注射鸟卵的方法

摘要

本发明提供了改善的方法用于对含有胚的鸟卵进行注射，优选的情况下该卵含有早期胚(例如胚盘)。本发明的方法可被用于向卵中递送物质、从卵中取样和/或向卵内插入检测器装置以从中收集信息。在优选的实施方案中，本发明被用于向胚进行物质的卵内递送。在其它的优选的实施方案中，本发明被用于在卵内产生嵌合或者转基因鸟胚。

权利要求

1.进入鸟卵的方法，该方法包括：(a)使含有胚盘和气室的鸟卵朝向一个预定位置；

(b)在钝端气室之上向卵壳引入一个小开口；

(c)向卵壳小开口下的卵的外壳膜引入小开口；然后(d)将一种装置通过卵壳和外壳膜上的小开口伸入以使该装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在通过其插入装置之前基本完好；以及(e)从卵中收回该装置。

2.权利要求1的方法，其中装置为一种递送装置，并且所述方法在所述刺穿步骤后进一步包括通过递送装置释放某种物质并且将该物质沉积在卵内的步骤。

3.权利要求1的方法，其中装置为一种取样装置，并且所述方法在所述刺穿步骤后进一步包括从卵中取出样本的步骤。

4.权利要求1的方法，其中装置为一种检测器装置，并且所述方法在所述的刺穿步骤后进一步包括以检测器装置检测来自卵内部的信息的步骤。

5.权利要求1的方法，其中装置通过卵壳上的小开口伸入至一个预定位置。

6.权利要求1的方法，其中装置通过卵壳上的小开口伸入至胚盘中的位置或其紧邻位置。

7.权利要求6的方法，其中装置通过卵壳上的小开口伸入至一个位置，该位置选自：(a)胚下腔，

(b)暗区与卵黄膜之间，

(c)明区与卵黄膜之间，

(d)暗区与明区之间，

(e)明区内，

(f)暗区内，以及

(g)(a)到(f)的任何组合。

8.权利要求1的方法，其中在步骤(d)之后，该方法进一步包括使胚盘受损的步骤。

9.权利要求1的方法，其中卵在处理之前被贮存。

10.权利要求1的方法，其中胚盘为XIII期(EG&K)或者更早期的胚盘。

11.权利要求10的方法，其中胚盘为VIII期到XIII期(EG&K)的胚盘。

12.权利要求10的方法，其中胚盘为X期(EG&K)的胚盘。

13.权利要求1的方法，其中卵选自鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、鸵鸟和鸸鹋的卵。

14.权利要求1的方法，其中卵选自长尾鹦鹉、大冠鹦鹉和澳洲鹦鹉的卵。

15.权利要求13的方法，其中卵为鸡卵。

16.权利要求13的方法，其中卵为火鸡卵。

17.权利要求1的方法，其中胚盘含有异源核酸。

18.权利要求1的方法，其中在步骤(b)之前，该方法进一步包括将胚盘定向到需要的位置的步骤。

19.权利要求18的方法，其中所述的测定步骤包括对胚盘进行可视化。

20.权利要求18的方法，其中所述的测定步骤包括使用一种检测器装置测定胚盘或其区室的位置。

21.权利要求1的方法，其中在步骤(e)之后，该方法进一步包括封闭卵壳上的小开口的步骤。

22.权利要求2的方法，其中装置为一种多注射递送装置。

23.权利要求2的方法，其中在卵中进行沉积的物质包括多肽。

24.权利要求23的方法，其中多肽选自抗体、激素、生长因子、酶和细胞因子。

25.权利要求2的方法，其中在卵中进行沉积的物质包括核苷酸序列。

26.权利要求25的方法，其中核苷酸序列是使用一种方法引入胚盘的，该方法选自病毒载体、脂质体和电穿孔。

27.权利要求25的方法，其中核苷酸序列编码一种多肽或者一种反义核酸。

28.权利要求2的方法，其中在卵中进行沉积的物质包括抗生素。

29.权利要求2的方法，其中在卵中进行沉积的物质包括供体细胞。

30.权利要求29的方法，其中供体细胞为鸟类细胞。

31.权利要求30的方法，其中供体细胞选自鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、鸵鸟和鸸鹋的细胞。

32.权利要求30的方法，其中供体细胞选自长尾鹦鹉、大冠鹦鹉和澳洲鹦鹉的细胞。

33.权利要求30的方法，其中供体细胞所来自的鸟类物种不同于胚盘的物种。

34.权利要求29的方法，其中供体细胞为转基因细胞。

35.权利要求29的方法，其中供体细胞选自胚盘细胞、干细胞、培养的干细胞、胚胎干细胞、原生殖细胞、胚生殖细胞以及上述细胞的任何组合。

36.权利要求29的方法，其中胚盘为鸡胚盘并且供体细胞为鸡细胞。

37.权利要求36的方法，其中胚盘和供体细胞来自鸡的不同品种或者品系。

38.权利要求3的方法，其中从卵中取出的样本含有胚下腔液。

39.权利要求3的方法，其中从卵中取出的样本含有胚盘细胞。

40.权利要求4的方法，其中检测器装置为电子传感器。

41.权利要求4的方法，其中检测器装置为光学传感器。

42.权利要求4的方法，其中检测器装置为化学传感器。

43.权利要求4的方法，其中检测器装置为温度传感器。

44.权利要求4的方法，其中检测器装置为声传感器。

45.权利要求4的方法，其中检测器装置为压力传感器。

46.进入鸟卵的方法，该方法包括：使鸟卵的钝端朝向一个预定的位置，该鸟卵含有(i)胚盘以及(ii)气室；

在卵的钝端气室之上引入一个小开口；

在卵壳上的小开口下的外壳膜中引入一个小开口；然后通过卵壳和外壳膜上的小开口伸入一个递送装置，以使递送装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在递送装置通过其插入之前基本完好；

通过递送装置释放某种物质并将物质沉积在胚盘中的位置或其紧邻位置；以及从卵中收回递送装置。

47.权利要求46的方法，其中定向步骤包括将卵的钝端置于大体朝上的位置。

48.权利要求46的方法，其中在卵壳的钝端的小开口被引入于一个预定的位置。

49.权利要求48的方法，其中预定位置基本上位于气室的中央。

50.权利要求46的方法，其中在卵壳和外壳膜中引入小开口的步骤基本上同步进行。

51.权利要求46的方法，该方法进一步包括在所述的释放步骤之前测定胚盘的位置的步骤。

52.权利要求46的方法，其中递送装置通过卵壳上的小开口伸入至一个位置，该位置选自：(a)胚下腔，

(b)暗区与卵黄膜之间，

(c)明区与卵黄膜之间，

(d)暗区与明区之间，

(e)明区内，

(f)暗区内，以及

(g)(a)到(f)的任何组合。

53.进入鸟卵的方法，该方法包括：使多个鸟卵朝向预定位置，其中各卵均含有胚盘和气室；

在钝端气室之上将一个小开口引入各个卵的卵壳；然后将一种递送装置通过各个卵壳上的小开口伸入，以使递送装置刺穿各个卵的内壳膜，其中内壳膜在通过其插入递送装置之前基本完好；

通过递送装置释放某种物质并将物质沉积在各个卵的胚盘中的位置或其紧邻的位置；

以及

从各个卵中收回该装置。

54.一种产生嵌合鸟类的方法，该方法包括的步骤有：使含有胚盘和气室的鸟卵朝向一个预定位置；

在钝端气室之上将一个小开口引入卵的卵壳，然后将一种递送装置通过卵壳上的小开口伸入，以使递送装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在通过其插入递送装置之前基本完好；

通过递送装置释放鸟类供体细胞并将供体细胞沉积在胚盘中或其紧邻的位置，该步骤在足以产生嵌合胚的条件下进行；以及从卵中收回递送装置，

对嵌合胚进行温育以孵化产生嵌合鸟类。

55.权利要求54的方法，其中递送装置通过卵壳上的小开口伸入至一个位置，该位置选自：(a)胚下腔，

(b)暗区与卵黄膜之间，

(c)明区与卵黄膜之间，

(d)暗区与明区之间，

(e)明区内，

(f)暗区内，以及

(g)(a)到(f)的任何组合。

56.一种产生转基因鸟类的方法，该方法包括的步骤有：使含有胚盘和气室的鸟卵朝向一个预定位置；

在钝端气室之上将一个小开口引入卵的卵壳；然后将一种递送装置通过卵壳上的小开口伸入，以使递送装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在通过其插入递送装置之前基本完好；

通过递送装置释放含有一种核苷酸序列的物质并将该物质沉积在胚盘中或其紧邻的位置，该步骤在足以产生转基因胚的条件下进行；以及从卵中收回递送装置，

对转基因胚进行温育以孵化产生转基因鸟类。

57.进入鸟卵的方法，该方法包括：使鸟卵的钝端朝向一个预定的位置，该鸟卵含有(i)胚盘以及(ii)气室；

在卵的钝端气室之上的卵壳引入一个小开口；

在卵壳上的小开口下的外壳膜中引入一个小开口；然后通过卵壳和外壳膜上的小开口伸入一个取样装置，以使取样装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在取样装置通过其插入之前基本完好；

