针对丙型肝炎病毒E2糖蛋白的人单克隆抗体转让专利
申请号 : CN01813409.2
文献号 : CN1545551B
文献日 : 2010-04-07
发明人 : 伯恩哈德·库巴内克 , 马尔恰·达席瓦尔·卡尔多索 , 卡尔·西蒙内特 , 什洛莫·达冈 , 拉赫尔·埃伦
申请人 : DRK-献血服务中心巴登-符腾堡-黑森公益有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种人单克隆抗体,该抗体选自:
(a)人单克隆抗体HCV-AB68,其由保藏在欧洲动物细胞保藏中心,保藏号为ECACC00051714的杂交瘤细胞系分泌,或者所述人单克隆抗体HCV-AB68的Fab或F(ab)2片段;
(b)一种人单克隆抗体或者其Fab或F(ab)2片段,其包含至少一个重链可变区和一个轻链可变区,重链可变区的氨基酸序列描述于图4,轻链可变区的氨基酸序列描述于图4。
2.于2000年5月17日保藏在欧洲动物细胞保藏中心,保藏号为ECACC00051714的杂交瘤细胞系。
3.一种药物组合物,其包含治疗有效量的、权利要求1的抗体和药用载体。
4.权利要求1中的抗体在治疗和/或预防HCV感染的药物组合物制备方面的用途。
5.一种药物组合物,其包含治疗有效量的权利要求1的抗体,该抗体与至少一种作为附加活性组分的其它抗病毒制剂结合,该制剂选自干扰素,抗HC单克隆抗体,抗HC多克隆抗体,RNA聚合酶抑制剂,蛋白酶抑制剂,IRES抑制剂,解旋酶抑制剂,反义化合物和核酶。
6.根据权利要求5的药物组合物,其中的抗病毒制剂是一种可进入细胞并在细胞内作用的分子。
7.与抗病毒制剂结合的权利要求1的抗体在治疗HCV感染的药物组合物制备方面的用途,所述的制剂选自干扰素,抗HC单克隆抗体,抗HC多克隆抗体,RNA聚合酶抑制剂,蛋白酶抑制剂,IRES抑制剂,解旋酶抑制剂,免疫调节剂,反义化合物和核酶。
8.一种用于治疗HCV的药物组合物,其包含治疗有效量的权利要求1的抗体,该抗体与至少一种作为附加活性组分的其它抗病毒制剂结合,该制剂选自干扰素,抗HC单克隆抗体,抗HC多克隆抗体,RNA聚合酶抑制剂,蛋白酶抑制剂,IRES抑制剂,解旋酶抑制剂,免疫调节剂,反义化合物和核酶。
9.根据权利要求8的药物组合物,其中的抗病毒制剂是一种可进入细胞并在细胞内作用的分子。
10.权利要求1的人单克隆抗体在制备用于降低个体群中HCV感染的发生的药物中的应用。
12.一种多核苷酸,其编码权利要求1所述的单克隆抗体。
说明书 :
针对丙型肝炎病毒E2糖蛋白的人单克隆抗体
发明领域
因素(Cohen 1999Science 285:26-30)。
个长的可读框,该可读框编码大约有3,010个氨基酸的多蛋白。已经在两个推定的包膜糖
蛋白E1(gp35)和E2(gp72)上分别鉴定出了5或6和11个连接到N端的糖基化位点。高水
平的遗传变异性与包膜基因相关。 这着重体现在E2基因的5’末端,其被定义为HVR1
和HVR2的两个高变区已经被描述(Kato等.,1992Bioch.Biophys.Res.Commum.189:
119-127)。
工作提示:在来自HCV感染患者的血清中存在中和抗体(Rosa et al.,1996PNAS(美
国)93:1759-1763;Zibert等.,1995Virology208:653-661;Zibert等.,1997J.Virol.71:
4123-4127)。
Lippincott-Raven,Philadelphia,1035-1058页)。 一种替代分析——结合中和作用(NOB)
分析评价特定抗体或血清在防止HCV E2蛋白与人T细胞系相关联的能力(Rosa等.,
1996PNAS(美国)93:1759-1763)。
能沉淀E1/E2复合体。
需要作进一步证实。
序,这种抗体就是本发明的主题。
单核细胞(PBMC)从具有抗HCV E1/E2抗体的人个体中获得。来自于人供体的PBMC可
以从全血中获得或者通过白细胞分离置换法(leukophoresis)获得。 然后用EB病毒(EBV)
体外转化人PBMC(Simoneit等.1994Hybridoma 13:9-13)。 在转化以后,通过本领域熟
知的技术,将所得到的抗HCV-产生的类淋巴母细胞在体外优选与人鼠融合体例如异骨髓
瘤(Heteromyeloma)融合(例如Kohler&Milstein,Nature,256:495-497,1975)。 产生的
