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2012-11-07

在易感哺乳动物中引起呼吸道疾病的病毒转让专利

申请号 : CN02806763.0

文献号 : CN1524088B

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法律信息:

相似专利:

发明人 : J·C·德永 , R·A·M·福基尔 , B·G·范登霍根 , A·D·M·E·奥斯特豪斯 , J·格罗恩

申请人 : 维洛诺瓦蒂夫公司

摘要 :

本发明涉及病毒学领域。本发明提供一种分离的副粘病毒科肺病毒亚科内可鉴定为在系统发育上对应于Metapneumovirus及其组分的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒(MPV)。

权利要求 :

1.一种分离的负义单链RNA病毒哺乳动物MPV，所述病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒亚科(Pneumovirinae)，并且在系统发育上鉴定为相当于Metapneumovirus病毒属，其中所述病毒是包含图20-28所示序列的MPV分离株00-1或

99-1。

2.一种权利要求1的分离的负义单链RNA哺乳动物metapneumovirus，其中所述病毒的基因组包含图6A、图6B或图6C所示的HMPV的核苷酸序列。

3.权利要求1或2的病毒，其中所述病毒是一种减毒病毒。

4.一种免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含权利要求1或2的病毒。

5.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述病毒是一种减毒病毒。

6.一种分离的核酸，其中所述核酸编码蛋白，所述蛋白包含图20所示的MPV分离株

00-1或99-1的N蛋白的氨基酸序列。

7.权利要求6的核酸在制备检测样品中哺乳动物metapneumovirus的试剂盒中的用途。

8.权利要求7的用途，其中所述哺乳动物MPV是人MPV。

9.一种载体，所述载体包含权利要求6的核酸。

10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求6的核酸。

11.一种抗体，其中所述抗体特异性结合在权利要求10的宿主细胞中表达的病毒蛋白。

12.权利要求11的抗体在制备用于检测样品中哺乳动物metapneumovirus的试剂盒中的用途。

13.一种病毒分离株，所述病毒分离株可用权利要求6的核酸或11的抗体鉴定为副粘病毒科肺病毒亚科的哺乳动物负义单链RNA病毒，并且在系统发育上鉴定为相当于Metapneumovirus病毒属。

14.权利要求6的核酸在制备用于病毒学诊断哺乳动物MPV感染的试剂盒中的用途。

15.一种药用组合物，其中所述药用组合物包含(i)权利要求1或2的病毒，和(ii)药学上可接受的载体。

16.一种药用组合物，其中所述药用组合物包含编码权利要求1或2的病毒的基因组或其基因组组成部分的核酸；其中所述核酸还编码其它病毒的序列。

17.一种药用组合物，其中所述药用组合物包含编码权利要求1或2的病毒的基因组或其基因组组成部分的核酸；其中所述基因组可以缺少产生复制缺陷型病毒的病毒基因组组成部分，并且可以含有产生减毒病毒的突变、缺失或插入。

18.一种药用组合物，其中所述药用组合物包含(i)权利要求1或2的病毒的亚单位；

和(ii)药学上可接受的载体。

19.一种分离或重组的核酸或其MPV特异性功能片段，其可得自权利要求1或2的病毒。

20.一种由权利要求19的核酸编码的分离或重组的蛋白性分子或其MPV特异性功能片段。

21.一种抗原，所述抗原包含权利要求20的蛋白性分子或其MPV特异性功能片段。

22.一种用于诊断MPV感染的诊断试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2的病毒、权利要求19的核酸、权利要求20的蛋白性分子或其片段、权利要求21的抗原或权利要求11的抗体。

23.权利要求15、16、17或18中任一项的药用组合物在制备用于治疗或预防MPV感染的药物中的用途。

24.权利要求15、16、17或18中任一项的药用组合物在制备用于治疗或预防呼吸道疾病的药物中的用途。

25.抗体或其片段在制备用于检测样品中哺乳动物metapneumovirus的试剂盒中的用途，其中抗体或其片段特异性识别权利要求1或2的病毒的蛋白。

26.第一组的一种或多种核酸在制备用于检测样品中哺乳动物metapneumovirus的试剂盒中的用途，其中所述第一组的一种或多种核酸在严格条件下与编码蛋白或其片段的第二组的一种或多种核酸杂交，所述蛋白包含图20所示的MPV分离株00-1和99-1的N蛋白的氨基酸序列。

27.权利要求26的用途，其中所述第一组的核酸长度为至少18个、至少20个、至少23个或至少25个核苷酸。

28.嵌合3型副流感病毒，其包含哺乳动物MPV核苷酸序列，其中所述哺乳动物MPV核苷酸序列由权利要求1或2的病毒的基因组编码。

29.引物在制备用于检测样品中哺乳动物metapneumovirus的试剂盒中的用途，其中所述引物选自引物N3、N4、M3、M4、F7、F8、L6和L7。

30.探针在制备用于检测样品中哺乳动物metapneumovirus的试剂盒中的用途，其中所述探针具有选自以下的核酸序列：(i)TGC TTG TAC TTC CCA AAG；

(ii)TAT TTG AAC AAA AAG TGT；和(iii)TGG TGT GGG ATA TTA ACA G。

说明书 :