以取样装置从胚盘中收取样本；以及从卵中收回取样装置。

58.进入鸟卵的方法，该方法包括：使鸟卵的钝端朝向一个预定的位置，该鸟卵含有(i)胚盘以及(ii)气室；

在卵的钝端气室之上的卵壳引入一个小开口；

在卵壳上的小开口下的外壳膜中引入一个小开口；然后通过卵壳和外壳膜上的小开口伸入一个检测器装置，以使检测器装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在检测器装置通过其插入之前基本完好；

以检测器装置检测来自卵内部的信息；以及从卵中收回检测器装置。

说明书

注射鸟卵的方法

[0001] 相关申请资料

[0002] 本申请要求2001年8月13日提交的美国临时申请No.60/312,015的权益，其在本文中完整引入作为参考。

[0003] 发明领域

[0004] 本发明涉及对含有胚的卵进行操作的一些方法，并且特别涉及到向含有鸟胚的卵中引入物质或者从中取出物质的方法。

[0005] 发明背景

[0006] 有许多的应用需要对含有早期鸟胚的卵进行注射。例如，可能需要向一种早期胚，例如胚盘(blastoderm)中递送某种物质。例如，在家禽业中可能需要对早期胚进行卵内操作以向发育中的胚内引入某种外源核酸分子(即产生一种转基因鸟类)或者引入某种外源细胞(即产生一种嵌合(chimeric)鸟类)。

[0007] 类似地，经过改进的向含有早期胚的卵内进行注射的方法还可被用于从卵中取出样品，该样品包括胚物质和胚外物质。进一步，其它的应用可能需要在含有胚的卵内插入某种传感装置以从中收集信息。

[0008] 目前对含有早期胚的鸟卵进行操作的方法可能不甚理想，这是因为这些方法导致了不可接受的低孵化率。据认为孵化率降低是在卵壳上产生开口、向卵中引入气泡、胚外膜或者胚本身的损伤或者这些因素综合的结果。

[0009] 因此，在本领域中需要经过改进的操作含有早期胚的鸟卵的方法。

[0010] 发明概述

[0011] 本发明提供了一种对含有胚，特别是早期胚的鸟卵进行操作的方法，该方法对胚的损伤较低，提高了存活率和孵化率。相应地，本发明提供了一些改进的方法，这些方法用于向含有胚，特别是早期胚(例如胚盘)的鸟卵中，插入或者植入多种装置(例如递送装置、取样装置和/或检测器装置等等)，该方法可在受操作的胚中引起较低水平的致病率和致死率。本发明的方法在向鸟进行疫苗、维生素、促生长激素和生长因子、酶、细胞因子、核酸和/或细胞的卵内递送的方法中特别有用。例如，该方法可用于产生一种嵌合鸟类(即含有外源细胞)或者转基因鸟类(即含有外源核酸序列)。本发明的方法还可用于卵内收集鸟的样本或者信息，例如，用于性别筛选、测定胚活力和/或获取该胚遗传特征的信息的方法。

[0012] 本发明的方法可在单一的卵内或者多个卵内进行。进一步，本发明的方法可以手工操作、自动操作或者半自动操作。

[0013] 相应地，作为第一个方面，本发明提供了一种对鸟卵进行注射的方法，该方法包括以下步骤：将含有胚盘的鸟卵在预定的位置上定向；向该卵的卵壳上引入一个小开口；通过卵壳上的开口伸入一种装置；以该装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在插入装置之前基本完好；将该装置从卵中收回。

[0014] 所述装置可以为，例如，递送装置、取样装置或者检测器装置。在优选的情况下，在卵壳上的开口被产生于该卵钝端的气室之上。

[0015] 作为进一步的方面，本发明提供了一种对鸟卵进行注射的方法，该方法包括以下步骤：将鸟卵的钝端在预定的位置上定向，该鸟卵含有(i)胚盘以及(ii)气室；在该卵的钝端于气室之上在卵壳上引入一个小开口；在卵壳的小开口之下的外壳膜中引入一个小的开口；通过卵壳以及外壳膜上的开口伸入递送装置；以该递送装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在插入递送装置之前基本完好；通过递送装置释放某种物质并且将该物质沉积于胚盘中的某个位置或者紧邻于该位置；将递送装置从卵中收回。在特定的实施方案中，卵被定向于大体向上的位置。

[0016] 作为更进一步的方面，本发明提供了一种对鸟卵进行注射的方法，该方法包括以下步骤：将含有胚盘的鸟卵在预定的位置上定向；向该卵的卵壳上引入一个小开口；通过卵壳上的开口伸入取样装置；以该取样装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在插入取样装置之前基本完好；以取样装置从卵中取出样品；将该取样装置从该卵中收回。

[0017] 作为更进一步的方面，本发明提供了一种对鸟卵进行注射的方法，该方法包括以下步骤：将含有胚盘的鸟卵在预定的位置上定向；向该卵的卵壳上引入一个小开口；通过卵壳上的开口伸入检测器装置；以该检测器装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在插入检测器装置之前基本完好；以检测器装置检测卵内的信息；将该检测器装置从卵中收回。

[0018] 如下文所详述的，本发明可有利地被用于任何一种需要对含有早期胚(例如胚盘)的鸟卵的内容物进行操作或者从中获得信息的应用。特别地，本发明可被用于产生转基因胚或者嵌合胚或者进行任何基于染色体或者DNA的测定(例如，性别筛选或者评估胚的遗传特征)。或者，本发明可用于从含有早期胚的鸟卵中取出任何胚的或胚外的体液或组织的样本。另外，或者在替代的情况下，本发明可用于从卵或者胚中获取信息，该方法可与递送或者取样方法联合使用。

[0019] 本发明的这些或者其它方面在下文中更为详尽地描述。

[0020] 附图简述

[0021] 图1为一个流程图，显示根据本发明对卵进行操作的方法。

[0022] 图2为一个流程图，显示根据本发明的实施方案在注射之前制备鸟卵的方法。

[0023] 图3为一个流程图，显示根据本发明的实施方案在注射之前对胚进行定向或者定位的方法。

[0024] 图4为一个流程图，显示根据本发明的实施方案在卵内引入一个开口的方法。

[0025] 图5为一个流程图，显示根据本发明的实施方案在注射之前测定胚的位置的方法。

[0026] 图6为一个流程图，显示根据本发明的实施方案在卵内插入某种装置的方法。该装置可为，例如递送装置、取样装置或者检测器装置，或这些装置的组合。

[0027] 图7所示为来自于开口(windowed)的卵的两日龄胚的照片。各组中：(a)代表性的参照胚，来自于无开口卵。(b-h)实验性胚，来自于开口卵。实验性胚同参照相比较在发育阶段和形态学上实际上是相同的。

[0028] 图8所示为对经过2天培养的受体胚的体节(somite)中荧光标记细胞(绿色)的检测。

[0029] 图9为一系列的显微照片，所示为在X期鸟胚中的细胞死亡的原位检测。所有的照片均来自于X期鸡胚的明区(area pellucida)的中央区域。顶排中显示的胚(组a-d)是在亮视野光下所拍摄，中排(组e-h)所示为在外加荧光照射(epifluorescence illumination)下使用若丹明滤镜组(filter-set)所拍摄的相同视野。底排(组i-1)所示为上部两排的数码合并，以此来展示胚盘中的细胞死亡的精确定位。荧光像素计数(底排)显示了来自数字化荧光成像的红色像素的数目，从而实现了细胞死亡数量的定量比较。

[0030] 发明详述

[0031] 本发明将在此参考附图进行描述，在这些附图中展示了优选的实施方案。然而，本发明可以以不同的形式实现并且不应被解释为受限于本文所提出的实施方案。提供这些实施方案是使本发明的公开彻底而完整，并且完全地向本领域技术人员传达了本发明的范围。

[0032] 应当注意，在本发明的一些备选的实施方案中，图1-6的流程图的单元(block)中所提示的功能可以不按照所提示的顺序出现。例如，连续的两个或者多个单元实际上可以基本上同时进行或者这两个或者多个单元在某些情况下可以按照相反(或者不同)的次序进行实施。进一步，在本发明的特定的实施方案中，图1-6所展示的功能可以平行进行或者依次进行。更进一步，在其它的实施方案中，特定的单元可以被完全省去。

[0033] 除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语所具有的含义同本发明所属的领域的普通技术人员的通常理解的相同。本发明的说明书所使用的术语仅仅为了描述特定的实施方案，该术语并不意味着对本发明进行限定。