杂交瘤细胞系可以在合适的培养基中体外培养,所需要的单克隆抗体从上清液中回收,
或者任选地,也可以将杂交瘤细胞系注射至小鼠腹腔中,并且从这些小鼠的恶性腹水
(ascitis)或血清中获得抗体。 通过任何本领域已知的方法例如酶联免疫吸附测定(ELISA)
或放射免疫测定法(RIA)对杂交瘤细胞系的上清液进行筛查,通过将HCV E1/E2作为抗体
结合底物来筛查是否存在抗HCV E1/E2抗体。 通过此方法产生的人单克隆抗HCV E1/E2
抗体被进一步用于HCV感染的小动物模型中来检验其中和病毒或者降低病毒负荷(viral
load)的能力。 病毒的中和作用或者病毒负荷的降低可以通过例如,使用对动物血清中
HCV RNA的RT-PCR分析或者通过HCV阳性鼠的数量来进行测量。
CAMR,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK),保藏号为00051714。 该实施方案还提供
了由上述杂交瘤细胞系分泌的抗HCV E2人单克隆抗体(在此被命名为HCV-AB 68)及其
片断,这些片断保留有该抗体的抗原结合特性。 这样的片断可以是例如Fab或F(ab)2片
断,其通过使用各种酶来降解整个抗体而获得,这对本领域的技术人员是熟知的并且已
经被广泛地描述。 通过使用标准分析法如RIA,ELISA或FACS(荧光激活细胞分选仪)
分析来确定抗体的抗原结合特性。
和10 M范围内的HCV E2具有相对高的亲和力。
肝炎患者,所述治疗是通过给予这些患者治疗有效量的能够结合HCV E2的抗体或者其片
断。 治疗学有效量指的是能够在个体中有效减轻HCV感染症状的量,或者是有效降低
循环中病毒粒子的量。 这些药物组合物也可用于例如对HCV阳性母亲分娩的新生儿的
被动免疫,也可用于肝移植患者的被动免疫以防止在这些患者体内可能出现的反复HCV
感染。 本发明的另一个方面是一种药物组合物,其包含治疗有效量的本发明的抗体,该
抗体与至少一种作为附加活性组分的其它抗病毒制剂结合。 这些制剂包括但不限于干扰
素,抗HCV单克隆抗体,抗HCV多克隆抗体,RNA聚合酶抑制剂,蛋白酶抑制剂,
IRES抑制剂,解旋酶抑制剂,免疫调节剂,反义化合物和核酶。
(c)和板(d)代表了用β-巯基乙醇(β-ME)处理的E2样品。 板(e)和板(f)代表了用DTT
处理的E2样品。 板(a)(c)(e)代表了这样的E2样品,这些样品在上样之前,在37℃培育
了5分钟,而板(b)(d)(f)样品于上样前在100℃被加热。
颗粒的PCR产物。 图2B是一张图示,其代表了对结合+未结合部分进行PCR,所检测
到的结合病毒占病毒总量的百分比。
染动物的百分比(括号中的数字)。
HCV-三跗节类(Trimera)小鼠的百分比(括号中的数字)。
中含有阳性HCV RT-PCR信号的HCV-三跗节类小鼠的百分比(括号中的数字)。
1中描述的数字相对应。
HCV RT-PCR信号的HCV三跗节类小鼠的百分比(括号中的数字)。
和血清中含有阳性HCVRT-PCR信号的HCV三跗节类小鼠的百分比(括号中的数字)。
实施例
中都表现为HCV阳性。 用EB病毒(EBV)转化此供者的PBMC(Siemonet K等.1994,
Hybridoma 13:9-13)。 将转化产生的类淋巴母细胞的上清液用于抗HCV E1/E2抗体产
物筛查。 通过使用HCV基因型1a病毒(H株)的包膜蛋白E1和E2的ELISA来执行这
种筛查。 将阳性克隆与异骨髓瘤细胞系K6H6/B5(Cardoso MS等.1998,J Med Virol 55:
28-34)融合。 如上筛查所得到的杂交瘤克隆,将阳性克隆通过限制稀释克隆三次并且最
后被扩增以用于抗体生产。
孔)包被。 鼠抗人IgG亚类(IgG1,IgG2,IgG3,IgG4)(Sigma)被作为第二抗体,纯化
的羊抗鼠IgG过氧化物酶偶联剂(Zymed实验室)被作为检测试剂。 室温下培育1小时后
洗涤,加入底物溶液3,3’,5,5’-四甲基-联苯胺二氢氯化物(TMB)(Sigma)。 使用
ELISA读出器在450nm处读取结果。
亲和常数(KD)。
等.1991PNAS 88:2451)。这是一种被截短了的蛋白,其包含有331个氨基酸而且在蛋白
印迹上的电泳结果表现为一段约60KD的带。 2)E2BEVS,用杆状病毒作为表达载体,在
