适合转基因棉花等外源基因检测的内标准基因及其应用转让专利
申请号 : CN200410016060.9
文献号 : CN1557966B
文献日 : 2010-05-05
发明人 : 张大兵 , 梁婉琪 , 贾军伟 , 苏振洪 , 杨立桃 , 丁嘉羽 , 翁海波 , 潘爱虎
申请人 : 上海市农业科学院生物技术研究中心
摘要 :
本发明涉及适合于转基因棉花、番茄、水稻、油菜外源基因定性、定量PCR检测及拷贝数分析的内标准基因及其应用。本发明依据内标准基因的种内非特异性、种间特异性、单拷贝或低拷贝数，通过生物信息学分析和分子生物学实验验证，在棉花、番茄、水稻和油菜中寻找到4个内标准基因，分别为棉花的SAD I、番茄的LAT52、水稻的SPS和油菜的HMG I/Y基因。应用PCR方法进行了这些内标准基因的检测灵敏度和精确度实验验证。同时依据这些内标准基因分别建立了转基因棉花、番茄、水稻和油菜外源基因的定性、定量PCR检测系统；根据内标准基因的恒定拷贝数，建立转基因水稻、油菜、棉花、番茄的外源基因拷贝数的荧光定量PCR检测分析平台。
权利要求 :
1.适合转基因棉花外源基因检测的内标准基因检测方法，针对该内标准基因序列设计定性、定量PCR检测的引物和探针，用于转基因棉花检测，其特征在于：所述的棉花内标准基因序列为如图2所示的长度107bp的sadI基因片段，定性、定量PCR检测的正向引物序列为5’CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA 3’，反向引物序列为5’TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC 3’，探针序列为5’TCACCCACTCCATGCCGCCTCACA 3’。
2.根据权利要求1所述的转基因棉花外源基因检测的内标准基因检测方法，特征在于所述的方法具备种间特异性，即在其他物种内没有该基因DNA片段。
3.根据权利要求1或2所述的转基因棉花外源基因检测的内标准基因检测方法，特征在于所述的方法特异性的扩增sadI基因的107bp的DNA片段。
4.权利要求1所述的适合于转基因棉花外源基因检测的内标准基因检测方法的应用，用于定性、定量检测转基因棉花的转基因成分。
5.权利要求4所述的适合于转基因棉花外源基因检测的内标准基因检测方法的应用，其特征在于用于分析外源基因在转基因棉花中的拷贝数。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种适合转基因棉花、番茄、水稻、油菜中外源基因定性、定量检测及拷贝数检测的内标准基因及其应用。属生物工程技术领域。
背景技术
以基因工程技术为核心的现代生物技术在20世纪广泛渗入农业，高科技改变了传统农业的研究和生产模式，为我们提供了更丰富的食品和医疗产品。以农业转基因技术研究和产业化最发达的美国为例，美国市场50％以上大豆、玉米、棉花等农作物是转基因品种。(一)转基因植物定性、定量检测中的内标准基因研究进展
针对消费者的需求，国际生物贸易和食品工业等部门对转基因产品逐步实施了IP管理(Identity Preservation)，确保转基因与非转基因农产品(如大豆和玉米)在生产和运送过程中分开处理。据不完全统计，目前国际上有30多个国家和地区要求对转基因产品进行标识。我国政府对于转基因产品生物安全管理工作十分重视，2001年5月23日，国务院发布了第304号令《农业转基因生物安全管理条例》，在该条例的第四章第二十八条明确规定了在中华人民共和国境内销售列入农业转基因生物目录的农业转基因生物，应当有明显的标识。
转基因产品标识制度依赖于对转基因产品的检测。转基因农产品的检测方法主要有两种，一种是基于DNA的检测方法，一种是基于蛋白质的免疫学检测方法。
实际检测工作中，基于DNA为基础的检测方法得到广泛使用。转基因农产品的检测过程涉及样本的采集、DNA抽提、定性PCR检测、定量PCR检测、作出结论等过程。转基因产品的检测可通过分析其引入DNA的序列来检测，实际检测工作中需要了解插入的DNA的一些信息或者可能的候选序列。转基因农产品的PCR检测主要采取的策略是检测一个或多个“通用的”转基因序列(通常是35s启动子、Nos终止子等)，然后检测一系列特异DNA序列。
欧盟和其他国家加强了对GMOs释放到环境中的监督管理，建立并强制实行了包含对GMOs产品的标签制度。自愿性的标签则根据产品中GMO的含量而定。因此通过DNA或蛋白质分析，对产品中GMO含量进行精确定量非常重要。从90年代初期开始，以PCR为基础的定量PCR技术得到迅猛发展。一般来说，定量PCR方法有三种类型：PCR-ELISA(PCR-Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)检测、竞争性定量PCR(Quantitative Competitive PCR，QC-PCR)和实时定量PCR(Real-time PCR)。由于PCR-ELISA和竞争性定量PCR方法在实际检测中有一定的局限性，因此没有得到广泛使用。
另外，在转基因产品检测工作中，需要使用内标准基因作为内源的参照，现在根据已有的报道，常用invertase基因作为转基因玉的内标准基因，lectin andβ-actin基因作为大豆的内标准基因。此外也有文献报道将5个拷贝的apx基因和拷贝数在1-2拷贝数之间的BnACCg8基因分别作为番茄和油菜的内标准基因。但是国际上有关转基因棉花、油菜、番茄和水稻定性和定量PCR检测的低拷贝，且拷贝数恒定的内标准分子还没有报道。
(二)转基因植物中外源基因拷贝数分析研究进展：
在转基因植物的研究和产业化过程中，从原始的众多转基因植物中筛选、检测到拷贝数低、遗传相对稳定的转基因植物的工作量很大，外源基因整合到植物的基因组中的拷贝数会严重影响转基因的表达水平以及后代的稳定表达。
转基因植物后代遗传不稳定是一个十分复杂的问题，很多转基因植物经过田间种植后，外源基因表达量低或不能表达，这种现象通常称为基因沉默(gene silencing)。大量研究证明许多因素都与基因沉默现象有关。现有研究结果普遍认为由于植物遗传转化中外源基因在植物体染色体上的整合具有很大的随机性，如外源基因插入到植物细胞的重要基因中，可能致死或失活，如在不同位点上或同一位点上插入多个外源基因时，基因失活的频率更高。
一般认为通过转基因技术，将外源DNA整合到宿主细胞的染色体上是外源蛋白质得以稳定表达的前提。而外源基因的这种整合可以是单拷贝或者多拷贝的，整合的拷贝数将影响重组蛋白的表达。因此，外源基因在宿主细胞中的拷贝数检测是转基因植物乃至植物功能基组研究的一个重要的技术环节目前，检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法有：
1，SB(Southern blot analysis)技术，该技术是一种在大多数实验室中普遍使用的测定拷贝数的标准方法，它是于1975年由英国分子生物学家E.M.Southern所发明的。其基本过程为：将一定量的DNA样品用适当的限制性内切酶切割成不同长度的DNA片段，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，电泳后的凝胶经碱变性处理，使DNA解离成单链，然后用毛细管虹吸法或电转移法，使凝胶上的单链DNA片段，按凝胶上相同的位置转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜，经适当洗涤、晾干。如果是硝酸纤维素膜，还要在75～80℃烤箱中加温2小时或经354nm紫外照射3～5分钟进行固定，即可用于杂交。
纯化的探针DNA一般用放射性同位素32P或生物素、地高辛配基等标记。杂交后的膜在暗盒中进行放射自显影后，即在一定的位置显示同标记探针特异地结合的阳性DNA条带。
该方法的主要优点是1)灵敏度高：在理想条件下，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也可以被清晰的检测出来。2)用途广泛：可以同时用于构建DNA的分子酶切图谱和遗传图谱。但是该方法费时，费力，需要大量的DNA样品，同时在操作过程往往需要接触对人体有害的放射性同位素。
2，毛细管电泳法(CE，capillary electrophoresis)
该技术是在90年代初发展起来的，它是一种通过PCR扩增，然后进行核酸定量分析的方法，在一定的范围内，紫外吸收值与相应的质浓度成线性关系，不需要特异性标记探针，还可以同时作PCR特征鉴定，对PCR混合物中各组分如核苷酸，引物，引物二聚体，异二聚体，非特异性产物进行观察。在毛细管电泳中，应用SDS缓冲液，以PCR混合物中每一组分单独进样校正洗脱时间，然后通过计算电泳图谱面积，直接定量PCR扩增产物。其主要优点是所需要的样品和试剂量低，且具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、分析时间短和易于实现自动化的特点。
但是以下一些因素将影响它的结果：1)PCR循环次数影响CE峰的形成，在PCR平台期易于形成杂交分子，增加新谱峰.2)进样方式：如电迁移进样，压力进样，可带来结果的偏差.3)电渗流的影响，在进样结束时电渗流会除去介面的部分样品分子，影响定量结果.
3，荧光原位杂交技术(FISH，fluorescence in situ hybridization)该技术是80年代末开始发展起来的，它结合了免疫荧光和分子杂交技术，是一项重要的非放射性标记原位杂交技术。其原理主要是：将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记，使标记的探针原位杂交到染色体切片上，再用与荧光素分子耦联的单克隆抗体与探针分子特异结合，经洗脱和与荧光标记的亲和性试剂共培养，在探针杂交位点便可见不连续的荧光信号。该方法具有如下优点：1)FISH操作简单、杂交速度快(一般2天内可完成)、标记探针稳定(一般标记后可使用两年)、结果直观、背景低，不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，且不需要放射性同位素；2)FISH可在同一次杂交中使用多个探针、进行多种颜色的分析；3)FISH既用于显示分列相，也可用于间期核，从而拓展了FISH应用范围；4)DNA序列能被定位在目标范围从载玻片上分散的中期细胞染色体到悬浮固定保存细胞三维结构的间期核中；5)快速而且精确的测定拷贝数，能在成分复杂的组织中进行单一细胞拷贝数的研究，而且可以在活组织检查的肿瘤切片上进行操作；6)特异性高，可以精确定位，可完整地保持组织与细胞的形态。
但是，同时FISH技术目前也存在一些问题。主要包括：1)FISH检测染色体异常时，仍然只能针对特定的一条或几条染色体；2)探针制备技术比较困难，探针的种类远远满足不了实际工作中无穷无尽变化的需要；3)FISH技术开展起来相对比较昂贵；4)FISH主要用于对植物DNA重复序列和多拷贝基因家族作图，而不适宜进行单拷贝基因的FISH，这是因为单拷贝基因大多检出率低，Gustafson等以0.7kb的单拷贝DNA序列作探针，检出率只有6％左右，并且在染色体上是单点检出，在如此低的检出率条件下，如果没有大量的样本群体和仔细的分析统计，很难区分信号点和背景杂点。
4，狭线转移杂交技术(slot blot analysis)该技术是Southern印迹杂交的基础上发展起来的快速检测特异核酸分子的核酸杂交技术。其基本步骤是：通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后再按如同Southern印迹杂交一样的方式同核酸探针分子进行杂交。由于在实验的加样过程中，使用了特殊设计的加样装置，使众多待测的核酸样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并且有规律的排列成线，因此得名。同时，该技术也可以用于核酸样品的定量检测，通过在实验中补加已知其浓度的靶核酸序列作为对照样品来检测核酸混合物中某种特殊DNA序列的相对含量，同时使用光密度测定法也可以对狭线印迹的相应杂交信号作定量分析。此方法具有简便，直观，快速，经济等优点，在一般实验室均可以进行。但是对待测DNA样品和标准对照质粒DNA样品的纯度要求很高，且要求含量测定要精确。
5，实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术是在1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时定量PCR中反应信号的检测贯穿于整个反应过程，最初DNA分子的量(N0)和Ct值之间的线性-对数关系可以通过下列公式来表示：Log(N0)＝a-b·Ct(a和b是常数)，可以通过标准曲线来计算.实时PCR定量的线性动力学范围为5～7个数量级，适于高通量和常规分析；通过对一个内源基因进行定量可以进行相对定量，无需对PCR产物进行分析；大大减少了PCR后污染的机会.文献中有关应用实时定量PCR检测技术研究的报导增长迅速.实时荧光PCR一般使用Ct(每个反应荧光信号达到设定域值所需要的循环数)定量，Ct与模板初始拷贝数的对数成线性关系.利用已知起始拷贝数的标准品可得到标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数.