[0034] 本发明的说明书和所附权利要求的描述中所使用的单数形式“一个/一种(a或an)”和“该(the)”也包括复数形式，除非上下文明确地指出并非如此。

[0035] 本文所提及的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考文献在此全文引为参考。

[0036] 本文使用的术语“鸟类”和“鸟类对象”包括任何鸟类的雄性和雌性，但主要包括出于商业目的而被饲养用于产卵、肉食或者作为宠物的家禽。因此，术语“鸟类”或者“鸟类对象”特别包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、长尾鹦鹉、鹦鹉、大冠鹦鹉、澳洲鹦鹉、鸵鸟、鸸鹋等等。鸡和火鸡是优选的鸟类对象，鸡最为优选。或者，该鸟类或者鸟类对象为濒危鸟种。

[0037] 本发明提供了对含有鸟胚的卵进行操作的经改进的方法。“进行操作”或者“操作”意指在该卵的卵壳、外壳膜和内壳膜上产生开口并且向其中植入或者插入某种物质或者装置。

[0038] 本文所使用的“早期胚”指的是从产卵(胚盘期)直至原生殖细胞(PGC)迁移的大致发育阶段的鸟胚。对于鸡胚，“早期胚”一般约为胚20期(H&H)或者更早的胚。鸡胚的发育阶段在本领域为人所熟知，例见，The Atlas of Chick Development，R.Bellairs &M.Osmond，eds.，Academic Press，1998。在特定的实施方案中，早期鸡胚约为4期到约18期的胚，或者约为12期到约17期(H&H)的胚，或者，在替代的情况下约为13期到约15期(H&H)的胚(例如，用于PGC的递送)。根据下文所述，在其它的特定实施方案中，早期胚为胚盘期的胚。

[0039] 本文所使用的术语“胚盘”在本领域中具有被充分了解的含义。一般来说，在本发明的实践中，胚盘包括从产卵之时到原肠胚形成终了的胚。胚盘有时在本领域中使用替代性的名称“germinal disc”或者“embryonic disc”。胚盘可被描述为在早期胚分裂时形成的平整的细胞盘，并且该细胞盘维持至原肠胚形成的结束。产卵之时可见该胚盘有两个主要的区域，中央位置的明区和位于周边的暗区(areaopaca)(The Atlas of Chick Development，R.Bellairs &M.Osmond，eds.，Academic Press，1998)。对于鸡胚，典型特征的胚盘为从产卵之时(即，IX期或者X期EG&K)到约为XIII期(EG&K)的胚。在本发明的特定实施方案中，该鸡胚为约VIII期到XIII期(EG&K)的胚，或者，在替代的情况下为约IX期到约XII期(EG&K)的胚。在其它的实施方案中，该鸡胚为约X期到约XI期(EG&K)的胚。在另外的实施方案中，该鸡胚为约X期(EG&K)的胚。

[0040] 目前所应用的对含有早期胚的卵进行操作的方法可能并不能满足商业目的，这是因为这些方法可能导致不可接受的高水平的致病率和致死率。在特定的实施方案中，该鸟胚可以是转基因的(即含有一个外源核苷酸序列)。

[0041] 用装置注射或者插入“紧邻”于胚或者胚盘指的是该装置被正好注射入或者插入于早期胚或者胚盘的上方、下方或者附近或者其附近的结构，例如，在该早期胚或者胚盘的约10、8、5、3、2或者1mm或者更小的范围内。术语“紧邻”于该胚盘包括用某种装置注射或者插入于该胚的胚下腔、介于暗区和卵黄膜之间、介于明区和卵黄膜之间和/或加入明区和暗区之间。

[0042] 本文所使用的术语“注射”和“进行注射”包括将某种装置(典型情况下为延伸装置)插入卵或者胚中的方法，包括将某种物质递送入或者散布于卵或者胚中的方法、从卵或者胚中取出某种物质(即样品)的方法和/或将检测器装置插入卵或者胚中的方法。

[0043] 术语“嵌合鸟类”或者“嵌合胚”分别指的是某种“受体鸟类”或者胚，这种鸟类或者胚含有来自于被称为“供体”的另一种鸟类或者胚的细胞(即体细胞和/或配子细胞)。所产生的嵌合鸟类或者胚在典型的情况下应同时含有来自于受体和供体的细胞。在特定的实施方案中，该嵌合鸟类中可以有至少约5％、10％、25％、35％、50％、65％、75％、85％、90％、95％或者更多的体细胞来自于供体。类似地，在另一个实施方案中，基本上所有的体细胞来自于供体。在另一个实施方案中，嵌合鸟类或者胚中至少有一部分配子(例如，至少约5％、
10％、25％、35％、50％、65％、75％、85％、90％、95％或者更多)来自于该供体。在另一个特定的实施方案中，基本上所有的配子来自于该供体。

[0044] 术语“转基因鸟类”和“转基因胚”在本文中的使用同这些术语在本领域中的一般理解相一致。转基因鸟类或者转基因胚在一个或者多个细胞中含有外源的核酸序列。该外源核酸可来自于不同的物种(例如，鸟类、哺乳类、昆虫、细菌、原生动物、酵母、真菌、病毒)或者来自同物种。例如，可以引入来自同物种的野生型编码序列或者突变形式的编码序列的额外拷贝。根据下文的详述，该外源核酸可编码多肽、反义RNA或者其它非翻译的RNA。该外源核酸一般被稳定地转化入该转基因鸟类或者胚的一个或者多个细胞，例如，通过稳定整合入基因组或者引入被该宿主细胞稳定维持的游离型结构体。

[0045] 本文所使用的术语“预定位置”指的是卵内的一个固定位置或者深度(例如，该卵可被置于一个预定朝向并且将该装置在固定点插入该卵的固定深度)。在备选的实施方案中，注射可根据从卵中所获得的信息而进行，例如，根据胚(例如胚盘)的位置或者其中的区室、该卵中的卵黄膜等等(例如，所需的区室的位置可以使用传感器或者探针而测定并且根据该信息而插入该装置)。

[0046] 术语“基本完好”在用于描述该卵壳或者壳内膜或者壳外膜时意指其上无明显的穿孔或者裂缝。术语“基本完好”在用于描述壳内膜时意指意指内壳膜上无明显的穿孔或者裂缝。典型情况下，内壳膜唯一的可见部分位于在卵壳上形成的窗口或者开口之下，并且根据开口下的这一暴露部分对内壳膜的情况进行测定。

[0047] 美国专利5,897,998(Speksnijder)描述了一种用于对鸟卵的内含物进行操作的方法，该操作通过在该卵壳上与其长轴平行的位置产生一个开口而进行，其中该开口被开在该卵顶侧的卵壳上。随后将一滴液体加于卵壳的开口上“从而使该开口被完全覆盖”(美国专利5,897,998；摘要)。随后切除底下的膜并且将某种溶液通过壳上的开口微注射进该卵，并且封缄该开口。

[0048] 本发明人业已发现，通过一滴液体将装置插入卵是不必要的。进一步，如果滴注该液体，不需要如美国专利5,897,998所述将暴露的膜以及该卵壳中的开口完全覆盖。进一步，本发明人已经发现可通过在将该装置插入卵之前保持内壳膜基本完好而改善经操作的胚的存活。

[0049] 为进行阐示，在向鸟卵引入物质的一个优选和示例性的方法中，该卵被定向于一个预定的位置，在该卵的壳中制造了一个小的开口从而使内壳膜在注射之前维持基本完好。将一个递送装置伸入卵壳上的开口并且使用递送装置(例如，微量移液器或者微注射针头)刺穿内壳膜，并且通过递送装置释放物质并将该物质沉积于卵内的所需位置。该物质一般以约1到10微升(典型情况下低于5或者10微升)体积的预定剂量进行释放。需递送的体积不是关键，只要该体积并不过度地伤害胚并且被有效地递送便可。

[0050] 在卵壳上的“小开口”指的是一种开口，该开口小得足以对发育中的胚不造成过度伤害并且可在需要的情况下被封缄或者闭合。在特定的实施方案中，在卵壳上的“小开口”直径可约为35mm或者更低，例如，直径约为10mm到30mm或者约为15mm到25mm。在另一个实施方案中，该“小开口”在直径上低于约10mm，低于约5mm或者低于约3mm、2mm或者甚至低于1mm。

[0051] 在典型的情况下，递送装置应从卵中被收回，除非该递送装置是一种留在卵内的可移植的装置。一般情况下，在卵上的开口被封缄，除非再向其上引入开口之前对卵壳使用了一种自封材料(即，一种封闭剂)。接受操作的卵可随后被置于保温器中或者进行保存直至孵化或者其它任何所需的终点。

[0052] 在卵壳上的开口可被在任何适当的位置上制出，例如在卵上接近赤道轴的一侧或者位于该卵任意一端。在一个特定的优选的实施方案中，卵壳上的开口被引入于该卵的钝端的气室之上。根据该实施方案，在外壳膜上也引入了小的开口。通过气室而同外壳膜相分离的内壳膜在注射之前保持基本完好。内壳膜被递送装置刺穿并且通过其将某种物质释放进入该卵的所需位置。