在易感哺乳动物中引起呼吸道疾病的病毒

[0001] 本发明涉及病毒学领域。
[0002] 在过去数十年中，已经鉴定了几种哺乳动物疾病的病原，尤其是呼吸道疾病7
(RTI)的病原，特别是人类疾病的病原 。哺乳动物RTI的经典病原是在人类(hRSV)和反刍动物如牛或绵羊(bRSV和/或oRSV)中发现的属于肺病毒属(Pneumovirus)的呼吸道合胞病毒。在人RSV中，利用正反交中和测定中的差异、免疫测定中G蛋白的反应性和G基因的核苷酸序列，确定了两个hRSV抗原性亚组。在所述亚组内，氨基酸序列显示出94％(A亚组)或98％(B亚组)同一性，而在亚组之间仅发现53％的氨基酸
序列同一性。基于单克隆抗体、RT-PCR测定和RNA酶保护测定，在亚组内观察到额外的变异性。来自两个亚组的病毒都有世界范围的分布，可以在一个季节中发生。在现有免疫存在下可能发生感染，并且对于再感染，并不严格需要抗原性变异。参见例如Sullender，W.M.，Respiratory Syncytial Virus Genetic and AntigenicDiversity.Clinical Microbiology Reviews，2000.13(1)：p.1-15；Collins，P.L，MiIntosh，K. 和Chanock，R.M.，Respiratory syncytial virus.Fieldsvirology，B.N.Knipe，Howley，P.M. 编 著，1996，Philadelphia：lippencott-raven.1313-1351；Johnson，P.R. 等，The G glycoprotein of humanrespiratory syncytial viruses of subgroups A and B：
extensive sequencedivergence between antigenically related proteins.Proc Natl Acad Sci U SA，1987，84(16)：p.5625-9；Collins，P.L.，The molecular Biology of HumanRespiratory Syncytial Virus (RSV)of the Genus Pneumovirus， 载 于TheParamyxoviruses，D.W.Kingsbury编著，1991，Plenum Press：New York，p.103-153。
[0003] 另一经典的肺病毒是小鼠肺炎病毒(PVM)，一般仅在实验室小鼠中发现。然而，在哺乳动物中观察到的一定比率的疾病仍不能归因于已知的病原体。
[0004] 本发明提供一种分离的属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒亚科(Pneumovirinae)、可鉴定为在系统发育上对应于Metapneumovirus的基本上为哺乳动物的负义(negative-sense)单链RNA病毒(MPV)。通过测定所述病毒的核酸序列并且在系统发育分析中对其进行测试，例如其中采用100个引导程序和3个jumble生成最大似然进化树，并且发现在系统发育上与对应于也称为火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)(禽鼻气管炎的病原)的禽肺病毒(APV)的基本禽病毒分离株相比，它更密切地对应于以I-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分离株，所述病毒可鉴定为在系统发育上对应于Metapneumovirus。对于所述系统发育分析，最有用的是获得非MPV的核酸序列作为外类群(outgroup)，以便进行比较，一种非常有用的外类群分离株可以得自禽肺病毒血清型C(APV-C)，这例如在此中的图5中得到证实。
[0005] 虽然系统发育分析提供了一种鉴定病毒为MPV的便捷方法，但是此中也提供几种其它可能更为直接但过程略多的、用于鉴定所述病毒或得自所述病毒病毒蛋白或核酸的方法。根据经验，在用序列或保藏物与此中鉴定的分离株、病毒蛋白或核酸的比较中待鉴定病毒蛋白质或核酸的百分同源性，可以鉴定MPV。众所周知，病毒种、尤其是RNA病毒种通常构成一个准种，其中所述病毒分类群(cluster)在其成员之间显示出异质性。因此，预期每个分离株与此中提供的各种分离株之一的关系百分率可能略有差异。
[0006] 当人们希望与保藏的病毒I-2614进行比较时，本发明提供一种分离的属于副粘病毒科肺病毒亚科的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒(MPV)，通过测定所述病毒的氨基酸序列，并且确定在L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白方面，所述氨基酸序列与以I-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分离株的氨基酸同源性的百分率基本上高于此中提供的与APV-C相比的百分率，所述病毒可鉴定为在系统发育上对应于Metapneumovirus；或者，同样，提供一种分离的属于副粘病毒科肺病毒亚科的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒(MPV)，所述病毒通过以下步骤可鉴定为在系统发育上对应于Metapneumovirus：测定所述病毒的核酸序列，并且确定在编码L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白的核酸方面，所述核酸序列与以I-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分离株的核酸同一性的百分率基本上高于此中鉴定的与APV-C相比的百分率。
[0007] 再根据经验，当需要鉴定的分离株或者所述分离株的病毒蛋白或核酸的同源性百分率落入本文鉴定的两个组(以分离株00-1或99-1作为相应的比较分离株)各自的所述同源性百分率范围内，人们可以认为所述MPV属于本文鉴定的MPV两个血清学组之一。然而，当所述同源性百分率较小，或者更需要区别所述病毒分离株与例如APV-C时，则建议优选采用本文鉴定的系统发育分析。
[0008] 再者，当在测定同源性百分率时选择其它分离株时，人们应该记住，所述百分率可能略有变化。
[0009] 由于提供了这种MPV，本发明提供用于诊断和/或治疗疾病、特别是呼吸道疾病、特别是哺乳动物疾病、更特别是人类疾病的诊断工具和方法以及治疗工具和方法。然而，由于基本上为哺乳动物的MPV与基本上为禽类的APV、特别是与APV-C的关系虽然远，但有基因关联，本发明也提供用于诊断和治疗禽类疾病的工具和方法。在病毒学中，最好的忠告是：用对引起所述感染的所述特定病毒最具特异性的试剂，进行特定病毒感染的诊断和/或治疗。在这种情况下，这意味着，优选用对MPV最具特异性的试剂，进行所述MPV感染的诊断和/或治疗。然而，这决不排除使用特异性较低却有足够交叉反应性的试剂来替代的可能性，例如因为它们更容易获得，并且足以完成眼前的任务。在此，例如提供用来源于APV的试剂、特别是来源于APV-C的试剂来进行哺乳动物MPV感染的病毒学和/或血清学诊断，在本文的详细描述中，例如表明，通过运用专门设计用于检测鸟类APV抗体的ELISA，可以达到足够值得信赖的哺乳动物MPV感染的血清学诊断。用于此目的的一个特别有用的试验是设计用于检测APV抗体(例如血清或卵黄中)的ELISA，这是一种市售形式，名为APV-AbSVANOVIR ，由SVANOVA Biotech AB(Uppsal Science Park GluntenSE-75183 Uppsala Sweden)生产。相反的情形也是如此，在此例如提供用来源于MPV的试剂来进行哺乳动物APV感染的病毒学和/或血清学诊断，在本文的详细描述中，例如表明，通过运用设计用于检测MPV抗体的ELISA，可以达到足够值得信赖的鸟类APV感染的血清学诊断。考虑到抗原和抗体有锁和钥匙的关系，通过选择具有足够交叉反应性的合适抗体，可以达到对各种抗原的检测。当然，由于依赖于这种交叉反应性，所以最好在各种病毒的各种(糖)蛋白之间存在氨基酸同源性的指导下，选择所述试剂(诸如抗原或抗体)，从而与最为同源的蛋白相关的试剂对于在依赖于这种交叉反应性的试验中使用将是最有用的。
[0010] 对于核酸检测，甚至更为简单的，不用根据各种病毒的异源核酸序列设计引物或探针、并且因此不需要检测所述基本上为哺乳动物或禽类的Metapneumoviruses之间的差异，只要根据病毒特异性核酸序列中显示出高同源性的那些序列段设计或选择引物或探针即可。一般而言，对于核酸序列，90％或90％以上的同源性百分率可保证在运用严谨杂交条件的诊断性试验中所依靠的足够的交叉反应性。
[0011] 本发明例如提供一种病毒学诊断动物、特别是哺乳动物、更尤其是人类MPV感染的方法，所述方法包括通过使所述动物的样品与本发明的MPV特异性核酸或抗体反应，测定所述样品中病毒分离株或其组分的存在情况；本发明还提供一种血清学诊断哺乳动物MPV感染的方法，所述方法包括通过使所述哺乳动物的样品与本发明的MPV特异性蛋白性分子或其片段或抗原反应，测定所述样品中特异性针对MPV或其组分的抗体的存在情况。本发明还提供一种用于诊断MPV感染的诊断试剂盒，所述试剂盒包含本发明的MPV、MPV特异性核酸、蛋白性分子或其片段、抗原和/或抗体，优选包含用于检测所述MPV、MPV特异性核酸、蛋白性分子或其片段、抗原和/或抗体的工具，所述工具例如包含本领域使用可激发的基团，例如荧光团或酶检测系统(合适的诊断试剂盒形式的实例包括IF、ELISA、中和测定、RT-PCR测定)。为了确定一种尚未鉴定的病毒组分或其合成类似物例如核酸、蛋白性分子或其片段是否可以鉴定为MPV特异性的，只要运用例如本文提供的系统发育分析，通过与已知MPV序列和与已知的非MPV序列APV-C的序列同源性比较，分析(分别)所述组分的核酸序列或氨基酸序列，例如分析所述核酸或氨基酸的优选至少10个、更优选至少25个、更优选至少40个核苷酸或氨基酸的序列段即可。根据与所述MPV或非MPV序列的关系程度，可以鉴定所述组分或合成类似物。
[0012] 本发明也提供病毒学诊断哺乳动物MPV感染的方法，所述方法包括通过使所述哺乳动物的样品与来源于APV(优选血清型C)的交叉反应性核酸或与所述APV反应的交叉反应性抗体反应，测定所述样品中病毒分离株或其组分的存在情况；本发明还提供一种血清学诊断哺乳动物MPV感染的方法，所述方法包括通过使所述哺乳动物的样品与来源于APV的蛋白性分子或其片段或抗原反应，测定所述样品中也针对APV或其组分的交叉反应性抗体的存在情况。此外，本发明提供最初设计用于APV或APV抗体检测的诊断试剂盒在诊断MPV感染、特别是在检测人类中所述MPV感染方面的应用。
[0013] 本发明也提供病毒学诊断鸟类APV感染的方法，所述方法包括通过使所述鸟类的样品与来源于MPV的交叉反应性核酸或与所述MPV反应的交叉反应性抗体反应，测定所述样品中病毒分离株或其组分的存在情况；本发明还提供一种血清学诊断鸟类APV感染的方法，所述方法包括通过使所述鸟类的样品与来源于MPV的蛋白性分子或其片段或抗原反应，测定所述样品中也针对MPV或其组分的交叉反应性抗体的存在情况。此外，本发明提供最初设计用于MPV或MPV抗体检测的诊断试剂盒在诊断APV感染、特别是在检测家禽例如鸡、鸭或火鸡中所述APV感染方面的应用。
[0014] 正如人们所述，对于治疗，可以类似地应用所发现的交叉反应性，特别是在现有的情况下，利用不太直接的更高同源性的途径。例如，当不能得到更为同源的MPV疫苗时，可以用来源于APV(优选C型)分离株的疫苗制剂，进行不能等待的疫苗接种，例如针对MPV感染的紧急疫苗接种；反之，可以考虑用来源于MPV的疫苗制剂，进行针对APV感染的疫苗接种。此外，反向基因技术使得有可能产生可用作疫苗、与待减毒至所需水平的每种相应毒株的现场分离株足够不同的嵌合APV-MPV病毒构建体。相似的反向基因技术将使得也有可能产生供疫苗制剂用的嵌合副粘病毒-metapneumovirus构建体，例如RSV-MPV或PI3-MPV构建体。这类构建体尤其可用作抵抗呼吸道疾病的联合疫苗。
[0015] 因此，本发明提供一种新型的病原-一种分离的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒(在此也称为MPV)及其MPV特异性组分或合成类似物，所述病毒属于副粘病毒科的肺病毒亚科，但不能鉴定为典型的肺病毒，而是属于Metapneumovirus。迄今尚未发现类似metapneumovirus的哺乳动物病毒，即可从哺乳动物中分离的、基本上以哺乳动物作为所述病毒的天然寄主或者在所述哺乳动物中致病的metapneumovirus。被普遍认为基本上限于以家禽作为天然寄主或者是家禽疾病的病原的metapneumovirus，也被称为禽肺病毒。最近，描述了鸭的APV分离株(FR 2801　607)，进一步证明APV感染基本上限于作为天然寄主的鸟类。
[0016] 本发明提供分离的哺乳动物肺病毒(在此也称为MPV)，所述MPV包含与肺病毒属不同的基因顺序和氨基酸序列，并且是密切相关的，认为其系统发育相关性可能属于副粘病毒科肺病毒亚科中的Metapneumovirus。虽然至今尚未从鸟类分离出metapneumovirus，但现在表明，可以在其它动物种例如哺乳动物中，鉴定出虽然显著不同、但却相关的病毒。在此，我们表明，从人类重复地分离出MPV，而没有关于APV的这类报告。此外，与APV不同，MPV在鸡和火鸡中基本上不复制，或者仅很少复制，而在恒河猴中容易复制。没有发现关于APV在哺乳动物中复制的报道。另外，虽然针对MPV产生的特异性抗血清中和MPV，但针对APV A、B或C产生的抗血清并不以相同的程度中和MPV，这种全交叉反应性(full cross reactivity)的缺乏提供了另一个关于MPV是一种不同的metapneumovirus的证明。此外，虽然APV和MPV有相似的基因顺序，但MPV的G蛋白和SH蛋白与已知的APV的所述蛋白有明显的差异，因为它们在氨基酸水平或核酸水平上都没有显示出显著的序列同源性。根据这些蛋白中的一种或两种，可以有利地开发用于鉴别APV分离株和MPV分离株或针对这些不同病毒的抗体的诊断性测定(例如IF、ELISA、中和测定、RT-PCR测定)。然而，此外，得自MPV的更相关的N、P、M、F和L蛋白的序列信息和/或抗原性信息和与APV的相应蛋白的序列同源性分析，也可以用来鉴别APV和MPV。例如，得自MPV的序列信息的系统发育分析表明，MPV和APV是两类不同的病毒。特别是，系统发育进化树表明，APV和MPV是两个不同的病毒谱系。我们也表明，MPV在人群中循环了至少50年，因此种间传播可能至少在
50年前发生，而不是每天的事件。由于MPV CPE实际上不能与由hRSV或hPIV-1在tMK或其它细胞培养物中引起的CPE区别，所以可能至今所述MPV仍被忽视。tMK(第三代猴肾细胞，即细胞培养物中第三次传代的MK细胞)由于其与原代或第二代培养物相比成本较低而优选使用。所述CPE以及由典型副粘病毒科的某些病毒引起的CPE的特征为合胞体形成，此后细胞表现出快速内部破坏，然后所述细胞与所述单层分离。所述细胞通常(但不总是)在病毒从原始物质传代三次后，在接种后第10-14天时表现出CPE，比由其它病毒例如hRSV或hPIV-1引起的CPE略晚。
[0017] 通常，作为疾病的破坏性因子，副粘病毒每年在全世界引起许多动物和人死亡。副粘病毒科构成单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)(负义单链RNA病毒)的一个科，由副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)和肺病毒亚科(Pneumovirinae)组成。后一亚科1
目前在分类学上分为肺病毒属(Pneumovirus)和Metapneumovirus。人呼吸道合胞病毒
2
(hRSV)-肺病毒属的典型种，是全世界婴儿和幼儿下呼吸道感染的最重要的单一病因 。肺病毒属的其它成员包括牛和羊呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒(PVM)。
[0018] 禽肺病毒(APV)也称为火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)，是火鸡上呼吸道感染禽类鼻气3
管炎的病原 ，APV是最近指定的Metapneumovirus的唯一成员，正如已描述的，至今APV尚未与感染相关、或者更具体地讲与哺乳动物疾病相关。APV血清学亚组可以根据G糖蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列以及运用也识别G糖蛋白的单克隆抗体的中和试验来鉴别。在A、B和D亚组内，G蛋白在亚组内显示出98.5-99.7％的氨基酸序列同一性，而在亚组间仅观察到31.2-38％的氨基酸同一性。参见例如Collins，M.S.，Gough，R.E.和Alexander，D.J.，Antigenicdifferentiation of avian pneumovirus isolates using polyclonal antisera andmouse monoclonal antibodies.Avian Pathology，1993.22：p.469-479；
Cook，J.K.A.，Jones，B.V.，Ellis，M.M.，Antigenic differentiation of strainsof turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies.AvianPathology，
1993.22：p.257-273；Bayon-Auboyer，M.H. 等，Nucleotidesequences of the F，L and G protein genes of two non-A/non-B avianpneumoviruses(APV)reveal a novel APV subgroup .J Gen Virol，2000.81(Pt 11)：p.2723-33；Seal，B.S.，Matrix Protein gene nucleotide andpredicted amino acid sequence demonstrate that the first US avianpneumovirus isolate is distinct from European strains.Virus Res，
1998.58(1-2)：p.45-52；Bayon-Auboyer，M.H. 等，Comparison of F-，G- and N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for thedetection and typing of turkey rhinotracheitis virus.Arch Virol，1999，144(6)：p.1091-109；
Juhasz，K.和A.J.Easton，Extensive sequencevariation in the attachment(G)protein gene of avian pneumovirus：evidence of two distinct subgroups.J Gen Virol，
1994.75(Pt 11)：p.2873-80。
[0019] 在WO00/20600中提供了另一种APV血清型，WO00/20600描述了APV Colorado分离株，并且用体外血清中和试验将其与已知的APV或TRT毒株进行了比较。首先，针对识别TRT分离株的单特异性多克隆抗血清，测试了所述Colorado分离株。所述Colorado分离株不被针对任何所述TRT毒株的单特异性抗血清中和。然而，它被针对A亚组毒株产生的超免疫抗血清所中和。这种抗血清在1∶400的滴度下中和所述同源病毒，而在1∶80的滴度下中和所述Colorado分离株。然后运用上述方法，针对TRT单克隆抗体测试了所述Colorado分离株。在所有情况下，交互中和效价都小于10。针对所述Colorado分离株产生的单特异性抗血清也针对两个亚组的TRT毒株进行了测试。所测试的TRT毒株中没有一个被抗所述Colorado分离株的抗血清中和。
[0020] APV Colorado毒株不保护SPF鸡抵抗TRT病毒的A亚组或B亚组毒株的攻击。这些结果提示，所述Colorado分离株可能是禽肺病毒的另一种血清型的首个例子，Bayon-Auboyer等也提示了这一点(J.Gen.Vir.81：2723-2733(2000))。
[0021] 在一个优选实施方案中，本发明提供一种在分类学上对应于(迄今未知的哺乳动物)metapneumovirus的分离的MPV，所述MPV包含与副粘病毒科肺病毒亚科中的肺病毒不同的基因顺序。这两个属的分类主要基于其基因构象(gene constellation)；metapneumovirus一般缺乏非结构蛋白诸如NS1或NS2(也参见Randhawa等，J.Vir.71：
9849-9854(1997)，并且基因顺序不同于肺病毒的基因顺序(RSV：’3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G
4，5，6
-F-M2-L-5’，APV：’3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’) 。本发明提供的MPV或者在分类学上与其对应的病毒分离株基于EM分析，揭示为副粘病毒样颗粒。与分类一致，MPV或在系统发育上或分类学上与其对应的病毒分离株对氯仿处理敏感；最适于在tMK细胞或与其功能等同的细胞上培养，并且在大多数细胞培养物中基本上是酪氨酸依赖性的。此外，典型的CPE以及对于最经典使用的红细胞缺乏血细胞凝集活性，提示本文提供的病毒虽然仅与经典肺病毒如RSV是远缘，但却是相关的。虽然大多数副粘病毒具有血细胞凝集活性，但大
13
多数肺病毒没有所述活性 。依照本发明的MPV在编码M2蛋白的核酸片段中也含有第二个重叠ORF(M2-2)，与一般大多数其它肺病毒一样，诸如也在Ahmadian等，J.Gen.Vir.80：
2011-2016(1999)中所证明的。
[0022] 为了发现本发明提供的其它病毒分离株，只要测试任选得自患病动物或人的样品中肺病毒亚科病毒的存在情况，并且测试如此得到的病毒中编码(功能性)NS1或NS2的基因的存在情况，或者如上所述基本上证明不同于肺病毒如RSV的基因顺序即可。此外，通过用得自本文提供的MPV分离株的核酸的交叉杂交实验，或者在运用特异性针对MPV分离株的单克隆抗体和/或具体来源于MPV分离株的抗原和/或免疫原的经典交叉血清学实验中，可以发现在系统发育上并且因此在分类上与MPV相对应的病毒分离株。
[0023] 当新分离的病毒包含与我们的原型MPV分离株足够相似的基因顺序和/或氨基酸序列，或者在结构上与其对应，并且显示出与肺病毒亚科的Metapneumovirus密切相关时，所述病毒在系统发育上并且因此在分类学上对应于MPV。MPV和同一科的任何迄今已知的其它病毒(APV C亚型)之间有最高氨基酸序列同源性，并且在各个蛋白质水平上确定结构相关性，对于基质蛋白为87％，对于核蛋白为88％，对于磷蛋白为68％，对于融合蛋白为81％，而对于聚合酶蛋白的部分为56-64％，这可以在将图6中给出的序列与其它病毒、特别是APV-C的序列比较时得出。分别相对于这些上述最大值有较高同源性的各个蛋白质或完整的病毒分离株，被认为在系统发育上并且因此在分类学上对应于MPV，并且包含在结构上与图6所示序列对应的核酸序列。在此，本发明提供一种在系统发育上对应于所保藏的病毒的病毒。应该注意到，与其它病毒相似，在本文提供的不同分离的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒分离株之间，发现一定程度的变异。在系统发育进化树中，根据L、M、N和F基因的部分的比较性序列分析，我们鉴定出病毒分离株的至少2个遗传分类群(genetic cluster)。基于所述病毒核酸序列或氨基酸序列(病毒序列)的核苷酸和氨基酸差异，以及与其它肺病毒如RSV相似，这些MPV基因型代表MPV亚型。在MPV分离株的每个遗传分类群内，发现核苷酸水平的同一性百分率对于L为94-100，对于M为91-100，对于N为
90-100，而对于F为93-100，并且在氨基酸水平上，发现同一性百分率对于L为91-100，对于M为98-100，对于N为96-100，而对于F为98-100。在图18-28中，可以发现另一种比较。对于此中提供的、迄今已鉴定的分离的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒(MPV分离株)的整个组而言，核苷酸水平的最低同一性百分率，对于L和M为81，对于N为83，而对于F为82。在氨基酸水平上，该百分率对于L和N为91，对于M为94，对于F为95。此中提供的MPV分离株的病毒序列或分离的MPV F基因例如表现出与例如Seal等，Vir.Res.66：
139147(2000)提供的APV-C融合(F)基因的相应核苷酸序列或氨基酸序列有低于81％的核苷酸序列同一性或低于82％的氨基酸序列同一性。
[0024] 此外，此中提供的MPV分离株的病毒序列或分离的MPV L基因例如表现出与例如Ranhawa等，J.Gen.Vir.77：3047-3051(1996)提供的APV-A聚合酶基因的相应核苷酸序列或氨基酸序列有低于61％的核苷酸序列同一性或低于63％的氨基酸序列同一性。
[0025] 全世界MPV毒株的序列差异百分比与其它病毒类似，可能略高。因此，通过分析9种病毒分离株的N、M、F和L ORF中的部分核苷酸序列，鉴定了两个潜在的遗传分类群。
在一个分类群内观察到90-100％核苷酸同一性，在分类群间观察到81-88％的同一性。用更多病毒分离株获得的序列信息证实存在两种基因型。作为A分类群原型的病毒分离株ned/00/01和作为B分类群原型的病毒分离株ned/99/01已经用于交叉中和测定，以测试所述基因型是否与不同的血清型或亚组相关。根据这些数据，我们总结出，表现出与分离株
1-2614的氨基酸同源性百分率对于L高于64、对于M高于87、对于N高于88、对于P高于
68、对于F高于81、对于M2-1高于84或对于M2-2高于58的基本上为哺乳动物的病毒分离株，可以分类为此中提供的分离的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒。特别是，一般在核苷酸序列水平与此中提供的一种原型MPV分离株的最低同一性百分率对于L和M为81、对于N为83和/或对于F为82的那些病毒分离株，是此中提供的MPV分离株组的成员。在氨基酸水平上，这些百分率对于L和N为91、对于M为94、和/或对于F为95。当给定病毒分离株的氨基酸序列同源性百分率对于L和N高于90、对于M高于93、或对于F高于94时，所述病毒分离株与图5所示的MPV分离株组相似。当给定病毒分离株的氨基酸序列同源性百分率对于L高于94、对于N高于95或对于M和F高于97时，所述病毒分离株可以被鉴定为属于图5所示的基因型分类群之一。应该注意到，借以确定遗传分类群的这些同源性百分率与在RSV的相应基因的遗传分类群中发现的同源性程度相似。
[0026] 简而言之，本发明提供分离的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒(MPV)，所述MPV属于副粘病毒科肺病毒亚科，并且通过测定所述病毒基因组中合适片段的核酸序列并且在系统发育进化树分析中对其进行测试，其中采用100个引导程序和3个jumble生成最大似然进化树，并且发现在系统发育上与对应于也称为火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)(禽鼻气管炎的病原)的禽肺病毒(APV)的病毒分离株相比，它更密切地对应于以I-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分离株，所述病毒可鉴定为在系统发育上对应于Metapneumovirus。
[0027] 每种可用于这样的系统发育进化树分析的合适的核酸基因组片段，例如为此中在详细描述中公开的、生成此中图4或图5中公开的各种系统发育进化树分析的RAP-PCR片段1-10中的任一种。MPV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)和融合蛋白(F)基因的系统发育进化树分析揭示与主要在在美国鸟类中发现的禽肺病毒-APV C血清型有最高程度的序列同源性。
[0028] 在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒(MPV)，所述MPV属于副粘病毒科肺病毒亚科，并且通过测定所述病毒基因组中合适片段的核酸序列并且在系统发育进化树分析中对其进行测试，其中采用100个引导程序和3个jumble生成最大似然进化树，并且发现在系统发育上与对应于也称为火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)(禽鼻气管炎的病原)的禽肺病毒(APV)的病毒分离株相比，它更密切地对应于以I-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分离株，所述病毒可鉴定为在系统发育上对应于Metapneumovirus，其中所述合适片段包含编码所述病毒的病毒蛋白的可读框。