以最常用的TaqMan方法为例，其工作原理为：在PCR扩增时，加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团，如FAM(6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处)等和一个淬灭荧光基团，如TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明，荧光发射峰值在582nm处)等，两者之间构成能量传递结构。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不出现荧光信号变化；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，使淬灭基团的淬灭作用被解除，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。其主要优点是：a.不需要进行PCR的后处理，最大限度的减少了操作过程中可能导致的污染；b.快速，便宜；c.避免使用具有危害的放射性同位素；d.仅需要少量的DNA样品；e.提供一个广泛的定量动力学范围，能对拷贝数差异较大的不同样品进行精确定量；f.由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。
针对消费者的需求，国际生物贸易和食品工业等部门对转基因产品逐步实施了IP管理(Identity Preservation)，确保转基因与非转基因农产品(如大豆和玉米)在生产和运送过程中分开处理。据不完全统计，目前国际上有30多个国家和地区要求对转基因产品进行标识。我国政府对于转基因产品生物安全管理工作十分重视，2001年5月23日，国务院发布了第304号令《农业转基因生物安全管理条例》，在该条例的第四章第二十八条明确规定了在中华人民共和国境内销售列入农业转基因生物目录的农业转基因生物，应当有明显的标识。
转基因产品标识制度依赖于对转基因产品的检测。转基因农产品的检测方法主要有两种，一种是基于DNA的检测方法，一种是基于蛋白质的免疫学检测方法。
实际检测工作中，基于DNA为基础的检测方法得到广泛使用。转基因农产品的检测过程涉及样本的采集、DNA抽提、定性PCR检测、定量PCR检测、作出结论等过程。转基因产品的检测可通过分析其引入DNA的序列来检测，实际检测工作中需要了解插入的DNA的一些信息或者可能的候选序列。转基因农产品的PCR检测主要采取的策略是检测一个或多个“通用的”转基因序列(通常是35s启动子、Nos终止子等)，然后检测一系列特异DNA序列。
欧盟和其他国家加强了对GMOs释放到环境中的监督管理，建立并强制实行了包含对GMOs产品的标签制度。自愿性的标签则根据产品中GMO的含量而定。因此通过DNA或蛋白质分析，对产品中GMO含量进行精确定量非常重要。从90年代初期开始，以PCR为基础的定量PCR技术得到迅猛发展。一般来说，定量PCR方法有三种类型：PCR-ELISA(PCR-Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)检测、竞争性定量PCR(Quantitative Competitive PCR，QC-PCR)和实时定量PCR(Real-time PCR)。由于PCR-ELISA和竞争性定量PCR方法在实际检测中有一定的局限性，因此没有得到广泛使用。
另外，在转基因产品检测工作中，需要使用内标准基因作为内源的参照，现在根据已有的报道，常用invertase基因作为转基因玉的内标准基因，lectin andβ-actin基因作为大豆的内标准基因。此外也有文献报道将5个拷贝的apx基因和拷贝数在1-2拷贝数之间的BnACCg8基因分别作为番茄和油菜的内标准基因。但是国际上有关转基因棉花、油菜、番茄和水稻定性和定量PCR检测的低拷贝，且拷贝数恒定的内标准分子还没有报道。
(二)转基因植物中外源基因拷贝数分析研究进展：
在转基因植物的研究和产业化过程中，从原始的众多转基因植物中筛选、检测到拷贝数低、遗传相对稳定的转基因植物的工作量很大，外源基因整合到植物的基因组中的拷贝数会严重影响转基因的表达水平以及后代的稳定表达。
转基因植物后代遗传不稳定是一个十分复杂的问题，很多转基因植物经过田间种植后，外源基因表达量低或不能表达，这种现象通常称为基因沉默(gene silencing)。大量研究证明许多因素都与基因沉默现象有关。现有研究结果普遍认为由于植物遗传转化中外源基因在植物体染色体上的整合具有很大的随机性，如外源基因插入到植物细胞的重要基因中，可能致死或失活，如在不同位点上或同一位点上插入多个外源基因时，基因失活的频率更高。
一般认为通过转基因技术，将外源DNA整合到宿主细胞的染色体上是外源蛋白质得以稳定表达的前提。而外源基因的这种整合可以是单拷贝或者多拷贝的，整合的拷贝数将影响重组蛋白的表达。因此，外源基因在宿主细胞中的拷贝数检测是转基因植物乃至植物功能基组研究的一个重要的技术环节目前，检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法有：
1，SB(Southern blot analysis)技术，该技术是一种在大多数实验室中普遍使用的测定拷贝数的标准方法，它是于1975年由英国分子生物学家E.M.Southern所发明的。其基本过程为：将一定量的DNA样品用适当的限制性内切酶切割成不同长度的DNA片段，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，电泳后的凝胶经碱变性处理，使DNA解离成单链，然后用毛细管虹吸法或电转移法，使凝胶上的单链DNA片段，按凝胶上相同的位置转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜，经适当洗涤、晾干。如果是硝酸纤维素膜，还要在75～80℃烤箱中加温2小时或经354nm紫外照射3～5分钟进行固定，即可用于杂交。
纯化的探针DNA一般用放射性同位素32P或生物素、地高辛配基等标记。杂交后的膜在暗盒中进行放射自显影后，即在一定的位置显示同标记探针特异地结合的阳性DNA条带。
该方法的主要优点是1)灵敏度高：在理想条件下，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也可以被清晰的检测出来。2)用途广泛：可以同时用于构建DNA的分子酶切图谱和遗传图谱。但是该方法费时，费力，需要大量的DNA样品，同时在操作过程往往需要接触对人体有害的放射性同位素。
2，毛细管电泳法(CE，capillary electrophoresis)
该技术是在90年代初发展起来的，它是一种通过PCR扩增，然后进行核酸定量分析的方法，在一定的范围内，紫外吸收值与相应的质浓度成线性关系，不需要特异性标记探针，还可以同时作PCR特征鉴定，对PCR混合物中各组分如核苷酸，引物，引物二聚体，异二聚体，非特异性产物进行观察。在毛细管电泳中，应用SDS缓冲液，以PCR混合物中每一组分单独进样校正洗脱时间，然后通过计算电泳图谱面积，直接定量PCR扩增产物。其主要优点是所需要的样品和试剂量低，且具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、分析时间短和易于实现自动化的特点。
但是以下一些因素将影响它的结果：1)PCR循环次数影响CE峰的形成，在PCR平台期易于形成杂交分子，增加新谱峰.2)进样方式：如电迁移进样，压力进样，可带来结果的偏差.3)电渗流的影响，在进样结束时电渗流会除去介面的部分样品分子，影响定量结果.
3，荧光原位杂交技术(FISH，fluorescence in situ hybridization)该技术是80年代末开始发展起来的，它结合了免疫荧光和分子杂交技术，是一项重要的非放射性标记原位杂交技术。其原理主要是：将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记，使标记的探针原位杂交到染色体切片上，再用与荧光素分子耦联的单克隆抗体与探针分子特异结合，经洗脱和与荧光标记的亲和性试剂共培养，在探针杂交位点便可见不连续的荧光信号。该方法具有如下优点：1)FISH操作简单、杂交速度快(一般2天内可完成)、标记探针稳定(一般标记后可使用两年)、结果直观、背景低，不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，且不需要放射性同位素；2)FISH可在同一次杂交中使用多个探针、进行多种颜色的分析；3)FISH既用于显示分列相，也可用于间期核，从而拓展了FISH应用范围；4)DNA序列能被定位在目标范围从载玻片上分散的中期细胞染色体到悬浮固定保存细胞三维结构的间期核中；5)快速而且精确的测定拷贝数，能在成分复杂的组织中进行单一细胞拷贝数的研究，而且可以在活组织检查的肿瘤切片上进行操作；6)特异性高，可以精确定位，可完整地保持组织与细胞的形态。
但是，同时FISH技术目前也存在一些问题。主要包括：1)FISH检测染色体异常时，仍然只能针对特定的一条或几条染色体；2)探针制备技术比较困难，探针的种类远远满足不了实际工作中无穷无尽变化的需要；3)FISH技术开展起来相对比较昂贵；4)FISH主要用于对植物DNA重复序列和多拷贝基因家族作图，而不适宜进行单拷贝基因的FISH，这是因为单拷贝基因大多检出率低，Gustafson等以0.7kb的单拷贝DNA序列作探针，检出率只有6％左右，并且在染色体上是单点检出，在如此低的检出率条件下，如果没有大量的样本群体和仔细的分析统计，很难区分信号点和背景杂点。
4，狭线转移杂交技术(slot blot analysis)该技术是Southern印迹杂交的基础上发展起来的快速检测特异核酸分子的核酸杂交技术。其基本步骤是：通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后再按如同Southern印迹杂交一样的方式同核酸探针分子进行杂交。由于在实验的加样过程中，使用了特殊设计的加样装置，使众多待测的核酸样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并且有规律的排列成线，因此得名。同时，该技术也可以用于核酸样品的定量检测，通过在实验中补加已知其浓度的靶核酸序列作为对照样品来检测核酸混合物中某种特殊DNA序列的相对含量，同时使用光密度测定法也可以对狭线印迹的相应杂交信号作定量分析。此方法具有简便，直观，快速，经济等优点，在一般实验室均可以进行。但是对待测DNA样品和标准对照质粒DNA样品的纯度要求很高，且要求含量测定要精确。
5，实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术是在1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时定量PCR中反应信号的检测贯穿于整个反应过程，最初DNA分子的量(N0)和Ct值之间的线性-对数关系可以通过下列公式来表示：Log(N0)＝a-b·Ct(a和b是常数)，可以通过标准曲线来计算.实时PCR定量的线性动力学范围为5～7个数量级，适于高通量和常规分析；通过对一个内源基因进行定量可以进行相对定量，无需对PCR产物进行分析；大大减少了PCR后污染的机会.文献中有关应用实时定量PCR检测技术研究的报导增长迅速.实时荧光PCR一般使用Ct(每个反应荧光信号达到设定域值所需要的循环数)定量，Ct与模板初始拷贝数的对数成线性关系.利用已知起始拷贝数的标准品可得到标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数.
以最常用的TaqMan方法为例，其工作原理为：在PCR扩增时，加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团，如FAM(6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处)等和一个淬灭荧光基团，如TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明，荧光发射峰值在582nm处)等，两者之间构成能量传递结构。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不出现荧光信号变化；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，使淬灭基团的淬灭作用被解除，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。其主要优点是：a.不需要进行PCR的后处理，最大限度的减少了操作过程中可能导致的污染；b.快速，便宜；c.避免使用具有危害的放射性同位素；d.仅需要少量的DNA样品；e.提供一个广泛的定量动力学范围，能对拷贝数差异较大的不同样品进行精确定量；f.由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。
发明内容
本发明目的在于：提供一种适合转基因棉花等外源基因检测的内标准基因及其应用。
本发明适合转基因棉花等外源基因检测的内标准基因，包含编码油菜高效移动蛋白HMGI/Y基因(high mobility group protein I/Y)、棉花内源基因SadI(stearoyl-ACP desaturase)、番茄内源基因Lat52和水稻SPS(sucrose phosphate synthase)基因，并根据这些内标准基因设计定性、定量PCR检测的外源基因的引物和探针，其中，所述HMGI/Y基因的长度为99个bp的DNA片段，SadI基因的长度为107个bp的DNA片段，Lat52基因的长度为92个bp的DNA片段，水稻SPS基因的长度为81bp的DNA片段。
其中，所述任一项的核苷酸序列具备种内一致性，即所有的油菜品种含有HMGI/Y基因，棉花品种含有SadI基因，番茄品种含有Lat52基因，水稻品种含有SPS基因。
所述任一项的核苷酸序列还具备种间特异性，即在其它物种里没有该基因或该DNA片段。
所述HMGI/Y基因在油菜基因组中的拷贝数是1；Lat52基因在番茄基因组中拷贝数是1；SadI基因在棉花基因组中是2拷贝；SPS基因在水稻基因组中是1拷贝。
利用这些内标准基因，并根据这些设计定性、定量PCR检测的外源基因的引物和探针，用于定性、定量检测转基因棉花、番茄、油菜和水稻转基因成分。
利用参照基因分析外源基因在转基因棉花、番茄、油菜和水稻中的拷贝数，利用实时荧光定量PCR技术，通过发掘新的棉花、水稻、油菜和番茄等内标准基因，建立一种快速、有效、高通量的转基因棉花、油菜、番茄和水稻中外源基因的拷贝数检测技术，利用该技术可以从众多转基因植物中高通量筛选低拷贝的转基因植物.同时，基于拷贝数快速筛选、鉴定研究，对转基因作物可进行快速育种.