[0053] 在外壳膜上的“小开口”与上文关于卵壳上的小开口的描述基本相同。

[0054] 本领域中的技术人员应意识到，无论卵是水平置放、竖直置放或者成一个角度置放，早期胚(例如胚盘)在典型情况下应定位于该卵的最上部位的区域或其附近。由此，在该卵壳上的开口一般应被制成于位于早期胚(胚盘)的预期位置附近的卵最上部，除非进行了测定而将该胚位置定于该卵内的其它位置。

[0055] 在特定的实施方案中，在卵壳中的开口被制成于该卵的顶侧位置(即，沿着该卵的长轴)。根据该实施方案，该卵在典型的情况下应被定向于一个大体上水平的位置，即，使长轴同水平的倾斜角度低于约45度。在特定的实施方案中，以卵的长轴为准该卵同水平的倾斜角度低于约30、20、15、10或者5度。在其它的实施方案中，该卵被置于一个基本水平的位置，即，该卵沿其长轴基本上无倾斜(例如，同水平的倾斜低于约5％或者10％)。

[0056] 当装置被注射入该卵的侧面时，该装置一般应同时插入于内壳膜和外壳膜之中。在其它的特定实施方案中，该膜可在将开口制成于卵壳之上时被取出。在另一个特定的实施方案中，在将装置通过内壳膜插入之前在外壳膜上制出小开口，在该情况下内壳膜在将装置通过其插入之前保持基本完好。

[0057] 在特定的优选的实施方案中，以该卵的长轴为准卵被定向于竖直位置，该卵的钝端被定向于大体上朝上的位置。“大体上朝上的位置”指的是该卵被竖直定位并且长轴同竖向的倾斜角度低于约45度。在特定的实施方案中，以该卵的长轴为准该卵同竖向的倾斜角度低于约30、20、15、10或者5度。在其它的实施方案中，卵被置于一个基本直立的位置，即，该卵沿其长轴基本上无倾斜(例如，同竖向的倾斜低于约5％或者10％)。根据该实施方案，该卵总体上的倾斜使得早期胚(例如胚盘)被定位于该卵钝端的气室之下。

[0058] 卵壳膜中的开口可被制成于一个预定的位置(例如，位于卵的钝端的中央或者位于卵的钝端气室的中央)，或者可被制成于一个由早期胚(例如胚盘)的位置所决定或者至少部分决定的位置。

[0059] 本发明还可被有利地用于向早期胚中或者从早期胚中进行卵内的物质递送或者取出(如上描述)。在特定的实施方案中，早期胚为胚盘(亦如上述)。同样优选的情况还有，早期胚处于卵中的气室可检测的阶段。

[0060] 物质可被释放于胚(例如胚盘)本身之中(例如，于明区或者暗区之中)。或者，物质可被释放于早期胚附近(例如，正在其上、其下或者邻近)，其同胚(例如胚盘)的距离在约10、8、5、3、2或者1mm之内或者更近。根据这一实施方案，物质可被释放于胚的胚下腔、介于暗区和卵黄膜之间、介于明区和卵黄膜之间和/或加入明区和暗区之间。在本发明的另一个实施方案中，物质被释放于卵黄心和/或释放入潘德而氏核。

[0061] 递送PGC的方法在本领域中是已知的，并且一般通过将PGC注射进入胚的血管(例如背动脉)中或者注射进外胚膜中任何一条足够大的血管(例见，专利出版物WO99/06533；University of Massachusetts)而进行实施。类似地，可从胚的血管中或者从PGC期胚的外胚膜的血管中进行血样的收取。

[0062] 在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种向含有早期胚(例如胚盘)以及气室的鸟卵中递送某种物质的方法，该方法包括：将卵定向以使卵的钝端处于一个预定的位置(例如，如前所定义处于一个大体向上的位置)，在卵的钝端于气室之上向卵壳以及外壳膜中引入一个小开口，该情况下内壳膜保持基本完好的状态，通过在卵壳和外壳膜上的开口伸入一种递送装置，以递送装置刺穿内壳膜，以及通过该递送装置将某种物质释放进入胚盘或者其附近。

[0063] 在外壳膜上形成开口以及刺穿内壳膜的步骤可通过将装置穿过此两种膜而在基本上同步实施。在特定的实施方案中，一个开口应首先被制成于外壳膜上，并且随后该装置应被插透内壳膜以在其上产生开口。类似地，卵壳中的开口可在外壳膜上开口的形成之前形成(例如，首先将一个开口穿入卵壳并随后开口被穿入外壳膜)或者基本上同时形成(即作为单一步骤)。

[0064] 根据上文所述，在优选的情况下穿过内壳膜的注射并不是通过将一个液滴沉积在内壳膜上而完成。在那些通过液体进行注射的实施方案中，在优选的情况下该液体为一种水性液体(例如，一种白蛋白溶液)并且仅仅有小体积(例如，二至十微升)沉积于内壳膜上。

[0065] 本领域的技术人员将会意识到，本发明的方法可在多个鸟卵上实施，例如，在商业化的家禽作业中实施。当本发明的方法在多个鸟卵上实施时，可以在禽群整体水平上观察到提高的孵化率和降低的发病率，尽管经受卵内操作的个体鸟类中仍然存在一定的发病率和致死率。

[0066] 在优选的情况下，接受操作的卵中的孵化率至少约为40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者更高。同样优选的情况下，接受操作的卵中的孵化率类似于在未经操作(例如，未在壳中产生开口，等等)的参照卵中所观察到的孵化率，或者孵化率同参照卵相比较的减少低于约25％、15％、10％、5％、3％、2％或者甚至1％。

[0067] 在特定的实施方案中，本发明可被用于向含有早期胚(例如，胚盘)的卵中递送某种物质或者向早期胚本身递送某种物质。任何物质均可通过本发明的实施方案进行注射，包括细胞、疫苗、多肽、生长刺激物、原生培养物，例如竞争性排它培养基(competitive exclusionmedia)、抗生素、异源核苷酸序列(包括基因转移载体)、维生素和/或标记物，例如染料等等，但不限于这些。这些物质可单独注射或者联合注射(例如，抗生素可被包括入其它物质的递送之中)。作为另一个阐示性的例子，一种染料或者其它标记物可被包括于其它的物质之中进行注射以提供一种测定该递送是否达到所需位置的方法。

[0068] 本文所使用的“多肽”包括蛋白质和肽。用于向卵或者胚本身中递送的多肽包括抗体、抗原(例如，用于免疫化)、生长因子、激素以及其它生长或者性能增强性多肽、酶、细胞因子等等。

[0069] “生长或者性能增强”指的是生长速度、动物体的最终体积、投入产出比(feed to gain ratio)、卵产量、肉产量等等有所提高。

[0070] 疫苗有机体包括死亡、活体或者减毒的病毒、细菌、原生动物和真菌，包括这些不同的有机体的多种生活期在内。

[0071] 该方法还可被有利地应用于向发育中的胚内引入所需的核苷酸序列(在优选的情况下，核苷酸序列被稳定地转化进入胚细胞)，即，用于产生一种转基因的鸟类(如前所述)。本领域的技术人员将会意识到，让所产生的转基因鸟类的每个细胞均含有该转基因是不必要的。核苷酸序列可以为DNA或者RNA，并且序列可编码任何目的多肽或者可编码非翻译RNA(例如，反义RNA或者核酶)。在核苷酸序列编码多肽的实施方案中，多肽可为一种报告多肽(例如，诸如绿色荧光蛋白或者碱性磷酸酶这样的酶)、一种治疗性多肽、一种免疫源性多肽(即，用于接种疫苗)、一种生长或者性能增强性多肽，等等。

[0072] 可以使用本领域所已知的任何载体和方法将核苷酸序列引入胚。例如，可以使用病毒载体(例如，反转录病毒)或者DNA载体以携带目的外源核苷酸序列。在特定的实施方案中，病毒载体不被用于将核苷酸序列引入胚。向细胞中进行病毒转导和裸露的DNA载体的引入(例如，使用脂质体或者电穿孔)的方法在本领域中是已知的。用于卵内电穿孔的装置包括BTX ECM 2001电穿孔装置(www.genetronics.com)。

[0073] 在其它的优选实施方案中，本发明被用于将一种“外源”或者“供体”细胞引入受体胚(即，用于产生一种嵌合胚并且根据情况产生嵌合鸟类，如上文所定义)。供体细胞可以是一种转基因细胞或者具有任何其它用于向胚中进行引入的目的特征。如前所述，供体细胞在典型情况下应为一种鸟类细胞。

[0074] 在特定的实施方案中，受体胚和供体细胞来自于相同的鸟种。或者，供体细胞可来自于一种与受体胚不同的鸟种(例如，将一种火鸡细胞送入一种鸡胚)。作为进一步的备选，胚和供体细胞可来自于相同的鸟种，但来自于不同的品种(breed)或者品系(strain)(例如，鸡的两种不同的品种或者品系)。受体或者供体细胞可来自一种频危的鸟种。

