环杷明在制备治疗基底细胞癌及其它肿瘤的药物中的应用

摘要

本发明涉及环杷明在体内治疗基底细胞癌的应用，通过引起肿瘤细胞的分化和高效的凋亡以及将这些肿瘤细胞的除去实现治疗效果，而对正常的组织细胞，包括正常表皮基底层及毛囊的未分化细胞无影响。环杷明通过非基因毒性机制引起细胞凋亡。这些效果使环杷明在治疗基底细胞癌及其它癌症方面非常理想，这些癌症利用hedgehog/smoothened信号转导通路进行分化并防止凋亡。

权利要求

1.选择性抑制hedgehog/smoothened信号转导通路的环杷明或其可药用盐或其衍生物在用于药物制备中的用途，所述药物引起肿瘤缩小和消失，所述肿瘤细胞利用hedgehog/smoothened信号转导通路防止凋亡和预防分化。

2.根据权利要求1的用途，特征在于，所述的药物配制成适合局部、非局部或全身给药的药物。

3.根据权利要求2的用途，特征在于，环杷明或其药用盐或其衍生物为水溶液形式，或包封在脂质体中。

4.根据权利要求2的用途，特征在于，所述药物为能控释的药物形式。

5.根据权利要求1的用途，特征在于，所述药物为直接肿瘤内注射的药物。

6.根据权利要求1的用途，特征在于，所述药物吸附到皮肤贴片上。

7.根据权利要求1的用途，特征在于，所述药物制备成乳膏、软膏、凝胶或水凝胶的形式，且所述药物用于治疗基底细胞癌。

说明书

本发明涉及环杷明(cyclopamine)在体内治疗基底细胞癌(BCC’s)的应用，通过诱导肿瘤细胞分化，以及凋亡将这些肿瘤细胞除去从而实现治疗作用，而对正常的组织细胞，包括正常表皮基底层及毛囊的未分化细胞无影响。环杷明通过非基因毒性机制引起细胞凋亡，因此与放疗及当前使用的绝大多数化疗药物通过损伤DNA发挥作用的方法不一样。这些先前的癌症化疗药物所不能达到的新效果使环杷明适于癌症治疗，适于治疗BCC’s其他肿瘤，所述肿瘤利用hedgehog/smoothened信号转导通路进行增殖及防止凋亡。

基底细胞癌是一种常见的上皮肿瘤。其发病率随年龄增长而升高。当前对BCC’s的治疗包括将肿瘤及其边缘正常组织手术切除，当不宜手术或手术不理想时，采取放疗或其它手段破坏肿瘤细胞。尽管具有留下疤痕及毁容的潜在副作用，但将肿瘤细胞清除完全的手术切除可以将其治愈。放疗通过造成大量不可恢复的DNA损伤而起作用，该损伤随后引发肿瘤细胞凋亡。放疗的这种作用模式，即继发于DNA损伤的细胞凋亡，与当前癌症治疗中使用的许多化疗药物的作用机理相似。然而，放疗及细胞毒性癌症化疗药物也会对肿瘤细胞以外的正常细胞的DNA造成损伤。因此，它们在癌症治疗中的有效性及有用性是非常有限的。放疗及基因毒性癌症化疗药物还存在另一烦扰的两难局面，即患者的原发癌症即使被治愈，其患新发癌症的危险明显地增加，因为在原发癌症的治疗中造成了DNA损伤并因此产生突变。因此，通过非基因毒性方式选择性诱导肿瘤细胞凋亡在癌症治疗领域最有前景。

BCC’s经常显示出基因patched的失活性突变，该基因编码一种为hedgehog蛋白的受体的跨膜蛋白，这些hedgehog蛋白的首次发现源于其在组织发育模式方面的作用。当不与hedgehog结合时，patched蛋白质抑制通过另一种跨膜蛋白smoothened的细胞内信号转导。Hedgehog与patched蛋白质的结合会解除这种抑制作用。然后，通过解除的smoothened的细胞内信号转导启动一系列细胞活动，最终导致hedgehog目的基因的表达及细胞行为发生改变。这种hedgehog/smoothen信号转导通路，首先在果蝇中得到证实，其一般特征在从果蝇到人的多种生物体中是保守的。然而，该通路在更高级的生物体中更加复杂(如人类多个基因与果蝇单一patched基因具有显著相似性)。已发现，patched基因的失活性突变可引起通过hedgehog/smoothened通路的组成型(无配体)信号转导。在所有BCC’s中，都发现了源于patched基因和/或下游通路元件突变引起的hedgehog/smoothened通路的过度活跃。痣样基底细胞癌综合征(NBCCS)源于patched基因的单倍不足性。NBCCS患者由于在先前所有细胞中都存在突变型patched基因，他们日后会发展为多发性的BCC’s。

环杷明为一种甾类生物碱，具有以下结构式。

发现环杷明在百合Veratrum califomicum中天然存在，可从其中或其它来源提取获得.在鸡胚及鼠培养细胞中发现了环杷明对hedgehog/smoothened通路的抑制作用.