利用内标准基因进行定量检测的方法：实时定量PCR技术主要通过标准曲线来确定样品中外源基因的拷贝数，同时确定样品中内标准基因的拷贝数。通过内外标准基因的比例来确定转基因成分在食品中的比例。
检测前先利用质粒标准分子(待扩增的外源和内源基因片段连接后构建在质粒载体上以便较准确绘出定量标准曲线)确定阳性标准品中内源基因和外源基因的相对比值(T/C；Target/control)值。
相对某一转基因作物品系来说，T/C值是一个比较稳定的系数。它反应了外源基因拷贝数与内源标准基因拷贝数之间的比值，主要是由仪器的性能决定的。如果定量PCR仪型号发生变动，则T/C值需要重新调校。
检测样品时，利用标准分子确定样品中外源基因和内标准基因的拷贝数的拷贝数，根据下列公式即可计算出样品中转基因成分的含量。
因此，选用具备种间特异性，种内一致性，在基因组中拷贝数较低(几个拷贝或者单拷贝)的内标准基因在整个定量过程中显得尤为重要。
本发明是根据内标准基因的三个主要特征，即：种内非特异性、不同种间的特异性、单拷贝或低拷贝数，利用生物信息学、GENBANK和EMBL等数据库、分子生物学实验技术在棉花、番茄、水稻、油菜中寻找到四个内标准基因，分别为棉花的内标准基因SAD I、番茄的内标准基因LAT52、水稻的内标准基因SPS、油菜的内标准基因HMGI/Y。
从上述获得的棉花的内标准基因SAD I、番茄的内标准基因LAT52、水稻的内标准基因SPS、油菜的内标准基因HMG I/Y，设计GC比含量相当和扩增片段大小相近的Taqman引物和探针，并且优化最佳反应条件和反应体系。
优化实验条件及体系，建立转基因棉花、油菜、番茄、水稻中外源基因外源基因拷贝数的检测系统。
优化实验条件及体系，建立转基因棉花、油菜、番茄、水稻中外源基因(如抗生素标记基因)的定性，定量PCR检测系统。
本发明的优越性在于根据内标准基因的三个主要特征：种内非特异性、不同种间的特异性、单拷贝或低拷贝数，利用生物信息学、GENBANK和EMBL等数据库、分子生物学实验技术在棉花、番茄、水稻、油菜中寻找到4个内标准基因，分别为棉花的内标准基因SAD I、番茄的内标准基因LAT52、水稻的内标准基因SPS和油菜的内标准基因HMGI/Y。通过实时定量PCR进行了这些内源基因的灵敏度和精确度试验。同时利用内标准基因作为转基因作物拷贝数恒定的内源参照基因建立转基因棉花、油菜、番茄和水稻中外源基因拷贝数检测的高通量、快速的荧光定量PCR分析技术。同时也利用内标准基因建立适合于转基因棉花、油菜、番茄和水稻中的外源基因的定性、定量PCR检测方法。
本发明适合转基因棉花等外源基因检测的内标准基因，包含编码油菜高效移动蛋白HMGI/Y基因(high mobility group protein I/Y)、棉花内源基因SadI(stearoyl-ACP desaturase)、番茄内源基因Lat52和水稻SPS(sucrose phosphate synthase)基因，并根据这些内标准基因设计定性、定量PCR检测的外源基因的引物和探针，其中，所述HMGI/Y基因的长度为99个bp的DNA片段，SadI基因的长度为107个bp的DNA片段，Lat52基因的长度为92个bp的DNA片段，水稻SPS基因的长度为81bp的DNA片段。
其中，所述任一项的核苷酸序列具备种内一致性，即所有的油菜品种含有HMGI/Y基因，棉花品种含有SadI基因，番茄品种含有Lat52基因，水稻品种含有SPS基因。
所述任一项的核苷酸序列还具备种间特异性，即在其它物种里没有该基因或该DNA片段。
所述HMGI/Y基因在油菜基因组中的拷贝数是1；Lat52基因在番茄基因组中拷贝数是1；SadI基因在棉花基因组中是2拷贝；SPS基因在水稻基因组中是1拷贝。
利用这些内标准基因，并根据这些设计定性、定量PCR检测的外源基因的引物和探针，用于定性、定量检测转基因棉花、番茄、油菜和水稻转基因成分。
利用参照基因分析外源基因在转基因棉花、番茄、油菜和水稻中的拷贝数，利用实时荧光定量PCR技术，通过发掘新的棉花、水稻、油菜和番茄等内标准基因，建立一种快速、有效、高通量的转基因棉花、油菜、番茄和水稻中外源基因的拷贝数检测技术，利用该技术可以从众多转基因植物中高通量筛选低拷贝的转基因植物.同时，基于拷贝数快速筛选、鉴定研究，对转基因作物可进行快速育种.
利用内标准基因进行定量检测的方法：实时定量PCR技术主要通过标准曲线来确定样品中外源基因的拷贝数，同时确定样品中内标准基因的拷贝数。通过内外标准基因的比例来确定转基因成分在食品中的比例。
检测前先利用质粒标准分子(待扩增的外源和内源基因片段连接后构建在质粒载体上以便较准确绘出定量标准曲线)确定阳性标准品中内源基因和外源基因的相对比值(T/C；Target/control)值。
相对某一转基因作物品系来说，T/C值是一个比较稳定的系数。它反应了外源基因拷贝数与内源标准基因拷贝数之间的比值，主要是由仪器的性能决定的。如果定量PCR仪型号发生变动，则T/C值需要重新调校。
检测样品时，利用标准分子确定样品中外源基因和内标准基因的拷贝数的拷贝数，根据下列公式即可计算出样品中转基因成分的含量。
因此，选用具备种间特异性，种内一致性，在基因组中拷贝数较低(几个拷贝或者单拷贝)的内标准基因在整个定量过程中显得尤为重要。
本发明是根据内标准基因的三个主要特征，即：种内非特异性、不同种间的特异性、单拷贝或低拷贝数，利用生物信息学、GENBANK和EMBL等数据库、分子生物学实验技术在棉花、番茄、水稻、油菜中寻找到四个内标准基因，分别为棉花的内标准基因SAD I、番茄的内标准基因LAT52、水稻的内标准基因SPS、油菜的内标准基因HMGI/Y。
从上述获得的棉花的内标准基因SAD I、番茄的内标准基因LAT52、水稻的内标准基因SPS、油菜的内标准基因HMG I/Y，设计GC比含量相当和扩增片段大小相近的Taqman引物和探针，并且优化最佳反应条件和反应体系。
优化实验条件及体系，建立转基因棉花、油菜、番茄、水稻中外源基因外源基因拷贝数的检测系统。
优化实验条件及体系，建立转基因棉花、油菜、番茄、水稻中外源基因(如抗生素标记基因)的定性，定量PCR检测系统。
本发明的优越性在于根据内标准基因的三个主要特征：种内非特异性、不同种间的特异性、单拷贝或低拷贝数，利用生物信息学、GENBANK和EMBL等数据库、分子生物学实验技术在棉花、番茄、水稻、油菜中寻找到4个内标准基因，分别为棉花的内标准基因SAD I、番茄的内标准基因LAT52、水稻的内标准基因SPS和油菜的内标准基因HMGI/Y。通过实时定量PCR进行了这些内源基因的灵敏度和精确度试验。同时利用内标准基因作为转基因作物拷贝数恒定的内源参照基因建立转基因棉花、油菜、番茄和水稻中外源基因拷贝数检测的高通量、快速的荧光定量PCR分析技术。同时也利用内标准基因建立适合于转基因棉花、油菜、番茄和水稻中的外源基因的定性、定量PCR检测方法。
附图说明
附图1，HCMI/Y片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针
核苷酸序列和位置。
附图2，SadI片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。
图3，LAT52片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。
图4，SPS片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。
图5，HMGI/Y种内非特异性鉴定结果照片。
图6，SADI种内非特异性鉴定结果照片。
图7，LAT52种内非特异性鉴定结果照片。
图8，SPS种内非特异性鉴定结果照片。
图9HMGI/Y种间特异性鉴定结果照片。
图10HMGI/Y芸薹属内特异性鉴定结果照片。
图11SADI种间特异性鉴定结果照片。
图12LAT52种间特异性鉴定结果照片。
图13SPS种间特异性(禾本科内)鉴定结果照片。
图14SPS种间特异性鉴定结果照片。
图15.SADI定性PCR检测灵敏度照片。
图16SPS定性检测灵敏度照片。
图17HMGI/Y定量灵敏度检测结果。
图18SADI定量灵敏度检测结果。
图19SPS定量灵敏度检测结果。
图20Southern-Blot分析内标准基因的拷贝数照片。
核苷酸序列和位置。
附图2，SadI片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。
图3，LAT52片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。
图4，SPS片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。
图5，HMGI/Y种内非特异性鉴定结果照片。
图6，SADI种内非特异性鉴定结果照片。
图7，LAT52种内非特异性鉴定结果照片。
图8，SPS种内非特异性鉴定结果照片。
图9HMGI/Y种间特异性鉴定结果照片。
图10HMGI/Y芸薹属内特异性鉴定结果照片。
图11SADI种间特异性鉴定结果照片。
图12LAT52种间特异性鉴定结果照片。
图13SPS种间特异性(禾本科内)鉴定结果照片。
图14SPS种间特异性鉴定结果照片。
图15.SADI定性PCR检测灵敏度照片。
图16SPS定性检测灵敏度照片。
图17HMGI/Y定量灵敏度检测结果。
图18SADI定量灵敏度检测结果。
图19SPS定量灵敏度检测结果。
图20Southern-Blot分析内标准基因的拷贝数照片。
具体实施方式
实验过程
(一).实验材料
1，非转基因植物：
非转基因棉花，如：GK12、SGK321、GK19、GK22、9409、苏棉310、保铃棉1560BG、保铃棉DP410B、保铃棉32B、保铃棉33B、保铃棉99B、显性无腺体、徐州142、中棉所常规棉、中棉30等。
非转基因水稻，如：寒丰，农虎6号，9520，秀水04，申香粳6号，太湖糯，20566，D5黑河爱晖，C43βg94-1，C26PR106，D20BaSmati，C21中育早18，D57kholt marshi，P2C1花育一号等。
非转基因番茄，如：871、1687、1685、1866、1867、822、丽春、西粉一号、西粉二号、西粉三号、西粉五号、西粉八一号、毛红801、毛G1号、毛粉802、早丰、中丰、早魁、红杂14号、红杂16号、红杂18号、红杂20号、红杂25号等。
非转基因油菜，如：沪油12、沪油50、安437、苏991246、苏97-2126、苏油1号、浙双758、嘉兴9308、中双6号、华农大-1以及欧洲品种PGCP15、PGCH23、PGCH55、PGCH57、PGCH58等.
其他常见的作物，如：锦葵科的向日葵；茄科的马铃薯、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的大麦、小麦、玉米；十字花科的拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜。
2、酶与试剂
植物材料DNA提取试剂盒为上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的食品DNA抽提试剂盒。
限制性内切酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶及其缓冲液购自TakarapGEM-7Zf(+)/Hae IIIMarkers、λDNA/EcoR+Hind III Markers、DL2000Marker购自华美生物工程公司。
TaqMan探针及引物由上海申友生物技术公司合成
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
3、实验仪器
DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)
PTC-100型PCR扩增仪(MJ Research Inc.)