[0029] 合适的可读框(0RF)包括编码N蛋白的ORF。当发现所分析的N蛋白与分离株I-2614的N蛋白的总体氨基酸同一性至少为91%优选至少95％时，则所分析的病毒分离株包含依照本发明的优选的MPV分离株。正如所表明的，MPV基因组图谱中的第一个基因编码一种394个氨基酸(aa)的蛋白质，并且表现出与其它肺病毒的N蛋白有广泛的同源性。所述N ORF的长度与APV-C的N ORF的长度相同(表5)，而小于其它副粘病毒的N ORF的长度(Barr等，1991)。氨基酸序列的分析揭示，与APV-C的同源性最高(88％)，与其它副粘病毒仅有7-11％的同源性(表6)。
[0030] Bart等(1991)鉴定出在属于单分子负链RNA病毒目的病毒之间有相似性的3个区：A、B和C(图8)。虽然在病毒科内的相似性最高，但这些区在病毒科之间是高度保守的。在所有三个区中，MPV显示出与APV-C的氨基酸序列同一性为97％，与APV-B的氨基酸序列同一性为89％，与APV-A的氨基酸序列同一性为92％，而与RSV和PVM的氨基酸序列同一性为为66-73％。在aa残基160和340之间的区看来在metapneumovirus中是高度保守的，在肺病毒亚科中其保守程度略低(Miyahara等，1992；Li等，1996；Barr等，1991)。这与MPV是一种metapneumovirus是一致的，这一特定区显示出与APV C的相似性为99％。
[0031] 可用于系统发育分析的另一合适的可读框(ORF)包括编码P蛋白的ORF。当发现所分析的P蛋白与分离株I-2614的P蛋白的总体氨基酸同一性至少为70％、优选至少85％时，则所分析的病毒分离株包含依照本发明的优选的MPV分离株。MPV基因组图谱中的第二个ORF编码一种294个aa的蛋白质，所述蛋白质与APV-C的P蛋白有68％的氨基酸序列同源性，与RSV的P蛋白仅有22-26％的氨基酸序列同源性(表6)。MPV的P基因含有一个实质上的ORF，并且在该方面与得自许多其它副粘病毒的P相似(有关综述参见Lamb和Kolakofsky，1996；Sedlmeier等，1998)。与APV A和B以及PVM相反，而与RSV和APV-C相似，MPV P ORF缺乏半胱氨酸残基。Ling(1995)提出，在所有肺病毒中有高度相似性的一个区(aa 185-241)在RNA合成过程或者在维持核衣壳复合体结构完整性方面起作用。这一高相似性的区也存在于MPV中(图9)，尤其是当考虑到保守取代时，显示出与APV-C的相似性为100％，与APV-A和B的相似性为93％，与RSV的相似性大约为81％。MPV P蛋白的C末端富含谷氨酸残基，正如关于APV已描述的(Ling等，1995)。
[0032] 可用于系统发育分析的另一合适的可读框(ORF)包括编码M蛋白的ORF。当发现所分析的M蛋白与分离株I-2614的M蛋白的总体氨基酸同一性至少为94％、优选至少97％时，则所分析的病毒分离株包含依照本发明的优选的MPV分离株。MPV基因组中的第三个ORF编码一种254个aa的蛋白质，所述ORF类似其它肺病毒的M ORF。MPVM ORF的大小与其它metapneumovirus的M ORF的大小完全相同(表5)，并且显示出与APV基质蛋白的氨基酸序列同源性高(76-87％)，与RSV和PVM的氨基酸序列同源性较低(37-38％)，而与其它副粘病毒的同源性为10％或更低(表6)。Easton(1997)比较了所有肺病毒的基质蛋白的序列，发现残基14-19有一个保守的六肽，所述六肽在MPV中也是保守的(图10)。对于RSV、PVM和APV而言，已经鉴定出M主要ORF内或者与M主要ORF重叠的小的第二个ORF(bRSV中的52个aa和51个aa，RSV中的75个aa，PVM中的46个aa和APV中的51 aa)(Yu等，1992；Easton等，1997；Samal等，1991；Satake等，1984)。我们注意到MPV M ORF中有两个小ORF。在M主要ORF内发现一个始于核苷酸2281的54个aa残基的小ORF，发现一个始于核苷酸2893的与M主要ORF重叠的33个aa残基的小ORF(数据未显示)。与RSV和APV的第二ORF相似，在这些第二ORF和其它肺病毒的第二ORF之间没有显著的同源性，并且缺乏表观的起始信号或终止信号。另外，有关对应于APV和RSV的这些第二ORF的蛋白质的合成的证据尚未有报道。
[0033] 可用于系统发育分析的另一合适妁可读框(ORF)包括编码F蛋白的ORF。当发现所分析的F蛋白与分离株I-2614的F蛋白的总体氨基酸同一性至少为95％、优选至少97％时，则所分析的病毒分离株包含依照本发明的优选的MPV分离株。MPV的F ORF邻近M ORF定位，这是Metapneumovirus成员的特征。MPV F基因编码一种539个aa的蛋白质，该蛋白比APV-C的F长2个aa残基(表5)。氨基酸序列分析表明，与APV-C的同源性为
81％，与APV-A和B的同源性为67％，与肺病毒F蛋白的同源性为33-39％，而与其它副粘病毒的同源性仅有10-18％(表6)。在副粘病毒F蛋白中并且也在MPV中观察到的保守特征之一是半胱氨酸残基的分布(Morrison，1988；Yu等，1991)。metapneumovirus在F1中共享12个半胱氨酸残基(7个在所有副粘病毒中是保守的)，在F2中共享2个半胱氨酸残基(1个在所有副粘病毒中是保守的)。在MPV F ORF中存在的3个潜在的N-联糖基化位点中，没有一个是与RSV共享的，与APV共享2个所述位点(位置66和389)。MPV的第三个特有的潜在N-联糖基化位点位于位置206(图11)。虽然与其它副粘病毒的序列同源性低，但MPV的F蛋白表现出与关于其它副粘病毒科成员的F蛋白所描述的相一致的典型融合蛋白的特征(Morrison，1988)。副粘病毒科成员的F蛋白作为无活性前体(F0)合成，被宿主细胞的蛋白酶切割，产生氨基末端F2亚基和大的羧基末端F1亚基。已提出的切割位点(Collins等，1996)在副粘病毒科的所有成员中都是保守的。MPV的所述切割位点含有残基RQSR。两个精氨酸(R)残基与APV和RSV共享，但谷氨酰胺(Q)和丝氨酸(S)残基与其它副粘病毒如人副流感病毒1型、仙台病毒和麻疹病毒共享(数据未显示)。F1氨基末端的疏水性区据认为作为膜融合结构域起作用，并且在副粘病毒和麻疹病毒中显示出高序列相似性，而在肺病毒中显示出的序列相似性程度较低(Morrison，1988)。这26个残基(位置137-163，图11)在MPV和APV-C之间是保守的，这与该区在metapneumovirus中高度保守相一致(Naylor等，1998；Seal等，2000)。
[0034] 正如对于APV和其它副粘病毒的F2亚基所观察到的，与RSV相比，MPV显示出缺失22个aa残基(位置107-128，图11)。此外，对于RSV和APV，发现信号肽和锚定结构域在亚型内保守，而在亚型间显示出高变异性(Plows等，1995；Naylor等，1998)。MPV的位于F2氨基末端的信号肽(aa 10-35，图11)显示出与APV-C有一定的序列相似性(26个aa残基中的18个是相似的)，与其它APV或RSV有较低的保守性。在F1羧基末端的膜锚定结构域中观察到大得多的变异性，虽然仍观察到与APV-C有一定的同源性。
[0035] 可用于系统发育分析的另一合适的可读框(ORF)包括编码M2蛋白的ORF。当发现所分析的M2蛋白与分离株I-2614的M2蛋白的总体氨基酸同一性至少为85％、优选至少90％时，则所分析的病毒分离株包含依照本发明的优选的MPV分离株。M2基因是肺病毒亚科特有的，在所有肺病毒中观察到两个重叠的ORF。第一个主要ORF代表M2-1蛋白，该蛋白增强病毒聚合酶的持续合成能力(Collins等，1995；Collins，1996)和其基因间区的通读性(Hardy等，1998；Fearns等，1999)。MPV的M2-1基因邻近F基因定位，编码一种187个aa的蛋白质(表5)，并且显示出与APV-C的M2-1的同源性最高(84％)(表6)。所有肺病毒M2-1蛋白的比较表明，在所述蛋白氨基端一半中的保守性最高(Collins等，1990；Zamora等，1992；Ahmadian等，1999)，这与MPV显示出在该蛋白的前80个aa残基中与APV-C的相似性为100％的保守性的观察相一致(图12A)。MPV M2-1蛋白含有3个位于前30个aa残基内、在所有肺病毒中保守的半胱氨酸残基。这种半胱氨酸的集中在锌结合蛋白中是常见的(Ahmadian等，1991；Cuesta等，2000)。
[0036] 与肺病毒M2-1 ORF重叠的第二ORF(M2-2)的位置是保守的，但在序列上不保守，所述ORF被认为参与病毒RNA复制和转录间转换的控制(Collins等，1985；Elango等，1985；Baybutt 等，1987；Collins 等，1990；Ling 等，1992；Zamora 等，1992；Alansari 等，
1994；Ahmadian等，1999；Bermingham等，1999)。对于MPV而言，M2-2 ORF始于M2-1 ORF中的核苷酸512(图7)，这正是APV-C中的相同起始位置。APV-C和MPV的M2-2 ORF的长度相同，有71个aa残基(表5)。MPV和APV-C之间M2-2 ORF的序列比较(图12B)表明有56％的氨基酸序列同源性，而在MPV与APV-A和B之间仅有26-27％的氨基酸序列同源性(表6)。
[0037] 可用于系统发育分析的另一合适的可读框(ORF)包括编码L蛋白的ORF。当发现所分析的L蛋白与分离株I-2614的L蛋白的总体氨基酸同一性至少为91％、优选至少95％时，则所分析的病毒分离株包含依照本发明的优选的MPV分离株。与其它负链病毒类似，MPV基因组的最后一个ORF是复制转录复合物的依赖RNA的RNA聚合酶组分。MPV的L基因编码一种2005个aa的蛋白质，所述蛋白质比APV-A的所述蛋白长1个残基(表5)。MPV的L蛋白与APV-A有64％的同源性，与RSV有42-44％的同源性，而与其它副粘病毒有约13％的同源性(表6)。Poch等(1989；1990)鉴定出非分段负链RNA病毒的L蛋白内的6个保守结构域，其中结构域III含有被认为对于聚合酶功能所必需的4个核心聚合酶基序。这些基序(A、B、C和D)在MPV L蛋白中的保守性很好：在基序A、B和C中：MPV与所有肺病毒有100％的相似性，在基片D中，MPV与APV有100％相似性，与RSV有92％的相似性。对于完整的结构域III(L ORF中的aa 625-847)，MPV与APV有83％的同一性，与RSV有67-68％的同一性，与其它副粘病毒有26-30％的同一性(图15)。除所述聚合酶基序之外，肺病毒的L蛋白含有一个符合共有ATP结合基序K(X)21GEGAGN(X)20K的序列(Stec，1991)。MPV L ORF含有一个与APV类似的基序，其中中间残基的距离少一个残基：K(x)22GEGAGN(X)19K。
[0038] 可用于系统发育分析的更为优选的合适的可读框(0RF)包括编码SH蛋白的ORF。当发现所分析的SH蛋白与分离株I-2614的SH蛋白的总体氨基酸同一性至少为30％、优选至少50％、更优选至少75％时，则所分析的病毒分离株包含依照本发明的优选的MPV分离株。所述基因邻近MPV的M2定位，编码一种183个aa的蛋白质(图7)。所述核苷酸序列及其导出的氨基酸序列的分析表明，没有与其它RNA病毒基因或基因产物可辨别的同源性。MPV的SH ORF是迄今已知的最长的SH ORF(表5)。所述SH ORF的aa残基的组成与APV、RSV和PVM的相当相似，具有高百分比的苏氨酸和丝氨酸(MPV、APV、RSV A、RSV B、bRSV和PVM的丝氨酸/苏氨酸含量分别为22％、18％、19％、20.0％、21％和28％)。MPV的SH ORF含有10个半胱氨酸残基，而APV SH含有16个半胱氨酸残基。所有肺病毒都有类似数目的潜在的N-糖基化位点(MPV 2、APV 1、RSV 2、bRSV 3、PVM 4)。
[0039] MPV SH蛋白以及APV和RSV的SH的疏水性分布型揭示出相似的结构特征(图13B)。APV和MPV的SH ORF有一个亲水性N末端(aa1-30)、一个可以充当潜在的跨膜结构域的中心疏水性结构域(aa 30-53)、残基160周围的一个第二疏水性结构域和一个亲水性C末端。相反，RSV的SH看来缺乏APV和MPV ORF的C端一半。在所有肺病毒的SH蛋白中，所述疏水性结构域都邻接多个碱性氨基酸，该碱性氨基酸在MPV的SH ORF中也存在(aa
29和54)。
[0040] 可用于系统发育分析的另一个更为优选的合适的可读框(ORF)包括编码G蛋白的ORF。当发现所分析的G蛋白与分离株I-2614的G蛋白的总体氨基酸同一性至少为30％、优选至少50％、更优选为至少75％时，则所分析的病毒分离株包含依照本发明的优选的MPV分离株。MPV的G ORF邻近SH基因定位，编码一种236个氨基酸的蛋白质。紧接该ORF之后，发现第二个小ORF，可能编码68个aa残基(位置6973-7179，)，但缺乏起始密码子。在一个不同读框中的194个aa残基的第三个主要ORF(片段4，图7)与这两个ORF重叠，但也缺乏起始密码子(核苷酸6416-7000)。这一主要ORF在同一读框内后接第四个ORF(nt7001-7198)，可能编码65个aa残基，但又是缺乏起始密码子。最后，在所述第三个读框中发现一个可能的97个aa残基的ORF(但缺乏起始密码子)(nt 6444-6737，图1)。与第一个ORF不同，所述其它ORF没有表观的基因起始序列或基因终止序列(参见下文)。虽然236个aa残基的G ORF可能代表MPV吸附蛋白的至少一部分，但不能排除的是：所述额外的编码序列通过某些RNA编辑事件而作为单独的蛋白或作为所述吸附蛋白的部分表达。应该注意到，对于APV和RSV而言，在所述主要G ORF之后没有鉴定出第二个ORF，但APV和RSV在G的主要ORF内都有第二个ORF。然而，缺乏有关这些ORF表达的证据，并且在不同病毒的预测氨基酸序列之间没有同源性(Ling等，1992)。MPV G中的第二个ORF没有显示出其它G蛋白的特征，所述额外ORF是否表达有待进一步研究。对于所有4个ORF的BLAST分析表明，在核苷酸序列或氨基酸序列水平上与其它已知病毒基因或基因产物没有可辨别的同源性。这与发现其它G蛋白例如hRSV A和B的G蛋白(53％)(Johnson等，1987)以及与APV A和B的G蛋白(38％)(Juhasz等，1994)的序列同源性低相一致。而大多数所述MPVORF在长度和序列上与APV的所述ORF相似，MPV的G ORF比APV的G ORF小得多(表5)。氨基酸序列表明，丝氨酸和苏氨酸的含量为34％，这甚至高于RSV的32％和APV的24％。所述G ORF也含有8.5％的脯氨酸残基，这高于RSV的8％和APV的7％。APV、RSV和MPV的G蛋白中脯氨酸残基的不寻常的丰度在粘蛋白起源的糖蛋白中也观察到，在粘蛋白起源的糖蛋白中这是蛋白质三维结构的一个主要考虑因素(Collins等，1983；Wertz等，1985；Jentoft，
1990)。MPV G中的潜在N-联糖基化位点的数目与其它肺病毒的相似：MPV有5个，而hRSV有7个，bRSV有5个，APV有3-5个。
[0041] MPV G的预测疏水性分布型揭示了与其它肺病毒相似的特征。氨基末端含有一个亲水性区，后接一个短的疏水性区(aa 33-53)和一个主要为亲水性的羧基末端(图14B)。这种总体组构与锚定II型跨膜蛋白的相一致，与APV和RSV的G蛋白中的这些区很好地对应。MPV的G ORF仅含有1个半胱氨酸残基，这与RSV和APV形成对比(分别有5个和20个)。
[0042] 依照经典的血清学分析，例如得自以下文献的分析：Francki，R.I.B.，Fauquet，C.M.，Knudson，D.L和Brown，F.，Classification andnomenclature of viruses.Fifth report of the international Committee onTaxonomy of viruses.Arch Virol，1991.Supplement 2：p.140-144，根据通过用动物抗血清(在详细描述中提供的得自例如白鼬或豚鼠的抗血清)定量中和测定的免疫学区别(immunological distinctiveness)，MPV分离株也可被鉴定为属于本文提供的血清型。这样一种血清型或者与其它血清型没有交叉反应，或者在两个方向上都显示出同种与异种效价之比大于16。如果中和表明两种病毒在任一个或两个方向上有一定程度的交叉反应(同种与异种效价之比为8或16)，则若存在DNA的显著生物物理/生物化学差异，就推定有血清型区别(distinctiveness)。如果中和表示两种病毒在任一个或两个方向上有不同程度的交叉反应(同种与异种效价之比小于8)，则推定所研究的分离株的血清型相同。正如所述的，在此提供一种有用的原型分离株例如分离株I-2614，在本文也称为MPV分离株00-1。
[0043] 根据G和/或SH蛋白的同源性，可以进一步将病毒分类为此中提供的分离的基本上为哺乳动物的负义单链RNA病毒。在一般APV(从鸟类分离的)和MPV(从人类分离的)的N、P、M、F、M2和L ORF之间存在64-88％的总体氨基酸序列同一性，并且在APV和MPV基因组的非编码区之间也发现有核苷酸序列同源性的情况下，发现在所述人类分离株(MPV)的所述ORF中的两个和其它副粘病毒的所述ORF中任一个之间基本上没有可辨别的氨基酸序列同源性。在所述病毒基因组中这些ORF的氨基酸含量、疏水性分布型和位置表明，它们代表G和SH蛋白类似物。在APV和MPV之间的序列同源性、其相似的基因组组构(3′-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5′)以及系统发育分析，提供了有关所提出的MPV分类为第一种哺乳动物metapneumovirus的进一步证据。因此，新的MPV分离株可以例如如此通过以下方法来鉴定：通过病毒分离和用tMK或其它细胞进行特征鉴定、通过RT-PCR和/或序列分析，后接系统发育进化树分析、通过血清学技术例如病毒中和测定、间接免疫荧光测定、直接免疫荧光测定、FACs分析或其它免疫学技术。优选这些技术针对SH和/或G蛋白类似物。
[0044] 例如，本发明在此提供一种鉴定此中提供的MPV的其它分离株的方法，所述方法包括接种基本上为MPV不感染或无特定病原体的豚鼠或白鼬(在详细描述中，所述动物经鼻内接种，但其它接种方式诸如肌内或皮内接种以及使用其它实验动物也是可行的)与原型分离株I-2614或相关分离株。在第0天、接种后2周和3周，从所述动物收集血清。在所述其它分离株的免疫学检测中，使用用病毒中和(VN)测定和针对相应的分离株I-2614的间接IFA测定为特异性血清转变的动物和得自所述血清转变的动物的血清。
[0045] 作为一个例子，本发明提供副粘病毒科的一个新成员-在人类中可能引起重症RTI的人metapneumovirus或metapneumovirus样病毒(由于其最终的分类学有待病毒分类委员会的讨论，所以所述MPV在此例如描述为在分类学上对应于APV)(MPV)的表征。由MPV引起的疾病的临床体征基本上与hRSV引起的体征相似，例如咳嗽、肌痛、呕吐、发热、支气管炎或肺炎、可能的结膜炎或它们的并发症。正如在hRSV感染的儿童、尤其是非常小的儿童中所观察到的，可能需要住院。作为一个例子，提供于2001年1月19日以I-2614保藏于巴黎巴斯德研究所(Institute Pasteur，Paris)CNCM的MPV或者在系统发育上与其对应的病毒分离株。此外，本发明提供一种包含在系统发育上对应于图6a、6b、6c中所示的核酸序列或在结构上与其对应的核酸或功能片段的病毒。特别是，本发明提供一种病毒，所述病毒的特征在于在其中用100个引导程序和3个jumble生成最大似然进化树的系统发育进化树分析中测试后，发现在系统发育上与对应于也称为火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)(禽鼻气管炎的病原)的禽肺病毒(APV)的病毒分离株相比，它更密切地对应于以I-2614保藏于巴黎CNCM的病毒分离株。尤其有用的是，在所述系统发育进化树分析中用APV-C病毒分离株作为外类群，所述APV-C病毒分离株虽然基本上是非哺乳动物病毒，但却是最相关的。
[0046] 根据几个观察结果，我们提议新型人类病毒被命名为人metapneumovirus或metapneumovirus样病毒(MPV)。EM分析揭示出副粘病毒样颗粒。与所述分类一致的是，MPV看来对氯仿处理敏感。MPV最适于在tMK细胞上培养，并且是酪氨酸依赖性的。由MPV引起的临床症状以及典型的CPE和缺乏血细胞凝集活性提示，这种病毒与hRSV最为相关。13
虽然大多数副粘病毒有血细胞凝集活性，但大多数肺病毒没有所述活性 。
[0047] 作为一个例子，本发明提供先前尚未鉴定的、得自取自28位患有重症RTI的儿童的鼻咽吸出物样品的副粘病毒。这些儿童的临床症状主要与hRSV所致的症状相似。所述患者中的27位是5岁以下的儿童，其中一半为1-12个月。另一位患者为18岁。所有个体都患有上呼吸道疾病，症状从咳嗽、肌痛、呕吐和发热至支气管炎和重症肺炎。这些患者中的大多数住院1-2周。
[0048] 得自这些患者的病毒分离株在负对比电子显微镜下具有副粘病毒的形态，但不与针对已知的人类和动物副粘病毒的特异性抗血清反应。通过使用针对所述分离株中的2株产生的血清的间接免疫荧光测定(IFA)测定，它们之间都密切相关。这些分离株中的9个的序列分析表明，所述病毒与APV略微相关。基于病毒学数据、序列同源性以及基因组组构，我们提出，所述病毒是Metapneumovirus的成员。血清学调查表明，这种病毒是相对常见的病原体，因为在荷兰的血清阳性率接近5岁人群的100％。此外，在1958年从人类收集的血清中，发现血清阳性率同样高，表明这种病毒在人群中已经循环超过40年。这种建议的Metapneumovirus新成员的鉴定，也为开发供诊断分析或试剂盒和疫苗用的工具和方法、或者针对病毒呼吸道感染的血清或抗体组合物、以及测试或筛选可用于MPV感染治疗的抗病毒药的方法创造了条件。
[0049] 在这方面，本发明其中提供可得自本发明病毒的分离或重组的核酸或其病毒特异性功能片段。特别是，本发明提供适用于鉴定MPV核酸的引物和/或探针。
[0050] 此外，本发明提供一种包含本发明核酸的载体。首先，提供载体，例如含有MPV基因组(的部分)的质粒载体、含有MPV基因组(的部分)的病毒载体(例如但不限于其它副粘病毒、痘苗病毒、逆转录病毒、杆状病毒)、或含有其它病毒或其它病原体的基因组(的部分)的MPV。此外，描述了关于基于两个临床参数产生重组负链病毒的多种反向遗传学技术。首先，这种病毒的产生依赖于所述负义病毒RNA(vRNA)基因组的部分或全长拷贝或其互补拷贝(cRNA)的复制。可以从通过体外转录时产生的或者在用核酸转染时在细胞中产生的感染性病毒中，分离这种vRNA或cRNA。其次，重组负链病毒的产生依赖于功能性聚合酶复合体。通常，肺病毒的聚合酶复合物由N、P、L和可能的M2蛋白组成，但不一定限于此。聚合酶复合物或其组分可以从病毒颗粒、表达一种或多种所述组分的细胞中分离，或者通过用特定表达载体转染来产生。
[0051] 当上述vRNA、cRNA或者表达这些RNA的载体由上述聚合酶复合体复制16，17，18，19，20，21，22
时，可以获得MPV的感染性拷贝。为了产生小复制子(minireplicons)或者用于产生包含大多数或者完整的MPV基因组的全长拷贝的反向遗传学系统，只要运用可得自例如APV(Randhawa等，1997)或MPV本身的3’端和/或5’端核酸序列即可。
[0052] 另外，本发明提供包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。在原核细胞中产生含有MPV聚合酶组分(推测为N、P、L和M2，但不一定限于此)的质粒或病毒载体，以供在相关细胞类型(细菌、昆虫细胞、真核细胞)中表达所述组分。将在原核细胞中产生含有MPV基因组的全长拷贝或部分拷贝的质粒或病毒载体，以便在体外或体内表达病毒核酸。后一类载体可能含有供产生嵌合病毒或嵌合病毒蛋白用的其它病毒序列，可以缺乏病毒基因组的多个部分，以便产生复制缺陷型病毒，并且可以含有某些突变、缺失或插入，以便产生减毒病毒。
[0053] 可以通过依照上述的现有技术共表达所述聚合酶组分，产生MPV的感染性拷贝(野生型、减毒型、复制缺陷型或嵌合型)。
[0054] 另外，可以使用瞬时或稳定表达一种或多种全长或部分MPV蛋白的真核细胞。这类细胞可以通过转染(蛋白质或核酸载体)、感染(病毒载体)或转导(病毒载体)来制备，并且可用于上述野生型、减毒型、复制缺陷型或嵌合型病毒的互补。
[0055] 对于产生抗两种或两种以上病毒的重组疫苗而言，嵌合病毒可能特别有用23，24，26。例如，可以设想，表达RSV的一种或多种蛋白的MPV病毒载体或者表达MPV的一种或多种蛋白的RSV载体，将保护接种了这类载体的个体抵抗两种病毒的感染。对于PI3或者其它副粘病毒，可以设想相似的方法。对于用活疫苗接种的目的，减毒型和复制缺陷型病毒可能是
25，26
有用的，正如对于其它病毒所建议的 。
[0056] 在一个优选实施方案中，本发明提供由本发明的核酸编码的蛋白性分子或metapneumovirus特异性病毒蛋白或其功能片段。有用的蛋白性分子例如来源于可得自本发明的病毒的任何基因或基因组片段。此中提供的这类分子或其抗原性片段，例如可用于诊断方法或试剂盒中以及用于药用组合物中，例如亚单位疫苗中。特别有用的是供作为抗原或亚单位免疫原来包括的F、SH和/或G蛋白或其抗原性片段，但也可以使用灭活的全病毒。特别有用的也有由供系统发育分析用的所鉴定的重组核酸片段所编码的蛋白性物质，当然优选可用于系统发育分析的ORF、尤其是用于无论是体内(例如用于保护目的或者用于提供诊断性抗体)或体外(例如通过噬菌体展示技术或可用于产生合成抗体的另一种技术)诱发MPV特异性抗体的优选ORF范围内的那些蛋白性物质。
[0057] 在此也提供与包含本发明的蛋白性分子或其MPV特异性功能片段的抗原特异性反应的抗体，所述抗体为天然的多克隆抗体或单克隆抗体或者为合成的(例如(噬菌体)文库衍生的结合分子)抗体。这类抗体可用于鉴定病毒分离株为MPV的方法中，所述方法包括使所述病毒分离株或其组分与此中提供的抗体反应。这例如可以通过运用纯化或非纯化MPV或其部分(蛋白质、肽)，采用ELISA、RIA、FACS或相似形式的抗原检测测定(CurrentProtocols in Immunology)来实现。另一方面，可以用受感染的细胞或细胞培养物，运用经典的免疫荧光或免疫组织化学技术鉴定病毒抗原。
[0058] 用于鉴定病毒分离株为MPV的其它方法包括使所述病毒分离株或其组分与本发明的病毒特异性核酸反应，特别是在所述哺乳动物病毒包括人类病毒的情况下。
[0059] 这样，本发明提供一种病毒分离株，所述病毒分离株可用本发明的方法鉴定在分类学上对应于可鉴定为可能属于副粘病毒科肺病毒亚科中Metapneumovirus的负义单链RNA病毒的哺乳动物病毒。
[0060] 所述方法可用于病毒学诊断哺乳动物MPV感染的方法中，所述方法例如包括通过使所述哺乳动物的样品与本发明的核酸或抗体反应，测定所述样品中病毒分离株或其组分的存在情况。在详细描述中进一步给出了实例，例如运用PCR(或本领域众所周知的其它扩增或杂交技术)或者运用免疫荧光检测(或者本领域已知的其它免疫学技术)。
[0061] 本发明也提供一种血清学诊断哺乳动物MPV感染的方法，所述方法包括通过使所述哺乳动物的样品与本发明的蛋白性分子或其片段或抗原反应，测定所述样品中特异性针对MPV或其组分的抗体的存在情况。
[0062] 在此提供的方法和工具，尤其可用于供通过病毒学诊断或血清学诊断来诊断MPV感染用的诊断试剂盒。这类试剂盒或者测定可以例如包含本发明的病毒、核酸、蛋白性分子或其片段、抗原和/或抗体。也提供本发明的病毒、核酸、蛋白性分子或其片段、抗原和/或抗体在生产药用组合物、例如用于治疗或预防MPV感染和/或用于治疗或预防呼吸道疾病、特别是人类疾病的药用组合物中的应用。所述病毒的减毒可以通过开发用于此目的的已建立的方法来实现，所述方法包括但不限于运用其它物种的相关病毒、通过实验动物连续传代和/或组织/细胞培养物、分子克隆的定点诱变和相关病毒之间基因或基因片段的交换。
[0063] 包含本发明的病毒、核酸、蛋白性分子或其片段、抗原和/或抗体的药用组合物，可以例如用于治疗或预防MPV感染和/或呼吸道疾病的方法中，所述方法包括给个体提供本发明的药用组合物。这在所述个体包括人类时，尤其是当所述人群不足5岁时最为有用，因为这样的婴儿和幼儿最可能受在此提供的人MPV感染。一般而言，在急性期，患者将患有其它呼吸道疾病和其它疾病素因性上呼吸道症状。也可能发生多种其它严重疾病素因性的下呼吸道疾病。
[0064] 本发明也提供获得可用于治疗呼吸道疾病的抗病毒药的方法，所述方法包括建立包含本发明病毒的细胞培养物或实验动物，用候选抗病毒药处理所述培养物或治疗所述动物，并且测定所述因子对所述病毒或其对所述培养物或动物的感染的影响。这样的抗病毒药的一个例子包括在此提供的MPV中和抗体或其功能组分，但也可获得其它性质的抗病毒药。本发明也提供本发明的抗病毒药在药用组合物制备中、特别是用于治疗呼吸道疾病、尤其是当由MPV感染引起的呼吸道疾病的药用组合物制备中的应用；以及提供包含本发明抗病毒药的、可用于治疗或预防MPV感染或呼吸道疾病的方法中的药用组合物，所述方法包括为个体提供这样一种药用组合物。