在局部应用时，可将环杷明溶于乙醇或其它合适的溶剂中，再与合适的碱性基质乳膏、软膏或凝胶混合。也可将环杷明固定于水凝胶上或制成其它剂型以达到控释，及吸收到皮肤贴片上。图1A～图1D、图2A～图2F、图3A～图3G及图4A～图4D显示的是乳膏制剂的效果，该制剂为将环杷明乙醇溶液与基质乳膏混合得到终浓度为18mM的环杷明乳膏。使用的乳膏基质主要由重石蜡油(10％w/w)、凡士林(10％w/w)、十八烷醇(8％w/w)、polyoxylsteareth-40(3％w/w)及水(68％w/w)组成，然而，其它合适地制剂的乳膏基质也可使用。环杷明制剂的最佳浓度、最佳给药剂量及应用方案将明显受具体剂型、包含肿瘤的皮肤的位置及特点(如表皮的厚度)以及肿瘤的大小等因素影响；然而，这些因素可经下述已知的发表地优化方法确定。对图1A(位于鼻唇褶上的BCC，表面积为4×5mm)及图1C(位于前额的BCC，表面积为4×4mm)所示的肿瘤的剂量及治疗方案如下：以钢刮刀将10±2μl乳膏直接施用于BCC′s，每日四次，约从上午9:00开始，用药间隔3.5小时。夜间使用时，应避免该方案，由于患者熟睡时，将乳膏易从皮肤流失至被褥上，此时可使用合适的皮肤贴片。接触环杷明后对正常表皮及毛囊中未分化细胞的保护，如本发明所述，提供了关于以其它可能的用药方式的耐受剂量的信息；如直接向肿瘤内注射其水溶液或水溶液的全身使用，或将环杷明包封在脂质体中。

图1A、图1B、图1C及图1D显示了暴露于环杷明后BCC′s的快速临床转归。在不足一周的时间内，不但可见到几处肿块的消失，同时，图1B与图1A及图1D与图1C相比较，BCC′s典型的半透明外观消失。

图2A～图2F显示了在应用环杷明第5及第6天后，与边缘正常组织一起进行手术切除的肿块的显微外观，此时BCC′s治疗前的绝大部分面积已经消失，仍然有少数区域，尽管其高度明显下降，但仍未完全消失，因此，显微分析仍发现残留的肿瘤细胞。

图2A及图2B所示对应于消失肿块的组织切片上的皮肤区域。经过观察发现，肿瘤消失留下大量包含少量物质的囊状结构，没检测到肿瘤细胞。

图2C显示了体内仍包含可见BCC的皮肤区域的显微外观。在这些区域中可观察到残留的BCC′s，其显示出在肿瘤中心的大量胞囊及位于外围残留的BCC细胞中各种大小的较小囊状结构。

图2D及图2E显示了这些残留的BCC′s内部及围护外围区域的1000倍放大外观，也显示在肿瘤区域的残留BCC中存在大量的细胞凋亡活动。这些高倍放大的图片显示，细胞凋亡形态BCC细胞及由细胞的凋亡去除形成的囊状结构的频率大大增加，由图2D所示可以例证，一旦凋亡的隔膜细胞被清除，三个较小的胞囊相连形成一个较大的胞囊。

图2F显示BCC′s以安慰剂乳膏的治疗(即除不含环杷明，与环杷明乳膏制剂相同的乳膏，用作安慰剂)，与上不同，显示出典型的BCC细胞且无细胞凋亡活动。

已知发生凋亡的细胞通过巨噬细胞及正常组织中的邻近细胞清除，已知基于苏木精-伊红染色切片的形态学标准进行的凋亡活动定量偏低。尽管如此，表1中的定量数据表明，经过环杷明治疗后的残留BCC细胞中的凋亡活动大大增加。