[0075] 进一步，供体细胞还可来自于表现出色或者血统优良的鸟类。在典型的情况下，表现出色或者血统优良的鸟类被用作为育种禽群以产生具有所需性状的谱系。本发明有利地实现了对来自于单个表现出色或者血统优良的鸟类的细胞的直接转移从而一步便产生了多个“后代”，而非通过连续传代扩展品系的传统方法，该传统方法可导致一些所需性状的消褪或者丧失。这些表现出色或者血统优良的鸟类可在任何所需的性状(例如，在商业上重要的性状)上有所改善或者具有优越性，包括，增高的肌肉产量、减少的脂肪成分、改善的疾病抗性、不同的体积(例如，较小的鸟类)、羽毛减少的降低或者不同的羽毛组成，和/或不同的雄鸟比例，但不限于这些。

[0076] 在典型的情况下，供体细胞将选自胚盘细胞、干细胞、培养的干细胞、胚胎干细胞、原生殖细胞以及胚生殖细胞。

[0077] 在一些实施方案中，在引入供体细胞之前使受体胚中的细胞受损是需要的。使胚细胞受损的方法为本领域的技术人员所已知。使胚受损的适当的方法包括，去核(从受体胚中取出细胞)、机械伤害(例如，撕裂)、伽玛照射、微波、软X-射线、化学处理(例如，氨气)、热、激光处理和/或低温冷冻等等，但不限于这些。在特定的实施方案中，放射照射、加热、化学处理以及软X-射线可被用于全卵。在其它的实施方案中，紫外照射、微波、热、激光处理、低温处理、机械伤害和去核可被用于通过卵壳上的开窗对胚进行损伤。

[0078] 胚的受损程度可通过本领域中所知的任何方法进行测定，例如，通过染料，特别是荧光染料，该方法选择性地对死亡细胞(例如，碘化丙啶)或者凋亡细胞(例如，Hoeschst333342染料)进行染色。或者，可对本领域已知的指示死亡或者凋亡状态的mRNA转录本或者多肽进行检测。

[0079] 因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种产生嵌合鸟类的方法，该方法包括的步骤有，将一个小的开口引入卵壳中，通过在卵壳上的开口伸入一种递送装置，以递送装置刺穿内壳膜，其中内壳膜在被插入递送装置之前保持基本完好，在足以产生嵌合胚的条件下通过递送装置释放一种供体细胞，并将供体细胞沉积在胚盘之上或其附近(如上所述)，从卵之中收回递送装置，并且将嵌合胚温育直至孵化以产生嵌合鸟类。

[0080] 这些细胞向胚盘之中的成功递送和/或嵌合体的产生可通过本领域的已知方法进行估测。例如，可以使供体细胞接触某种染料(例如，荧光染料诸如羧基荧光素-二乙酸-琥珀酰酯)、金颗粒，或者任何本领域中已知的可以在细胞向受体胚的递送之后被检测到的其它标记物。或者，供体细胞可以携带特定的表位或者核酸序列，这些表位或者核酸序列可以使用抗体或者标准核酸检测方法进行检测以对供体细胞或其后代在胚盘、胚或者所产生的鸟类中的存在进行鉴定。另外，在替代的情况下，供体细胞可携带某种或者某些基因，该基因产生一种特定的表型性状，该表型性状可容易地在胚或者孵化后的鸟体中进行检测(例如，羽色)。

[0081] 本发明的上文说明主要涉及将某种物质递送入卵或者早期胚(例如，胚盘)的方法。对卵进行注射的方法还可以被用于将一种取样装置插入于卵之中以从该卵(例如，如上文所述，从胚中)之中收取物质(即样品)或者对来自卵的信息进行检测(例如，来自胚)。

[0082] 在一个实施方案中，可将某种取样装置插入于卵之中以从其中收取样本。样本可取自于卵的外胚部分(例如，卵黄或者白蛋白)。例如，可从白蛋白中收取样品以测定微生物污染(例如，沙门氏菌)在其中的存在与否。在其它的实施方案中，样品取自于早期胚(例如，胚盘)，例如明区、暗区和/或胚下腔。在本发明的实施方案中，样本含有胚盘细胞。在典型的情况下将对样品进行收取以获得来自其中的信息。例如，样品的收取可同性别鉴定或者测定胚的活力的方法联合使用。为加以说明，可从胚中收取含有细胞的样品，并且根据本领域的技术人员所知对这些细胞进行分析(在典型的情况下进行于从卵中的收取之后)以测定性别染色体或者染色体上的性别特异性序列。样品还可被用于任何其它的基于DNA的分析，例如，用于测定某种特定的目的基因或者等位基因在胚中的存在。

[0083] 在另一个实施方案中，可将一种检测器装置插入卵以检测其中(即，来自卵和/或来自胚)的信息。检测器可被插入于卵中的一个胚外位置(例如，卵黄或者气室)。或者检测器可被置于胚的明区或者暗区之中或者胚下腔中。

[0084] 检测器装置可被用于收集信息，这些信息包括，胚的大小、胚的位置、胚的发育阶段、胚的性别和/或胚的活力，但不限于这些。在优选的情况下，检测器装置获得的信息涉及胚和胚下腔的位置。信息可由同检测器相联结的仪器(例如，计算机或者其它数据处理器)进行捕获。

[0085] 对于特定的实施方案，卵接受了鉴定，从中收取了样品或者使用检测器对信息进行检测。涉及样品或者由检测器所获得的信息可同卵的标识一起保存。示例性的检测器装置在下文中进行更为详尽的讨论。

[0086] 图1-6为展示本发明的特定实施方案的流程图。

[0087] 如图1中所显示，根据本发明的对含有早期胚(例如，胚盘)的鸟卵进行注射的一个特定的实施方案包括的步骤有，在注射之前对卵进行准备1000，将胚在卵中进行定位2000，将一个开口引入卵之中3000，对胚的位置进行定位4000，以及将一种装置插入卵内的所需位置之中5000。

[0088] 如图2中所显示，卵可根据情况在注射之前进行准备。卵的表面，至少是注射位置周围，受到了消毒处理以降低微生物污染1200(例如，使用酒精或者其它消毒溶液)，卵可进一步在一个预定位置进行定向1300(例如，使卵的钝端处于大体朝上的位置)。在特定的实施方案中，对卵在注射前进行贮存1100。在典型的情况下，对卵进行贮存的时间足以辅助将胚定位或者“定向”于卵内所需的位置，但不足以对胚产生不可接受的致病或者致死发生率。为进行说明，卵可被贮存六小时、十二小时、二十四小时或者更长。只要活力不受到不适当的损害或者胚的发育不超过适于本发明的时间点，则贮存时间没有特定的限制。这些卵在注射前可被贮存长达约30或者甚至约60天。在本发明的实施方案中，卵在注射前可被贮存约30天或更短，约14天或更短，约10天或更短，或约7天或更短。在其它的特定的实施方案中，卵在注射之前被贮存约1、2、3、4、5、7、8、10、14或21天；或者约1-21天、约1-14天、约1-7天、约1-4天、约4-8天或者约6-12天。

[0089] 一般情况下，对卵进行贮存的条件(例如，温度)应不促进卵内的胚的发育或者可避免超过所需的发育阶段(例如，胚盘期)的发育。本领域中的技术人员应会意识到，在贮存期间可发生一些细胞分裂；但是，总体上胚的发育在贮存期间被暂时中止或者明显地延迟。

[0090] 在贮存期间，卵可被定向于一个水平或者竖直位置(以长轴为准)，或者处于一定的角度。在特定的实施方案中，卵被贮存的方向与注射所使用的相同。进一步，卵可被维持于一个固定的位置(例如，在装置中)，在该位置中侧向(side to side)移动以及绕长轴的转动都受到限制或者受阻。

[0091] 在特定的实施方案中，如上文所述，胚可进一步在对胚的注射之前受损。

[0092] 如前文所指出，在注射之前对胚进行定向或者定位是理想并且有利的，特别是对于对卵进行注射的自动或者半自动方法。对于图3，如上所述，卵可在注射2100之前进行贮存以促进胚盘定位于卵黄的顶端中心表面。在替代的情况下，或者与此同时，可对卵进行振动(agitate)(例如，进行摇晃)2200、转动2300、离心2400和/或旋转2500以辅助胚的定向。在替代或者进一步的情况下，卵的内容物可受到温度条件的变化，变化通过加热2600(例如，加热至温度介于约55°F或者约60°F到低于约75°F、80°F或者95°F
之间)或者降温2700。根据上文所讨论，本领域的技术人员将会意识到，卵被应用于足够温和的加热处理(时间×温度)从而使胚并不发育超过所需的阶段。作为进一步的替代性或者进一步的处理，卵可受到化学处理(例如，使用氨气处理白蛋白)2800以辅助胚定向于所需位置。另外，或者在替代的情况下，卵周围的空气湿度可受到控制2900(例如，高于或者低于约75％)。