[0065] 在详细描述中进一步解释本发明，但本发明并不限于此。
[0066] 图面说明
[0067] 图1A为表1：在分离株00-1和肺病毒亚科其它成员的氢基酸序列之间所发现的同源性百分率。给出了N、P、M、F和L中两个RAP-PCR片段(8和9/10)的氨基酸序列的百分率(×100)。在材料和方法一节中描述了所述分析所使用的登记号。
[0068] 图1B为表2；在根据年龄组分类的人群中运用免疫荧光测定和病毒中和测定所测定的MPV的血清阳性率。
[0069] 图2：APV基因组中用RAP-PCR和RT-PCR在病毒分离株00-1上获得的片段的位置和大小的图示。片段1-10运用RAP-PCR获得。片段A用RAP-PCR片段1和2中的一种6
引物和基于APV和RSV前导序列和尾随序列 的比对设计的一种引物而获得。片段B用在RAP-PCR片段1和2中以及RAP-PCR片段3中设计的引物获得。片段C用在RAP-PCR片段
3中和RAP-PCR片段4、5、6和7中设计的引物获得。
[0070] 对于所有的系统发育进化树，(图3-5)DNA序列运用ClustalW软件包进行序列比对，并且用使用100个引导程序和3个jumble的Phylip3.5的DNA-ML软件包生成最15
大似然进化树 。先前已发表的用于生成系统发育进化树的序列可得自Genbank，登记号为：对于所有ORF：hRSV：NC001781；bRSV：NC001989；对于F ORF：PVM，D11128；APV-A，D00850；APV-B，Y14292；APV-C，AF187152；对于N ORF：PVM，D10331；APV-A，U39295；APV-B，U39296；APV-C，AF176590；对于M ORF：PMV，U66893；APV-A，X58639；APV-B，U37586；APV.C，AF262571；对于P ORF：PVM，09649；APV-A，U22110，APV-C，AF176591。用APV C毒株作为外类群，对于9个不同的MPV病毒分离株进行系统发育分析。
[0071] 图中所用的缩写：hRSV：人RSV；bRSV：牛RSV；PVM：小鼠肺炎病毒；APV-A、B和C：禽肺病毒A、B和C型。
[0072] 图3：肺病毒亚科成员和病毒分离株00-1的N、P、M和F ORF的比较。所述序列比对显示出病毒分离株00-1的完整N、P、M和F蛋白和部分L蛋白的氨基酸序列。显示了分离株00-1和其它病毒之间不同的氨基酸，相同的氨基酸用句点表示，空位用破折号表示。编号对应于所述蛋白质中的氨基酸位置。所述分析所用的登记号在材料和方法一节中有描述。APV-A、B或C：A、B或C型禽肺病毒，bRSV或hRSV：牛或人呼吸道合胞病毒，PVM：小鼠肺炎病毒。L8：用RAP-PCR获得的位于L中的片段8，L9/10二用RAP-PCR获得的位于L中的片段9和10的共有序列。对于P序列比对，从Genebank不能得到APV-B序列。对于L序列比对，仅可得到bRSV、hRSV和APV-A的序列。
[0073] 图4：肺病毒亚科(Pneumovirinae)属成员和病毒分离株00-1的N、P、M和F ORF的系统发育分析。用得自以下基因的病毒序列进行系统发育分析：F(图面A)、N(图面B)、M(图面C)和P(图面D)。系统发育进化树基于使用100个引导程序和3个jumble的最大似然分析。显示了每个进化树的代表核苷酸改变数目的刻度。
[0074] 图5：9个原代MPV分离株和与其遗传上最为相关的APV-C的F(图面勾、N(图面B)、M(图面C)和L(图面D)ORF的部分的系统发育关系。系统发育进化树基于最大似然分析。显示了每个进化树的代表核苷酸改变数目的刻度。对于APV-C的登记号：图面A.D00850；图面B：U39295；图面C：X58639；以及图面D：U65312。
[0075] 图6A：得自MPV分离株00-1基因组3’末端的核苷酸序列和氢基酸序列信息。给出以下ORF：N：核蛋白的ORF；P：磷蛋白的0RF；M二基质蛋白的ORF；F：融合蛋白的ORF；GE：基因结束；GS：基因起始。
[0076] 图6B和C：得自ⅧV分离株00-1所得的聚合酶基因(L)中片段的核苷酸序列和氢基酸序列信息。所述L中片段的定位基于与APV-C的蛋白质同源性(登记号U65312)。已翻译的片段8(图6B)位于氨基酸号8-243，片段9和10的共有序列(图6C)位于APV-C L ORF的暴基酸号1358-1464。
[0077] 图7
[0078] MPV分离株00-1的基因组图谱。在每个0RF之下，指示了起始密码子和终止密码子的核苷酸位置。横过的L 0RF的双线指示缩短表示L基因。图谱下的三个读框指明第一G ORF(nt 6262-6972)和重叠的可能的第二ORF。
[0079] 图8：
[0080] MPV的核蛋白与其它肺病毒的所述蛋白的预测氨基酸序列的序列比对。由Barr(1991)鉴定的保守区以方框表示，并且标注A、B和C。肺病毒中的保守区(Li，1996)以灰色阴影显示。空位以破折号表示，句点表示与MPV相比相同氨基酸残基的位置。
[0081] 图9：
[0082] MPV的磷蛋白与其它肺病毒的所述蛋白的氨基酸序列比较。框注了高相似性的区(Ling，1995)，富含谷氨酸的区以灰色阴影表示。空位以破折号表示，句点表示与MPV相比相同氨基酸残基的位置。
[0083] 图10：
[0084] MPV的基质蛋白与其它肺病毒的所述蛋白的推导的氨基酸序列的比较。保守的六肽序列(Easton，1997)以灰色阴影表示。空位以破折号表示，句点表示与MPV相比相同氨基酸残基的位置。
[0085] 图11：
[0086] MPV的融合蛋白与其它肺病毒的所述蛋白的预测氨基酸序列的比对。框注了保守的半胱氨酸残基，N-联糖基化位点以下划线表示，F0的切割位点以双下划线表示，融合肽、信号肽和膜锚定结构域以灰色阴影表示。空位以破折号表示，句点表示与MPV相比相同氨基酸的位置。
[0087] 图12
[0088] MPV的M2 ORF与其它肺病毒的所述ORF的氨基酸序列的比较。M2-1ORF的序列比对示于图面A中，保守的氨基末端(Collins，1990；Zamora，1999)以灰色阴影表示。三个保守的半胱氨酸残基以粗体印刷并且用#指示。M2-2 ORF的序列比对示于图面B中。空位以破折号表示，句点表示与MPV相比相同氨基酸的位置。
[0089] 图13
[0090] MPV SH ORF的氨基酸序列分析。(A)MPV的SH ORF的氨基酸序列，丝氨酸和苏氨酸残基以灰色阴影表示，半胱氨酸残基以粗体表示，而疏水性区以双下划线表示。潜在的N-联糖基化位点以单下划线表示。数字表示邻接疏水性结构域的碱性氨基酸的位置。(B)MPV、APV-A和hRSV-B的SH蛋白的疏水性曲线图的比对。使用Kyte和Doolittle(1982)的方法和一个17个氨基酸的窗。箭头表示强疏水性结构域。所述ORF内的位置在X轴上给出。
[0091] 图14
[0092] MPV G ORF的氨基酸序列分析。(A)MPV的G 0RF的氨基酸序列，丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基以灰色阴影表示，半胱氨酸残基以粗体表示，而疏水性区以双下划线表示。潜在的N-联糖基化位点以单下划线表示。(B)MPV、APV-A和hRSV-B的G蛋白的疏水性曲线图的比对。使用Kyte和Doolittle(1982)的方法和一个17个氨基酸的窗。箭头表示所述疏水性区。所述ORF内的位置在X轴上给出。
[0093] 图15
[0094] MPV和其它副粘病毒的聚合酶基因中保守结构域的氨基酸序列的比较。显示了结构域III，框注了结构域III中的4个保守的聚合酶基序(A，B，C，D)(Poch 1998，1999)。空位以破折号表示，句点表示与MPV相比相同氨基酸残基的位置。hPIV3：3型人副流感病毒；SV；仙台病毒；hPIV-2：2型人副流感病毒；NDV：新城疫病毒；MV：麻疹病毒；nipah：Nipah病毒。
[0095] 图16：
[0096] MPV和所选副粘病毒的M2-1和L ORF的系统发育分析。所述M2-1 ORF与肺病毒亚科(Pneumovirinae)属其它成员的M2-1 ORF进行序列比对(A)，而所述L ORF与肺病毒亚科(Pneumovirinae)属成员以及图15图面说明中的所选其它副粘病毒的L ORF进行序列比对(B)。采用运用100个引导程序和3个jumble的最大似然分析生成系统发育进化树。显示了每个进化树的代表核苷酸改变数目的刻度。进化树中的数字代表基于所述共有序列进化树的引导程序的数值。
[0097] 图17：
[0098] hMPV分离株00-1的非编码序列。(A)所述ORF之间和基因组末端的非编码序列以正义方向表示。从左至右，显示出所示0RF的终止密码子、后接非编码序列、所示后续ORF的基因起始信号和起始密码子。数字表示hMPV图谱中第一个起始密码子和终止密码子的位置。显示出与已发表的基因终止信号有相似性的序列以下划线表示，显示出与UAAAAAU/A/C有相似性的序列以所述序列上的线表示。(B)hMPV基因组末端的核苷酸序列。hMPV基因组末端相互之间以及与APV的基因组末端进行序列比对。下划线的区表示RT-PCR测定中所使用的、基于APV和RSV的3’端和5’端序列(Randhawa等，1997；Mink等，1991)的引物序列。以粗斜体表示的核苷酸为N基因基因起始信号的部分。Le：前导序列，Tr：尾随序列。
[0099] 图18：
[0100] 两种原型hMPV分离株与APV-A和APV-C的比较；编码各种病毒蛋白的核酸的DNA相似性矩阵。
[0101] 图19：
[0102] 两种原型hMPV分离株与APV-A和APV-C的比较；各种病毒蛋白的蛋白质相似性矩阵。
[0103] 图20：
[0104] 两种原型hMPV分离株核蛋白的氨基酸序列比对
[0105] 图21：
[0106] 两种原型hMPV分离株磷蛋白的氨基酸序列比对
[0107] 图22：
[0108] 两种原型hMPV分离株基质蛋白的氨基酸序列比对
[0109] 图23：
[0110] 两种原型hMPV分离株融合蛋白的氨基酸序列比对
[0111] 图24：
[0112] 两种原型hMPV分离株M2-1蛋白的氨基酸序列比对
[0113] 图25：
[0114] 两种原型hMPV分离株M2-2蛋白的氨基酸序列比对
[0115] 图26：
[0116] 两种原型hMPV分离株短疏水性蛋白的氨基酸序列比对
[0117] 图27：
[0118] 两种原型hMPV分离株吸附糖蛋白的氨基酸序列比对
[0119] 图28：
[0120] 两种原型hMPV分离株聚合酶蛋白N末端的氨基酸序列比对
[0121] 图29：对接种了ned/00/01和/或ned/99/01的12只豚鼠的咽喉和鼻拭抹物的RT-PCR分析结果。
[0122] 图30A：用感染ned/00/01并且用ned/00/01(GP 4、5和6)或ned/99/01(GP 1和3)再感染的豚鼠针对ned/00/01和ned/99/01的IgG应答。
[0123] 图30B：用感染ned/99/01并且用ned/00/01(GP 8和9)或ned/99/01(GP 10、11、12)再感染的豚鼠针对ned/00/01和ned/99/01的IgG应答。
[0124] 图31：ned/00/01和ned/99/01 ELISA对取自用ned/00/01或ned/99/01感染的豚鼠的血清的特异性。
[0125] 图32：针对3只同种(00-1/00-1)、2只同种(99-1/99-1)、2只异种(99-1/00-1)和2只异种(00-1/99-1)感染豚鼠的ned/00/01和ned/99/01ELISA的平均IgG应答。
[0126] 图33：hMPV感染豚鼠的对APV抑制的平均百分率。
[0127] 图34：ned/00/01和ned/99/01感染豚鼠针对ned/00/01、ned/99/01和APV-C的病毒中和效价。
[0128] 图35：对接种了ned/00/01(两次)的恒河猴的喉拭抹物的RT-PCR测定结果。
[0129] 图36 A(上面两幅图)：
[0130] 2只用ned/00/01(再)感染的恒河猴针对ned/00/01的IgA、IgM和IgG应答。
[0131] 图36B(下图)
[0132] 2只用ned/00/01感染的恒河猴针对APV的IgG应答。
[0133] 图37：应用hMPV ELISA和APV抑制ELISA检测人血清中IgG抗体的比较。
[0134] 详细描述
[0135] 病毒的分离和表征
[0136] 从1980年至2000年，我们发现了28种从重症呼吸道疾病患者中分离的尚未鉴定的病毒分离株。这28种尚未鉴定的病毒分离株在tMK细胞中生长缓慢，在VERO细胞和A549细胞中生长差，并且在MDCK或鸡胚成纤维细胞中不能繁殖或很少繁殖。这些病毒分离株中的大多数在tMK细胞上经3次传代后在第10天和第14天之间诱导CPE。所述CPE实际上不能区别于由hRSV或hPIV在tMK或其它细胞培养物中引起的CPE，特征为合胞体形成，此后细胞表现出快速的内部破坏，然后所述细胞与单层分离。所述细胞通常(有时随后)在病毒从原始材料传代3次后，在接种后第10-14天，显示出CPE，比由其它病毒例如hRSV或hPIV引起的CPE略晚。
[0137] 我们使用受感染的tMK细胞的上清液进行EM分析，EM分析表明存在带有13-17纳米短包膜突起的150-600纳米的副粘病毒样病毒颗粒。与有包膜病毒例如副粘病毒科的8 4
生物化学特性一致的是，标准氯仿处理或乙醚处理 导致对tMK细胞的感染性降低超过10 TCID50。病毒感染的tMK细胞培养上清液对火鸡、鸡和豚鼠的红细胞不表现出血细胞凝集活性。在培养期间，病毒在所测试的细胞上的复制看来是酪氨酸依赖性的。这些综合病毒学数据表明，新鉴定的病毒在分类学上分类为副粘病毒科的成员。
[0138] 我们从用所述尚未鉴定的病毒分离株中的15株感染的tMK细胞中分离出RNA，以9
便用对副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)、hPIV-4、仙台病毒、猴病毒5型、新城疫病毒、麻疹病毒、hRSV腮腺炎病毒、Nipah病毒、Hendra病毒、Tupaia病毒和Mapuera病毒特异性的引物组，进行逆转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)分析。RT-PCR分析在低严谨性下进行，以便检测可能相关的病毒，并且用从同种病毒原液分离的RNA作为对照。所述可利用的对照与相应的病毒特异性引物反应阳性，新鉴定的分离株不与任何引物组反应，表明该病毒与所测试的病毒不密切相关。
[0139] 我们使用所述病毒感染的tMK细胞培养上清液中的两种，经鼻腔接种豚鼠和白鼬。第0天、接种后2周和3周，从这些动物收集血清。所述动物没有表现出临床症状，但用病毒中和(VN)测定和针对所述同源病毒的间接IFA测定，所有动物都发生血清转变。所述血清在间接IFA中与上述任何已知的副粘病毒以及与PVM不反应。接着，我们用豚鼠和白鼬感染前和感染后血清筛选了迄今尚未鉴定的病毒分离株，通过用感染后血清进行间接IFA测定，其中28株明显为阳性，提示它们在血清学上密切相关或相同。
[0140] RAP PC R
[0141] 为了获得有关所述未知病毒分离株的序列信息，我们运用称为RAP-PCR10的随机PCR扩增策略。为此，用其中一种病毒分离株(分离株00-1)以及用作对照的hPIV-1感染tMK细胞。在两种培养物都显示出相似水平的CPE之后，在连续20-60％蔗糖梯度上纯化培养上清液中的病毒。用EM检查各梯度级分中的病毒样颗粒，从含有约50％蔗糖的级分中分离出RNA，其中观察到核衣壳。用从两个病毒级分中分离出的等量RNA进行RAP-PCR，此后将样品在3％NuSieve琼脂糖凝胶上并排电泳。随后从凝胶中纯化出20个对所述尚未鉴定的病毒特异性的差别显示的条带，在质粒pCR2.1(Invitrogen)中克隆，并且用载体特异性引物测序。当我们使用这些序列来用BLAST软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对Genbank数据库中序列进行同源性搜索时，20个片段中的10个显示出与APV/TRTV序列相似。
[0142] 这10个片段位于编码核蛋白(N；片段1和2)、基质蛋白(M；片段3)、融合蛋白(F；片段4、5、6、7)和聚合酶蛋白(L；片段8、9、10)的基因中(图2)。我们接着基于我们6
的RAP PCR片段以及已发表的肺病毒亚科的前导序列和尾随序列 设计了PCR引物，以便完成所述病毒基因组3’端的序列信息。扩增出三个片段，其中片段A跨越N可读框(ORF)的最3’端，片段B跨越磷蛋白(P)ORF，而片段C紧靠M ORF和F ORF之间的间隙(图2)。
这三个片段的序列分析揭示，缺乏在病毒基因组最3’端的NS1和NS2 ORF，并且F ORF紧邻M ORF定位。这种基因组组构类似metapneumovirus APV的基因组组构，这也与序列同源性一致。N、P、M和F ORF的总体翻译序列显示出与肺病毒属成员平均有30-33％同源性，与Metapneumovirus成员有66-68％同源性。对于SH和G ORF，未发现与任一上述属成员有可辨别的同源性。所发现的N的氨基酸同源性表明，与hRSV有约40％的同源性，与APV.C有88％的同源性，与APV-C在遗传上最密切相关，这例如可以通过对图3的氨基酸序列与其它病毒的相应N蛋白的氨基酸序列进行比较而得出。P的氨基酸序列显示出与hRSV有约
25％的同源性，与APV-C有约66-68％的同源性，M显示出与hRSV有约36-39％的同源性，与APV-C有约87-88％的同源性，F显示出与hRSV有约40％的同源性，与APV-C有约81％的同源性，M2-1显示出与肺病毒有约34.36％的同源性，与APV-C有84-86％的同源性，M2-2显示出与肺病毒有15-17％的同源性，与APV-C有56％的同源性，而L中获得的片段显示出与肺病毒平均有44％的同源性，与APV-C有64％的同源性。
[0143] 系统发育
[0144] 虽然用得自所述尚未鉴定的病毒分离株的核苷酸序列进行BLAST搜索表明，主要与肺病毒亚科成员有同源性，但基于蛋白质序列的同源性表明，与其它副粘病毒也有一定的相似性(数据未显示)。作为所述新鉴定的病毒分离株和肺病毒亚科成员之间相关的指示，基于这些病毒的N、P、M和F ORF，构建了系统发育进化树。在所有4个系统发育进化树中，所述新鉴定的病毒分离株与APV最密切相关(图4)。根据已经描述的APV的4种血清11
型 ，APV C血清型-主要在美国鸟类中发现的metapneumovirus，显示出与所述新鉴定的病毒最为相似。然而，应该注意到，仅可得到APV D血清型的部分序列信息。
[0145] 为了确定我们的各种新鉴定的病毒分离株的关系，我们基于得自8-9个分离株(对于F为8个，对于N、M和L为9个)的序列信息，构建了系统发育进化树。为此，我们采用RT-PCR和设计用于扩增N、M、F和L ORF中短片段的引物，随后对所述片段直接测序。也发现先前发现在血清学方面相关(参见上文)的9个病毒分离株在遗传上密切相关。事实上，所有9个分离株相互之间比与APV之间更为密切相关。虽然供这些系统发育进化树用的序列信息是有限的，但是看来所述9个分离株可以分为两组，分离株94-1、99-1和99-2分为一组，而其它6个分离株(94-2；93-1；93-2；93-3；93-4；00-1)分为另一组(图5)。
[0146] 血清阳性率
[0147] 为了研究这种病毒在人群中的血清阳性率，我们通过用以所述尚未鉴定的病毒分离株之一感染的tMK细胞进行的间接IFA，检验得自不同年龄段人群的血清。这种分析揭示，6-12个月儿童中的25％有针对该病毒的抗体，到5岁为止，接近100％的儿童的血清为阳性。在通过间接IFA检验的总共56份血清样品中，用VN测定进行检验。对于所述样品中的51份样品(91％)，VN测定的结果(滴度＞8)与用间接IFA获得的结果(滴度＞32)一致。在IFA中发现为阳性的4份样品，通过VN检验为阴性(滴度＜8)，而一份血清在IFA中反应为阴性(滴度＜32)，但在VN检验中为阳性(滴度为16)(表2)。
[0148] 用1958年取自人类(年龄为8-99岁)的72份血清12，27进行的IFA揭示出100％的血清阳性率，表明所述病毒在人群中已经循环超过40年。另外，在VN测定中使用这些血清中的多份血清，以证实IFA数据(表2)。
[0149] N、M、P和F基因的基因分析揭示，iMPV与最近建议的属Metapneumovirinae的序列同源性(平均63％)高于与属肺病毒亚科(Pneumovirinae)(平均30％)的序列同源性，因此证明与一APV/TRTV相似和类似的基因组组构。与RSVs(′3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’)的基因组组构相对比，metapneumoviruses缺乏NS1和NS2基因，并且在M和L之间的基因的定位不同(′3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5′)。在我们的病毒分离株中缺乏M和F基因之间的ORF以及缺乏邻近N的NS1和NS2以及所发现的与APV有高氨基酸序列同源性，是提议从人类中分离的MPV应分类为Metapneumovirus的第一个哺乳动物(尤其是人类来源的)成员。
[0150] 系统发育分析揭示，从中获得序列信息的9个MPV分离株密切相关。虽然序列信息有限，但它们实际上相互之间的相关性比与任何禽metapneumovirus的相关性更为密切。在已经描述的APV的4种血清型中，基于N、P、M和F基因，C血清型与MPV最密切相关。然而，应该注意到，从Genbank中仅可得到D血清型F基因的部分序列，对于B血清型，仅可得到M、N和F序列。我们的MPV分离株在系统发育进化树中形成2个分类群。对于hRSV和APV，已经描述了不同的基因亚型和血清学亚型。目前仍不了解MPV分离株的所述两个遗传分类群是否代表在功能上也不同的血清学亚组。我们的血清学调查表明，MPV是一种常见的人类病原体。从得自重症RTI儿童的临床样品中重复分离出这种病毒，表明MPV的临床和经济影响可能高。基于病毒检测和血清学的新诊断测定，将提供一种这种病毒病原体发病率的更为详细的分析以及这种病毒病原体的临床和经济影响。
[0151] IFA结果和VN结果(5份样品)之间略有差异，可能是由于在所述IFA中仅检测IgG血清抗体，而VN测定既检测各抗体类别，也检测各抗体亚类所致，或者差异可能是由于两种测定之间灵敏度的差异所致。对于IFA，使用16的截止值，而VN使用8的截止值。
[0152] 另一方面，IFA与VN测定之间的差异也可能表明这种新鉴定的病毒的不同血清型之间的可能差异。由于MPV似乎与APV最密切相关，因此我们推测，所述人类病毒可能起源于鸟类。对1958年取自人类血清样品的分析显示，MPV在人群中已经广泛流传超过40年，表明在1958年之前很久，必定发生了假定的动物传染病事件。
[0153] 材料和方法
[0154] 样本采集
[0155] 在过去数十年间，我们的实验室从患有RTI的儿童收集了鼻咽吸出物，对其常规检验了病毒的存在情况。所有鼻咽吸出物都通过采用针对流感病毒A和B型、hRSV和人副流感病毒(hPIV)1-3型的荧光标记抗体的直接免疫荧光测定(DIF)进行了检验。也对所述14
鼻咽吸出物进行了处理，以便用快速shell vial技术 ，对包括VERO细胞、第三代恒河猴肾(tMK)细胞、人肺内皮(HEL)细胞和marbin dock肾(MDCK)细胞在内的各种细胞系进行病毒分离。在传代2-3次后显示出细胞病变效应(CPE)并且在DIF中为阴性的样品，通过采用针对以下病毒的病毒特异性抗体的间接免疫荧光测定(IFA)进行测试：流感病毒A、B和C型、hRSV A和B型、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人副流感病毒(hPIV)1-4型、仙台病毒、猴病毒
5型和新城疫病毒。虽然对于许多病例而言，可以鉴定出病原，但某些样本对于所测所有这些病毒都是阴性的。
[0156] 直接免疫荧光测定(DIF)
[0157] 依照已描述的方法14，15，用得自RTI患者的鼻咽吸出物样品来进行DIF和病毒分离。样品贮存于-70℃。简而言之，鼻咽吸出物用5mlDulbecco MEM(BioWhittaker，Walkersville，MD)稀释，在涡旋混合器上充分混合1分钟。将悬浮液以840×g离心10分钟。将沉淀涂在多点(multispot)玻片(Nutacon，Leimuiden，The Netherlands)上，用上清液进行病毒分离。干燥后，将细胞在丙酮中于室温固定1分钟。洗涤后，玻片于37℃用市售的FITC标记的病毒特异性抗血清例如抗流感病毒A和B、hRSV和hPIV 1-3的病毒特异性抗血清(Dako，Glostrup，Denmark)保温15分钟。用PBS洗涤3次并且在自来水中洗涤1次之后，使玻片包含在甘油/PBS溶液(Citifluor，UKC，Canterbury，UK)并使其被覆盖。
用Axioscop荧光显微镜(Carl Zeiss B.V，Weesp，the Netherlands)分析玻片。
[0158] 病毒分离
[0159] 为了分离病毒，将tMK细胞(PIVM，Bilthoven，The Netherlands)在带有玻片的24孔板(Costar，Cambridge，UK)中，用补充10％胎牛血清(BioWhittaker，Vervier，Belgium)的下述培养基培养。在接种之前，所述板用PBS洗涤，然后加入含有Hank氏盐的Eagle氏MEM(ICN，Costamesa，CA)，在所述培养基中，半升补充0.26克NaHCO3、0.025 M Hepes(Biowhittaker)、2 mM L-谷氨酰胺(Biowhittaker)、100单位青霉素、100μg链霉素(Biowhittaker)、0.5克乳清蛋白(Sigma-A1drich，Zwijndrecht，The Netherlands)、1.0克D-葡萄糖(Merck，Amsterdam，TheNetherlands)、5.0克蛋白胨(Oxoid，Haarlem，The Netherlands)和0.02％酪氨酸(Life Technologies，Bethesda，MD)。在所述板中一式三份接种所述鼻咽吸出物样品的上清液，每孔0.2ml，然后以840×g离心1小时。接种后，让所述板于37℃最多孵育14天，一周更换一次培养基，每日检查培养物的CPE。14天后，从第二次传代培养物中刮出细胞，然后再孵育14天。对于第三次传代，重复该步骤。用所述玻片如下所述通过间接IFA证实所述病毒的存在。
[0160] 动物免疫
[0161] 通过实验性鼻内感染在单独的加压手套箱中关养的两只无特定病原体的白鼬和两只豚鼠，产生针对所述新发现的病毒的白鼬和豚鼠特异性抗血清。2-3周后，通过心脏穿刺，给所有动物放血，用其血清作为参比血清。如下所述，用间接IFA检验所述血清中所有先前描述的病毒。
[0162] 通过间接IFA检测抗原
[0163] 我们在含有受感染tMK细胞的玻片上进行间接IFA。用PBS洗涤后，将玻片于37℃与病毒特异性抗血清一起孵育30分钟。我们在DIF中使用如上所述的针对流感病毒A、B和C型、hPIV 1-3型和hRSV的单克隆抗体。对于hPIV 4型、腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙台病毒、猴病毒5型、新城疫病毒，使用多克隆抗体(RIVM)以及白鼬和豚鼠参比血清。用PBS洗涤3次和用自来水洗涤1次后，玻片用针对第一次孵育中所用血清的第二抗体染色。对于所述多克隆抗血清的第二抗体是山羊抗白鼬(KPL，Guilford，UK，稀释40倍)、小鼠抗兔(Dako，Glostrup，Denmark，稀释20倍)、兔抗鸡(KPL，稀释20倍)和小鼠抗豚鼠(Dako，稀释20倍)。按照关于DIF所述的方法处理玻片。
[0164] 通过间接IFA检测人抗体
[0165] 为了检测病毒特异性抗体，用冷丙酮将受感染的tMK细胞固定在盖玻片上，用PBS洗涤，然后用1-16稀释度的血清样品染色。随后，样品用在PBS中稀释80倍的FITC标记的兔抗人抗体(Dako)染色。如上所述处理玻片。
[0166] MPV的病毒培养物
[0167] 在上述培养基中的tMK细胞亚融合单层中，接种在24孔板中传代2-3次后显示出CPE的样品的上清液。每日检查培养物的CPE，一周更换一次培养基。由于CPE随每种分离株而不同，在第12-14天，使用针对所述新病毒分离株的白鼬抗体，运用间接IFA检验所有培养物。将阳性培养物冻融3次，此后通过低速离心澄清所述上清液，分成等分样品并冻16
存于-70℃。按照已描述的方法 ，测定培养上清液中病毒的50％组织培养物感染性剂量(TCID50)。
[0168] 病毒中和测定
[0169] 用人血清和动物血清以8倍稀释度开始的2倍连续稀释液，进行VN测定。经稀释的血清与100 TCID50的病毒一起温育1小时，然后接种到在96孔板中生长的tMK细胞中，此后，将板以840×g离心。在3天和6天后更换培养基，在接种后8天，用针对MPV的白鼬抗体进行IFA。VN滴度被定义为导致阴性IFA和抑制细胞培养物中CPE的血清样品的最低稀释度。
[0170] 病毒表征