Rotor-Gene 2000定量PCR仪(Corbett Research，Australia)
BECKMAN公司的DUR640核酸和蛋白分析仪
DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)
DNA电泳分析系统包括暗箱、数码照相机、计算机、扫描仪、喷墨打印机、光敏打印机、Tianon UV-2000紫外分析仪、Gis凝胶图象分析
软件(上海天能公司)
其他仪器包括：离心机，恒温水浴锅，培养箱，天平等。
(二).实验方法及过程
1.候选内标准基因的查找
转基因植物PCR检测中需要使用的内标准基因必须符合3个条件：种内非特异性、种间特异性、低拷贝性(为提高检测灵敏度，最好为单拷贝基因)。首先通过查阅文献来选取相应的单拷贝基因，其次通过网上BLAST来确定该基因与其他作物的同源性，最后通过定量与定性PCR检测和Southern检测来确定该内标准基因的可用性。
2.植物DNA的提取与检测
1)植物DNA的提取
a)取适量的水稻样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约70mg-100mg磨碎的样品转入1.5ml的Eppendorf管中；
b)视材料量的多少，加入600-700μl已预热的Buffer A，轻轻混匀后，65℃水浴保温1小时，期间间或振荡混匀；
c)在管中加入等体积酚/氯仿(600-700μl)，上下颠倒充分混匀，静置抽提10min；
d)12000rpm×10分钟离心，吸取上清到一新的Eppendorf管中；
e)加入与上清等体积的异丙醇(约600μl)，混匀，常温放置10min后，12000×g离心10min，去上清，保留沉淀；
f)在沉淀中加入60μl TER，37℃放置2min后用枪头将其充分混匀后，于37℃放置约1小时；
g)取出后补加140μl TE，再加入200μl酚/氯仿，混匀，静置片刻；
h)12000rpmg×5min离心，取上清(约180μl)，加入1/10体积3M NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；
i)12000rpm×10min离心，去上清，加75％乙醇200μl，12000rpm×5min离心，弃上清，室温晾干，溶于50μl无菌ddH20中。
2)DNA检测：取3μl提取的DNA溶液电泳，选用的电泳胶为1％的琼脂糖凝胶，根据其亮度和扩散程度来判断DNA的质量。利用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度与纯度。
3.内标准基因及外源基因引物、探针的设计
利用Primer Primier5.0和Beacon Designer2.0软件设计针对油菜，棉花，番茄，水稻内标准基因以及外源HPT，GUS，NPTII基因的特异性引物和探针。引物和探针设计时尽量使他们的动力学性质相似，采取的原则是不发生错配、尽可能的减少引物自身及相互间形成引物二聚体的可能，选择3’端稳定性较5’端稳定性低的引物，引物的GC％为40％～65％，Tm值在50℃-65℃，此外探针的Tm值应高于引物的Tm值约10℃。根据上述原则选择合适的引物和探针，必要时适当地进行修改，见下列表1、表2。
表1为定性、定量PCR检测的内标准基因的引物和探针序列。
表2为定性、定量PCR检测的外源基因的引物和探针序列。
表1
表2
4.内标准基因的定性检测鉴定
1)内标准基因种内非特异性鉴定
HMGI/Y种内非特异性鉴定：以国产非转基因品种沪油12、沪油50、安437、苏991246、苏97-2126、.苏油1号、浙双758、嘉兴9308、中双6号、华农大-1以及欧洲品种PGCP15、PGCH23、PGCH55、PGCH57、PGCH58基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的HMCF/HMCR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SadI种内非特异性鉴定：以GK12、SGK321、GK19、GK22、9409、苏棉310、保铃棉1560BG、保铃棉DP410B、保铃棉32B、保铃棉33B、保铃棉99B、显性无腺体、徐州142、中棉所常规棉、中棉30基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的SADF/SADR引物对进行PCR扩增反应，其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
Lat52种内非特异性鉴定：以番茄品种871、1687、1685、1866、1867、822、丽春、西粉一号、西粉二号、西粉三号、西粉五号、西粉八一号、毛红801、毛G1号、毛粉802、早丰、中丰、早魁、红杂14号、红杂16号、红杂18号、红杂20号、红杂25号基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的LATF/LATR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SPS种内非特异性鉴定：以水稻品种寒丰，农虎6号，9520，秀水04，申香粳6号，太湖糯，20566，D5黑河爱晖，C43g94-1，C26 PR106，D20BaSmati，C21中育早18，D57kholt marshi，P2C1花育一号基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的SPSF/SPSR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测.
2)内标准基因种间特异性鉴定
HMGI/Y种间特异性鉴定：取十字花科的油菜、拟南芥，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的萝卜，豆科的扁豆、角豆，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、大豆、小麦、大麦的基因组DNA为PCR反应为模板，取十字花科芸苔属内种大白菜、小白菜、甘蓝、花椰菜的基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的HMCF/HMCR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SadI种间特异性鉴定：选用锦葵科的棉花、向日葵；茄科的马铃薯，番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜基因组DNA作为PCR反应膜板，选用相应的SADF/SADR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
Lat52种间特异性鉴定：取十字花科的油菜、拟南芥，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的萝卜，豆科的扁豆、角豆、大豆、，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、小麦、大麦的基因组DNA为PCR反应为模板，选用相应的LATF/LATR引物对进行PCR扩增反应，其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SPS种间特异性鉴定：选用锦葵科的棉花、向日葵；茄科的番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；豆科的大豆、绿豆、禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；胡萝卜基因组DNA作为PCR反应膜板，选用相应的SPSF/SPSR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
5.内标准基因的定量检测鉴定
1)定量反应体系的优化建立
为了获得高效灵敏的定量PCR反应系统，我们设计了不同引物探针浓度(引物初始浓度为25pM，探针初始浓度为10pM)比例的定量PCR反应体系(见表3)，通过相同的定量PCR反应条件，筛选荧光值上升较快，荧光信号强并且反应重复性好的体系作为定量检测的反应体系。
表3为优化定量反应体系不同引物探针浓度表(单位：ul)。
表3单位：ul
2)内标准基因种内非特异性鉴定
HMGI/Y种内非特异性鉴定：以国产非转基因品种沪油12、沪油50、安437、苏991246、苏97-2126、.苏油1号、浙双758、嘉兴9308、中双6号、华农大-1以及欧洲品种PGCP15、PGCH23、PGCH55、PGCH57、PGCH58基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的HMCF/HMCR引物对和HCM PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
SadI种内非特异性鉴定：以GK12、SGK321、GK19、GK22、9409、苏棉310、保铃棉1560BG、保铃棉DP410B、保铃棉32B、保铃棉33B、保铃棉99B、显性无腺体、徐州142、中棉所常规棉、中棉30基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的SADF/SADR引物对和SAD PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
Lat52种内非特异性鉴定：以番茄品种871、1687、1685、1866、1867、822、丽春、西粉一号、西粉二号、西粉三号、西粉五号、西粉八一号、毛红801、毛G1号、毛粉802、早丰、中丰、早魁、红杂14号、红杂16号、红杂18号、红杂20号、红杂25号基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的LATF/LATR引物对和LAT PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
SPS种内非特异性鉴定：以水稻品种寒丰，农虎6号，9520，秀水04，申香粳6号，太湖糯，20566，D5黑河爱晖，C43βg94-1，C26PR106，D20BaSmati，C21中育早18，D57kholt marshi，P2C1花育一号基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的SPSF/SPSR引物对和SPS PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环.
3)内标准基因种间特异性鉴定
HMGI/Y种间特异性鉴定：取十字花科的油菜、拟南芥，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的萝卜，豆科的扁豆、角豆，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、大豆、小麦、大麦的基因组DNA为PCR反应为模板，取十字花科芸苔属内种大白菜、小白菜、甘蓝、花椰菜的基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的HMCF/HMCR引物对和HCM PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94变性30秒，60退火20秒，72延伸30秒；共进行45个循环。
SadI种间特异性鉴定：选用锦葵科的棉花、向日葵；茄科的马铃薯，番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜基因组DNA作为PCR反应膜板，选用相应的SADF/SADR引物对和SAD PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
Lat52种间特异性鉴定：取十字花科的油菜、拟南芥，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的萝卜，豆科的扁豆、角豆、大豆、，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、小麦、大麦的基因组DNA为PCR反应为模板，选用相应的LATF/LATR引物对和LAT PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
SPS种间特异性鉴定：选用锦葵科的棉花、向日葵；茄科的番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；豆科的大豆、绿豆、禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；胡萝卜基因组DNA作为PCR反应膜板，选用相应的SPSF/SPSR引物对和SPS PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，5℃退火30秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
6.内标准基因定性、定量检测灵敏度和精确度实验
1)内标准基因定性检测灵敏度
SadI定性PCR检测灵敏度：非转基因棉花DNA以TE稀释为下列浓度：100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.01，0.001ng/μl，每个定性PCR反应取1μl，使反应中的DNA含量分别为100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.01，0.001ng。利用相应的SADF/SADR引物对和定性鉴定的反应条件进行PCR反应，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SPS定性检测灵敏度：非转基因水稻DNA以TE稀释为下列浓度：500、50、5、0.5、0.05、0.005ng/l，每个定性PCR反应取1μl，使反应中的DNA含量分别为500，50，5，0.5，0.05，0.005ng。利用相应的SPSF/SPSR引物对和定性鉴定的反应条件进行PCR反应，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
2)内标准基因定量检测灵敏度
SadI定量检测灵敏度：非转基因棉花DNA以TE稀释为下列浓度：100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，使反应中的DNA含量分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001ng.利用相应的SADF/SADR引物对和SAD PROBE利用定量鉴定的反应条件和体系进行定量PCR反应。
SPS定量检测灵敏度：非转基因水稻DNA以TE稀释为下列浓度：50、5、0.5、0.05、0.005、0.0025ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，使反应中的DNA含量分别为50，5，0.5，0.05，0.005，0.0025ng。利用相应的SPSF/SPSR引物对和SPS PROBE利用定量鉴定的反应条件和体系进行定量PCR反应。
3)内标准基因定量检测重复性和重演性实验
上述油菜，棉花，番茄，SPS内标准基因定量灵敏度检测实验进行三次重复实验。
7.Southern检测鉴定内标准基因的拷贝数
1)非转基因油菜、棉花、番茄，水稻基因组DNA的提取
用CTAB法抽提油菜、棉花、番茄和水稻的DNA，具体方法如下所示：取40g材料在液氮中磨成粉末。将所得粉末移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，立即加入20ml预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀，65℃水浴保温15-30分钟，期间轻轻摇动。混合物冷却后加入等体积的的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻摇使管内混合物成乳浊液，室温12000转离心10分钟，取上清加入0.01体积的RNAase贮液，混匀后37℃保温30分钟。加入0.7体积的异丙醇室温沉淀15分钟，用玻璃钩钩出白色絮状沉淀，放入76％乙醇、0.2M NaAc的溶液中冰上放置20分钟，再将沉淀转移至70％乙醇中旋转5分钟，离心弃上清，再加入70％乙醇。将DNA转移至另一干净管中，空气干燥15分钟，加入适量TE溶解。4℃储存备用。
2)基因组DNA的纯化
将上述DNA溶液加入等体积水稀释后再加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(PH＝5.2)，温和地混匀，-20℃静置沉淀4小时，13000转，4℃离心20分钟。沉淀用70％的乙醇洗涤后冻干溶解于无菌重蒸水中，用紫外分光光度计测定其浓度及纯度。
3)非转基因油菜、棉花、番茄，水稻基因组DNA酶切、电泳、变性、中和和转膜。
酶切：取油菜、棉花、番茄基因组DNA 10μg用EcoRI(Takara公司)酶切，水稻基因组DNA 10μg用HindIII(Takara公司)酶切，一次加入10×Buffer10μl，限制性内切酶5μl，用无菌水补至100μl，混合均匀后37℃酶切过夜(10-12小时)；微型凝胶电泳酶切鉴定，若呈现一条连续地的、荧光由深至浅的均匀条带，则说明酶切结果良好。
电泳：凝胶制备采用0.8％琼脂糖，电泳采用1V/cm，电泳约10-12小时或者过夜。
变性：将凝胶置于变性溶液(含1.5M NaCl，0.5M NaOH)中于旋转平台上振摇浸泡45分钟使DNA变性，之后用重蒸水大致漂洗凝胶
中和：将凝胶置于中和液(1M Tris-HCl(Ph 7.4)，1.5M NaCl)中于旋转平台上振摇中和，15分钟以后更换一次中和液继续温和震荡30分钟。
转膜：准备一张Whatman滤纸包住一个玻璃平板，将其放于一方磁盘中的平台上，使滤纸下缘浸入转移缓冲液(10×SSC)中.待滤纸全部浸透后用玻璃棒赶走滤纸与玻璃板之间的气泡.裁出一张稍大于凝胶的硝酸纤维素虑膜，用重蒸水彻底浸润后改用20×SSC浸泡5分钟以上.在虑膜上做与凝胶相应的标记.从中和液中取出凝胶，背面朝上放在平台上湿的3MM滤纸上，并赶走气泡.用保鲜膜盖住凝胶四周以防盘内液体直接从边缘渗透到上层纸巾.将浸润的硝酸纤维素膜覆盖住凝胶并赶走气泡，其上再盖上两张与凝胶大小相同并用2×SSC浸润的的3MM滤纸并赶走气泡.最后再在上面放一厚叠裁好的纸巾，纸巾上压一块玻璃板，板上压一重物(如500克的砝码)以形成液体自流池经凝胶向硝酸纤维素膜上行的流路，使凝胶中变性的DNA被洗脱迁移并吸附至纤维素滤膜上.维持液体毛细迁移8-24小时后，每当纸巾浸湿后须更换纸巾.