[0093] 在特定的实施方案中，这些卵受到导致白蛋白稀薄(即，破裂卵中稳固程度的丧失或者减低的Haugh单位)的处理(例如，化学或者机械处理)。据信较稀的白蛋白辅助胚盘定位于卵黄顶部中心表面。或者，来自较老的禽群的卵和/或较大的卵可被用于本发明的方法。由较老的产卵禽只产生的卵以及较大的卵均更有可能具有相对较稀的白蛋白。

[0094] 氨气在文献中已经被报道可导致白蛋白的稀薄。卵可被暴露于任何可导致胚盘定位于所需位置的适当水平的氨气。适当浓度的氨气可低于约100、150、250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000或者3500、4000、5000、6000、7000或者8000mg/kg或者更高，在足够的时间内使用(例如，约0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5或者6小时)。在特定的实施方案中，这些卵在相对较短的期间(例如，约0.5到1小时)被暴露于相对较高水平的氨气(例如，约
2000到4000mg/kg)。在其它的实施方案中，卵在约0.5到2小时的期间被暴露于低剂量的氨气，浓度为约250-1000或者500-1500mg/kg。

[0095] 在特定的实施方案中，一些手段的联合被用于帮助该胚盘定位或者定向于卵黄的顶部中央表面。例如，在一个特定的实施方案中，该卵在约65℃到约75℃之下被贮存了约2到7天，同时在贮存期间转动该卵。进一步，被选用与这一处理的卵可为较大的卵和/或来自较老产卵禽只的卵。

[0096] 对于图4，一个小的开口被引入卵壳3300以及外壳膜3400。尽管这些步骤被分别实施，它们也可以基本上同时实施，特别是在自动或者半自动的方法中。作为进一步的备选步骤，可对位于卵钝端的气室的位置进行测定3100，该步骤在典型情况下在向卵壳内引入开口之前进行。作为进一步备选的步骤，可在卵壳3200中产生开口之前或者之后对其使用一种密封剂，从而使在卵壳内的开口基本上自行封闭。在替代的情况下，或者进一步的情况下，可在使用装置刺穿内壳膜之前或者之后对内壳膜使用密封剂。

[0097] 在本发明的一些实施方案中，装置将以预定的深度和位置被插入卵。在其它的实施方案中，装置将根据卵中的特定区室或者结构的位置插入卵，例如，根据卵中的胚或者胚下腔。胚或者胚下腔的位置的测定可与注射(或者取样)同时进行或者在此之前进行。对胚进行定位的优选方法示于图5。对于手动或者半自动注射方法，胚可简单地通过在卵壳上的开窗进行观察(使用或者不使用放大装置)4200。卵可进一步被旋转4100以使胚进入视野。可通过以特定波长的光(例如蓝色)通过卵壳上的开口对卵内部进行直射或者通过加入反差剂(例如，一种着色或者荧光染料)而增强胚和背景的反差。使用本领域中所已知的工艺，早期胚的观察还可以通过对雌鸡喂以可以影响卵黄颜色(例如，成为紫色阴影或者黄色的不同阴影)的食料或者化合物。

[0098] 在其它的实施方案中，特别是在自动或者半自动注射方法中，涉及胚或者其它区室在卵中的位置的信息可以使用检测器装置进行检测4300。检测器装置在下文详细讨论，可以是侵入性或者非侵入性装置。然而，在典型的情况下，某种装置将被插入卵壳和外壳膜的开口中以收集同测定胚在卵内的位置相关的信息。检测步骤可基本上同递送和/或取样步骤同时进行。或者，这些步骤可以依次进行。用于同步进行卵内注射和检测的装置在美国专利No.6,244,214(Hebrank)中有所描述。

[0099] 根据上文描述并且如图6所示，内壳膜在通过其插入某种装置之前被维持于基本完好的状态(如上所述)。一个小开口被制成于内壳膜中5100，典型情况下该开口位于胚之上方或着其附近。在典型的情况下，开口通过刺穿内壳膜而制成，过程通过将某种装置穿过内壳膜进行插入而完成。装置可为递送装置5200，取样装置5300，或者检测器装置5400。在一些实施方案中，装置可含有检测器、递送和/或取样功能。

[0100] 在一些实施方案中，向卵壳和外壳膜中引入开口的步骤以及根据情况进行的刺穿内壳膜的步骤被同步实施，即，在一个步骤中进行。但是，在典型的情况下，开口将作为一个单独的步骤被引入卵壳，这是因为根据本发明所使用的装置基于其功能(例如，微注射针头)可能会具有过细的直径而不能刺透卵壳。类似地，尽管本发明可通过同时穿过外壳膜和内壳膜的注射而实施(特别是在对卵的侧面进行注射的情况下，此二种膜融合于该处)，当对卵的钝端进行注射时这些步骤一般将会分开实施。

[0101] 本文所描述的注射方法可是完全手动、完全自动或者半自动。例如，如图1所示，卵的准备步骤和对胚进行定位的步骤可更能适于手工方法。在卵壳和外壳膜中引入开口的步骤、定位胚并且插入装置的步骤可以是手工步骤，但在优选的情况下为自动步骤。

[0102] 在优选的实施方案中使用了一种多位点的注射或者取样装置，例如，根据美国专利No.6,032,612的描述(Williams等)。其它的优选的递送或者取样装置包括在美国专利No.5,136,979(Paul等)；美国专利No.4,681,063和4,903,635(Hebrank)；以及美国专利No.4,040,388、4,469,047、4,593,646(Miller)中描述的装置。

[0103] 在进一步的一个实施方案中，一种进一步含有一种检测器的注射装置被用于在向卵中进行注射(用于取样和/或向卵或者胚中递送物质的目的)之前或者与之同时收集有关胚(例如，胚盘)或者其它区室的位置的信息，注射器根据美国专利No.6,244,214(Hebrank)中的描述。

[0104] 检测步骤的时机取决于方法的具体目的和待检测的项目，以及用于注射的材料或者被收取的样本的性质。一般情况下，检测步骤可在递送或者取样步骤之前、之后或者同时进行。

[0105] 电子传感器、光学传感器、化学传感器、温度传感器、声传感器、压力传感器或者其它用于检测物理或者化学参数的装置可在实施本发明的这一方面中内用作为检测手段或者检测器。检测器或者传感器可联至注射装置的外壁，或者对于电子检测器以及在装置有导电的金属材料而非绝缘或者多聚物材料制成的情况下，注射装置的外壁本身可作为检测器，其中具有适当的电路与之相联。检测器可以是一个或者两个(或多个)电极，这些电极由一种不导电的注射装置携带或者装在一种导电的注射装置的绝缘部分之上。应会受到认可的是，出于感受在卵解剖结构中的深度或者位置的目的，多个不同的物理或者化学参数可被感知或者检测，只要这些参数为该卵是否应被注射或者是否已经达到了特定的深度或者位置提供了有用的指示信息。

[0106] 传感器可被置于注射装置的顶端，或者位于其外壁上的预定位置，以及/或者离开注射装置的顶端。

[0107] 生物传感器可被用于实施本发明。已知多种生物传感器。例见，美国专利No.5,804,453、5,770,369、5,496,701、4,682,895、5,646,039、5,587,128和4,786,396。

[0108] 当使用电子传感器时，可能需要提供第二个电极同第一个电极进行操作联结。在使用两个电极的情况下，它们可同时与注射装置相联，或者一个与注射装置相联而另一个通过卵壳上的同一开口另行插入。在一个优选的实施方案中，第二个电极同卵的外部相接触。一个电信号可通过此二电极，并且检测这两个电极之间传导的存在与否。当第二电极简单地同卵的外部相接触时，信号在优选的情况下为交流电信号，从而使第二电极同卵的内容物电容性耦联(capacitively couple)。在优选的情况下，各个卵(或者容有多个卵的平板)在使用电子检测器进行检测之前被置于一种导电材料的顶部(例见，涉及导电聚氨酯泡沫的美国专利No.5,591,482)。

[0109] 当使用电子检测器对诸如胚下腔这样的充液区室的位置进行感测时，电子检测器对进入液体区室的探头的进入进行感测，并且由此而用作为深度检测器(术语“深度检测器”在此包括“位置感测器”)。在本发明的一个实施方案中，检测器和/或相联的注射装置的移动在检测器和/或装置进入区室时被中断。通过该方式，注射装置可在刚好刺透胚下液后并且完全刺透该腔之前停止前进。

[0110] 光学传感器可包括光导纤维，并且可同注射装置的外壁部分相联。可通过第二个光导纤维提供一个光源，第二光导纤维与该装置同时插入卵，或者将一个外部照明源照在该卵之上。光传导或者透射特征可被用于测定胚或者胚下腔的位置。光还可以检测某种颜色标记物，该标记物用于生理测量、疾病测量或者性别测量。