[0171] 按照已描述的方法8，14进行血细胞凝集测定和氯仿敏感性试验。对于EM分析，在微量离心机中于4℃以17000×g，从受感染细胞培养上清液中浓缩病毒，此后，将沉淀重悬于PBS，用负对比EM检查。对于RAP-PCR，通过在60％蔗糖垫层(cussion)上超离心(150000×g 2小时，4℃)，从受感染的tMK细胞上清液浓缩病毒。60％蔗糖中间相随后用PBS稀释，然后铺在20-60％连续蔗糖梯度顶部，以275000×g于4℃离心16小时。用EM和聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用银染，检查蔗糖梯度各级分中病毒样颗粒的存在情况。看来含有核衣壳的约50％蔗糖的级分，用于RNA分离和RAP-PCR。
[0172] RNA分离
[0173] 用High Pure RNA Isolation kit(高纯度RNA分离试剂盒)，依照生产商的说明(Roche Diagnostics，Almere，The Nethedands)，从受感染细胞培养物的上清液或蔗糖梯度级分中分离RNA。
[0174] RT-PCR
[0175] 在附录1中描述了用于对已知副粘病毒进行RT-PCR的病毒特异性寡核苷酸序列。在含有50mM Tris.HCl pH 8.5、50mN NaCl、4mMMgCl2、2mM二硫苏糖醇、dNTP各200μM、10单位重组RNAsin(Promega，Leiden，the Netherlands)、10单位AMV RT(Promega，Leiden，The Netherlands)、5单位Amplitaq Gold DNA聚合酶(PE Biosystems，Nieuwerkerk aan de Ijssel，The Netherlands)和5μl RNA的50μl反应物中，进行一步RT-PCR。循环条件为42℃45 min和95℃7 min一次，95℃1 min、42℃2 min和72℃3 min重复40次，以及72℃10 min一次。RAP-PCR
[0176] RAP-PCR基本上按照已描述的方法10进行。在附录2中描述了所述寡核苷酸序列。对于RT反应，在含有10ng/μl寡核苷酸、10mM二硫苏糖醇、dNTP各500 μm、25 mM Tris-HCl pH 8.3、75 mM KCl和3mM MgCl2的10μl反应物中含有2μl RNA。将反应混合物于70℃保温5分钟，于37℃保温5分钟，然后加入200单位Superscript RT酶(Life Technologies)。继续于37℃保温55分钟，通过于72℃保温5分钟终止反应。将RT混合物稀释，得到含有8 ng/μl寡核苷酸、dNTP各300 μm、15mM Tris-HCL pH 8.3、65 mM KCl、3.0 mM MgCL2和5单位Taq DNA聚合酶(PE Biosystems)的50μl PCR反应物。循环条件为94℃5 min、40℃5 min和72℃1 min一次，然后于94℃1min、56℃2min和72℃1 min重复40次，然后于72℃5 min一次。在RAP-PCR之后，用RT-PCR产物各15μl在3％NuSieve琼脂糖凝胶(FMC BioProducts，Heerhugowaard，The Netheerlands)上并排电泳。
用Qiaquick Gel ExtractionKit(凝胶提取试剂盒)(Qiagen，Leusden，The Netherlands)，从凝胶中纯化差别显示出对MPV特异性的片段，依照生产商的说明，将其克隆到pCR2.1载体(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中。
[0177] 序列分析
[0178] 在载体pCR2.1(Invitrogen)中克隆的RAP-PCR产物用M13特异性寡核苷酸测序。用Qiaquick Gel Extraction Kit(凝胶提取试剂盒)(Qiagen，Leusden，The Netherlands)，从琼脂糖凝胶中纯化通过RT-PCR获得的DNA片段，用供PCR用的相同的寡核苷酸直接测序。用Dyenamic ETterminator sequencing kit(Dyenamic ET终止测序试剂盒)(AmershamPharmacia Biotech，Roosendaal，The Netherlands)和ABI 373自动DNA测序仪(PE Biosystem)进行序列分析。所有技术都依照生产商的说明进行。
[0179] 通过RT-PCR产生MPV的基因组片段
[0180] 为了产生跨越RAP-PCR片段之间的间隙A、B和C(图2)的PCR片段，我们对从病毒分离株00-1分离的RNA运用如上所述的RT-PCR测定。使用以下引物：
[0181] 对于片段A：设计位于前导序列中的TR1：(5’-AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3′)和设计位于所获得的N中RAP-PCR片段3’端的N1(，5′-CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3′)。
[0182] 对 于 片 段 B：设 计 位 于 所 获 得 的N 中RAP-PCR 片 段 5’端 的 N2：(5′-CATGCAAGCTTATGGGGC-3′)和设计位于所获得的M中RAP-PCR片段3’端的M1：
(5′-CAGAGTGGTTATTGTCAGGGT-3′)。
[0183] 对 于 片 段 C：设 计 位 于 所 获 得 的M 中RAP-PCR 片 段 5’端 的 M2：(5′-GTAGAACTAGGAGCATATG-3’)和设计位于所获得的F中RAP-PCR片段3’端的F1：
(5’-TCCCCAATGTAGATACTGCTTC-3′)。
[0184] 如上所述，从凝胶中纯化所述片段、将其克隆并测序。
[0185] 用于诊断MPV的RT-PCR
[0186] 为了对所述MPV分离株中9株的N、M、F和LORF的部分进行扩增和测序，我们使用引物N3(5′-GCACTCAAGAGATACCCTAG-3′)和N4(5′-AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3′)，来扩增一个151个核苷酸的片段，使用M3(5′-CCCTGACAATAACCACTCTG-3′)和M4(5′-GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3′)扩增一个252个核苷酸的片段，使用F7(5 ′-TGCACTATCTCCTCTTGGGGCTTTG-3 ′)和F8(5 ′-TCAAAGCTGCTTGACACTGGCC-3 ′ )扩增一个221个核苷酸的片段，使用L6(5′-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3′)和
L7(5′-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3′)扩增一个173个核苷酸的片段。如上所述进行RT-PCR、凝胶纯化和直接测序。此外，所用的探针是：
[0187] 用于M的探针：5′-TGC TTG TAC TTC CCA AAG-3′
[0188] 用于N的探针：5′-TAT TTG AAC AAA AAG TGT-3′
[0189] 用于L的探针：5′-TGGTGTGGGATATTAACAG-3′
[0190] 系统发育分析
[0191] 对于所有系统发育进化树，用C1ustalW软件包进行DNA序列的比对，用使用10015
个引导程序和3个jumble的Phylip 3.5程序的DNA-ML软件包 ，生成最大似然进化树。用于生成系统发育进化树的先前已发表的序列可从Genbank获得，登记号为：对于所有ORF：hRSV：NC001781；bRSV：NC001989；对于F ORF：PVM，D11128；APV-A，D00850；APV-B，Y14292；APV-C，AF187152；对于N ORF：PVM，D10331；APV-A，U39295；APV-B，U39296；APV-C，AF176590；对于M ORF：PMV，U66893；APV-A，X58639；APV-B，U37586；APV-C，AF262571；对于P ORF：PVM，09649；APV-A，U22110，APV-C，AF176591。用APV C毒株作为外类群，对所述9个不同的MPV病毒分离株进行系统发育分析。
[0192] 图中所用的缩写：hRSV：人RSV；bRSV：牛RSV；PVM：小鼠肺炎病毒；APV-A、B和C：禽肺病毒A、B和C型。
[0193] 鉴定MPV的方法的实施例
[0194] 样本采集
[0195] 为了发现病毒分离株，应该检查优选得自哺乳动物例如人、食肉动物(狗、猫、mustellits、海豹等)、马、反刍动物(牛、绵羊、山羊等)、猪、兔、鸟类(家禽、鸵鸟等)的鼻咽吸出物、喉和鼻拭抹物、支气管肺泡灌洗液。从鸟类，也可以检查泄殖腔拭抹物和粪便。应该收集血清，以进行免疫学测定，例如ELISA和病毒中和测定。
[0196] 所采集的病毒样本用5ml Dulbecco MEM培养基(BioWhittaker，Walkersville，MD)稀释，并且在涡旋混合器上充分混合1分钟。将悬浮液以840×g离心10分钟。对于免疫荧光技术，将沉淀涂在多点(multispot)玻片(Nutacon，Leimuiden，The Netherlands)上，而用上清液进行病毒分离。
[0197] 病毒分离
[0198] 为了分离病毒，将tMK细胞(PaVM，Bilthoven，The Netherlands)在带有玻片的24孔板(Costar，Cambridge，UK)中，用补充10％胎牛血清(BioWhittaker，Vervier，Belgium)的下述培养基培养。在接种之前，所述板用PBS洗涤，然后加入含有Hank氏盐的Eagle氏MEM(ICN，Costamesa，CA)，所述培养基补充0.52克/升NaHCO3、0.025 M Hepes(Biowhittaker)、2 mML-谷氨酰胺(Biowhittaker)、200单位/升青霉素、200μg/升 链 霉 素(Biowhittaker)、1克 /升 乳 清 蛋 白 (Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，The Netherlands)、2.0克/升D-葡萄糖(Merck，Amsterdam，The Netherlands)、10克/升蛋白胨(Oxoid，Haarlem，The Netherlands)和0.02％酪氨酸(Life Technologies，Bethesda，MD)。在所述板中一式三份接种所述鼻咽吸出物样品的上清液，每孔0.2 ml，然后以840×g离心1小时。接种后，让所述板于37℃最多孵育14天，一周更换一次培养基，每日检查培养物的CPE。14天后，从第二次传代培养物中刮出细胞，然后再孵育14天。对于第三次传代，重复该步骤。用所述玻片如下所述通过间接IFA证实所述病毒的存在。
[0199] 一般在第三次传代后，在第8-14天观察到CPE，这取决于分离株。所述CPE实际上不能区别于由hRSV或hPIV在tMK或其它细胞培养物中引起的CPE。然而，hRSV从大约第4天开始诱导CPE。CPE的特征为合胞体形成，此后细胞表现出快速的内部破坏，然后所述细胞与单层分离。对于某些分离株，难以观察到CPE，而用IFA证实这些培养物中所述病毒的存在。
[0200] MPV的病毒培养物
[0201] 在上述培养基中的tMK细胞亚融合单层中，接种在24孔板中传代2-3次后显示出CPE的样品的上清液。每日检查培养物的CPE，一周更换一次培养基。由于CPE随每种分离株而不同，在笫12-14天，使用针对所述新病毒分离株的白鼬抗体，运用间接IFA检验所有培养物。将阳性培养物冻融3次，此后通过低速离心澄清所述上清液，分成等分样品并冻存16
于-70℃。按照本领域中所使用的、已建立的技术 ，测定培养上清液中病毒的50％组织培养物感染性剂量(TCID50)。
[0202] 病毒表征
[0203] 按照已经很好建立并且在本领域使用的已描述的技术14，进行血细胞凝集测定和氯仿敏感性试验。对于EM分析，在微量离心机中于4℃以17000×g，从受感染细胞培养上清液中浓缩病毒，此后，将沉淀重悬于PBS，用负对比EM检查。
[0204] 通过间接IFA检测抗原
[0205] 如上所述处理所采集的样本，将样品沉淀涂在多点(multispot)玻片上。干燥后，将细胞在丙酮中于室温固定1分钟。
[0206] 或者，在带有玻片的24孔载玻片(24 well slide)中的tMK细胞上培养病毒。这些玻片用PBS洗涤，并于室温在丙酮中固定1分钟。
[0207] 用PBS洗涤后，将玻片于37℃与在PBS中以1∶50-1∶100稀释的多克隆抗体一起孵育30分钟。我们用经免疫的白鼬和豚鼠获得了多克隆抗体，但这些抗体可以在各种动物中产生，对于每种免疫，所述多克隆抗体的工作稀释度可以改变。用PBS洗涤3次和用自来水洗涤1次后，玻片与FITC标记的山羊抗白鼬抗体(KPL，Guilford，UK，稀释40倍)一起于37℃孵育30分钟。用PBS洗涤3次和用自来水洗涤1次后，使玻片包含在甘油/PBS溶液(Citifluor，UKC，Canterbury，UK)中并使其被覆盖。用Axioscop荧光显微镜(Carl Zeiss B.V.，Weesp，the Netherlands)分析玻片。
[0208] 通过间接IFA检测人类、哺乳动物、反刍动物或其它动物的抗体
[0209] 为了检测病毒特异性抗体，用丙酮将用MPV感染的tMK细胞固定在盖玻片上(如上所述)，用PBS洗涤，然后与1-16稀释度的血清样品一起于37℃孵育30分钟。用PBS洗涤2次和用自来水洗涤1次后，玻片与FITC标记的针对所用物种的第二抗体(Dako)一起于37℃孵育30分钟。如上所述处理玻片。
[0210] 抗体可以用荧光染料直接标记，这将产生直接免疫荧光测定。FITC可以用任何荧光染料替代。
[0211] 动物免疫
[0212] 通过实验性鼻内感染在单独的加压手套箱中关养的两只无特定病原体的白鼬和两只豚鼠，产生针对所述新发现的病毒的白鼬和豚鼠特异性抗血清。2-3周后，通过心脏穿刺，给所述动物放血，用其血清作为参比血清。如下所述用间接IFA，对所述血清检验所有先前描述的病毒。其它动物种也适合用于产生特异性抗体制备物，可以使用其它抗原制备物。
[0213] 病毒中和测定(VN测定)
[0214] 用人血清和动物血清以8倍稀释度开始的2倍连续稀释液，进行VN测定。经稀释的血清与100 TCID50的病毒一起孵育1小时，然后接种到在96孔板中生长的tMK细胞中，此后，将板以840×g离心。使用如上所述的相同培养基。在3天和6天后更换培养基，8天后，进行IFA(参见上文)。VN滴度被定义为导致阴性IFA和抑制细胞培养物中CPE的血清样品的最低稀释度。
[0215] RNA分离
[0216] 用High Pure RNA Isolation kit(高纯度RNA分离试剂盒)，依照生产商的说明(Roche Diagnostics，Almere，The Netherlands)，从受感染细胞培养物的上清液或蔗糖梯度级分中分离RNA。也可以依照本领域已知的其它方法分离RNA(Current Protocols in Molecular Biology)。
[0217] RT-PCR
[0218] 在 含 有 50mM Tris.HCl pH 8.5、50mMNaCl、4 mM MgCl2、2mM 二 硫 苏 糖 醇、dNTP各 200μM、10 单 位 重 组 RNAsin(Promega，Leiden，the Netherlands)、10单 位AMV RT(Promega，Leiden，The Netherlands)、5单 位Amplitaq Gold DNA聚 合酶 (PE Biosystems，Nieuwerkerk aan deIjssel，The Netherlands)和5μl RNA的50μl反应物中，进行一步RT-PCR。循环条件为42℃45 min和95℃7min一次，95℃1min、42℃2 min和72℃3min重复40次，以及72℃10min一次。
[0219] 用于诊断性PCR的引物：
[0220] 在 核 蛋 白 中：N3(5 ′ -GCACTCAAGAGATACCGTAG-3 ′ ) 和N4(5′-AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3一)，用以扩增一个151个核苷酸的片段。
[0221] 在基质蛋白中：M3(5′-CCCTGACAATAACCACTCTG-3′)和M4(5′-GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3′)，用以扩增一个252个核苷酸的片段。
[0222] 在 聚 合 酶 蛋 白 中：L6(5 ′ -CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3 ′ ) 和L7(5′-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3′)，用以扩增一个173个核苷酸的片段。
[0223] 可以基于MPV的序列设计其它引物，对于特定的目的，可以使用不同的缓冲液和测定条件。
[0224] 序列分析
[0225] 用Dyenamic ET terminator sequencing kit(Dyenamic ET终止测序试剂盒)(Amersham Pharmacia Biotech，Roosendaal，The Netherlands)和ABI 373自动DNA测序仪(PE Biosystem)进行序列分析。所有技术都依照生产商的说明进行。PCR片段用供PCR用的相同寡核苷酸直接测序，或者用Qiaquick Gel Extraction Kit(凝胶提取试剂盒)(Qiagen，Leusden，The Netherlands)，从凝胶中纯化所述片段，并且依照生产商的说明，将其克隆到pCR2.1载体(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中，随后用Ml3特异性寡核苷酸测序。
[0226] 供分析所述基因组(缺乏NS1/NS2)3’端用的寡核苷酸。
[0227] 基于Randhawa(1997)发表的hRSV和APV的尾随序列和前导序列，设计引物TR1(5′-AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3′)，基于所获得的N蛋白中的序列，设计引物N1(5’-CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3′)。RT-PCR测定和测序如上所述来进行。
[0228] 所述RT-PCR得到一种约500个碱基对的产物，该产物太小，以致于不能含有两个ORF的信息，这些序列的翻译并未揭示出0RF。
[0229] 通过ELISA检测人类、哺乳动物、反刍动物或其它动物的抗体
[0230] 在副粘病毒科中，N蛋白是丰度最高的蛋白质，针对这种蛋白的免疫应答在感染早期发生。由于这些原因，优选使用重组来源的所述N蛋白来开发用于检测抗MPV抗体的ELISA测定。适用于抗体检测的抗原包括与接触过或被MPV病毒感染的患者的任何MPV特异性抗体结合的任何MPV蛋白。本发明的优选抗原包括主要在接触了MPV的患者中引发免疫应答并因此通常最容易为患者的抗体所识别的那些抗原。特别优选的抗原包括MPV的N、F和G蛋白。供免疫学技术用的抗原可以是天然抗原，或者可以是其经修饰的形式。可以运用众所周知的分子生物学技术，来改变MPV抗原的氨基酸序列，以产生可以用于免疫学技术的经修饰形式的所述抗原。
[0231] 用于克隆基因、操作所述基因以加入到表达载体和从表达载体中取出、以及在异源宿主中表达由所述基因编码的蛋白质的方法是众所周知的，这些技术可以用来提供所述表达载体、宿主细胞以及用于在宿主中表达所克隆的编码抗原的基因，以产生供诊断测定使用的重组抗原。参见例如：Molecular cloning，A laboratory manual and CurrentProtoco in Molecular Biology。可以用各种各样的表达系统来产生MPV抗原。例如，适合于在大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(B.subtlis)、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中产生蛋白质的各种各样的表达载体已有描述，可以用其中任一种，来产生适用于检测接触过MPV病毒的患者体内的抗MPV抗体的MPV抗原。
[0232] 杆状病毒表达系统的优点是提供蛋白的必需加工，因此优选杆状病毒表达系统。该系统利用多角体蛋白启动子来指导MPV抗原的表达(Matsuura等，1987，J.Gen.Virol.68：1233-1250)。
[0233] 由重组杆状病毒产生的抗原可以用于各种各样的免疫学测定中，以检测患者体内的抗MPV抗体。已经很好确立的是，重组抗原可以用来在实际上任何的免疫测定中替代天然病毒，来检测病毒特异性抗体。这些测定包括直接测定和间接测定、夹心测定、固相测定其中例如使用板或微珠的那些固相测定、和液相测定。合适的测定包括用第一抗体和第二抗体的那些测定、以及使用抗体结合试剂例如A蛋白的那些测定。此外，在本发明中可以使用各种各样的检测方法，包括比色、荧光、磷光、化学发光、发光和放射性方法。
[0234] 实施例1：采用重组N蛋白的间接抗MPV IgG EIA
[0235] 可以进行采用重组N蛋白(用重组杆状病毒在昆虫(Sf9)细胞中产生的)作为抗原的间接IgG EIA。对于抗原制备，用所述重组杆状病毒感染Sf9细胞，在感染后3-7天收6
获。细胞悬浮液在PBS，pH7.2中洗涤2次，调至5.0×10 细胞/ml的细胞密度，然后冻融
3次。通过低速离心(500xg，15min.)沉淀大的细胞碎片，收集上清液，将其贮存于-70℃待用。对于阴性对照抗原，类似地处理未经感染的细胞。
[0236] 用100μl冻融裂解液来包被微量滴定板，其稀释度范围为1∶50至1∶1000。在两个复份孔中加入未经感染的细胞裂解液，用作阴性对照。在保温过夜后，用PBS/0.05％Tween洗板2次。试验血清在ELISA缓冲液(PBS，补充正常山羊血清至2％，并且补充0.5％牛血清白蛋白和0.1％奶粉)稀释1∶50至1∶200，然后将各孔于37℃保温1小时。
[0237] 用PBS/0.05％Tween洗板2次。向各孔中加入在ELISA缓冲液中以1∶3000至1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人(或针对其它物种)IgG，于37℃保温1小时。然后用PBS/0.05％Tween洗板2次，周自来水洗板1次，于室温与酶底物TMB-例如得自Sigma的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺一起保温15分钟，并且用100μl2M磷酸终止反应。用自动微量滴定板读出仪，测量450nm的比色读数。
[0238] 实施例2：采用重组核蛋白的捕获抗MPV IgM EIA
[0239] 可以采用先前Erdman等(1990)J.Clin.Microb.29：1466-1471描述的测定的改进测定，进行用重组核蛋白或任何其它重组蛋白作为抗原的捕获IgM EIA。
[0240] 向微量滴定板的各孔中，加入亲和纯化的抗人IgM捕获抗体(或针对其它物种的抗体)，例如得自Dako的所述抗体，浓度为每孔0.1M碳酸盐缓冲液pH9.6中的250ng。于室温过夜保温后，用PBS/0.05％Tween洗板2次。以三个重复孔加入100μl在ELISA缓冲液中以1∶200至1∶1000稀释的试验血清，于37℃保温1小时。然后用PBS/0.05％Tween洗板2次。
[0241] 所述冻融(经重组病毒感染的)Sf21细胞裂解液在ELISA缓冲液中以1∶100至1∶500稀释，加入至各孔中，于37℃保温2小时。未经感染的细胞裂解液用作阴性对照，以两个重复孔加入。然后用PBS/0.05％Tween洗板3次，与100μl在ELISA缓冲液中最适稀释度的抗MPV的多克隆抗体于37℃一起保温1小时。用PBS/0.05％Tween洗涤2次后，所述板与辣根过氧化物酶标记的第二抗体(例如兔抗白鼬)一起保温，将所述板于37℃保温20分钟。
[0242] 然后用PBS/0.05％Tween洗板5次，于室温与酶底物TMB-例如得自“Sigma”的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺一起保温15分钟，并且用100μl2M磷酸终止反应。用自动微量滴定板读出仪，测量450nm的比色读数。
[0243] 用得自患有临床MPV病毒感染的人的急性期和恢复期血清对，比较采用重组核蛋白(或其它重组蛋白)以及采用MPV全病毒的捕获IgM EIA的灵敏度。通过检验得自健康人和患有其它副粘病毒感染的人的血清样本，测定重组核蛋白捕获EIA的特异性。
[0244] 采用通过杆状病毒表达产生的重组MPV融合蛋白和糖蛋白的EIM的可能性。
[0245] 糖蛋白G和F是MPV病毒体的两种跨膜包膜糖蛋白，是主要的中和保护性抗原。这些糖蛋白在载体病毒系统例如杆状病毒系统中的表达，提供了一种供用于检测MPV特异性抗体的测定用的重组抗原源。此外，它们与例如核蛋白联用，进一步提高了酶免疫测定在检测抗MPV抗体中的灵敏度。
[0246] 可以使用各种各样的其它免疫学测定(Currenf Protocols inImmunology)，作为本文所述方法的替代方法。
[0247] 为了发现病毒分离株，可以检查优选但不限于得自人、食肉动物(狗、猫、海豹等)、马、反刍动物(牛、绵羊、山羊等)、猪、兔、鸟类(家禽、鸵鸟等)的鼻咽吸出物、喉和鼻拭抹物、支气管肺泡灌洗液和喉拭抹物。从鸟类，也可以检查泄殖腔和小肠拭抹物以及粪便。对于所有样品，可以进行血清学(抗体和抗原检测等)、病毒分离和核酸检测技术，来检测病毒。可以通过用纯化的MPV或其部分(蛋白质、肽)免疫小鼠(或其它动物)，然后随后用已建立的杂交瘤技术(Currentprotocols in Immunology)，产生单克隆抗体。或者，为此可以使用噬菌体展示技术(Current protocols in Immunology)。同样，可以从受感染的人或动物，或者从经免疫的人或动物，获得多克隆抗体(Currentprotocols in Immunology)。
[0248] 检测NS1和NS2蛋白是否存在，可以用采用各种各样抗体制剂的蛋白质印迹分析、IFA、免疫沉淀技术来进行。检测在病毒分离株中是否存在NS1和NS2基因或其同源物，可以用PCR，用根据已知的NS1和/或NS2基因设计的引物组以及各种各样的核酸杂交技术来进行。
[0249] 为了确定NS1和NS2基因是否存在于病毒基因组的3’端，可以用对所述基因组的这一3’端特异性的引物来进行PCR。在我们的情况下，我们使用对所述病毒基因组3’非翻译区特异性的一种引物和NORF中的一种引物。对于同一目的，可以设计其它引物。根据PCR产物的长度和/或核苷酸序列，揭示缺乏NS1/NS2基因。对NS1和/或NS2基因特异性的引物可以与对所述病毒基因组3’端的其它部分(例如所述非翻译区或N、M或F ORF)特异性的引物联用，以达到对存在NS1基因或NS2基因的阳性鉴定。除PCR之外，对于相同的目的，可以使用各种各样的技术，例如分子克隆、核酸杂交。
[0250] 实施例3：MPV的不同血清型/亚组
[0251] 通过分析9个病毒分离株的N、M、F和L ORF中的部分核苷酸序列，鉴定出两个可能的遗传分类群。在分类群内观察到90-100％的核苷酸同一性，在分类群间观察到81-88％的同一性。用更多病毒分离株获得的序列信息，证实存在两种基因型。作为A分类群原型的病毒分离株ned/00/01和作为B分类群原型的病毒分离株ned/99/01已经用于交叉中和测定中，以测试所述基因型是否与不同的血清型或亚组相关。
[0252] 结果
[0253] 运用RT-PCR测定，用位于聚合酶基因中的引物，我们从鼻咽吸出物样品中鉴定出另外30个病毒分离株。有关这些新分离株的基质基因和聚合酶基因的部分的序列信息、以及有关先前9个分离株的所述序列信息，用来构建系统发育进化树(图16)。这些进化树的分析证实存在两个遗传分类群，病毒分离株ned/00/00-1为A组的原型病毒，而病毒分离株ned/99/01为B组的原型病毒。组内的核苷酸序列同一性超过92％，而所述分类群之间的所述同一性为81-85％。
[0254] 已经用病毒分离株ned/00/01和ned/99/01来接种白鼬，以产生病毒特异性抗血清。这些抗血清与所述两种病毒一起用于病毒中和测定。
[0255] 表3：
[0256] 病毒中和滴度
[0257]
[0258] 对于分离株00-1，滴度相差32(64/2)倍
[0259] 对于分离株99-1，滴度相差16(64/4)倍
[0260] 另外，6只豚鼠已经接种了任一种所述病毒(ned/00/01和ned/99/01)。对鼻咽吸出物样品的RT-PCR测定表明，病毒从感染后第2天至第10天复制。感染后第70天，用或者同种病毒或者异种病毒攻击所述豚鼠，在所有4种情况下，都观察到了病毒的复制。
[0261] 表4
[0262]第一次感染 病毒复制 第二次感染 病毒复制
豚鼠1-3 00-1 2/3 99-1 1/2
豚鼠4-6 00-1 3/3 00-1 1/3
豚鼠7-9 99-1 3/3 00-1 2/2
豚鼠10-12 99-1 3/3 99-1 1/3