烤膜：转移结束后揭去纸巾及上面的3MM滤纸，翻转凝胶和纤维素滤膜，放在一张干的3MM滤纸上。用铅笔透过凝胶标记出加样孔在纤维素膜上的位置，之后剥离弃掉凝胶。用6×SSC溶液室温浸泡滤膜5分钟以除去滤膜上沾有的凝胶碎片。取出滤膜置纸巾上室温晾干30分钟以上，之后用两张3MM滤纸夹住滤膜在真空炉中80℃干烤2小时。
4)用于Southern印迹分析的DNA探针的标记，杂交，洗膜，显影
预杂交：按每平方厘米硝酸纤维素滤膜0.2毫升用量配制适量SDS-磷酸预杂交液。将烤干的滤膜浮于6×SSC液面上待其完全湿润后沉入液面内泡2分钟。然后将湿滤膜装入杂交桶中中，加入配好的预杂交液，赶尽滤膜与瓶壁接触处的气泡，置42℃杂交炉中2小时。
探针标记：用随机引物法标记探针，试剂盒为Takara公司产品。以定性检测PCR扩增产物为模板，制备32P标记的探针。具体方法为：取2.5ng模板DNA和2μl随机引物补水至终体积为，95℃变性5分钟，迅速冰浴5分钟，然后依次加入2.5μl缓冲液，2.5μl dNTP溶液，1μl Klenow酶(约5U)和3μl[α-32P]dCTP，总体积为25μl，充分混匀后于37℃反应30分钟以上，95℃变性探针5分钟，置于冰上约5分钟后，加入预杂交液中按所需的杂交温度进行杂交反应18-24小时。
洗膜：杂交完毕后取出杂交桶，倒弃杂交液至废物缸中，往杂交桶中倒入一定量的0.2*SSC/0.1％SDS洗膜液，在室温下轻轻振荡5-10分钟，期间用monitor检测杂交信号，更换洗膜液，直至背景信号基本洗净，随后取出滤膜放于纸巾上吸去大部分液体。
压片：滤膜外包裹一张保鲜膜，放入曝光夹中压入X光片及增感屏，置-70℃曝光适当时间(几小时至几天)。
显影：在暗室中将X光片放入显影液内，轻轻晃动约5-10分钟，待出现相应的图象结果后，将X光片转入定影液中定影，即得最终的Southern结果
(三).实验结果
1.候选内标准基因的查找及网上Blast结果
根据T.Masek，et al(2000)的报道，编码油菜high-mobility-group HMGI/Y protein的HCMI/Y基因为一单拷贝内源基因(GeneBank N0.AF127919)，所选择的DNA序列见附图1。图1HCMI/Y片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。其中，加下划线部分为PCR引物位置，粗体部分为定量PCR探针位置。
将该基因在GENEBANK上分析结果表明：找不到连续50bp与其同源的DNA的DNA片段，我们选择了417-559之间长度为99个bp的特异性DNA片段作为内标。
根据Qin Liu，et al的报道，编码棉花stearoyl-ACPdesaturase的SAD1基因为一单拷贝内源基因(Genebank No.X95988)，我们选择的DNA序列见图2，图2SadI片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。其中，加下划线部分为PCR引物位置，粗体部分为定量PCR探针位置。
将该基因在GENEBANK上进行BLAST，结果发现，找不到连续50bp与其同源的DNA的DNA片段，我们选择了4834-4940之间长度为107个bp的特异性DNA片段作为内标。
根据Twell D.，et al(1989)的报道，番茄的LAT52基因为一单拷贝内源基因(GeneBank NO.19263)，所选择的DNA序列见附图3。图3LAT52片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。其中，加下划线部分为PCR引物位置，粗体部分为定量PCR探针位置。
将该基因在GENEBANK上进行BLAST，结果发现，找不到连续50bp与其同源的DNA的DNA片段，我们选择了1385-1476之间长度为92个bp的特异性DNA片段作为内标。
根据Juan Jose Valdez-Alarcon et al(1996)的报道，编码水稻sucrose phosphate synthase的SPS基因为一单拷贝内源基因(GeneBank NO.U33175)，所选择的DNA序列为见附图4。图4SPS片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。其中，加下划线部分为PCR引物位置，粗体部分为定量PCR探针位置。
将该基因在GENEBANK上进行BLAST，结果发现，在800bp-1600bp为水稻特异性片段，我们在1055-1135bp处设计相应的引物和探针。
2.内标准基因的定性检测鉴定
1)内标准基因种内非特异性鉴定
HMGI/Y种内非特异性鉴定：不同品种的油菜在设计的特异性HMCF/HMCR引物的PCR扩增反应中，PCR反应产物电泳显示在15个不同品种中都能扩增出大小为146bp、专一的条带，条带大小与预期的一致。说明在油菜的不同品种中都含有候选基因HMCI/Y；从而说明油菜HMCI/Y基因具有种内的非特异性。如图5，图5HMGI/Y种内非特异性鉴定结果照片。其中，1.沪油12；2.沪油50；3.安437；4.苏991246；5.苏97-2126；6.苏油1号；7.浙双758；8.嘉兴9308；9.中双6号；10.华农大-1；11.PGCP15；12.PGCH23；13.PGCH55；14.PGCH57；15.PGCH58；MW表示pGEM-7Zf(+)/Hae III。
SADI种内非特异性鉴定：不同品种的水稻在设计的特异性SADF/SADR引物的PCR扩增反应中，PCR反应产物电泳显示在15个不同品种中都能扩增出大小为107bp、专一的条带，条带大小与预期的一致。说明在棉花的不同品种中都含有候选基因SADI；从而说明棉花SADI基因具有种内的非特异性。见图6，图6SADI种内非特异性鉴定结果照片。M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1.为空白对照；2.GK12；3.SGK321；4.GK19；5.GK22；6.9409；7.苏棉310；8.保铃棉1560BG；9.保铃棉DP410B；10.保铃棉32B；11.保铃棉33B；12.保铃棉99B；13.显性无腺体；14.徐州142；15.中棉所常规棉；16.中棉30。
LAT52种内非特异性鉴定：不同品种的番茄在设计的特异性LATF/LATR引物的PCR扩增反应中，PCR反应产物电泳显示在23个不同品种中都能扩增出大小为92bp、专一的条带，条带大小与预期的一致。说明在番茄的不同品种中都含有候选基因LAT52；从而说明番茄LAT52基因具有种内的非特异性。见图7，图7LAT52种内非特异性鉴定结果。其中，M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1.为空白对照；2.871；3.1687；4.1685；5.1866；6.1867；7.822；8.丽春；9.西粉一号；10.西粉二号；11.西粉三号；12.西粉五号；13.西粉八一号；14.毛红801；15.毛G1号；16.毛粉802；17.早丰；18.中丰；19.早魁；20.红杂14号；21.红杂16号；22.红杂18号；23.红杂20号；24.红杂25号。
SPS种内非特异性鉴定：不同品种的水稻在设计的特异性SPSF/SPSR引物的PCR扩增反应中，PCR反应产物电泳显示在15个不同品种中都能扩增出大小为81bp、专一的条带，条带大小与预期的一致.说明在水稻的不同品种中都含有候选基因SPS；从而说明水稻SPS基因具有种内的非特异性.见图8.图8SPS种内非特异性鉴定结果.其中，M表示MARKER，1.寒丰(晚粳中熟)；2.农虎6号(晚粳迟熟)；3.9520(晚粳早熟)；4.秀水04(晚粳中熟)；5.申香粳；6.号(中粳中熟，香稻)；7.太湖糯(晚粳糯)；8.20566(日本稻粳稻)；9.D5黑河爱晖(籼稻)；10.C43βg94-1(籼稻)；11.C26PR106(籼稻)；12.D20BaSmati(籼稻，爪哇型)；13.C21中育早18(籼稻)；14.D57kholt marshi(籼稻)；15.P2C1花育一号(粳稻)。2)内标准基因种间特异性鉴定
HMGI/Y种间特异性鉴定：常见的植物和与油菜亲缘关系较近的植物(十字花科的油菜、拟南芥、大白菜、小白菜、甘蓝、花椰菜，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的胡萝卜，豆科的扁豆、角豆，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、大豆、小麦、大麦)在特异性引物的PCR扩增反应中，PCR产物电泳分析显示在常见植物和亲缘关系较近的植物中没有扩增出特异性的条带，而阳性样品中有大小为146bp、专一的条带，说明在常见的植物和与油菜亲缘关系较近的植物中不含有油菜的HMC基因和与油菜HMC基因同源性较高的基因。因此，证明油菜HMC基因具有种间的特异性。见图9和图10，其中，图9HMGI/Y种间特异性鉴定结果，MW表示MARKER；1.转基因油菜(沪油12)；2.拟南芥；3.胡萝卜；4.茄子；5.甜椒；6.番茄；7.尖椒；8.烟草；9.梅；10.扁豆；11.角豆；12.玉米；13.大豆；14.宁麦；15.大麦；16.水稻。图10HMGI/Y芸薹属内特异性鉴定结果。其中，MW表示MARKER；1.转基因油菜(沪油12)；2.上海青菜-超矮青；3.甘蓝-早夏16号；4.大白菜-夏薯1号；5.小白菜-杂交一代；6.甘蓝-夏冠；7.花椰菜-一代金光。
SADI种间特异性鉴定：常见的植物和与棉花亲缘关系较近的植物(锦葵科的棉花、向日葵；茄科的马铃薯，番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜)在特异性引物的PCR扩增反应中，PCR产物电泳分析显示在常见植物和亲缘关系较近的植物中没有扩增出特异性的条带，而阳性样品中有大小为106bp、专一的条带，说明在常见的植物和与棉花亲缘关系较近的植物中不含有棉花的SADI基因和与棉花SADI基因同源性较高的基因。因此，证明棉花SADI基因具有种间的特异性。见图11，图11 SADI种间特异性鉴定结果。其中，M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1棉花；泳道2～23分别为马铃薯；番茄；剑麻；木槿；大豆；绿豆；红豆；扁豆；豇豆；水稻；大麦；小麦；玉米；油菜；茄子；烟草；拟南芥；辣椒；杨梅；向日葵；人参果；胡萝卜。
LAT52种间特异性鉴定：常见的植物和与番茄亲缘关系较近的植物(锦葵科的棉花、向日葵；茄科的马铃薯、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜)在特异性引物的PCR扩增反应中，PCR产物电泳分析显示在常见植物和亲缘关系较近的植物中没有扩增出特异性的条带，而阳性样品中有大小为91bp、专一的条带，说明在常见的植物和与番茄亲缘关系较近的植物中不含有番茄的LAT52基因和与番茄LAT52基因同源性较高的基因。因此，证明番茄LAT52基因具有种间的特异性。见图12，图12LAT52种间特异性鉴定结果。其中，M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1番茄；泳道2～23分别为马铃薯；棉花；剑麻；木槿；大豆；绿豆；红豆；扁豆；豇豆；水稻；大麦；小麦；玉米；油菜；茄子；烟草；拟南芥；辣椒；杨梅；向日葵；人参果；胡萝卜。
SPS种间特异性鉴定：常见的植物和与水稻亲缘关系较近的植物(锦葵科的棉花、向日葵；茄科的番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；豆科的大豆、绿豆、禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；胡萝卜)在特异性SPSF/SPSR引物的PCR扩增反应中，PCR产物电泳分析显示在常见植物和亲缘关系较近的植物中没有扩增出特异性的条带，而阳性样品中有大小为81bp、专一的条带，说明在常见的植物和与水稻亲缘关系较近的植物中不含有水稻的SPS基因和与水稻SPS基因同源性较高的基因.因此，证明水稻SPS基因具有种间的特异性.见图13和图14.图13SPS种间特异性(禾本科内)鉴定结果.M表示MARKER，1水稻2小麦3大麦4玉米.图14SPS种间特异性鉴定结果.M表示MARKER 1.水稻2.烟草3.大豆4剑麻5.油菜6.番茄7.葵花8.胡萝卜9.茄子10.辣椒11.绿豆12.拟南芥13.梅。
3.内标准基因的定量检测鉴定
1)内标准基因定量反应优化条件：根据不同引物探针浓度配比(表3)的定量PCR反应体系进行定量反应，我们选出了荧光值上升快，信号强并且重复性好的反应体系进行内标准基因的定量检测鉴定以及外源基因拷贝数的测定(表4)
表4内标准基因定量反应体系优化结果(单位：ul)
Primer F Primer R Probe HMGI/Y 0.9 0.9 0.9 SADI 0.3 0.3 0.9 Lat52 0.3 0.3 0.9 SPS 0.3 0.3 0.9
2)内标准基因种内非特异性定量鉴定：分别选用15个不同品种的油菜，棉花，水稻和23个不同品种的番茄DNA作为模板，选用相对应的引物，探针，反应体系和反应条件进行定量PCR反应，结果显示油菜，棉花，番茄，水稻的内标准基因特异性的引物和探针在不同品种的油菜，棉花，番茄，水稻中均能分别检测到相似的荧光信号，由此可以说明HMCI/Y基因在油菜品种中，SADI基因在棉花品种中，LAT52基因在番茄品种中，SPS基因在水稻品种中均具有种内的非特异性。3)内标准基因种间特异性定量鉴定：分别选用油菜，棉花，番茄，水稻和其他与之具有亲缘关系或者常见的植物DNA作为模板，选用相对应的引物，探针，反应体系和反应条件进行定量PCR反应，结果显示针对油菜HMCI/Y设计的引物探针只能扩增油菜基因组DNA，针对棉花SADI设计的引物探针只能扩增棉花基因组DNA，针对番茄LAT52设计的引物探针只能扩增番茄基因组DNA，针对水稻SPS基因设计的引物探针只能扩增水稻基因组DNA，获得荧光信号，由此可以说明油菜HMCI/Y基因，棉花SADI基因，番茄LAT52基因，水稻SPS基因均具有种间的特异性。
4.内标准基因定性、定量PCR检测灵敏度和精确度实验
1)内标准基因定性检测灵敏度
SADI定性检测灵敏度：以非转基因棉花DNA作为模板，用TE将DNA浓度稀释为100ng/μl、50ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl不同的梯度，各取1μl进行PCR反应，电泳结果显示该定性PCR反应系统的检测灵敏度为0.1ng.(图15).图15.SADI定性PCR检测灵敏度.其中，M表示MARKER；1-9分别表示DNA含量为100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.01，0.001ng的PCR反应结果.