昆虫细胞中产生的重组体HCV基因型1b E2蛋白。此蛋白包含279个氨基酸,而且在E2
的3’疏水末端有150个氨基酸缺失(删除这些氨基酸的目的是为了使蛋白溶解并且使蛋
白表达)。
β-巯基乙醇(360mM)或DTT(50mM)的天然样品缓冲液混合,并且用与天然凝胶相同的
方法进行处理。
中与被1∶20,000稀释的过氧化物酶偶联的羊抗人IgG共培育60分钟。用PBS/0.04%吐
温-20洗涤5分钟,在洗涤3次后,印迹被暴露于X光胶片并且使用增强化学发光(ECL)
进行显影。
被加入孔内,在4℃O.N.培育。1∶20,000稀释的羊抗人IgG过氧化物酶偶联剂(Zymed)
被用作二抗。 37℃培育一个小时后洗涤,加入底物溶液3,3’,5,5’-四甲基-联苯
胺二氢氯化物(TMB,Sigma,St.Louis,Mo)。 在波长450nm处,用ELISA读出器读取
结果。
在结合部分和未结合部分被磁性分离以后,用特殊的RT-PCR分析来检测这些颗粒。
下进行。 在pH 8.1的0.1M Na-P缓冲液中洗涤抗体包被的磁珠3次,在1%BSA中封闭
30分钟,而且在将其再悬浮于PBS-0.1%BSA中之前,再次用PBS洗涤。 平行地,用
蛋白-A琼脂糖(Pharmacia)对从感染个体中得到的测试血清进行预处理以清除血清抗体。
这样的结果可以通过将10μl的蛋白-A琼脂糖与10μl的血清振荡培育30分钟,然后在
5000转/分的转速下离心5分钟实现。 而后将去除抗体的血清与抗体包被的磁珠振荡培
养2小时。 使用含有0.1%BSA的PBS将最后的体积定容至200μl。 通过磁性分离而使
其与非结合部分分离的结合部分,在被最后重新悬浮于200μl PBS之前,要用1毫升的
PBS洗涤5次。
有4μl的RT缓 冲 液,1mM dNTP’s,10mM DTT,100U mMLV-RT(Promega),2.7U
AMV-RT(Promega)和2.5pM HCV反义引物ATGRTGCTCGGTCTA。 反应条件被设置为
由37℃升至42℃,每20分钟增加1℃。 反应完成于94℃培育10分钟这一步骤。 5μl
的RT反应物被作为PCR反应的模板(50μl终体积)。 PCR反应包括5μlPCR缓冲
液,2.5mM MgCl2,0.2mM dNTP’s,0.25U Taq聚合酶(Promega),0.25pM有意义引物
CACTCCACCATRGATCACTCCC和反义引物ACTCGCAAGCACCCTATCAGG。在94℃1
分钟;在58℃1分钟;在72℃1.5分钟进行33个扩增循环,最后在72℃有一个5分钟
的延长步骤。 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离,在EagleEye II装置上进行EB染色
后,显影并且定量。
的总RNA来制备cDNA。 用下列变性的引物,使用1μl的RT反应混合物进行PCR:
特异的活性分析。 对轻链和重链质粒的阳性组合,即产生抗体活性的组合进行测序。
通过与基因库相比较和通过与Kabat序列(Kabat等.,1991,Sequences of proteins of
th
immunological interest(5 Ed.)美国卫生保健部(U.S.Dept.of Health Services),美国国立卫
生院(National Institute fo Health),贝塞斯达,马里兰州)进行序列对比,来对序列进行分
析。
交瘤细胞系。 一种稳定的杂交瘤克隆被进一步表征,该克隆分泌特异的人抗HCV E1/E2
抗体,其被表示为HCV-AB 68。 上述克隆所分泌的抗体被发现是IgG1。 HCV-AB 68对
-11 -9
E2CHO的亲和常数为1.4×10 ±0.3,对E2BEVS的亲和常数为1.7×10 ±1。通过蛋白
印迹分析和ELISA来测试其特异性。 在蛋白印迹中,HCV-AB 68结合同时在杆状病毒
表达系统(BEVS)和在哺乳动物表达系统(CHO细胞)中表达的不同E2构建体。 图1证
明:HCV-AB 68除了构建体No.2(即:没有HVR1区域的E2蛋白)以外,结合到所有的
E2构建体。 在β巯基乙醇或者DTT存在的情况下,抗体不与E2结合。 这些结果表明
HCV-AB,68识别构象表位。
抗体结合表位的一部分。表1证明了在ELISA中,HCV-AB 68对E2BEVS的结合特性。
