cgc agc gtc gcg gtg acc ctg cgg ctg cgc ggg gtg ccc ccc 2952[0263] Pro Asn Arg Ser Val Ala Val Thr Leu Arg Leu Arg Gly Val Pro Pro[0264] 450 455 460 465[0265] ggc ccg ggc ctg gtc tac gtc acg cgc tac ctg gac aac ggg ctc tgc 3000[0266] Gly Pro Gly Leu Val Tyr Val Thr Arg Tyr Leu Asp Asn Gly Leu Cys[0267] 470 475 480[0268] agc ccc gac ggc gag tgg cgg cgc ctg ggc cgg ccc gtc ttc ccc acg 3048[0269] Ser Pro Asp Gly Glu Trp Arg Arg Leu Gly Arg Pro Val Phe Pro Thr[0270] 485 490 495

[0271] gca gag cag ttc cgg cgc atg cgc gcg gct gag gac ccg gtg gcc gcg 3096[0272] Ala Glu Gln Phe Arg Arg Met Arg Ala Ala Glu Asp Pro Val Ala Ala[0273] 500 505 510

[0274] gcg ccc cgc ccc tta ccc gcc ggc ggc cgc ctg acg ctg cgc ccc gcg 3144[0275] Ala Pro Arg Pro Leu Pro Ala Gly Gly Arg Leu Thr Leu Arg Pro Ala[0276] 515 520 525

[0277] ctg cgg ctg ccg tcg ctt ttg ctg gtg cac gtg tgt gcg cgc ccc gag 3192[0278] Leu Arg Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val His Val Cys Ala Arg Pro Glu[0279] 530 535 540 545[0280] aag ccg ccc ggg cag gtc acg cgg ctc cgc gcc ctg ccc ctg acc caa 3240[0281] Lys Pro Pro Gly Gln Val Thr Arg Leu Arg Ala Leu Pro Leu Thr Gln[0282] 550 555 560[0283] ggg cag ctg gtt ctg gtc tgg tcg gat gaa cac gtg ggc tcc aag tgc 3288[0284] Gly Gln Leu Val Leu Val Trp Ser Asp Glu His Val Gly Ser Lys Cys[0285] 565 570 575

[0286] ctg tgg aca tac gag atc cag ttc tct cag gac ggt aag gcg tac acc 3336[0287] Leu Trp Thr Tyr Glu Ile Gln Phe Ser Gln Asp Gly Lys Ala Tyr Thr[0288] 580 585 590

[0289] ccg gtc agc agg aag cca tcg acc ttc aac ctc ttt gtg ttc agc cca 3384[0290] Pro Val Ser Arg Lys Pro Ser Thr Phe Asn Leu Phe Val Phe Ser Pro[0291] 595 600 605

[0292] gac aca ggt gct gtc tct ggc tcc tac cga gtt cga gcc ctg gac tac 3432[0293] Asp Thr Gly Ala Val Ser Gly Ser Tyr Arg Val Arg Ala Leu Asp Tyr[0294] 610 615 620 625[0295] tgg gcc cga cca ggc ccc ttc tcg gac cct gtg ccg tac ctg gag gtc 3480[0296] Trp Ala Arg Pro Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Pro Tyr Leu Glu Val[0297] 630 635 640[0298] cct gtg cca aga ggg ccc cca tcc ccg ggc aat cca tgagcctgtg3526

[0299] Pro Val Pro Arg Gly Pro Pro Ser Pro Gly Asn Pro

[0300] 645 650

[0301] ctgagcccca gtgggttgca cctccaccgg cagtcagcga gctggggctg cactgtgccc 3586[0302] atgctgccct cccatcaccc cctttgcaat atatttttat attttaaaaa aaaaaaaaaa 3646[0303] aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagaattcc 3706[0304] tgcagcccgg gggatccact agttctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga 3766[0305] ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 3826[0306] tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 3886[0307] tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 3946[0308] gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa 4006[0309] gaaccagctg gggctcgaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 4066[0310] ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 4126[0311] gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 4186[0312] gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 4246[0313] tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4306[0314] gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4366[0315] ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4426[0316] ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4486[0317] acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4546[0318] tggaagctcc ctggtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4606[0319] ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 4666[0320] ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4726[0321] ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4786[0322] actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 4846[0323] gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 4906[0324] tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 4966[0325] caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 5026[0326] atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 5086[0327] acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 5146[0328] ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 5206[0329] ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttegtt catccatagt 5266[0330] tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 5326[0331] tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5386[0332] gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 5446[0333] tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5506[0334] tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 5566[0335] ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 5626[0336] tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 5686[0337] ggttatggca gcactgcata attctgttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 5746[0338] gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 5806[0339] ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 5866[0340] cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 5926[0341] ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 5986[0342] ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 6046[0343] gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6106[0344] ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6166[0345] gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc 6200[0346] <210>2