SPS定性检测灵敏度：以非转基因水稻为模板DNA，用TE将DNA浓度稀释为500、50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，各取1μl进行反应，电泳结果显示该定性PCR反应系统的检测灵敏度为0.05ng，见图16。图16 SPS定性检测灵敏度。其中，M表示DL2000 MARKER，1：500ng 2：52ng 3：5ng 4：0.50ng 5：0.05ng 6：0.005ng 7：水对照。
2)内标准基因定量检测灵敏度
HMGI/Y定量检测灵敏度：以非转基因油菜DNA为模板，用TE稀释成下列浓度：100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，定量检测结果显示该定量PCR反应系统的检测灵敏度为0.01ng。见图17，图17HMGI/Y定量灵敏度检测结果。
SADI定量检测灵敏度：以非转基因棉花DNA为模板，用TE稀释成下列浓度：100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，定量检测结果显示该定量PCR反应系统的检测灵敏度为0.01ng。见图18SADI定量灵敏度检测结果。
SPS定量检测灵敏度：以非转基因水稻DNA为模板，以TE稀释成下列浓度：50、5、0.5、0.05、0.005、0.0025ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，定量检测结果显示该定量PCR反应系统的检测灵敏度为0.005ng。见图19SPS定量灵敏度检测结果。
5.Southern检测结果Southern杂交结果显示我们所选用的油菜HMG I/Y基因，水稻SPS基因，棉花SADI基因以及番茄LAT52基因为一单拷贝的内源基因，具有种内一致性的特点。见图20，油菜HMGI/Y Southern检测结果。Southern-Blot分析内标准基因的拷贝数。其中，1.沪油12；2.沪油50；3.安437；4.苏991246；5.苏97-2126；6.苏油1号7.浙双758；8.嘉兴9308；9.中双6号；10.华农大-1。
6.外源基因拷贝数检测结果
1)外源GUS，HPT，NPTII基因定量反应条件优化：根据不同引物探针浓度配比(表3)的定量PCR反应体系进行定量反应，我们选出了荧光值上升快，信号强并且重复性好的反应体系进行外源基因拷贝数的测定。见表5。
表5外源定量反应体系优化结果(单位：ul)
Primer F Primer R Probe GUS 0.3 0.3 0.3 HPT 0.3 0.3 0.9 NPTII 0.3 0.3 0.9
2)转基因水稻外源GUS，HPT基因拷贝数测定，见表6、表7。
表6转基因水稻外源HPT基因拷贝数测定
表7转基因水稻外源GUS基因拷贝数测定
3)转基因油菜外源GUS，NPTII基因拷贝数检测，见表8、表9。
表8转基因油菜外源GUS基因拷贝数测定
表9转基因棉花外源NPTII基因拷贝数测定
(一).实验材料
1，非转基因植物：
非转基因棉花，如：GK12、SGK321、GK19、GK22、9409、苏棉310、保铃棉1560BG、保铃棉DP410B、保铃棉32B、保铃棉33B、保铃棉99B、显性无腺体、徐州142、中棉所常规棉、中棉30等。
非转基因水稻，如：寒丰，农虎6号，9520，秀水04，申香粳6号，太湖糯，20566，D5黑河爱晖，C43βg94-1，C26PR106，D20BaSmati，C21中育早18，D57kholt marshi，P2C1花育一号等。
非转基因番茄，如：871、1687、1685、1866、1867、822、丽春、西粉一号、西粉二号、西粉三号、西粉五号、西粉八一号、毛红801、毛G1号、毛粉802、早丰、中丰、早魁、红杂14号、红杂16号、红杂18号、红杂20号、红杂25号等。
非转基因油菜，如：沪油12、沪油50、安437、苏991246、苏97-2126、苏油1号、浙双758、嘉兴9308、中双6号、华农大-1以及欧洲品种PGCP15、PGCH23、PGCH55、PGCH57、PGCH58等.
其他常见的作物，如：锦葵科的向日葵；茄科的马铃薯、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的大麦、小麦、玉米；十字花科的拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜。
2、酶与试剂
植物材料DNA提取试剂盒为上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的食品DNA抽提试剂盒。
限制性内切酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶及其缓冲液购自TakarapGEM-7Zf(+)/Hae IIIMarkers、λDNA/EcoR+Hind III Markers、DL2000Marker购自华美生物工程公司。
TaqMan探针及引物由上海申友生物技术公司合成
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
3、实验仪器
DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)
PTC-100型PCR扩增仪(MJ Research Inc.)
Rotor-Gene 2000定量PCR仪(Corbett Research，Australia)
BECKMAN公司的DUR640核酸和蛋白分析仪
DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)
DNA电泳分析系统包括暗箱、数码照相机、计算机、扫描仪、喷墨打印机、光敏打印机、Tianon UV-2000紫外分析仪、Gis凝胶图象分析
软件(上海天能公司)
其他仪器包括：离心机，恒温水浴锅，培养箱，天平等。
(二).实验方法及过程
1.候选内标准基因的查找
转基因植物PCR检测中需要使用的内标准基因必须符合3个条件：种内非特异性、种间特异性、低拷贝性(为提高检测灵敏度，最好为单拷贝基因)。首先通过查阅文献来选取相应的单拷贝基因，其次通过网上BLAST来确定该基因与其他作物的同源性，最后通过定量与定性PCR检测和Southern检测来确定该内标准基因的可用性。
2.植物DNA的提取与检测
1)植物DNA的提取
a)取适量的水稻样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约70mg-100mg磨碎的样品转入1.5ml的Eppendorf管中；
b)视材料量的多少，加入600-700μl已预热的Buffer A，轻轻混匀后，65℃水浴保温1小时，期间间或振荡混匀；
c)在管中加入等体积酚/氯仿(600-700μl)，上下颠倒充分混匀，静置抽提10min；
d)12000rpm×10分钟离心，吸取上清到一新的Eppendorf管中；
e)加入与上清等体积的异丙醇(约600μl)，混匀，常温放置10min后，12000×g离心10min，去上清，保留沉淀；
f)在沉淀中加入60μl TER，37℃放置2min后用枪头将其充分混匀后，于37℃放置约1小时；
g)取出后补加140μl TE，再加入200μl酚/氯仿，混匀，静置片刻；
h)12000rpmg×5min离心，取上清(约180μl)，加入1/10体积3M NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；
i)12000rpm×10min离心，去上清，加75％乙醇200μl，12000rpm×5min离心，弃上清，室温晾干，溶于50μl无菌ddH20中。
2)DNA检测：取3μl提取的DNA溶液电泳，选用的电泳胶为1％的琼脂糖凝胶，根据其亮度和扩散程度来判断DNA的质量。利用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度与纯度。
3.内标准基因及外源基因引物、探针的设计
利用Primer Primier5.0和Beacon Designer2.0软件设计针对油菜，棉花，番茄，水稻内标准基因以及外源HPT，GUS，NPTII基因的特异性引物和探针。引物和探针设计时尽量使他们的动力学性质相似，采取的原则是不发生错配、尽可能的减少引物自身及相互间形成引物二聚体的可能，选择3’端稳定性较5’端稳定性低的引物，引物的GC％为40％～65％，Tm值在50℃-65℃，此外探针的Tm值应高于引物的Tm值约10℃。根据上述原则选择合适的引物和探针，必要时适当地进行修改，见下列表1、表2。
表1为定性、定量PCR检测的内标准基因的引物和探针序列。
表2为定性、定量PCR检测的外源基因的引物和探针序列。
表1
表2
4.内标准基因的定性检测鉴定
1)内标准基因种内非特异性鉴定
HMGI/Y种内非特异性鉴定：以国产非转基因品种沪油12、沪油50、安437、苏991246、苏97-2126、.苏油1号、浙双758、嘉兴9308、中双6号、华农大-1以及欧洲品种PGCP15、PGCH23、PGCH55、PGCH57、PGCH58基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的HMCF/HMCR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SadI种内非特异性鉴定：以GK12、SGK321、GK19、GK22、9409、苏棉310、保铃棉1560BG、保铃棉DP410B、保铃棉32B、保铃棉33B、保铃棉99B、显性无腺体、徐州142、中棉所常规棉、中棉30基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的SADF/SADR引物对进行PCR扩增反应，其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
Lat52种内非特异性鉴定：以番茄品种871、1687、1685、1866、1867、822、丽春、西粉一号、西粉二号、西粉三号、西粉五号、西粉八一号、毛红801、毛G1号、毛粉802、早丰、中丰、早魁、红杂14号、红杂16号、红杂18号、红杂20号、红杂25号基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的LATF/LATR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SPS种内非特异性鉴定：以水稻品种寒丰，农虎6号，9520，秀水04，申香粳6号，太湖糯，20566，D5黑河爱晖，C43g94-1，C26 PR106，D20BaSmati，C21中育早18，D57kholt marshi，P2C1花育一号基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的SPSF/SPSR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测.
2)内标准基因种间特异性鉴定
HMGI/Y种间特异性鉴定：取十字花科的油菜、拟南芥，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的萝卜，豆科的扁豆、角豆，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、大豆、小麦、大麦的基因组DNA为PCR反应为模板，取十字花科芸苔属内种大白菜、小白菜、甘蓝、花椰菜的基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的HMCF/HMCR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SadI种间特异性鉴定：选用锦葵科的棉花、向日葵；茄科的马铃薯，番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜基因组DNA作为PCR反应膜板，选用相应的SADF/SADR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
Lat52种间特异性鉴定：取十字花科的油菜、拟南芥，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的萝卜，豆科的扁豆、角豆、大豆、，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、小麦、大麦的基因组DNA为PCR反应为模板，选用相应的LATF/LATR引物对进行PCR扩增反应，其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SPS种间特异性鉴定：选用锦葵科的棉花、向日葵；茄科的番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；豆科的大豆、绿豆、禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；胡萝卜基因组DNA作为PCR反应膜板，选用相应的SPSF/SPSR引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行35个循环；最后，72℃延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
5.内标准基因的定量检测鉴定
1)定量反应体系的优化建立
为了获得高效灵敏的定量PCR反应系统，我们设计了不同引物探针浓度(引物初始浓度为25pM，探针初始浓度为10pM)比例的定量PCR反应体系(见表3)，通过相同的定量PCR反应条件，筛选荧光值上升较快，荧光信号强并且反应重复性好的体系作为定量检测的反应体系。
表3为优化定量反应体系不同引物探针浓度表(单位：ul)。
表3单位：ul
2)内标准基因种内非特异性鉴定
HMGI/Y种内非特异性鉴定：以国产非转基因品种沪油12、沪油50、安437、苏991246、苏97-2126、.苏油1号、浙双758、嘉兴9308、中双6号、华农大-1以及欧洲品种PGCP15、PGCH23、PGCH55、PGCH57、PGCH58基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的HMCF/HMCR引物对和HCM PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
SadI种内非特异性鉴定：以GK12、SGK321、GK19、GK22、9409、苏棉310、保铃棉1560BG、保铃棉DP410B、保铃棉32B、保铃棉33B、保铃棉99B、显性无腺体、徐州142、中棉所常规棉、中棉30基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的SADF/SADR引物对和SAD PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
Lat52种内非特异性鉴定：以番茄品种871、1687、1685、1866、1867、822、丽春、西粉一号、西粉二号、西粉三号、西粉五号、西粉八一号、毛红801、毛G1号、毛粉802、早丰、中丰、早魁、红杂14号、红杂16号、红杂18号、红杂20号、红杂25号基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的LATF/LATR引物对和LAT PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
SPS种内非特异性鉴定：以水稻品种寒丰，农虎6号，9520，秀水04，申香粳6号，太湖糯，20566，D5黑河爱晖，C43βg94-1，C26PR106，D20BaSmati，C21中育早18，D57kholt marshi，P2C1花育一号基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的SPSF/SPSR引物对和SPS PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环.