进行3次。 患者1的HCV基因型是1b而患者2的基因型是1a/1b。 每个血清的HCV滴
度为1-5×106。 图2显示:HCV-AB68结合的片段比HBV-AB17对照结合的片段要明显
大得多。HCV-AB68可以结合超过50%的病毒颗粒,而对照的HBV-AB17背景结合是在
1-5%之间(图2B)。
基因序列。 图3显示了编码HCV AB 68可变区重链和轻链的cDNA核酸序列(序列识别
号码分别是1和2)。 图4显示了相应的氨基酸序列(序列识别号码分别是3,4)。
射后,进行scid(严重联合免疫缺陷)小鼠骨髓移植。 使用HCV阳性患者的血清,体外
进行人肝脏片段的病毒感染(US 5,849,987)。
HBV-AB17;每只小鼠总共给予40μg的mAb,连续给予两天(20μg/小鼠/天)。 在治
疗完成后1天,在小鼠的血清样品中确定HCV-RNA。 图5说明:HCV-AB 68能够同时
降低阳性小鼠百分比(从85%到42%)和平均病毒负荷(从3.1×104到1.0×104HCV RNA
拷贝/ml)。 而非相关人单克隆抗体HBV-AB17却没有显示出任何降低平均病毒负荷或者
阳性小鼠百分比的能力。 图6显示:HCV-AB 68在降低HCV阳性小鼠百分比和病毒负
荷方面是剂量依赖的。如治疗1天后的测量结果所示,5μg/小鼠的总剂量将病毒负荷从
4 4
4.2×10 降低到1.6×10HCV RNA拷贝/ml,并且将HCV-RNA阳性小鼠的百分比从71%
降低到43%。 最高剂量(60μg/小鼠)显示出最强的作用:病毒负荷降低了超过1-log系
4 3
数(从4.2×10 到3.1×10 拷贝/ml)而且HCV-阳性小鼠的百分比从71%降低到14%。
在治疗停止6天后,对于所有3种剂量,病毒负荷和HCV-阳性小鼠的百分比稍微反弹至
明显低于在未治疗组中看到的水平。 在该时间点,对于不同组的平均病毒负荷,仍然观
察到了用药反应行为。 感染抑制——这种方式证明了使用抗体来预防肝脏感染的能力。
6
将含有10HCV-RNA拷贝/ml的0.5ml人血清样品与200μg的HCV-AB68或者与不相关
的人抗-HBsAg单克隆抗体HBV-AB17预先培育(室温3小时),随后将其用于体外感染
正常人肝脏碎片。 感染发生以后,将该肝脏碎片移植到小鼠体内,并且在11或者15天
以后在血清中确定HCV-RNA。图7显示:通过测定平均病毒负荷和HCV-RNA阳性小鼠
的百分比表明HCV-AB 68在抑制HCV感染肝脏方面的作用。HCV-AB 68将这些HCV阳
4 3
性小鼠的百分比从75%降低到41%。 其同时将病毒负荷从2.2×10 降低到5.0×10HCV
RNA拷贝/ml小鼠血清。 而相等量(200μg)的不相关人单克隆抗体HBV-AB17,却既不
能降低阳性小鼠的百分比,也不能降低病毒负荷,这些结果与未治疗的对照组中所得到
的结果类似(图7)。 在一个不同的实验中,在移植后15天取样进行测量,结果表明:
HCV-AB 68能够将HCV阳性小鼠的百分比从76%降低到41%(p=0.05,n=17)并且
4 4
将平均病毒负荷从6.0×10 降低到1.1×10HCV RNA拷贝/ml(p=0.003)。
分比并且不能降低平均病毒负荷(图8B)。
Therapeutics,这是一种抑制HCV翻译的小分子)治疗。 第二组用HCV-AB68治疗。 第
三组用两者的组合治疗。第四组作为对照组,仅仅使用Dulbecco’s氏磷酸盐缓冲盐水。
在I70治疗组中,每只小鼠在肝脏移植后10-13天接受1mg的药物(0.25mg/小鼠/天,腹
膜内给予(i.p))。在HCV-AB 68治疗组中,每只小鼠在肝脏移植后12-13天接受40μg的
抗体(20μg/小鼠/天i.p.)。在组合组中,每只小鼠接受上述治疗的组合。在第14天(治
疗后一天),测定小鼠血清中的病毒负荷和HCV阳性小鼠的百分比。图9说明了使用药物
组合在治疗上的优势。 在治疗后1天进行的测量结果表明:使用I70进行治疗,将HCV
4 4
平均病毒负荷从4.72×10 降低到1.42×10 并且将HCV阳性小鼠的百分比从93%降低到
4
50%,而使用HCV-AB68进行治疗,将HCV平均病毒负荷降低到1.74×10 并且将HCV
3
阳性小鼠的百分比降低到50%。 组合治疗将病毒负荷降低到5.83×10 并且将HCV感染
动物的百分比降低到28%。