在环杷明治疗的BCC′s中的半透明性的消失提高了在环杷明的影响下BCC′s分化的令人感兴趣的可能性.本发明发现该可能性的确存在，可经BCC′s的免疫组化分析测定.在正常的表皮中，基底层细胞向上层细胞的分化伴随单克隆抗体Ber-Ep4标记特性的消失.Ber-Ep4还标记BCC细胞，为这些肿瘤的已知标记物.图3A、图3B及表1的定量数据表明，尽管Ber-Ep4强烈地标记安慰剂对照组BCC′s中所有外围围护细胞及90％的内部细胞，Ber-Ep4却不标记环杷明治疗组BCC′s的任何残留外围细胞或内部细胞.在环杷明的影响下的BCC′s分化，迄今未见其它类似报道，由于其在体内及在所有细胞中按照免疫组化标准所达到的非同一般的效果，在癌症的治疗上具有独特的价值.

另一个分化标记物，1型Ulex Europaeus外源凝集素，正常地不标记BCC′s或正常表皮的基底层细胞，但标记分化的上层细胞。图3C显示了以该外源凝集素对环杷明治疗组BCC′s地残留细胞的异质性标记，显示了从Ber-Ep4无法检测的步骤一直到用1型Ulex Europaeus外源凝集素可检测的步骤的一些BCC细胞的分化。

p53是细胞对DNA损伤主要的调节子。已知当细胞暴露于基因毒性药物后该蛋白在细胞核中的量将增加。当DNA损伤超过一定阈值时，p53便诱导细胞凋亡。癌症的放疗及当前常用的基因毒性化疗药物，主要通过这种机制起作用，即通过诱导继发于DNA损伤的细胞凋亡起作用。单克隆抗体DO-7可与正常的及错义突变体(即非功能性)形式的p53结合，且能对暴露于DNA损伤药物后细胞中p53的增加进行检测。

图3D、图3E及表I中的定量数据显示，与安慰剂处理的BCC′s相比，环杷明治疗组BCC′s中的DO-7的标记强度及标记频度都显著降低。因而，环杷明导致经其治疗后的BCC细胞核中的p53降低，而不是升高。已知分化的表皮细胞的p53将降低，因而，环杷明治疗组BCC′s的DO-7标记降低可能继发于环杷明诱导的BCC细胞的分化。无论如何，尽管有p53表达的显著降低，但在环杷明治疗的BCC′s细胞中存在的大量的细胞凋亡活动表明，环杷明诱导的肿瘤细胞的凋亡是通过非基因毒性机制进行的。

已知BCC′s增殖的抑制与其自基质中的收缩有关。尽管由于组织的不适当固定及处理可产生自基质的收缩的假象，但按照公开的技术方案可避免这些假象。如图3F及图3G所示，环杷明处理的，而非安慰剂处理的BCC′s一致性地出现自基质收缩。因而，将BCC′s暴露于环杷明似乎也与增殖的抑制有关。

图4A～图4D显示了环杷明处理的BCC′s或其附近的正常皮肤组织的Ber-Ep4标记。图4A、图4B及图4C显示用环杷明处理的不同表皮区域，以显示Ber-Ep4标记的正常模式，即基底层细胞的标记。类似地，图4D显示了暴露于环杷明的毛囊的正常Ber-Ep4标记。因而，尽管正常表皮及毛囊的未分化细胞以BCC′s同样的方案及剂量暴露于环杷明，但仍保持原样。

当以不影响未分化的组织细胞的环杷明剂量，在体内高效地诱导肿瘤细胞分化及诱导肿瘤细胞凋亡，这些成就目前还不为人所知，这些机制及环杷明的非基因毒性作用模式，支持将环杷明用于BCC’s及其它一些肿瘤治疗中的用途，所述肿瘤利用hedgehog/smoothened信号转导通路进行增殖及防止凋亡和/或分化。

附图描述

图1A、1B、1C、1D：显示了环杷明处理后BCC′s的快速转归，体现在肿块的消失(箭头所示)、距皮肤表面的高度明显减小及透明的外观在不足一周内消失。1A：位于左侧鼻唇褶的治疗前的BCC。1B：同样的BCC在环杷明局部治疗第五天的情况。1C：位于前额的BCC治疗前的情况。1D：同样的BCC在环杷明局部治疗第六天的情况。