[0263] 注释：对于第二次感染，不再包括豚鼠2和9。
[0264] 在首次攻击后用抗血清进行的病毒中和测定显示出与用白鼬进行的VN测定基本相同的结果(VN滴度的差异＞16倍)。
[0265] 在该实施例中所述的结果证实存在两种基因型，它们对应于MPV的两个血清型，并且表明有被异种病毒和同种病毒重复感染的可能性。
[0266] 实施例4：进一步的序列测定
[0267] 该实施例描述了对MPV可读框(ORF)序列和基因间序列以及基因组末端的部分序列的进一步分析。
[0268] MPV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)和融合蛋白(F)基因的序列分析揭示，与主要在美国鸟类发现的禽肺病毒APV C血清型的序列同源性程度最高。这些分析也揭示，缺乏位于病毒基因组3’端的非结构蛋白NS1和NS2，并且融合蛋白紧邻基质蛋白定位。在此，我们提出22K(M2)蛋白、小疏水性(SH)蛋白、吸附(G)蛋白和聚合酶(L)蛋白基因、以及基因间区和尾随序列的序列。与先前描述的序列一起，此中提出的序列完成了MPV的基因组序列，但基因组末端的最后12-15个核苷酸除外，因而建立了MPV的基因组组构。MPV基因组的序列与APV A、B和C亚型、RSV A和B亚型、PVM和其它副粘病毒的序列的并排比较，提供了有关MPV应分类在Metapneumovirus中的强有力的证据。
[0269] 结果
[0270] 序列策略
[0271] MPV分离株00-1(van den Hoogen等，2001)在第三代猴肾(tMK)细胞中繁殖，用接种后3周从上清液中分离的RNA作为供RT-PCR分析用的模板。根据可得到的MPV 00-1的部分序列信息(van den Hoogen等，2001)以及APV和RSV的前导序列和尾随序列(Randhawa等，1997；Mink等，1991)设计引物。最初，通过RT-PCR扩增产生在先前所得产物之间的、大小范围为长500 bp至4 Kb的片段，并且直接测序。随后，通过产生一系列大小范围为500-800 bp、代表完整MPV基因组的重叠RT-PCR片段，证实所述基因组序列。对于所有PCR片段，对两条链直接测序，以将扩增和测序错误减至最低。用所述核苷酸序列和氨基酸序列，使用BLAST软件(www.ncbi.n1m.nih.gov/BLAST)，搜索与Genbank数据库中序列的同源性。基于与已知病毒基因的同源性以及它们在所述基因组中的位置，指定蛋白质名称。根据这一信息，构建了MPV的基因组图谱(图7)。MPV基因组长13378个核苷酸，其组构与APV的基因组组构相似。下面，我们提出了MPV的ORF和非编码序列与其它副粘病毒的ORF和非编码序列之间的比较，并且讨论了重要的相似性和差异。
[0272] 核蛋白(N)基因
[0273] 正如所示的，MPV基因组图谱中的第一个基因编码一种394个氨基酸(aa)的蛋白质，并且表现出与其它肺病毒的N蛋白有广泛的同源性。所述N ORF的长度与APV-C的N ORF的长度相同(表5)，而小于其它副粘病毒N ORF的长度(Barr等，1991)。氨基酸序列的分析揭示，与APV-C的同源性最高(88％)，而与其它副粘病毒仅有7-11％的同源性(表6)。
[0274] Barr等(1991)鉴定出在属于单分子负链RNA病毒目的病毒之间有相似性的3个区：A、B和C(图8)。虽然在病毒科内的相似性最高，但这些区在病毒科之间是高度保守的。在所有3个区中，MPV显示出与APV-C有97％氨基酸序列同一性，与APV-B有89％氨基酸序列同一性，与APV-A有92％氨基酸序列同一性，与RSV和PVM有66-73％氨基酸序列同一性。氨基酸残基160和340之间的区看来在metapneumovirus中高度保守，在肺病毒亚科中的保守性略低(Miyahara等，1992；Li等，1996；Barr等，1991)。这与MPV是一种metapneumovirus相一致，显示出与APV C有100％相似性。
[0275] 磷蛋白(P)基因
[0276] 所述基因组图谱中的第二个ORF编码一种294个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质与APV-C的P蛋白有68％的氨基酸序列同源性，与RSV的P蛋白仅有22-26％的氨基酸序列同源性(表6)。MPV的P基因含有一个实质上的ORF，在这方面与得自许多其它副粘病毒的P相似(有关综述参见Lamb和Kolakofsky，1996；Sedlmeier等，1998)。
[0277] 与APV A和B以及PVM相反，而与RSV和APV-C相似，MPVP ORF缺乏半胱氨酸残基。Ling(1995)提出，在所有肺病毒之间相似性高的一个区(aa 185-241)在RNA合成过程或者在维持核衣壳复合体的结构完整性方面起作用。这一高相似性的区也存在于MPV中(图9)，尤其是当考虑到保守取代时，显示出与APV-C有100％的相似性，与APV-A和B有93％的相似性，与RSV有约81％的相似性。正如关于APV所描述的(Ling等，1995)，MPV P蛋白的C末端富含谷氨酸残基。
[0278] 基质(M)蛋白基因
[0279] NIPV基因组的第三个ORF编码一种254个氨基酸的蛋白质，类似其它肺病毒的M ORF。MPV M ORF与其它met印neumovirus的MORF的大小完全相同(表5)，并且表现出与APV的基质蛋白的氨基酸序列同源性高(78-87％)，与RSV和PVM基质蛋白的同源性较低(37-38％)，而与其它副粘病毒基质蛋白的同源性为10％或更低(表6)。
[0280] Easton(1997)对所有肺病毒的基质蛋白的序列作出了比较，发现位于残基14-19的一个保守七肽，所述七肽在MPV中也是保守的(图10)。对于RSV、PVM和APV而言，已经鉴定出M主要ORF内或者与M主要ORF重叠的小的第二个ORF(bRSV中的52个aa和51个aa，RSV中的75个aa，PVM中的46个aa和APV中的51 aa)(Yu等，1992；Easton等，1997；Samal等，1991；Satake等，1984)。我们注意到MPV MORF中有两个小ORF。在M主要ORF内发现一个始于核苷酸2281的54个aa残基的小ORF(片段1，图7)，发现一个始于核苷酸
2893的与M主要ORF重叠的33个aa残基的小ORF(片段2，图7)。与RSV和APV的第二ORF相似，在这些第二ORF和其它肺病毒的第二ORF之间没有显著的同源性，并且缺乏表观的起始信号或终止信号。另外，有关对应于APV和RSV的这些第二ORF的蛋白质的合成的证据尚未有报道。
[0281] 融仑蛋白(F)基因
[0282] MPV的F ORF邻近M ORF定位，这是Metapneumovirus成员的特征。MPV的F基因编码一种539个aa的蛋白质，该蛋白比APV-C的F长2个aa残基(表5)。氨基酸序列分析表明，与APV-C的同源性为81％，与APV-A和B的同源性为67％，与肺病毒F蛋白的同源性为33-39％，而与其它副粘病毒的同源性仅有10-18％(表6)。在副粘病毒F蛋白中并且也在MPV中观察到的保守特征之一是半胱氨酸残基的分布(Morrison，1988；Yu等，1991)。metapneumovirus在F1中共享12个半胱氨酸残基(7个在所有副粘病毒中是保守的)，在F2中共享2个半胱氨酸残基(1个在所有副粘病毒中是保守的)。在MPV F ORF中存在的3个潜在的N-联糖基化位点中，没有一个是与RSV共享的，与APV共享2个所述位点(位置
74和389)。MPV的第三个特有的潜在N-联糖基化位点位于位置206(图11)。
[0283] 虽然与其它副粘病毒的序列同源性低，但MPV的F蛋白表现出与关于其它副粘病毒科成员的F蛋白所描述的相一致的典型融合蛋白的特征(Morrison，1988)。副粘病毒科成员的F蛋白作为无活性前体(F0)合成，被宿主细胞的蛋白酶切割，产生氨基末端F2亚基和大的羧基末端F1亚基。已提出的切割位点(Collins等，1996)在副粘病毒科的所有成员中都是保守的。MPV的所述切割位点含有残基RQSR。两个精氨酸(R)残基与APV和RSV共享，但谷氨酰胺(Q)和丝氨酸(S)残基与其它副粘病毒如人副流感病毒1型、仙台病毒和麻疹病毒共享(数据未显示)。
[0284] F1氨基末端的疏水性区据认为作为膜融合结构域起作用，并且在副粘病毒和麻疹病毒中显示出高序列相似性，而在肺病毒中显示出的序列相似性程度较低(Morrison，1988)。这26个残基(位置137-163，图11)在MPV和APV-C之间是保守的，这与该区在metapneumovirus中高度保守相一致(Naylor等，1998；Seal等，2000)。
[0285] 正如对于APV和其它副粘病毒的F2亚基所观察到的，与RSV相比，MPV显示出缺失22个aa残基(位置107-128，图11)。此外，对于RSV和APV，发现信号肽和锚定结构域在亚型内保守，而在亚型间显示出高变异性(Plows等，1995；Naylor等，1998)。MPV的位于F2氨基末端的信号肽(aa 10-35，图11)显示出与APV-C有一定的序列相似性(26个aa残基中的18个是相似的)，与其它APV或RSV有较低的保守性。在F1羧基末端的膜锚定结构域中观察到大得多的变异性，虽然仍观察到与APV-C有一定的同源性。
[0286] 22K(M2)蛋白
[0287] M2基因是肺病毒亚科特有的，在所有肺病毒中观察到两个重叠的ORF。第一个主要ORF代表M2-1蛋白，该蛋白增强病毒聚合酶的持续合成能力(Collins等，1995；Collins，1996)和其基因间区的通读性(Hardy等，1998；Feams等，1999)。MPV的M2-1基因邻近F基因定位，编码一种187个aa的蛋白质(表5)，并且显示出与APV-C的M2-1的同源性最高(84％)(表6)。所有肺病毒M2-1蛋白的比较表明，在所述蛋白氨基端一半中的保守性最高(Collins等，1990；Zamora等，1992；Ahmadian等，1999)，这与MPV显示出在该蛋白的前80个aa残基中与APV-C的相似性为100％的保守性的观察相一致(图12A)。
MPVM2-1蛋白含有3个位于前30个aa残基内、在所有肺病毒中保守的半胱氨酸残基。这种半胱氨酸的集中在锌结合蛋白中是常见的(Ahmadian等，1991；Cuesta等，2000)。
[0288] 与肺病毒M2-1 ORF重叠的第二ORF(M2-2)的位置是保守的，但在序列上不保守，所述ORF被认为参与病毒RNA复制和转录间转换的控制(Collins等，1985；Elango等，1985；Baybutt 等，1987；Collins 等，1990；Ling 等，1992；Zamora 等，1992；Alansari 等，
1994；Ahmadian等，1999；Bermingham等，1999)。对于MPV而言，M2-2 ORF始于M2-1 ORF中的核苷酸512(图7)，这正是APV-C中的相同起始位置。APV-C和MPV的M2-20RF的长度相同，有71个aa残基(表5)。MPV和APV-C之间M2-20RF的序列比较(图12B)表明有
64％的氨基酸序列同源性，而在MPV与APV-A和B之间仅有44-48％的氨基酸序列同源性(表6)。
[0289] 小蔬水性蛋白(SH)ORF
[0290] 所述基因邻近MPV的M2定位，可能编码一种183个aa的SH蛋白(图1和7)。在该ORF和其它RNA病毒基因或基因产物之间没有可辨别的序列同一性。由于在肺病毒SH蛋白之间的序列相似性一般都低，所以这一点并不出乎意料。hMPV的推定SH ORF是迄今已知的最长的SH 0RF(表1)。所述SH ORF的aa组成与APV、RSV和PVM的相当相似，具有高百分比的苏氨酸和丝氨酸残基(hMPV、APV、RSVA、RSV B、bRSV和PVM的丝氨酸/苏氨酸含量分别为22％、18％、19％、20.0％、21％和28％)。hMPV的SH ORF含有10个半胱氨酸残基，而APV SH含有16个半胱氨酸残基。hMPV的SH ORF含有2个潜在的N-联糖基化位点(aa 76和121)，而APV有1个所述位点，RSV有2个或3个，而PVM有4个。
[0291] 推定的hMPV SH蛋白以及APV和RSV的SH的亲水性分布型揭示出相似的特征(图7B)。APV和hMPV的SH 0RF有一个亲水性N末端、一个可以充当潜在的跨膜结构域的中心疏水性结构城(对于hMPV为aa 30-53)、一个第二疏水性结构域(aa 155-170)和一个亲水性C末端。相反，RSV的SH看来缺乏APV和hMPV ORF的C末端部分。在所有肺病毒的SH蛋白中，所述疏水性结构域都邻接多个碱性氨基酸残基，该碱性氨基酸残基在hMPV的SH ORF中也存在(aa 29和54)。
[0292] 吸附糖蛋白(G)ORF
[0293] hMPV的推定的G ORF邻近推定的SH基因定位，编码一种236个aa的蛋白质(nt 6262-6972，图1)。紧接该ORF之后，发现第二个小ORF，可能编码68个aa残基(nt6973-7179)，但缺乏起始密码子。在在所述第二读框中的一个194个aa残基的第三个可能的ORF与这两个ORF重叠，但也缺乏起始密码子(nt 6416-7000)。这一ORF在同一读框内后接一个65个aa残基的第四个可能的0RF(nt 7001-7198)，但又是缺乏起始密码子。
最后，在所述第三个读框中发现一个可能的97个aa残基的ORF(但缺乏起始密码子)(nt
6444-6737，图1)。与第一个ORF不同，所述其它ORF没有表观的基因起始序列或基因终止序列(参见下文)。虽然236个aa的G ORF可能代表hMPV吸附蛋白的至少一部分，但不能排除的是：所述额外的编码序列通过某些RNA编辑事件而作为单独的蛋白或作为所述吸附蛋白的部分表达。应该注意到，对于APV和RSV而言，在所述主要G ORF之后没有鉴定出第二个ORF，但APV和RSV在G的主要ORF内都有第二个ORF。然而，缺乏有关这些ORF表达的证据，并且在不同病毒的预测氨基酸序列之间没有序列同一性(Ling等，1992)。hMPV G中的第二个ORF没有显示出其它G蛋白的特征，所述额外0RF是否表达有待进一步研究。
[0294] 对于所有ORF的BLAST分析表明，在核苷酸序列或氨基酸序列水平上与其它已知病毒基因或基因产物没有可辨别的序列同一性。这与发现其它G蛋白例如hRSV A和B的G蛋白(53％)(Johnson等，1987)以及与APV A和B的G蛋白(38％)(Juhasz和Easton，1994)的序列同一性百分比低相一致。
[0295] 而大多数所述hMPV ORF在长度和序列上与APV的所述0RF相似，hMPV的236个aa残基的推定G ORF比APV的G ORF小得多(表1)。氨基酸序列表明，丝氨酸和苏氨酸的含量为34呢这甚至高于RSV的32％和APV的24％所述推定的G ORF也含有8.5％的脯氨酸残基，这高于RSV的8％和APV的7％。APV、RSV和hMPV的G蛋白中脯氨酸残基的不寻常的丰度在粘蛋白起源的糖蛋白中也观察到，在粘蛋白起源的糖蛋白中这是蛋白质三维结构的一个主要考虑因素(Collins和Wertz，1983；Wertz等，1985；Jentoft，1990)。hMPV的G ORF含有5个潜在N-联糖基化位点，而hRSV有7个，bRSV有5个，APV有3-5个。
[0296] hMPV G的预测亲水性分布型揭示了与其它肺病毒相似的特征。
[0297] 氨基末端含有一个亲水性区，后接一个短的疏水性区(对于hMPV为aa33-53)和一个主要为亲水性的羧基末端(图8B)。这种总体组构与锚定II型跨膜蛋白的相一致，与APV和RSV的G蛋白中的这些区很好地对应。hMPV的推定G ORF仅含有1个半胱氨酸残基，这与RSV和APV形成对比(分别有5个和20个)。当然，所述G基因内4个第二ORF中的仅2个ORF含有一个额外的半胱氨酸残基，这4个可能的ORF显示出12-20％的丝氨酸和苏氨酸残基以及6-11％的脯氨酸残基。
[0298] 聚合酶基因(L)
[0299] 与其它负链病毒类似，MPV基因组的最后一个ORF是复制转录复合物的依赖RNA的RNA聚合酶组分。MPV的L基因编码一种2005个aa的蛋白质，所述蛋白质比APV-A的所述蛋白长1个残基(表5)。MPV的L蛋白与APV-A有64％的同源性，与RSV有42-44％的同源性，而与其它副粘病毒有约13％的同源性(表6)。Poch等(1989；1990)鉴定出非分段负链RNA病毒的L蛋白内的6个保守结构域，其中结构域III含有被认为对于聚合酶功能所必需的4个核心聚合酶基序。这些基序(A、B、C和D)在MPVL蛋白中的保守性很好：在基序A、B和C中：MPV与所有肺病毒有100％的相似性，在基序D中，MPV与APV有100％相似性，与RSV有92％的相似性。对于完整的结构域III(LORF中的aa 627-903)，MPV与APV有77％的同一性，与RSV有61-62％的同一性，与其它副粘病毒有23-27％的同一性(图15)。除所述聚合酶基序之外，肺病毒的L蛋白含有一个符合共有ATP结合基序K(X)21GEGAGN(X)20K的序列(Stec，1991)。MPVL ORF含有一个与APV类似的基序，其中中间残基的距离少一个残基：
[0300] K(x)22GEGAGN(X)19K。
[0301] 系统发育分析
[0302] 作为MPV和肺病毒亚科成员之间关系的一个指标，先前已经构建了基于N、P、M和F ORF的系统发育进化树(van den Hoogen等，2001)，并且揭示出MPV和APV-C之间关系密切。因为MPV SH和G基因与其它副粘病毒的所述基因的同源性低，所以不能对于这些基因构建可靠的系统发育进化树。另外，肺病毒属和Metapneumovirus的成员之间不同的基因组组构，使得不可能基于所述完整的基因组序列生成系统发育进化树。因此，我们除了对那些先前已发表的基因之外，仅对M2基因和L基因构建了系统发育进化树。这两个进化树证实，在肺病毒亚科内APV和MPV密切相关(图16)。
[0303] MPV非编码序列
[0304] 副粘病毒基因组的基因接点在每个基因的起点和结尾(基因起始信号和基因终止信号)处含有短的高度保守的、可能在转录起始和终止中起作用的核苷酸序列(Curran等，1999)。MPV的所有基因之间的基因间序列的比较揭示出一个N、P、M、F、M2和G的基因起始信号的共有序列：GGGACAAGU(图17A)，该序列与metapneumovirus的共有基因起始信号(Ling等，1992；Yu等，1992；Li等，1996；Bayon-Auboyer等，2000)相同。发现MPV的SH基因和L基因的基因起始信号与这一共有序列略有不同(SH：GGGAUAAAU，L：GAGACAAAU)。对于APV，也发现L的基因起始信号与所述共有序列不同：AGGACCAAT(APV-A)(Randhawa等，
1996)和GGGACCAGT(APV-D)(Bayon-Auboyer等，2000)。
[0305] 与MPV和APV的基因起始序列相似相比，APV的共有基因终止序列UAGUUAAUU(Randhawa等，1996)在MPV基因间序列中不能找到。 除G-L基因间区之外，在大多数基因中发现的重复序列是UAAAAA U/A/C，该重复序列可能起基因终止信号的作用。
然而，由于我们是对病毒RNA测序，而不是对mRNA测序，所以不能指定确定的基因终止信号，因此需要进一步研究。肺病毒的基因间区在大小和序列上有所不同(Curan等，1999；
Blumberg等，1991；Collins等，1983)。MPV的基因间区没有显示出与APV和RSV的基因间区有同源性，并且其大小范围为10-228个核苷酸(图17B)。MPV的M ORF和F ORF之间的基因间区含有始于主要M ORF的第二ORF的一部分(参见上文)。SH和G之间的基因间区含有192个核苷酸，基于所有三个读框中存在许多终止密码子，看来没有编码潜力。G和L之间的基因间区含有241个核苷酸，可能包括额外的ORF(参见上文)。有趣的是，L ORF的起始位于这些第二ORF中。而APV的L基因不在前面的G ORF中起始，RSV的L ORF也在前面的M2基因内起始。在副粘病毒基因组的3’末端和5’末端，短的基因外区被称为前导序列和尾随序列，前导序列的前12个核苷酸和尾随序列的最后12个核苷酸大致互补，可能是因为它们分别含有病毒启动子的基本元件(Curran等，1999；Blumberg等，1991；Mink等，1986)。MPV和APV的3’前导序列的长度都是41个核苷酸，在这两种病毒的核苷酸16和41之间的区中观察到一定的同源性(26个核苷酸中的18个)(图17B)。如上所述，MPV基因组图谱的前15个核苷酸基于以APV基因组为基础的引物序列。MPV 5’尾随序列的长度(188个核苷酸)类似RSV 5’尾随序列的大小(155个核苷酸)，这比APV的5’尾随序列(40个核苷酸)长得多。MPV尾随序列和APV尾随序列的末端40个核苷酸的序列比对揭示，除代表基于APV的基因组序列的引物序列的最末端12个核苷酸之外，32个核苷酸中有21个有同源性。我们的序列分析揭示，在所述基因组3’端缺乏NS1和NS2基因，并且基因组组构类似metapneumovirus的组构(3′N-P-M-F-M2-SH-G-L-5′)。所发现的MPV和APV基因之间的序列同源性高，进一步强调了这两种病毒之间的密切关系。对于MPV的N、P、M、F、M2-1和M2-2基因而言，发现与APV-C的总体氨基酸同源性为79％。事实上，对于这些基因而言，APV-C和MPV显示出的序列同源性在其它属的亚组之间例如RSV-A和B或者APV-A和B之间所发现的序列同源性相同的范围内。APV-C和MPV的这种密切关系在系统发育分析中也观察到，系统发育分析揭示，MPV和APV-C总是在同一树枝(branch)中，与包含APV-A和B的树枝分开。相同的基因组组构、序列同源性和系统发育分析都支持将MPV分类为Metapneumovirus内可从哺乳动物中分离的第一个成员。应该注意到，在MPV的不同病毒分离株之间所发现的在N、M、F和L基因方面的序列变异表明，可能存在不同的基因型(van den Hoogen等，2001)。MPV和APV-C之间的密切关系并未在寄主范围方面反映出，因为与MPV形成对比，APV感染鸟类(van den Hoogen等，2001)。这种寄主范围的差异可能是由于两种病毒的SH蛋白和G蛋白之间高度趋异的差异所决定。MPV的SH蛋白和G蛋白没有显示出与任何其它病毒的SH蛋白和G蛋白有显著的氨基酸序列同源性。虽然氨基酸含量和疏水性曲线图支持将这些ORF确定为SH和G，但需要实验数据来评价其功能。这类分析也将为这些SH基因和G基因中所述额外的重叠ORF的作用提供线索。另外，对APV-C的SH和G基因的序列分析可能使得可以更深入了解MPV的SH蛋白和G蛋白的功能以及它们与APV-C的所述蛋白之间的关系。发现MPV的非编码区与APV的非编码区相当相似。APV和MPV的
3’前导序列和5’尾随序列显示出高度同源性。虽然APV和MPV的基因间区的长度不总是相同，但发现所述ORF中大多数的共有基因起始信号是相同的。相比之下，APV的基因终止信号在MPV基因组中并未发现。虽然我们在大多数基因间区中的确发现一个重复序列(U AAAAA U/A/C)，但需要对病毒mRNA进行序列分析，以便正式描绘那些基因终止序列。应该注意到，通过采用改良的cDNA末端快速扩增(RACE)方法，获得了有关3’最末端的15个核苷酸和5’最末端的12个核苷酸的序列信息。这一技术已被其它人证明对于相关病毒是成功的(Randhawa，J.S.等，Rescue of syntheticminireplicons establishes the absence of the NS1 and NS2 genes from avianpneumovirus.J.Virol，71，9849-9854(1997)；Mink，M.A.，等，Nucleotidesequences of the 3′leader aIld 5′trailer regiohs of human respiratorysyncytial virus genomic RNA.Virology 185，615-24(1991))。为了测定
3’vRNA前导序列的序列，使用poly-A聚合酶将同源聚合物A尾加入到经纯化的vRNA上，随后用poly-T引物和N基因中的引物，通过PCR扩增所述前导序列。为了测定5’vRNA尾随序列的序列，使用逆转录酶和L基因中的引物，制备尾随序列的cDNA拷贝，然后用末端转移酶，给所述cDNA加上同源聚合物dG尾。随后，用poly-C引物和L基因中的引物扩增所述尾随序列区。作为一种替代策略，将vRNA自身相连接，或者与合成接头连接，此后用L基因和N基因中的引物和接头特异性引物，扩增所述前导序列区和尾随序列区。对于5’尾随序列，对纯化vRNA进行直接双脱氧核苷酸测序也是可行的(Randhawa，1997)。运用这些方法，我们可以分析hMPV基因组末端的实际序列。在此提供的序列信息对于产生针对MPV和MPV感染的诊断检验、疫苗和抗病毒药具有重要性。
[0306] 材料和方法
[0307] 序列分析
[0308] 依照先前已描述的方法(van den Hoogen等，2001)，将病毒分离株00-1在第三代猴肾细胞上繁殖到高滴度(约10，000 TCID50/ml)。用HighPure RNA Isolating Kit(高纯度RNA分离试剂盒)，依照生产商的说明(Roch Diagnostics，Almere，The Netherlands)，从受感染细胞的上清液分离病毒RNA。除已发表的有关APV辰SV的前导序列和尾随序列的序列(Randhawa等，1997；Mink等，1991)之外，基于先前已发表的序列(vanden Hoogen等，2001)设计引物，所述引物可通过请求而得到。采用一种单管测定，在含有50 mM Tris pH
8.5、50 mM NaCl、4.5 mM MgCl2、2 mM DTT、1μM正向引物、1μM反向引物、0.6 mM dNTP、20单位RNAsin(Promega，Leiden，The Netherlands)、10 U AMV逆转录酶(Promega，Leiden，The Netherlands)和5单位Taq聚合酶(PE AppliedBiosystems，Nieuwerkerk aan de IJssel，The Netherlands)的50μl总体积中，用病毒RNA进行RT-PCR测定。逆转录于
42℃进行30分钟，然后于95℃灭活8分钟。如下扩增所述cDNA：95℃1分钟、42℃2分钟、72℃3分钟进行40个循环，最后于72℃进行10分钟的延伸。在1％琼脂糖凝胶上检查之后，用Qiaquick Gel Extraction Kit(凝胶提取试剂盒)(Qiagen，Leusden，The Netherlands)，从凝胶中纯化RT-PCR产物，然后用Dyenamic ET terminator sequencing kit(Dyenamic ET终止测序试剂盒)(Amersham Pharmacia Biotech，Roosendaal，The Netherlands)和ABI 373自动DNA测序仪(PE Applied Biosystem，Nieuwerkerk aan de Ussel，theNetherlands、)，依照生产商的说明直接测序。
[0309] 用在BioEdit vetsion 5.0.6
[0310] (http：//jwbrown.mbio.ncsu.edu/Bioedit//bioedit.htm1；Hall，1999)的软件包中可得到clusta1软件包，进行序列比对。
[0311] 系统发育分析
[0312] 为了构建系统发育进化树，用ClustalW软件包进行DNA序列的比对，并且用使用100个引导程序和3个jumble的Phylip 3.5程序的DNA-ML软件包，生成最大似然进化树。
计算用consense软件包(Felsenstein，1989)创建的共有序列进化树的引导程序值。
[0313] MPV基因组序列可从Genbank获得，登记号为：AF371337。此中所用的所有其它序列可从Genbank获得，登记号为：AB046218瞵疹病毒，所有ORF)、NC-001796(人副流感病毒3型，所有ORF)、NC-001552(仙台病毒，所有ORF)、X57559(人副流感病毒2型，所有ORF)、NC-002617(新城疫病毒，所有ORF)、NC-002728(Nipah病毒，所有ORF)、NC-001989(bRSV，所有ORF)、M11486(hRSV A,除L外的所有ORF)、NC-001803(hRSV，L ORF)、NC-001781(hRSV B，所有ORF)、D10331(PVIM，N ORF)、U09649(PVM，P ORF)、U66893(PVM，M ORF)、U66893(PVM，SH ORF)、D11130(PVM，G ORF)、D11128(F’ORF)。PViM M2 ORF 取 自 Ahmadian(1999)、AF176590(APV-C，NORF)、U39295(APV-A，N ORF)、U39296(APV-B，N ORF)、AF262571(APV-C，M ORF)、U37586(APV-B，M ORF)、X58639(APV-A,MORF、)、AF176591(APV-C，P ORF)、AF325443(APV-B，P ORF)、U22110(APV-A，P ORF)、AF187152(APV-C，F ORF)、Y14292(APV-B，FORF、)、D00850(APV-A，F ORF)、AF176592(APV-C，M2 ORF)、AF35650(APV-B，M2 ORF)、X63408(APV-A，M2 ORF)、U65312(APV-A，LORF)、S40185(APV-A，SH ORF)。