[0111] 化学传感器可以以生物传感器领域中的技术人员所知的任何形式进行提供。例如，可以通过来自Becton Dickinson MicrobiologySystems，Cockeysville，美国马里兰的脂质体技术或者根据美国专利NO.4,703,017和4,743,560中的描述而提供一种化学传感器。当这些组件被装配于注射装置之上时，这样一种分析的结果可根据上文通过使用光导纤维而读出。其它的化学分析可通过电化学检测而实施。这样的传感器可被用于，例如，测定卵之中的胚的位置或者性别。以及用于检测卵中的可能的微生物感染。

[0112] 化学传感器可为装配于注射装置上的pH传感器，pH测量被用于检测可能的微生物污染、将死卵和活卵区分等等。还可以使用检测不同阳离子或阴离子种类的离子特异性电极，如下文所进一步描述。离子和pH探头通过存在于卵的多种区域和区室的生物液体的化学性质的差异而感测卵内区室间的移动。

[0113] 温度传感器可被用于将活卵同死卵进行区分或者用于根据温度对胚和/或胚下腔进行定位，或者用于卵的性别分选。

[0114] 声传感器可被用作为被动或者主动传感器(即，同声信号源相联，例如同卵外部相接触的转导器)以检测深度、将可孵卵和不可孵卵加以区分、测定胚或者胚下腔的位置，等等。

[0115] 通过多种工艺可植入一种位置或者深度传感器。同气室膜的电接触可被用于控制装置相对卵的预定区室的刺穿，例如，相对于气室膜下的预定深度，或者被用于确保在胚下腔内、在胚内或者任何其它位置的更为精准的注射，等等。或者，可以使用一种压力传感器感测深度，传感器估测该装置在卵内的区室之间(例如，从气室到胚；从胚到胚下腔；等等)进行移位的期间的压力变化。感应该传感器的位置的一个适当的方法对包围该传感器的卵介质加诸于传感器上的压力进行测量。例如，可使用注射装置或者充满空气或者液体的中空管，对将气体或者液体注入包围着位于传感器中的出口的介质所需的压力进行测量。所需的释放压力在出口从充气区室(例如，气室)移动到充液区室时有所提高；当出口从充液区室移入胚时再度提高。压力的变化可通过放在卵外部的压力测量装置进行测量。

[0116] 光传感器可同外部光源或者由装置所携带的光源进行联合使用，从而对装置是否位于诸如气室这样的充气区室、诸如胚下腔或者卵黄这样的充液区室或者诸如胚这样的细胞区室进行区分。

[0117] 传感器可以是用于检测卵之中的细菌污染或者其它微生物污染的诊断传感器，这些污染的例子如，大肠杆菌、沙门氏菌或者单核细胞增多性李斯特菌对卵的污染。诊断型传感器可通过任何适当的手段被植入，在典型情况下为一种化学传感器或者生物传感器。对被污染卵的检测可被用于触发一个信号以用于随后对被污染卵同未污染卵进行分选。

[0118] 多个传感器可同装置进行连接。例如，在需要对卵的微生物污染进行检测、测定卵中的结构的位置的情况下，或者在需要对卵进行性别分选的情况下，提供两种不同的或者各异类型的数据以提供所需条件的更为精准的指示可能是有利的。

[0119] 检测步骤可通过从卵中收取样本放入一个处理系统进行实施，在处理系统中进行了随后的分析。例如，一个液体样本可被收取并且进行分析以从其中获得所需的信息，获得信息的方式与用于处理小液体样本的分析系统的方式(例如，在该系统中样品通过液体处理线内的气障而被分离)相同。在该情况下，提供一种用于鉴定进行了样本收取的卵的方法是优选的，例如，通过提供硬件、软件或者硬件和软件的综合以用于对这些卵和各个卵的相对位置进行计数。并且同取样的时间相关联并且将这样的信息进行短期或者长期存储直至该信息在所需的方式下被使用(例如，用于排除某种特定的卵、用于间别鸟的性别并且进行性别分选、或者用于提供关于被注射的卵的质量和其它一些信息的庞大数据库)。

[0120] 应意识到，本发明可提供一种途径以对被注射的卵的大量信息进行记录和存储。例如，可获得种群信息以用于质量控制程序、或者用于对卵的先期处理进行修正、或者修正选择孵化程序。在这些情况下，被注射卵的表示可以成为该卵同特定批次卵的联系，而不仅仅是其作为该批次卵中的特定个体的标识。

[0121] 因此，本发明提供了对含有早期胚(例如，胚盘)的鸟卵进行操作的方法，以及对胚本身进行操作的方法。本发明可被用于，例如，从卵中收集信息、从卵中收取样本，和/或向卵递送物质。

[0122] 已对本发明进行了描述，可参考具体的实施例例示本发明，这些实施例仅仅用于例示性的目的，非意味着对本发明的限定。

[0123] 实施例1

[0124] 下文为一种示例性的方法，该方法用于将液体或者细胞通过卵的钝端对受体鸡胚盘进行卵内注射。

[0125] 1.通过以100％乙醇进行擦拭对E0日的卵的整个卵的表面进行表面消毒。

[0126] 2.对光检查该卵以对气室进行定位。使用铅笔在壳的表面标记该气室的位置。

[0127] 3.通过将壳dremeling away而在卵的钝端(在气室的中心)制出小开窗(小开口)。小心保持外壳膜的完好。

[0128] 以下所有的步骤在优选的情况下在层流净化罩(laminar hood)或者干净的房间内进行实施：

[0129] 4.在外壳膜通过壳上的开窗暴露的情况下，再度使用70％的乙醇对卵的钝端以及周围区域进行消毒。

[0130] 5.使用镊子和解剖刀(#11刀刃；Personna Medical)小心地除去外壳膜，同时小心不要在膜上留下锯齿状边缘。

[0131] 6.胚盘可见于气室膜(即内壳膜)下，为环状结构。

[0132] 7.使用玻璃微移液吸头(或针头)刺穿气室膜并且注射进入胚盘的胚下腔液。约3-5微升液体(含有100g/ml的青霉素-链霉素)被注射。使用Sutter P-30推进器推进微移液吸头；温度-800，Pull-950。

[0133] 8.注射之后，将经过剪切以适应开窗的防水胶带(Johnson&Johnson，1英寸宽)粘贴其上并且压入位置。

[0134] 9.硅树脂(GE Silicone II，干净)封胶随后被洒在胶带的整个表面上，其重点在于封缄胶带的边缘。

[0135] 10.在将这些卵转入温育器中之前，将硅树脂干燥约30-45分钟。

[0136] 实施例2

[0137] 进行了一系列的实验，以评估实施例1的手工注射对于将液体或者细胞卵内注射入受体鸡胚盘(约为X期)的胚下腔的应用。供体细胞也来自于X期的鸡胚盘。在一些情况下，受体胚在注射前受损。在早期的实验中，一小滴(几微升)的白蛋白溶液被滴于胚盘上方的内壳膜上并且通过白蛋白液滴而刺穿该膜而进行了注射。在较晚的实验中，该步骤被省去。这些卵在处理之前不经保存或者保存4-8天。

[0138] 对参照卵和经操作的卵的孵化率进行了测定。成功的嵌合体的产生率也经受了评估。结果示于表1之中。

[0139]

[0140]

[0141] 实施例3

[0142] 对胚进行物理损伤的特定方法，例如紫外(UV)照射或者激光切除，可通过卵壳和壳膜上的开窗进行实施。我们已经开发了一种方法用于在卵的侧面产生开窗、将其封缄、并且将卵在标准条件下进行温育(99F，滚动)，这样使高百分比(＞90％)的胚在两天内正常发育(图7)。该方法可被用于估测在胚发育的两天之中的损伤效率和嵌合体的产生。进一步，该方法可被用于对卵的侧面的注射。

[0143] 简而言之，该卵受到如下的处理：

[0144] 1.在60F、75％得湿度下贮存这些卵0-7天，长轴平置(on their longaxis)，从而将胚盘定位于卵侧面的中心位置。

[0145] 2.使用sharpie pen对朝上的位置进行标记。

[0146] 3.贮存之后，在卵的侧面的笔标记位置上钻出7-mm的洞。

[0147] 4.除去壳。通常内壳膜和外壳膜保持完好，并且将这些膜也除去。

[0148] 5.对胚盘进行鉴定，胚盘在卵壳上被制出的开口附近或者直接位于其下。仅仅在胚盘直接位于开口之下的情况下卵才被用于这一特定的实验，这样可允许多种损伤处理的应用，例如UV光照。