图2A、2B、2C、2D、2E、2F：环杷明处理的及安慰剂处理的BCC′s的显微外观，显示环杷明诱导的大量细胞凋亡、肿瘤细胞的清除及肿块的消失、留下不含肿瘤细胞的大量囊腔.在环杷明预处理的第5及第6天，将对应于处理前BCC′s位置的皮肤区域以及周围正常组织，进行手术切除，然后进行常规的固定、切片及苏木精-伊红染色作显微分析.2A：对应于肿块消失位置处的真皮中的大胞囊，显示无残留的肿瘤细胞.2B：另一处真皮区类似的胞囊，该区域用环杷明治疗前包含BCC，但非治疗后不包含.2C：图1D显示的BCC区域的低倍视野，显示了残留细胞及这些细胞之间的无数小胞囊相连形成一个大胞囊.2D：图2C中同样的残留BCC内部区域的高倍视野，显示凋亡细胞及以及BCC细胞的凋亡清除导致的胞囊形成和扩大的频率大大增加.2E：图2C中同样的残留BCC的外围区域的高倍视野，显示凋亡细胞及由BCC细胞的凋亡清除导致的囊状结构形成频率大大增加.2F：安慰剂处理的BCC内部区域的高倍视野，显示了典型的肿瘤细胞且无细胞凋亡.2A、2B、2C的初始放大倍数为100×，2D、2E、2F的初始放大倍数为1000×.

图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G：环杷明及安慰剂处理的BCC′s免疫组化分析显示在环杷明的影响下所有残留BCC细胞的分化以及暴露于环杷明后BCC′s中p53表达的降低。3A及3B：与安慰剂处理的BCC的Ber-Ep4强染色(3B)形成对比，环杷明处理BCC的所有残留细胞无单克隆抗体Ber-Ep4染色(3A)，表明所有经环杷明处理的残留细胞都分化至或超过可以Ber-Ep4检测的步骤。Ber-Ep4已知的分化标记物，可以染色BCC细胞以及未分化的正常表皮基底层细胞及毛囊，但不能标记已分化的正常表皮的上层细胞。3C：以Ulex Europaeus外源凝集素I对环杷明处理的BCC′s中残留细胞的异质性标记，显示了一些BCC细胞一直分化至可由该凝集素检测到的步骤，该外源凝集素正常地不标记BCC′s或正常表皮的基底层细胞，但标记分化的上层细胞。3D及3E：与安慰剂处理的BCC′s(3E)相比，环杷明处理的BCC′s(3D)以单克隆抗体DO-7检测到p53表达的降低。当上皮基底细胞或角质化细胞分化时，已知p53表达将降低。众所周知，当暴露于DNA损伤药物后，在细胞中可检测到用DO-7检测的p53增加。3F及3G：BCC′s自基质中一致性收缩，据知其为肿瘤细胞增殖抑制相关联的特征，可见于环杷明处理肿瘤(3F，箭头显示了收缩区间)，而在安慰剂处理组(3G)的肿瘤(环杷明及安慰剂处理的BCC′s自基质收缩的差异也可参见3D、2C与3B、3E)中不可见。3A、3B、3D、3E的初始放大倍数为400×，3C为1000×，及3F、3G为100×。所有的免疫组化标记为过氧化酶偶联的链亲和素，该链亲和素结合生物素化的二级抗体；标记为棕色。3F及3G所示的切片以高碘酸-希夫反应以及艾西蓝染色。

图4A、4B、4C、4D：环杷明处理的正常皮肤的Ber-Ep4标记正常模式，该模式表明，尽管将正常表皮及毛囊的未分化细胞以与BCC′s同样的方案及剂量暴露于环杷明，仍保持原样。4A：环杷明处理的表皮基底层细胞的Ber-Ep4标记。4B及4C：环杷明处理的表皮的不同区域的高倍视野，表明基底细胞的Ber-Ep4标记。4D：以环杷明处理的毛囊的高倍视野，仍然显示Ber-Ep4的正常标记。4A的初始放大倍数为400×，4B、4C、4D为1000×。免疫组化检测方法同图3A、3B；标记显棕色。

表1：环杷明局部处理诱导的基底细胞癌细胞的分化及细胞凋亡

所示的平均值±标准差至少源于16个随机选择的每组肿瘤组织切片的高倍(1000×)视野。对围护外围及非围护的(内部)肿瘤区域、安慰剂与环杷明处理肿瘤的各项参数，p＜0.001。

第12页上的同样附图(图1A、1B、1C、1D，图2A、2B、2C、2D、2E、2F，图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G，图4A、4B、4C、4D)的彩图，其页码在此增补为12a，基于免疫组化方法的数据及资料的性质，彩图比灰图传递信息更佳；我们真诚地希望专利局能够考虑这些事实将这几页保留作为本专利申请的一部分。然而，若专利局考虑没有必要，也可从专利申请中去除12a。