3)内标准基因种间特异性鉴定
HMGI/Y种间特异性鉴定：取十字花科的油菜、拟南芥，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的萝卜，豆科的扁豆、角豆，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、大豆、小麦、大麦的基因组DNA为PCR反应为模板，取十字花科芸苔属内种大白菜、小白菜、甘蓝、花椰菜的基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的HMCF/HMCR引物对和HCM PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94变性30秒，60退火20秒，72延伸30秒；共进行45个循环。
SadI种间特异性鉴定：选用锦葵科的棉花、向日葵；茄科的马铃薯，番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜基因组DNA作为PCR反应膜板，选用相应的SADF/SADR引物对和SAD PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
Lat52种间特异性鉴定：取十字花科的油菜、拟南芥，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的萝卜，豆科的扁豆、角豆、大豆、，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、小麦、大麦的基因组DNA为PCR反应为模板，选用相应的LATF/LATR引物对和LAT PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
SPS种间特异性鉴定：选用锦葵科的棉花、向日葵；茄科的番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；豆科的大豆、绿豆、禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；胡萝卜基因组DNA作为PCR反应膜板，选用相应的SPSF/SPSR引物对和SPS PROBE按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，进入PCR反应循环：94℃变性30秒，5℃退火30秒，72℃延伸30秒；共进行45个循环。
6.内标准基因定性、定量检测灵敏度和精确度实验
1)内标准基因定性检测灵敏度
SadI定性PCR检测灵敏度：非转基因棉花DNA以TE稀释为下列浓度：100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.01，0.001ng/μl，每个定性PCR反应取1μl，使反应中的DNA含量分别为100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.01，0.001ng。利用相应的SADF/SADR引物对和定性鉴定的反应条件进行PCR反应，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
SPS定性检测灵敏度：非转基因水稻DNA以TE稀释为下列浓度：500、50、5、0.5、0.05、0.005ng/l，每个定性PCR反应取1μl，使反应中的DNA含量分别为500，50，5，0.5，0.05，0.005ng。利用相应的SPSF/SPSR引物对和定性鉴定的反应条件进行PCR反应，反应结束后吸取10μl产物在2％的琼脂糖上进行电泳检测。
2)内标准基因定量检测灵敏度
SadI定量检测灵敏度：非转基因棉花DNA以TE稀释为下列浓度：100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，使反应中的DNA含量分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001ng.利用相应的SADF/SADR引物对和SAD PROBE利用定量鉴定的反应条件和体系进行定量PCR反应。
SPS定量检测灵敏度：非转基因水稻DNA以TE稀释为下列浓度：50、5、0.5、0.05、0.005、0.0025ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，使反应中的DNA含量分别为50，5，0.5，0.05，0.005，0.0025ng。利用相应的SPSF/SPSR引物对和SPS PROBE利用定量鉴定的反应条件和体系进行定量PCR反应。
3)内标准基因定量检测重复性和重演性实验
上述油菜，棉花，番茄，SPS内标准基因定量灵敏度检测实验进行三次重复实验。
7.Southern检测鉴定内标准基因的拷贝数
1)非转基因油菜、棉花、番茄，水稻基因组DNA的提取
用CTAB法抽提油菜、棉花、番茄和水稻的DNA，具体方法如下所示：取40g材料在液氮中磨成粉末。将所得粉末移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，立即加入20ml预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀，65℃水浴保温15-30分钟，期间轻轻摇动。混合物冷却后加入等体积的的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻摇使管内混合物成乳浊液，室温12000转离心10分钟，取上清加入0.01体积的RNAase贮液，混匀后37℃保温30分钟。加入0.7体积的异丙醇室温沉淀15分钟，用玻璃钩钩出白色絮状沉淀，放入76％乙醇、0.2M NaAc的溶液中冰上放置20分钟，再将沉淀转移至70％乙醇中旋转5分钟，离心弃上清，再加入70％乙醇。将DNA转移至另一干净管中，空气干燥15分钟，加入适量TE溶解。4℃储存备用。
2)基因组DNA的纯化
将上述DNA溶液加入等体积水稀释后再加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(PH＝5.2)，温和地混匀，-20℃静置沉淀4小时，13000转，4℃离心20分钟。沉淀用70％的乙醇洗涤后冻干溶解于无菌重蒸水中，用紫外分光光度计测定其浓度及纯度。
3)非转基因油菜、棉花、番茄，水稻基因组DNA酶切、电泳、变性、中和和转膜。
酶切：取油菜、棉花、番茄基因组DNA 10μg用EcoRI(Takara公司)酶切，水稻基因组DNA 10μg用HindIII(Takara公司)酶切，一次加入10×Buffer10μl，限制性内切酶5μl，用无菌水补至100μl，混合均匀后37℃酶切过夜(10-12小时)；微型凝胶电泳酶切鉴定，若呈现一条连续地的、荧光由深至浅的均匀条带，则说明酶切结果良好。
电泳：凝胶制备采用0.8％琼脂糖，电泳采用1V/cm，电泳约10-12小时或者过夜。
变性：将凝胶置于变性溶液(含1.5M NaCl，0.5M NaOH)中于旋转平台上振摇浸泡45分钟使DNA变性，之后用重蒸水大致漂洗凝胶
中和：将凝胶置于中和液(1M Tris-HCl(Ph 7.4)，1.5M NaCl)中于旋转平台上振摇中和，15分钟以后更换一次中和液继续温和震荡30分钟。
转膜：准备一张Whatman滤纸包住一个玻璃平板，将其放于一方磁盘中的平台上，使滤纸下缘浸入转移缓冲液(10×SSC)中.待滤纸全部浸透后用玻璃棒赶走滤纸与玻璃板之间的气泡.裁出一张稍大于凝胶的硝酸纤维素虑膜，用重蒸水彻底浸润后改用20×SSC浸泡5分钟以上.在虑膜上做与凝胶相应的标记.从中和液中取出凝胶，背面朝上放在平台上湿的3MM滤纸上，并赶走气泡.用保鲜膜盖住凝胶四周以防盘内液体直接从边缘渗透到上层纸巾.将浸润的硝酸纤维素膜覆盖住凝胶并赶走气泡，其上再盖上两张与凝胶大小相同并用2×SSC浸润的的3MM滤纸并赶走气泡.最后再在上面放一厚叠裁好的纸巾，纸巾上压一块玻璃板，板上压一重物(如500克的砝码)以形成液体自流池经凝胶向硝酸纤维素膜上行的流路，使凝胶中变性的DNA被洗脱迁移并吸附至纤维素滤膜上.维持液体毛细迁移8-24小时后，每当纸巾浸湿后须更换纸巾.
烤膜：转移结束后揭去纸巾及上面的3MM滤纸，翻转凝胶和纤维素滤膜，放在一张干的3MM滤纸上。用铅笔透过凝胶标记出加样孔在纤维素膜上的位置，之后剥离弃掉凝胶。用6×SSC溶液室温浸泡滤膜5分钟以除去滤膜上沾有的凝胶碎片。取出滤膜置纸巾上室温晾干30分钟以上，之后用两张3MM滤纸夹住滤膜在真空炉中80℃干烤2小时。
4)用于Southern印迹分析的DNA探针的标记，杂交，洗膜，显影
预杂交：按每平方厘米硝酸纤维素滤膜0.2毫升用量配制适量SDS-磷酸预杂交液。将烤干的滤膜浮于6×SSC液面上待其完全湿润后沉入液面内泡2分钟。然后将湿滤膜装入杂交桶中中，加入配好的预杂交液，赶尽滤膜与瓶壁接触处的气泡，置42℃杂交炉中2小时。
探针标记：用随机引物法标记探针，试剂盒为Takara公司产品。以定性检测PCR扩增产物为模板，制备32P标记的探针。具体方法为：取2.5ng模板DNA和2μl随机引物补水至终体积为，95℃变性5分钟，迅速冰浴5分钟，然后依次加入2.5μl缓冲液，2.5μl dNTP溶液，1μl Klenow酶(约5U)和3μl[α-32P]dCTP，总体积为25μl，充分混匀后于37℃反应30分钟以上，95℃变性探针5分钟，置于冰上约5分钟后，加入预杂交液中按所需的杂交温度进行杂交反应18-24小时。
洗膜：杂交完毕后取出杂交桶，倒弃杂交液至废物缸中，往杂交桶中倒入一定量的0.2*SSC/0.1％SDS洗膜液，在室温下轻轻振荡5-10分钟，期间用monitor检测杂交信号，更换洗膜液，直至背景信号基本洗净，随后取出滤膜放于纸巾上吸去大部分液体。
压片：滤膜外包裹一张保鲜膜，放入曝光夹中压入X光片及增感屏，置-70℃曝光适当时间(几小时至几天)。
显影：在暗室中将X光片放入显影液内，轻轻晃动约5-10分钟，待出现相应的图象结果后，将X光片转入定影液中定影，即得最终的Southern结果
(三).实验结果
1.候选内标准基因的查找及网上Blast结果
根据T.Masek，et al(2000)的报道，编码油菜high-mobility-group HMGI/Y protein的HCMI/Y基因为一单拷贝内源基因(GeneBank N0.AF127919)，所选择的DNA序列见附图1。图1HCMI/Y片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。其中，加下划线部分为PCR引物位置，粗体部分为定量PCR探针位置。
将该基因在GENEBANK上分析结果表明：找不到连续50bp与其同源的DNA的DNA片段，我们选择了417-559之间长度为99个bp的特异性DNA片段作为内标。
根据Qin Liu，et al的报道，编码棉花stearoyl-ACPdesaturase的SAD1基因为一单拷贝内源基因(Genebank No.X95988)，我们选择的DNA序列见图2，图2SadI片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。其中，加下划线部分为PCR引物位置，粗体部分为定量PCR探针位置。
将该基因在GENEBANK上进行BLAST，结果发现，找不到连续50bp与其同源的DNA的DNA片段，我们选择了4834-4940之间长度为107个bp的特异性DNA片段作为内标。
根据Twell D.，et al(1989)的报道，番茄的LAT52基因为一单拷贝内源基因(GeneBank NO.19263)，所选择的DNA序列见附图3。图3LAT52片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。其中，加下划线部分为PCR引物位置，粗体部分为定量PCR探针位置。
将该基因在GENEBANK上进行BLAST，结果发现，找不到连续50bp与其同源的DNA的DNA片段，我们选择了1385-1476之间长度为92个bp的特异性DNA片段作为内标。
根据Juan Jose Valdez-Alarcon et al(1996)的报道，编码水稻sucrose phosphate synthase的SPS基因为一单拷贝内源基因(GeneBank NO.U33175)，所选择的DNA序列为见附图4。图4SPS片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。其中，加下划线部分为PCR引物位置，粗体部分为定量PCR探针位置。
将该基因在GENEBANK上进行BLAST，结果发现，在800bp-1600bp为水稻特异性片段，我们在1055-1135bp处设计相应的引物和探针。
2.内标准基因的定性检测鉴定
1)内标准基因种内非特异性鉴定