[0347] <211>653

[0348] <212>PRT

[0349] <213>人(Homo sapiens)

[0350] <400>2

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[0355] His Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp Pro Leu Arg Arg Phe Trp Arg[0356] 35 40 45

[0357] Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro His Ser Gln Ala Asp Gln Tyr[0358] 50 55 60

[0359] Val Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn Leu Ala Tyr Val Gly Ala Val[0360] 65 70 75 80[0361] Pro His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg Thr His Trp Leu Leu Glu Leu[0362] 85 90 95[0363] Val Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg Gly Leu Ser Tyr Asn Phe Thr[0364] 100 105 110

[0365] His Leu Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Glu Asn Gln Leu Leu Pro[0366] 115 120 125

[0367] Gly Phe Glu Leu Met Gly Ser Ala Ser Gly His Phe Thr Asp Phe Glu[0368] 130 135 140

[0369] Asp Lys Gln Gln Val Phe Glu Trp Lys Asp Leu Val Ser Ser Leu Ala[0370] 145 150 155 160[0371] Arg Arg Tyr Ile Gly Arg Tyr Gly Leu Ala His Val Ser Lys Trp Asn[0372] 165 170 175[0373] Phe Glu Thr Trp Asn Glu Pro Asp His His Asp Phe Asp Asn Val Ser[0374] 180 185 190

[0375] Met Thr Met Gln Gly Phe Leu Asn Tyr Tyr Asp Ala Cys Ser Glu Gly[0376] 195 200 205

[0377] Leu Arg Ala Ala Ser Pro Ala Leu Arg Leu Gly Gly Pro Gly Asp Ser[0378] 210 215 220

[0379] Phe His Arg Pro Pro Arg Ser Pro Leu Ser Trp Gly Leu Leu Arg His[0380] 225 230 235 240[0381] Cys His Asp Gly Thr Asn Phe Phe Thr Gly Glu Ala Gly Val Arg Leu[0382] 245 250 255[0383] Asp Tyr Ile Ser Leu His Arg Lys Gly Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ile[0384] 260 265 270

[0385] Leu Glu Gln Glu Lys Val Val Ala Gln Gln Ile Arg Gln Leu Phe Pro[0386] 275 280 285

[0387] Lys Phe Ala Asp Thr Pro Ile Tyr Asn Asp Glu Ala Asp Pro Leu Val[0388] 290 295 300

[0389] Gly Trp Ser Leu Pro Gln Pro Trp Arg Ala Asp Val Thr Tyr Ala Ala[0390] 305 310 315 320[0391] Met Val Val Lys Val Ile Ala Gln His Gln Asn Leu Leu Leu Ala Asn[0392] 325 330 335[0393] Thr Thr Ser Ala Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Asp Asn Ala Phe[0394] 340 345 350

[0395] Leu Ser Tyr His Pro His Pro Phe Ala Gln Arg Thr Leu Thr Ala Arg[0396] 355 360 365

[0397] Phe Gln Val Asn Asn Thr Arg Pro Pro His Val Gln Leu Leu Arg Lys[0398] 370 375 380

[0399] Pro Val Leu Thr Ala Met Gly Leu Leu Ala Leu Leu Asp Glu Glu Gln[0400] 385 390 395 400[0401] Leu Trp Ala Glu Val Ser Gln Ala Gly Thr Val Leu Asp Ser Asn His[0402] 405 410 415[0403] Thr Val Gly Val Leu Ala Ser Ala His Arg Pro Gln Gly Pro Ala Asp[0404] 420 425 430

[0405] Ala Trp Arg Ala Ala Val Leu Ile Tyr Ala Ser Asp Asp Thr Arg Ala[0406] 435 440 445

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[0419] Glu Lys Pro Pro Gly Gln Val Thr Arg Leu Arg Ala Leu Pro Leu Thr[0420] 545 550 555 560[0421] Gln Gly Gln Leu Val Leu Val Trp Ser Asp Glu His Val Gly Ser Lys[0422] 565 570 575[0423] Cys Leu Trp Thr Tyr Glu Ile Gln Phe Ser Gln Asp Gly Lys Ala Tyr[0424] 580 585 590

[0425] Thr Pro Val Ser Arg Lys Pro Ser Thr Phe Asn Leu Phe Val Phe Ser[0426] 595 600 605

[0427] Pro Asp Thr Gly Ala Val Ser Gly Ser Tyr Arg Val Arg Ala Leu Asp[0428] 610 615 620

[0429] Tyr Trp Ala Arg Pro Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Pro Tyr Leu Glu[0430] 625 630 635 640[0431] Val Pro Val Pro Arg Gly Pro Pro Ser Pro Gly Asn Pro

[0432] 645 650