[0314] 表5：MPV和其它副粘病毒的所述ORF的长度。
[0315]
[0316] 脚注：
[0317] 1.氨基酸残基的长度。
[0318] 2.不能得到序列
[0319] 3.其它：人副流感病毒2和3型、仙台病毒、麻疹病毒、nipah病毒、phocine瘟热病毒(phocine distemper virus)和新城疫病毒。
[0320] 4.ORF在病毒基因组中不存在
[0321] 表6：MPV的ORF和其它副粘病毒的ORF之间的氨基酸序列同一性1
[0322]
[0323] 1.用已知的G和SH蛋白没有发现序列同源性，因此被排除。
[0324] 2.不能得到序列。
[0325] 3.参见表5中一览表的脚注3。
[0326] 4.ORF在病毒基因组中不存在。
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[0415] 供RT-PCR检测已知副粘病毒用的引物。用于hPIV-1至4、腮腺炎病毒、麻疹病毒、Tupaja病毒、Mapuera病毒和Hendra病毒的引物已在内部开发了，并且基于可得到序列的比对。用于新城疫病毒的引物取自Sea1，J.，J.等；Clin.Microb.，2624-2630，1995。用于Nipah病毒和一般副粘病毒PCR的引物取自：Chua，K.B.等；Science，288 26 may2000[0416] 病毒 引物 位于蛋白质[0417] HPIV-1 fwd 5’-TGTTGTCGAGACTATCCAA-3’ HN
[0418] Rev 5’-TGTTG(T/A)ACCAGTTGCAGTCT-3’
[0419] HPIV-2 Fwd 5’-TGCTGCTTCTATTGAGAAACGCC-3’ N
[0420] Rev 5’-GGTGAC/T TC(T/C)AATAGGGCCA-3'
[0421] HPIV-3 Fwd 5’-CTCGAGGTTGTCAGGATATAG-3’ HN
[0422] Rev 5’-CTTTGGGAGTTGAACACAGTT-3'
[0423] HPIV-4 Fwd 5’-TTC(A/G)GTTTTAGCTGCTTACG-3’N
[0424] Rev 5’-AGGCAAATCTCTGGATAATGC-3'
[0425] 腮腺炎 Fwd 5’-TCGTAACGTCTCGTGACC-3’ SH
[0426] Rev 5’-GGAGATCTTTCTAGAGTGAG-3’
[0427] NDV Fwd 5’-CCTTGGTGAiTCTATCCGIAG.3， F
[0428] Rev 5’-CTGCCACTGCTAGTTGiGATAATCC.3’
[0429] Tupaia Fwd 5’-GGGCTTCTAAGCGACCCAGATCTTG-3’ N
[0430] Rev 5’-GAATTTCCTTATGGACAAGCTCTGTGC-3’
[0431] Mapuera Fwd 5’-GGAGCAGGAACTCCAAGACCTGGAG-3’ N
[0432] Rev： 5’-GCTCAACCTCATCACATACTAACCC-3’
[0433] Hendra Fwa 5’-GAGATGGGCGGGCAAGTGCGGCAACAG-3’ N
[0434] Rev 5’-GCCTTTGCAATCAGGATCCAAATTTGGG-3’
[0435] Niyah Fwd 5’-CTGCTGCAGTTCAGGAAACATCAG-3’ N
[0436] Rev 5’-ACCGGATGTGCTUACAGAACTG-3’
[0437] HRSV Fwd 5’-TTTGTTATAGGCATATCATTG-3’ F
[0438] Rev 5’-TTAACCAGCAAAGTGTTA-3’
[0439] 扇疹 Fwd 5’-TTAGGGCAAGAGATGGTAAGG-3’ N
[0440] Rev 5’-TTATAACAATGATGGAGGG-3’
[0441] 一般副粘病毒科：
[0442] 正向 5’-CATTAAAAAGGGCACAGACGC-3’ P
[0443] 反向 5’-TGGACATTCTCCGCAGT-3’
[0444] 用于RAP-PCR的引物
[0445] ZF1：5'-CCCACCACCAGAGAGAAA-3’
[0446] ZF4：5'-ACCACCAGAGAGAAACCC-3’
[0447] ZF7：5'-ACCAGAGAGAAACCCACC-3’
[0448] ZF10：5’-AGAGAGAAACCCACCACC-3’
[0449] ZF13：5'-GAGAAACCCACCACCAGA-3’
[0450] ZF16：5'-AAACCCACCACCAGAGAG-3’
[0451] CS1：5'-GGAGGCAAGCGAAGGCAA-3’
[0452] CS4：5'-GGCAAGCGAACGCAAGGA-3’
[0453] CS7：5'-AAGCGAACGCAAGGAGGC-3’
[0454] CS10：5'-CGAACGCAAGGAGGCAAG-3’
[0455] CS18：5'-ACGCAAGGAGGCAAGCGA-3’
[0456] CS16：5’-CAAGGAGGCAAGCGAACG-3’
[0457] 对20种片段进行成功地纯化和测序：
[0458] 在APV中发现的有序列同源性的10种片段
[0459] 片段1 ZF 7，335 bp N基因
[0460] 片段2 ZF 10，235 bp N基因
[0461] 片段3 ZF 10，800 bp M基因
[0462] 片段4 CS 1，1250 bp F基因
[0463] 片段5 CS 10，400 bp F基因
[0464] 片段6 CS 13，1450 bp F基因
[0465] 片段7 CS 13，750 bp F基因
[0466] 片段8 ZF 4，780 bp L基因(蛋白质水平)
[0467] 片段9 ZF 10，330 bp L基因(蛋白质水平)
[0468] 片段10 ZF 10，250 bp L基因(蛋白质水平)
[0469] 用于从原型分离株RAP-PCR扩增核酸的引物。
[0470] 实施例5
[0471] 对所述两种亚型的hMPV的进一步探察
[0472] 根据对迄今获得的hMPV的不同分离株的系统发育分析，鉴定了两种基因型，病毒分离株00一1是基因型A的原型，而分离株99-1是基因型B的原型。
[0473] 我们假定，所述基因型与亚型相关，并且在有先有免疫的情况下发生被得自两个亚组的病毒再感染，并且对于允许再感染而言可能并不严格需要抗原性变异。
[0474] 此外，看来hMPV与一种主要见于家禽的禽肺病毒密切相关。这两种病毒的核苷酸序列显示有高百分率的同源性，但SH蛋白和G蛋白除外。在此我们表明，所述病毒在主要基于核蛋白和基质蛋白的试验中交叉反应，但它们在基于吸附蛋白的试验中反应不同。病毒中和滴度的差异进一步提供了hMPV的两种基因型是一种病毒的两种不同的血清型、而APV是一种不同的病毒的证据。
[0475] 所述两种血清型之间的交叉反应和APV与hMPV之间的交叉反应方法
[0476] 用于IgG、IgA和IgM抗体检测hMPV的方案：
[0477] 基本上依照先前已描述的方法佩othbarth，P.H.等，1999；Influenzavirus serology-a comparative study.J.of Vir.Memods 78(1999)163-169)，在微量滴定板中进行对hMPV的间接IgG EIA。
[0478] 简而言之，通过用1％Triton X-100处理使浓缩hMPV溶解，在通过棋盘滴定(checkerboard titration)测定最适工作稀释度之后，将其在PBS中于室温包被到微量滴定板中达16小时。随后，向各孔中加入100μl体积的在EIA缓冲液中以1：100稀释的人血清样品，于37℃孵育1小时。通过加入山羊抗人IgG过氧化物酶缀合物(Biosource，USA)，检测人IgG的结合。加入TMB作为底物，使板显色，测量450nm的OD。结果以OD的S(即信号)/N(即阴性)之比来表示。如果S/N比超出阴性对照加上三倍标准之外，则认为血清为IgG阳性。
[0479] 通过基本上如先前已描述的捕获EIA(Rothbarth，P.H等，1999；Influenza virus sero1gy-a comparative study.J.Vir.methods 78(1999)163-169)，检测血清中IgM和IgA类别的hMPV抗体。为了检测IgA和IgM，使用以抗人IgM或IgA特异性单克隆抗体包被的市售微量滴定板。在于37℃孵育1时之后，将血清以1：100稀释，在各孔中加入hMPV的最适工作稀释液(100μl)。于37℃孵育1小时。洗涤后，加入用过氧化物酶标记的多克隆抗hMPV，将板于37℃孵育1小时。加入TMB作为底物使板显色，测量450nm的OD，结果以0D的S(即信号)/N(即阴性)之比来表示。如果S/N比超出阴性对照加上三倍标准之外，则认为血清为IgG阳性。
[0480] 用APV抑制测定来检测APV抗体。用于APV抑制试验的方案包括APV-AbSVANOVIR 酶免疫测定，它由SVANOVA Biotech AB(Uppsal Science Park Glunten SE-751
83 UppsaLla Swedeh)生产。结果以OD的S(即信号)/N(即阴性)之比来表示。如果S/N比超出阴性对照加上三倍标准之外，则认为血清为IgG阳性。
[0481] 1.豚鼠
[0482] A.用两种hMPV亚型(再)感染豚鼠
[0483] 已经用病毒分离株ned/00/01(亚型A)和ned/99/01(亚型B)接种了每种亚型6只豚鼠(guinea pig)(气管内、鼻和眼)。
[0484] 6 GP用hMPV 00-1(10e6，5 TCD50)感染
[0485] 6 GP用hMPV 99-1(10e4，1 TCD50)感染
[0486] 初次感染后54天，给所述豚鼠接种同种亚型和异种亚型(10e4TCID50/m1)：
[0487] 2只豚鼠：第一次感染00-1；第二次感染99-1(异种)
[0488] 3只豚鼠：第一次感染00-1；第二次感染00-1(同种)
[0489] 2只豚鼠：第一次感染99-1；第二次感染00-1(异种)
[0490] 3只豚鼠：第一次感染99-1；第二次感染99-1(同种)，
[0491] 在感染后采集了12天(第一次感染)或8天(第二次感染)的喉和鼻拭抹物，并且通过RT-PCR测定，检验了所述病毒的存在情况。
[0492] RT-PCR测定的结果：图29
[0493] 结果总结：用病毒分离株ned/oo/01接种的豚鼠，在感染后第1-10天表现出上呼吸道感染。用病毒分离株ned/99/01接种的豚鼠，在感染后第1-5天表现出上呼吸道感染。 看来被ned/99/01感染的严重程度低于被ne副00/01感染。用异种病毒第二次接种所述豚鼠，在4只豚鼠的3只中引起再感染，而用同种病毒第二次接种，在6只豚鼠的2只中引起再感染。注意到在再感染的那些动物中没有临床症状或临床症状很少，在受保护抵抗所述再感染的那些动物中没有观察到临床症状，证明甚至用野生型病毒，第一次感染的保护效应也是明显的，表明有可能用异种(当然还有同种)分离株作为疫苗，甚至有可能有未减毒形式的分离株。
[0494] hMPV的两种亚型都能够感染豚鼠，虽然似乎被B亚型(ned/99/01)感染的严重程度低于(病毒在鼻和喉中的存在时间短)被A亚型(ned/oo/01)感染。这可能是由于A亚型给予的剂量较高，或者B亚型的毒力较低。
[0495] 虽然先有免疫的存在并不完全保护而抵抗同种病毒以及异种病毒的再感染，所述感染看来不太显著，因为注意到病毒存在的时间较短，并且并非所有动物都变为病毒阳性。
[0496] B.被两种hMPV亚型感染的豚鼠的血清学
[0497] 第0、52、70、80、90、110、126和160天，从豚鼠采集血清，以1：100的稀释液，用针对ned/00/01和ned/99/01抗原的全病毒ELISA来测试。
[0498] 图30A和B：每只豚鼠针对ned/00/01和ned/99/01的IgG应答
[0499] 图31：ned/00/01和ned/99/01 ELISA的特异性。仅使用了得自同种再感染豚鼠的数据。
[0500] 图32：3只同种(00-1/00-1)、2只同种(99-1/99-1)、2只异种(99-1/00-1)和2只异种(00-1/99-1)感染豚鼠的针对ned/00/01和ned/99/01 ELISA的平均IgG应答。
[0501] 结果总结；
[0502] 在对所述两种不同EUSA的应答方面，仅观察到较小的差异。针对00-1或99-1的全病毒EUSA不能用来辨别所述两种亚型。
[0503] C.睬窝傣肉针对hⅧV卢本的血浩与APV抗原晌反应性
[0504] 已经用APV抑制ELISA，测试了从所述受感染豚鼠采集的血清。
[0505] 图33；h脚V感染豚鼠的平均APV抑制百分率。
[0506] 结果总结：
[0507] 豚鼠针对hMPV产生的血清在APV抑制试验中反应的方式与它们在hMPV IgG ELISA中反应的方式相同。
[0508] 针对ned/99/01产生的血清显示出在APV抑制ELISA中的抑制百分率低于针对ned/00/01产生的血清。被ned/99/01感染的豚鼠的效价可能较彳氐(正如在hMPV ELISA中所见的)，或者ne山99/01与APV的交叉反应低于ned/00/01的所述交叉反应。然而，可以用APV-Ab抑制ELISA来检测豚鼠的hMPV抗体。
[0509] D.用豚鼠的针对hMPV产生的血清进行的病毒中和测定。
[0510] 在采用ned/00/01、ned/99/01和APV-C的病毒(交叉)中和测定中，使用于第0天、感染后第52、70和80天采集的血清。起始稀释度为1-10，每孔用100 TCD50病毒。中和后，病毒附着在tMK细胞上，以3500 RPM离心15分钟，然后更换培养基。
[0511] APV试验是生长4天，而心律V试验是生长7天。用80％丙酮固定细胞，用以FITC标记的猴抗hMPV进行正A。染色为阴性的孔被认为是中和效价。对于每种病毒，包括病毒原液的10-10g连续稀释液(titration)和工作溶液的2倍连续稀释液(titration)。
[0512] 图34：ned/00/01和ned/99/01感染豚鼠的针对ned/00/01、ned/99/01和APV-C的病毒中和效价
[0513] 2.恒河猴
[0514] A.用两种hMPV亚型f(再)感染恒河猴
[0515] 用病毒分离株ned/00/01(亚型A)和ned/99/01(亚型B)(1°5 TCD50)每种亚型接种2只恒河猴(气管内、鼻和眼)。第一次感染后6个月，给所述恒河猴第二次接种ned/00/01。在感染后，采集了14天(第一次感染)或8天(第二次感染)的喉擦拭，并且通过RT-PCR测定检验了所述病毒的存在情况。
[0516] 图35：对接种了ned/00/01(两次)的恒河猴的喉拭抹物的RT-PCR测定结果。
[0517] 结果总结：
[0518] 接种了病毒分离株ned/00/01的恒河猴在感染后第1-10天表现出上呼吸道感染。临床症状包括化脓性鼻炎。给所述恒河猴第二次接种同种病毒，通过PCR证实引起了再感染，然而没有观察到临床症状。
[0519] B.对从hMPV感染的恒河猴采集的血清进行的血清学。
[0520] 从接受ned/00/01的恒河猴中，在第一次感染后6个月期间采集血清(再感染对于猴3而言发生在第240天，而对于猴6发生在第239天)。
[0521] 用血清检验针对或者ned/00/01或者APV的IgG抗体存在的情况，以及针对ned/00/01的IgA和IgM抗体存在的情况。
[0522] 结果：图36A
[0523] 2只用ned/0/0l(再)感染的恒河猴的针对ned/11/01的IgA、IgM和IgG应答。
[0524] 图36B
[0525] 2只用ned/00/01感染的恒河猴的针对APV的IgG应答。
[0526] 结果总结：
[0527] 已经用ned/00/01成功地感染了2只恒河猴，并且在有抗ned/00/01抗体的情况下，用同种病毒进行了再感染。IgA和IgM抗体的应答显示出在第一次感染之后IgM抗体升高，而在再感染之后无IgM抗体升高。IgA抗体仅在再感染之后可检测到，表明在第一次感染后免疫应答的直接性。恒河猴的针对h脚V所产生的血清在APV抑制ELISA中测试时表现出的应答与胁四V IgG EUSA相似。
[0528] 试瓷/晓诡
[0529] 用APV抑制ELISA检测恒河猴的hMPV抗体的灵敏度与使用hMPV EUSA的灵敏度相似，因此，APV抑制ELISA适合于检验人样品中hMPV抗体的存在。
[0530] C.使用从hMPV感染的恒河猴粟集的血清的病毒(交叉)中和测定
[0531] 结果总结：从第0天至的第一次感染后第229天采集的血清，仅表现出针对ned/00/01的低病毒中和效价(0-80)，在第二次感染后采集的血清表现出针对ned/00/01的高中和效价：＞1280。仅在第二次感染后采集的血清表现出针对ned/99/01的中和效价(80-640)，没有一种血清中和APV C病毒。
[0532] 在病毒(交叉)中和测定中，APV-C和hMPV之间没有交叉反应；而在一次加强所述抗体应答后，在ned/00/01和ned/99/01之间有交叉反应。
[0533] 3.人类
[0534] 年龄小于6个月至大于20岁的患者的血清，先前已经在IFA测定和病毒中和测定中针对ned/00/01进行了测试(参见专利的表1)。
[0535] 在此，我们已经用针对ned/00/01的ELISA检验了这些血清中的许多血清的IgG、Igm和IgA抗体的存在，并且我们用APV抑制ELISA检验了所述样品。
[0536] 结果.图37应用bMPV ELISA知APV抑制ELISA检测人血清中IgG抗体的比较，在所述IgG hMPV试验和所述APV-Ab试验之间有强相关性，因此所述APV-Ab试验基本上能够检测人中抗hMPV的IgG抗体。
[0537] 4.家禽
[0538] 用APV抑制ELISA以及所述ned/00/01 ELISA，对96只鸡检验了针对APV的IgG抗体的存在情况。
[0539] 结果总结：hMPV ELISA和APV抑制ELISA都检测到针对APV的抗体(数据未显示)。
[0540] 结果总结
[0541] 我们发现了bMPV的两个基因型，ned/00/01是A亚组的原型，而ned/99/01是B亚组的原型。
[0542] “依照经典血清学分析(例如已知的Francki，R.I.B.，Fauquet，C.M.，Knudson，D.L 和 Brown，F.，Classification and nomencfature ofviruses.Fifth report of the international Committee on Taxonomy ofViruses.Arch Virol，1991.Supplement2：p.140-144)，根据通过用动物抗血清进行定量中和测定而确定的免疫学区别(stinctiveness)，可以确定两个亚型。两个不同的血清型或者相互没有交叉反应，或者表现出两个方向的同种与异种效价之比＞16。如果中和表明两种病毒之间在任一个方向或两个方向有一定程度的交叉反应(同种与异种效价之比为8或16)，则如果存在DNA的显著生物物理/生物化学差异，则推定有血清学区别(distinctiveness)。如果中和表示两种病毒之间在任一方向或两个方向有不同程度的交叉反应(同种与异种效价之比小于8)，则推定所研究的分离株的血清型相同。”
[0543] 对于RSV，已知在先有免疫存在的情况下发生再感染(同种以及异种)。用同种血清型和异种血清型的hMPV感染豚鼠和恒河猴表明，对于hMPV的情况也是如此。另外，针对hMPV的IgA和IgM ELISA揭示，IgA抗体的反应仅在再感染后发生。针对hMPV或APV产生的血清在APV ELISA和hMPV ELISA中以同样的方式反应。根据核苷酸序列的比较，已知所述病毒对于N、P、M和F基因显示出约80％的氨基酸序列同源性。在ELISA中，N和M蛋白是引起反应的主要抗原。病毒中和测定(已知针对表面糖蛋白G、SH和F反应)表明在这两种不同血清之间有差异。虽然APV和hMPV在ELISA中交叉反应，但对hMPV和APV的核苷酸序列的系统发育分析、针对所述两种不同病毒产生的血清的病毒中和效价的差异、以及宿主用法的差异再次表明，APV-C和hMPV是两种不同的病毒。根据所述结果，我们推测哺乳动物中的hMPV感染可能是从鸟类至哺乳动物的动物传染病事件的结果。但是，所述病毒已经以这样一种方式(即G蛋白和SH蛋白)适应了，使得考虑到在鸟类中存在APV，回复(从哺乳动物至鸟类)动物传染病事件看来是可能的。
[0544] 附录
[0545] 肺病毒的背景信息
[0546] 副粘病毒科(Paramyxoviridae)有两个亚科：副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)和肺病毒亚科(Pneumovirinae)。肺病毒亚科由两个属组成：肺病毒属(Pneumovirus)和Metapneumovirus。肺病毒属有人、牛、绵羊和山羊呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒(PVM)。Metapneumovirus有禽肺病毒(APV，也称为TRTV)。
[0547] 肺病毒亚科中属的分类基于经典的病毒特征、基因顺序和基因构象。肺病毒属病毒在副粘病毒科中是独特的，因为在基因组3’端具有两个非结构蛋白(3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5')。相比之下，Metapneumovirus的病毒缺乏NS1和NS2基因，并且M编码区和L编码区之间的基因组构不同：3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’。
[0548] 副粘病毒亚科的所有成员都有血细胞凝集活性，但这一功能不是肺病毒亚科的限定性特征，在RSV和APV中无此功能，而在PMV中有此功能。在副粘病毒属(Paramyxovirus)和腮腺炎病毒属(rubulavirus)(副粘病毒亚科)的成员中有神经氨酸酶活性，但在麻疹病毒属(Morbillivirus)(副粘病毒亚科)以及肺病毒属和Metapneumovirus(肺病毒亚科)中无此活性。
[0549] 肺病毒亚科的第二个鉴别性特征是RSV对mRNA内可变ORF的表观有限的利用。相比之下，副粘病毒亚科的几个成员，例如仙台病毒和麻疹病毒，可利用mRNA中编码磷蛋白(P)的可变ORF来指导新蛋白质的合成。
[0550] 肺病毒亚科的G蛋白与副粘病毒亚科的HN蛋白或H蛋白没有序列相关性或结构相似性，仅为其链长的大约一半。另外，N蛋白和P蛋白都比副粘病毒亚科的其对应物小，并且缺乏明确的序列同源性。大多数非分段负链RNA病毒有一种基质(M)蛋白。肺病毒亚科的成员例外，因为它们有两种这样的蛋白-M和M2。M蛋白小于其副粘病毒亚科的对应物，并且与副粘病毒亚科没有序列相关性。
[0551] 当在细胞培养物中生长时，肺病毒亚科的成员表现出典型的细胞病变效应；它们诱导细胞特征性的合胞体形成(Col[ms，1996)。
[0552] 肺病毒亚科，肺病毒属
[0553] hRSV是肺病毒属的代表种，并且是婴儿和幼儿期间主要且分布广的下呼吸道疾病的病因(Selwyn，1990)。另外，hRSV越来越被认为是其它患者群、包括无免疫应答个体和老年人中的重要病原体。RSV也是所有年龄住院成人中社区获得性肺炎的重要病因(Eh抖und，1991二Falsey，2000；Dowell，1996)。已经根据与单克隆抗体和多克隆抗体的反应性以及核酸序列分析，鉴定了RSV的两个主要抗原性类型(A和B)(Anderson，1985；Johnson，1987；Sullender，2000)。具体地说，用G蛋白区别所述两个亚型。RSV-A和B在G中仅有53％的氨基酸序列同源性，而其它蛋白在所述亚型之间显示出较高的同源性(表1)(Collins，
1996)。
[0554] 已经描述了在免疫荧光技术(DIF，IFA)、病毒中和测定和ELISA或RT-PCR测定中，运用单克隆抗体和多克隆抗体检测RSV感染(Rothbarth，1988；Van Milaan，1994；Coggins，1998)。与hRSV密切相关的是牛RSV(bRSV)、绵羊RSV(oRSV)和山羊RSV(oRSV)，其中对bRSV的研究最为广泛。基于与hRSV的序列同源性，反刍动物RSV被分类在肺病毒亚科肺病毒属中(Collins，1996)。反刍动物RSV感染的诊断和分亚型基于血清学、抗原检测、病毒分离和RT-PCR测定的联合应用(Uttentha1，1996；Valarcher，1999；Oberst，1993；
Vilcek，1994)。
[0555] 已经用人抗血清和牛抗血清、单克隆抗体和cDNA探针，进行了对bRSV分子组构的几种分析。这些分析揭示，hRSV和bRSV的蛋白质组成非常相似，bRSV的基因组组构类似hRSV的基因组组构。对于bRSV和hRSV两者而言，G蛋白和F蛋白代表主要的中和保护性抗原。G蛋白在hRSV亚型之间以及在hRSV和bRSV之间高度可变(分别为53％和28%)(Prozzi，1997；Lerch，1990)。hRSV和bRSV毒株的F蛋白存在相当的结构特征和抗原相关性。bRSV的F蛋白显示出与hRSV有80-81％的同源性，而两个hRSV亚型在F中有90％的同源性(Walravens，K.1990)。
[0556] 基于应用hTSV和bRSV特异性单克隆抗体的研究已经提示存在不同的bRSV抗原亚型。A、B和AB亚型根据对G蛋白特异性的单克隆抗体的反应模式来辨别(F'urze，1994；Prozzi，1997；Elvander，1998)。bRSV的流行病学与hRSV的流行病学非常相似。在小牛中的自发感染通常与重症呼吸道体征相关，而实验性感染一般导致轻度疾病，有轻微的病理学改变(EIvander，1996)。
[0557] 也已经从天然感染的绵羊(oRSV)(LeaMaster，1983)和山羊(cRSV)(Lehmkuhl，1980)中分离出RSV。这两个毒株与牛RSV共享96％的核苷酸序列，并且在抗原上交叉反应。因此，这些病毒也被分类在肺病毒属中。
[0558] 肺病毒亚科肺病毒属的一个特殊成员是小鼠肺炎病毒(PVM)。
[0559] PVM在实验动物群体中，特别是在包括无胸腺小鼠的那些实验动物群体中是一种常见的病原体。天然获得睦感染被认为是无症状的，通过病毒在小鼠肺部传代，引起明显的疾病体征，从上呼吸道感染到致死性肺炎(Richter，1988；Weir，1988)。
[0560] 对于PVM和hRSV的核衣壳蛋白(N)和磷蛋白(P)之间有限的血清学交叉反应性已有描述，但外部蛋白中没有一个显示出交叉反应性，并且所述病毒在病毒中和测定中可以相互区别开(Chambers，1990a；Gimenez，1984；Ling，1989a)。就其糖基化模式而论，PVM的糖蛋白看来不同于其它副粘病毒的糖蛋白，而类似RSV的糖蛋白。然而，它们在加工上不同。与RSV不同，而与其它副粘病毒相似，PVM与鼠红细胞有血细胞凝集活性，看来G蛋白对此负责，因为针对该蛋白的单克隆抗体抑制血细胞凝集(Ling，1989b)。
[0561] PVM的基因组类似hRSV的基因组，在其3’端包括两个非结构蛋白，并且有相似的基因组组构(Chambers，1990a；Chambers，1990b)。PVM NS1/NS2基因的核苷酸序列与hRSV的所述基因的核苷酸序列没有可检测的同源性(ChaInbers，1991)。PVM的某些蛋白显示出与hRSV有强同源性(N；60％，F：38-40％)，而G明显不同(氨基酸序列长31％)(Barr，1991；Barr，1994；Chambers，1992)。据报道，PVMP基因，而不是RSV或APV的P基因，编码一个第二ORF，代表一种特有的PVM蛋白(Collins，1996)。新的PVM分离株通过病毒分离、血细胞凝集测定、病毒中和测定和各种免疫荧光技术来鉴定。
[0562] 附录的表：肺病毒亚科肺病毒属内不同病毒之间的氨基酸同源性。
[0563]基因 hRSV bRSV oRSV对 bRSV对 bRSV对 PVM对
hRSV hRSV oRSV hRSV