HMGI/Y种内非特异性鉴定：不同品种的油菜在设计的特异性HMCF/HMCR引物的PCR扩增反应中，PCR反应产物电泳显示在15个不同品种中都能扩增出大小为146bp、专一的条带，条带大小与预期的一致。说明在油菜的不同品种中都含有候选基因HMCI/Y；从而说明油菜HMCI/Y基因具有种内的非特异性。如图5，图5HMGI/Y种内非特异性鉴定结果照片。其中，1.沪油12；2.沪油50；3.安437；4.苏991246；5.苏97-2126；6.苏油1号；7.浙双758；8.嘉兴9308；9.中双6号；10.华农大-1；11.PGCP15；12.PGCH23；13.PGCH55；14.PGCH57；15.PGCH58；MW表示pGEM-7Zf(+)/Hae III。
SADI种内非特异性鉴定：不同品种的水稻在设计的特异性SADF/SADR引物的PCR扩增反应中，PCR反应产物电泳显示在15个不同品种中都能扩增出大小为107bp、专一的条带，条带大小与预期的一致。说明在棉花的不同品种中都含有候选基因SADI；从而说明棉花SADI基因具有种内的非特异性。见图6，图6SADI种内非特异性鉴定结果照片。M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1.为空白对照；2.GK12；3.SGK321；4.GK19；5.GK22；6.9409；7.苏棉310；8.保铃棉1560BG；9.保铃棉DP410B；10.保铃棉32B；11.保铃棉33B；12.保铃棉99B；13.显性无腺体；14.徐州142；15.中棉所常规棉；16.中棉30。
LAT52种内非特异性鉴定：不同品种的番茄在设计的特异性LATF/LATR引物的PCR扩增反应中，PCR反应产物电泳显示在23个不同品种中都能扩增出大小为92bp、专一的条带，条带大小与预期的一致。说明在番茄的不同品种中都含有候选基因LAT52；从而说明番茄LAT52基因具有种内的非特异性。见图7，图7LAT52种内非特异性鉴定结果。其中，M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1.为空白对照；2.871；3.1687；4.1685；5.1866；6.1867；7.822；8.丽春；9.西粉一号；10.西粉二号；11.西粉三号；12.西粉五号；13.西粉八一号；14.毛红801；15.毛G1号；16.毛粉802；17.早丰；18.中丰；19.早魁；20.红杂14号；21.红杂16号；22.红杂18号；23.红杂20号；24.红杂25号。
SPS种内非特异性鉴定：不同品种的水稻在设计的特异性SPSF/SPSR引物的PCR扩增反应中，PCR反应产物电泳显示在15个不同品种中都能扩增出大小为81bp、专一的条带，条带大小与预期的一致.说明在水稻的不同品种中都含有候选基因SPS；从而说明水稻SPS基因具有种内的非特异性.见图8.图8SPS种内非特异性鉴定结果.其中，M表示MARKER，1.寒丰(晚粳中熟)；2.农虎6号(晚粳迟熟)；3.9520(晚粳早熟)；4.秀水04(晚粳中熟)；5.申香粳；6.号(中粳中熟，香稻)；7.太湖糯(晚粳糯)；8.20566(日本稻粳稻)；9.D5黑河爱晖(籼稻)；10.C43βg94-1(籼稻)；11.C26PR106(籼稻)；12.D20BaSmati(籼稻，爪哇型)；13.C21中育早18(籼稻)；14.D57kholt marshi(籼稻)；15.P2C1花育一号(粳稻)。2)内标准基因种间特异性鉴定
HMGI/Y种间特异性鉴定：常见的植物和与油菜亲缘关系较近的植物(十字花科的油菜、拟南芥、大白菜、小白菜、甘蓝、花椰菜，茄科的烟草、茄子、番茄、尖椒，伞形花科的胡萝卜，豆科的扁豆、角豆，蔷薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、大豆、小麦、大麦)在特异性引物的PCR扩增反应中，PCR产物电泳分析显示在常见植物和亲缘关系较近的植物中没有扩增出特异性的条带，而阳性样品中有大小为146bp、专一的条带，说明在常见的植物和与油菜亲缘关系较近的植物中不含有油菜的HMC基因和与油菜HMC基因同源性较高的基因。因此，证明油菜HMC基因具有种间的特异性。见图9和图10，其中，图9HMGI/Y种间特异性鉴定结果，MW表示MARKER；1.转基因油菜(沪油12)；2.拟南芥；3.胡萝卜；4.茄子；5.甜椒；6.番茄；7.尖椒；8.烟草；9.梅；10.扁豆；11.角豆；12.玉米；13.大豆；14.宁麦；15.大麦；16.水稻。图10HMGI/Y芸薹属内特异性鉴定结果。其中，MW表示MARKER；1.转基因油菜(沪油12)；2.上海青菜-超矮青；3.甘蓝-早夏16号；4.大白菜-夏薯1号；5.小白菜-杂交一代；6.甘蓝-夏冠；7.花椰菜-一代金光。
SADI种间特异性鉴定：常见的植物和与棉花亲缘关系较近的植物(锦葵科的棉花、向日葵；茄科的马铃薯，番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜)在特异性引物的PCR扩增反应中，PCR产物电泳分析显示在常见植物和亲缘关系较近的植物中没有扩增出特异性的条带，而阳性样品中有大小为106bp、专一的条带，说明在常见的植物和与棉花亲缘关系较近的植物中不含有棉花的SADI基因和与棉花SADI基因同源性较高的基因。因此，证明棉花SADI基因具有种间的特异性。见图11，图11 SADI种间特异性鉴定结果。其中，M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1棉花；泳道2～23分别为马铃薯；番茄；剑麻；木槿；大豆；绿豆；红豆；扁豆；豇豆；水稻；大麦；小麦；玉米；油菜；茄子；烟草；拟南芥；辣椒；杨梅；向日葵；人参果；胡萝卜。
LAT52种间特异性鉴定：常见的植物和与番茄亲缘关系较近的植物(锦葵科的棉花、向日葵；茄科的马铃薯、茄子、烟草、辣椒；剑麻；木槿；豆科的大豆、绿豆、红豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；人参果；胡萝卜)在特异性引物的PCR扩增反应中，PCR产物电泳分析显示在常见植物和亲缘关系较近的植物中没有扩增出特异性的条带，而阳性样品中有大小为91bp、专一的条带，说明在常见的植物和与番茄亲缘关系较近的植物中不含有番茄的LAT52基因和与番茄LAT52基因同源性较高的基因。因此，证明番茄LAT52基因具有种间的特异性。见图12，图12LAT52种间特异性鉴定结果。其中，M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1番茄；泳道2～23分别为马铃薯；棉花；剑麻；木槿；大豆；绿豆；红豆；扁豆；豇豆；水稻；大麦；小麦；玉米；油菜；茄子；烟草；拟南芥；辣椒；杨梅；向日葵；人参果；胡萝卜。
SPS种间特异性鉴定：常见的植物和与水稻亲缘关系较近的植物(锦葵科的棉花、向日葵；茄科的番茄、茄子、烟草、辣椒；剑麻；豆科的大豆、绿豆、禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米；十字花科的油菜、拟南芥；杨梅；胡萝卜)在特异性SPSF/SPSR引物的PCR扩增反应中，PCR产物电泳分析显示在常见植物和亲缘关系较近的植物中没有扩增出特异性的条带，而阳性样品中有大小为81bp、专一的条带，说明在常见的植物和与水稻亲缘关系较近的植物中不含有水稻的SPS基因和与水稻SPS基因同源性较高的基因.因此，证明水稻SPS基因具有种间的特异性.见图13和图14.图13SPS种间特异性(禾本科内)鉴定结果.M表示MARKER，1水稻2小麦3大麦4玉米.图14SPS种间特异性鉴定结果.M表示MARKER 1.水稻2.烟草3.大豆4剑麻5.油菜6.番茄7.葵花8.胡萝卜9.茄子10.辣椒11.绿豆12.拟南芥13.梅。
3.内标准基因的定量检测鉴定
1)内标准基因定量反应优化条件：根据不同引物探针浓度配比(表3)的定量PCR反应体系进行定量反应，我们选出了荧光值上升快，信号强并且重复性好的反应体系进行内标准基因的定量检测鉴定以及外源基因拷贝数的测定(表4)
表4内标准基因定量反应体系优化结果(单位：ul)
Primer F Primer R Probe HMGI/Y 0.9 0.9 0.9 SADI 0.3 0.3 0.9 Lat52 0.3 0.3 0.9 SPS 0.3 0.3 0.9
2)内标准基因种内非特异性定量鉴定：分别选用15个不同品种的油菜，棉花，水稻和23个不同品种的番茄DNA作为模板，选用相对应的引物，探针，反应体系和反应条件进行定量PCR反应，结果显示油菜，棉花，番茄，水稻的内标准基因特异性的引物和探针在不同品种的油菜，棉花，番茄，水稻中均能分别检测到相似的荧光信号，由此可以说明HMCI/Y基因在油菜品种中，SADI基因在棉花品种中，LAT52基因在番茄品种中，SPS基因在水稻品种中均具有种内的非特异性。3)内标准基因种间特异性定量鉴定：分别选用油菜，棉花，番茄，水稻和其他与之具有亲缘关系或者常见的植物DNA作为模板，选用相对应的引物，探针，反应体系和反应条件进行定量PCR反应，结果显示针对油菜HMCI/Y设计的引物探针只能扩增油菜基因组DNA，针对棉花SADI设计的引物探针只能扩增棉花基因组DNA，针对番茄LAT52设计的引物探针只能扩增番茄基因组DNA，针对水稻SPS基因设计的引物探针只能扩增水稻基因组DNA，获得荧光信号，由此可以说明油菜HMCI/Y基因，棉花SADI基因，番茄LAT52基因，水稻SPS基因均具有种间的特异性。
4.内标准基因定性、定量PCR检测灵敏度和精确度实验
1)内标准基因定性检测灵敏度
SADI定性检测灵敏度：以非转基因棉花DNA作为模板，用TE将DNA浓度稀释为100ng/μl、50ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl不同的梯度，各取1μl进行PCR反应，电泳结果显示该定性PCR反应系统的检测灵敏度为0.1ng.(图15).图15.SADI定性PCR检测灵敏度.其中，M表示MARKER；1-9分别表示DNA含量为100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.01，0.001ng的PCR反应结果.
SPS定性检测灵敏度：以非转基因水稻为模板DNA，用TE将DNA浓度稀释为500、50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，各取1μl进行反应，电泳结果显示该定性PCR反应系统的检测灵敏度为0.05ng，见图16。图16 SPS定性检测灵敏度。其中，M表示DL2000 MARKER，1：500ng 2：52ng 3：5ng 4：0.50ng 5：0.05ng 6：0.005ng 7：水对照。
2)内标准基因定量检测灵敏度
HMGI/Y定量检测灵敏度：以非转基因油菜DNA为模板，用TE稀释成下列浓度：100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，定量检测结果显示该定量PCR反应系统的检测灵敏度为0.01ng。见图17，图17HMGI/Y定量灵敏度检测结果。
SADI定量检测灵敏度：以非转基因棉花DNA为模板，用TE稀释成下列浓度：100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，定量检测结果显示该定量PCR反应系统的检测灵敏度为0.01ng。见图18SADI定量灵敏度检测结果。
SPS定量检测灵敏度：以非转基因水稻DNA为模板，以TE稀释成下列浓度：50、5、0.5、0.05、0.005、0.0025ng/μl，每个定量PCR反应取1μl，定量检测结果显示该定量PCR反应系统的检测灵敏度为0.005ng。见图19SPS定量灵敏度检测结果。
5.Southern检测结果Southern杂交结果显示我们所选用的油菜HMG I/Y基因，水稻SPS基因，棉花SADI基因以及番茄LAT52基因为一单拷贝的内源基因，具有种内一致性的特点。见图20，油菜HMGI/Y Southern检测结果。Southern-Blot分析内标准基因的拷贝数。其中，1.沪油12；2.沪油50；3.安437；4.苏991246；5.苏97-2126；6.苏油1号7.浙双758；8.嘉兴9308；9.中双6号；10.华农大-1。
6.外源基因拷贝数检测结果
1)外源GUS，HPT，NPTII基因定量反应条件优化：根据不同引物探针浓度配比(表3)的定量PCR反应体系进行定量反应，我们选出了荧光值上升快，信号强并且重复性好的反应体系进行外源基因拷贝数的测定。见表5。
表5外源定量反应体系优化结果(单位：ul)
Primer F Primer R Probe GUS 0.3 0.3 0.3 HPT 0.3 0.3 0.9 NPTII 0.3 0.3 0.9
2)转基因水稻外源GUS，HPT基因拷贝数测定，见表6、表7。
表6转基因水稻外源HPT基因拷贝数测定
表7转基因水稻外源GUS基因拷贝数测定
3)转基因油菜外源GUS，NPTII基因拷贝数检测，见表8、表9。
表8转基因油菜外源GUS基因拷贝数测定
表9转基因棉花外源NPTII基因拷贝数测定