NS1 87 68-69 89 *
NS2 92 83-84 87 *
N 96 93 60
P - 81
M - 89
F 89 80-81 38-40
G 53 88-100 21-29 38_41 60-62 *
M2 92 94 41
SH 76 45-50 56
L -
[0564] *无可检测的序列同源性
[0565] Metapneumovirus
[0566] 禽肺病毒（APV)已被鉴定是火鸡鼻气管炎的病原(McDougall，1986；Collins，1988)，因此通常被称为火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)。所述疾病是火鸡的一种上呼吸道感染，导致高发病率和可变但常常高的死亡率。在母火鸡中，所述病毒也可以诱导产蛋量显著下降。所述病毒也可以感染鸡，但在这一物种中，该病毒作为主要病原体的作用的确不是太清楚，虽然它通常与种鸡中的肿头综合征(swollen head syndrome)(SHS)相关(Cook，2000)。
所述病毒体是多态的，虽然主要为球形，大小为70-600 nm，并且含有缗隍非分段负义RNA基因组的核衣壳显示出螺旋对称(Collins，1986；Giraud，1986)。这种形态类似副粘病毒科的成员。对APV编码的蛋白和RNA的分析提示，在该科的两个亚科(副粘病毒亚科和肺病毒亚科)中，APV最密切类似肺病毒亚科(Collins，1988；Ling，1988；Cavanagh，1988)。
[0567] APV没有非结构蛋白(NS1和NS2)，并且基因顺序(3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')不同于哺乳动物肺病毒例如RSV的基因顺序。因此，APV最近被分类为新的属Metapneumovirus的代表种(Pringle，1999)。中和模式、ELISA和与单克隆抗体的反应性的差异已经揭示存在不同的APV抗原类型。G基因的核苷酸测序使得确定了两个病毒亚型(A和B)，它们仅有38％的氨基酸同源性(Collins，1993；Juhasz，1994)。从美国科罗拉多分离的一种APV(Cook，1999)表明出与A和B亚型病毒的交叉中和差，并且根据序列信息，被指定为一个新亚型-C(Sea1，1998；Sea12000)。在法国分离出两种非A/非B APV，表明它们在抗原性上不同于A、B和C亚型。根据F、L和G基因的氨基酸序列，这些病毒又被分类为一个新的亚型-D(Bayon-Auboyer，2000)。
[0568] 通过在鸡或火鸡气管器官培养物(TOC)或在Vero细胞培养物中分离病毒，可以达到诊断APV感染。一般在一次或两次另外的传代之后，观察到细胞病变效应(CPE)。这种CPE的特征为导致合胞体形成的分散的局限性细胞rounding区(Buys，1989)。已经开发了多种血清学测定，包括巧'和病毒中和测定。通过ELISA检测针对APV的抗体，是最常用的方法(O'Loan，1989；Gulati，2000)。最近，已经用聚合酶链式反应(PC㈤来诊断APV感染。可以用取自食管的拭抹物作为起始材料(Bayon-Auboyer，1999；Shin，2000)。
[0569] Alansari，H和Potgieter，L.N.D.1994.Nucleotide and predictedamino acid sequence analysis of the ovine respiratory syncytial virus non-stmctutal lC and lB genes and the small hydrophobic protein gene(羊呼吸道合胞病毒非结构lC和lB基因以及小疏水性蛋白基因的核苷酸序列和预测氨基酸序列分析).J.Gen.Virol.75：401-404.
[0570] Alansari，H.，Duncan R.B.，Baker，J.C和Potgieter，L.N.1999.Analysis of ruminant respiratory syncytial virus iso1ates by RNAseprotection of the G glycoprotein transcripts(通过G糖蛋白转录物的RNA酶保护分析反刍动物呼吸道合胞病毒分离株).J.Vet.Diagn.Invest.11；215.20
[0571] Anderson，L.J，Hierholzer，J.C.，Tsou，C.，Hendry，R.M.，Fernic，B.F.，Stone，Y和McIntosh，K.1985.Antigenic characterisation of respiratorysyncytial virus strams with monoclonal antibodies(用单克隆抗体对呼吸道合胞病毒毒株进行抗原性表征).J.Inf.Dis.151；626-633.
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