[0149] 6.将洞保持开放5-10分钟。

[0150] 7.使用GE Silicon II和J&J防水胶带将洞封缄。

[0151] 8.将Silicon干燥约30分钟。

[0152] 9.将这些卵置于温育器中，钝端朝上，洞在其侧，并且在99F下温育两天，每3小时转动一次。

[0153] 10.从卵中收集胚以用于照相。

[0154] 代表性的参照和受处理胚的照片示于图7之中。

[0155] 实施例4

[0156] 一种对胚盘细胞在受体胚中的整合进行监测的方法被开发出来。该方法适用于对新鲜分离自任何鸟类或者品系的胚盘细胞进行追踪，并且应可容易地应用于对其它细胞的整合进行监测，例如胚性干细胞。概括该方法，新鲜分离的胚盘细胞在注射之前被暴露于羧基萤光素二乙酸琥珀酰酯(CFDA SE)。CFDA SE为一种氨基反应化合物，该化合物在同细胞内蛋白质进行反应之后荧光升高。一旦该化合物掺入胚盘细胞，这些细胞可以通过荧光显微镜在受体胚中进行监测。

[0157] 在下文所示的实验中，以CFDA SE对新鲜分离的胚盘细胞进行标记并将其微注射入X期胚盘，微注射通过穿过在卵钝端的内壳膜的注射而进行(如图1所描述)。当在温育两天之后通过显微镜进行观察时，在多种组织中发现了荧光标记的供体细胞。图8显示了整合入温育两天的受体胚的体节中的被标记的供体细胞，从而产生了一个嵌合体胚。对于使用遗传修饰细胞以对供体细胞在早期胚中的整合进行跟踪，荧光染料标记可为一种吸引人的备选或者互补手段。

[0158] 实施例5

[0159] 为对鸡嵌合体的产生进行优化，可对受体胚进行‘损伤’或者预处理以使这些胚更易接受供体细胞。被最广泛接受的损伤方法涉及到将供体卵暴露于600rad的γ射线照射之下。为对供体胚上的各种处理效果进行估测，我们已经开发了一些工艺以对受体胚盘中的细胞死亡进行原位测定。

[0160] 为对死亡细胞进行原位鉴定，我们已经对使用碘化丙啶(PI)进行的染色标记进行了估定，该试剂为一种荧光DNA染料，该染料主要对于死亡细胞是可透过的。据发现，通过对脆弱的胚盘进行的最小量的操作和洗涤，PI有效地标记了死亡细胞。这些细胞可被鉴定并且通过荧光显微镜进行照像，并且通过数字成像分析测定细胞死亡的相对量(见图9)。死亡细胞在胚盘中的精确位置也可通过数字成像分析进行确定(见图9)。据我们所知，这是第一次在活体鸟胚中对细胞死亡进行原位测量。

[0161] 在该实验中，PI标记工艺被用于未受处理的、经物理损伤的和经热处理的胚。未经处理的胚盘(图9，第一栏)表现出低水平的背景细胞死亡。在本实验中造成的物理损伤(第二和第三栏)是胚盘的分离过程所导致的非故意的损伤。注意细胞死亡精确地定位于胚盘内的撕伤周围区域(图9，组j和k)。热处理(在水浴中55C保温15分钟)基于先前的数据，这些数据表明这样的处理完全阻止了孵化。根据本实验所示(图9，第四栏)，孵化上的减低有可能是缘于胚盘中极高水平的细胞死亡。荧光像素计数(图9，底排)可被用于定量测量以及在各种处理之间比较细胞死亡的数量。

[0162] 凋亡细胞(与死亡细胞对比)的检测也可通过使用荧光染料Hoechst 333342进行测定，染料对活体和凋亡细胞进行区分染色。凋亡和/或死亡细胞的测量可被用于测定受体胚受损的程度。

[0163] 实施例6

[0164] 以下研究被用于测定胚盘在卵中的位置和直径，卵在商业孵化所贮存条件下进行贮存。在一周的基础上对来自单一禽群的白来亨鸡卵(Bovans)进行测量；该禽群被研究至其产卵循环的结束。收到卵后，这些卵在60F和75％的相对湿度下保存于平板上6或7天，保存方式类似于这些卵在商业孵卵场所中的贮存。每周测量平板上的59个卵。对于在平板上保存了6或7天的卵，胚盘的平均离中心距离为5.24，有3.05％的胚离中心太远难以看到。

[0165] 另外对一种Hy-Ling W-36白来亨鸡禽群进行了研究。这些卵在产后最多48小时被收取。这些卵在60F和75％的相对湿度下保存6或7天。对于在平板上保存了6或7天的卵，胚盘的平均离中心距离为5.86mm，有3.96％的胚离中心太远难以看到。

[0166] 在对胚盘位置进行测量时还对这些胚盘的直径进行了测量，包括明区的直径在内。在商业孵化所贮存条件下的结果见下表2。这些卵被保存了7天，这些胚被典型地认作为X期胚。

[0167] 表2

[0168]

[0169] 实施例7

[0170] 为测定胚是否可通过调整贮存条件而被动地进行定位而进行了一些实验。这些卵或者根据商业条件在平板上贮存(参照)，或者在一种被称为“固定器(fixture)”，该固定器使卵保持于固定的竖直位置(钝端向上)，其中基本上防止了侧向移动和绕垂直轴的转动。

[0171] 在进行中的使用Bovan禽群的研究中(这些母鸡处于其产卵的第69周；它们产卵高达约70周，无换羽)，总共2,766枚卵于60F和75％RH下在平板或者固定器中贮存7天(30枚卵贮存于平板中，30枚卵贮存于固定器中，在31周中每周均进行)，在一台Acu-Gage光学CoordinateMeasuring Machine(CMM)中对这些卵进行测量，该装置具有一个蓝色光纤光源以增强胚盘的对比度。基于所收集的数据，在平板上保存7天的卵的胚盘平均离心距离为5.24mm。对于在固定装置中保存7天的卵，该离心距离改善至平均4.58mm，该装置固定卵以使卵的长轴竖直。在保存于平板上的卵中，3.05％的胚离中心太远难以看到，而对在保存于固定器的卵中，仅仅2.53％离心太远。来自于Elizabethtown，Pennsylvania的Hy-Line W-36卵也接受了测量。总计1,649枚卵被测量，其中这些卵在60F和75％的相对湿度下保存6或7天。对于在平板上保存了6或7天的卵，胚盘的平均离中心距离为5.86mm，有3.96％的胚离中心太远难以看到。对在固定器中进行保存以使其长轴竖直的卵，其离心距离略为好一些，平均为5.31mm，并且4.81％的胚离中心太远难以看到。

[0172] 对这些数据(Bovans，23-69周；Hy-Line，26-42周)进行了统计分析以确定在固定器中固定卵是否可以影响胚盘的位置。来自不育或者受损的卵的数据被排除在外。如果胚盘离中心太远以致难于测量则使用13.716作为该值。使用协方差分析，该分析将位置作为因变量并且固定保存装置(在固定器或者卵平板中)，该分析针对禽种分别进行。同在平板上相比较，在固定器中进行贮存对胚盘位置的影响见下表3，该影响是全部禽群年龄的汇总。

[0173] 表3

[0174]

[0175] 在固定器中进行贮存的效果对于Bovans(P≤0.001)以及Hy-Line(P≤0.004)是显著的；贮存于固定器中的卵使得胚盘显著地距中心更为接近。

[0176] 对贮存于固定器中的卵的数据组进行了分析以测定是否胚盘离心位置同禽群年龄和/或卵重量相关联。进行了协方差分析，该分析以位置为因变量并且固定禽群，以卵重量作为共变量(covariate)。以禽种划分该分析。Bovans卵显示出很明显(P≤0.001)的禽群年龄对贮存于固定器中的卵的影响，而Hy-Line并未显示出胚盘位置同禽群年龄之间的相关性(P≥0.05)。

[0177] 不出所料，卵重量随着禽群年龄有所提高；对于卵重量同胚盘离卵中心的距离观察到了相反的关系。Bovan数据组显示卵重量为显著的共变量(P≤0.05)；而卵重量对于Hy-Line卵并非显著的共变量。卵重量在Hy-Line分析中不是显著的共变量的原因可能是禽群年龄并未超出42周，因此卵重量可能还未成为影响因素。尽管Bovan数据组的回归分析显示出卵重量同胚盘位置的显著关联，据显示低于1％的胚盘位置变化可被解释由卵重2
量造成(R ＝0.007)。

[0178] 上述实验的参照组由贮存于平板纸上的卵组成。这些平板为一些存放卵的纸板；这些卵在置于这些平板纸上时可绕其垂直轴相对自由地移动。孵化场所使用塑料平板。在这些平板上卵绕其垂直轴仅仅具有受限水平的移动。为测定在塑料平板及纸板上贮存卵和在固定器中贮存卵的影响，在60F，75％RH下，在塑料平板或者纸平板上以及固定器中将Bovan卵贮存6天。如下表4所示，在贮存于塑料平板的卵中，胚盘离心位置有所降低，但在贮存于固定器的卵中，胚盘离心距离有很大改善。

[0179] 表4

[0180]

[0181] 实施例8

[0182] 进行了一些研究以测定不同贮存时间对胚盘位置的影响。先前的一项研究表明，贮存7天(60F以及75％相对湿度)的卵在胚盘的位置上显示出相对于0天的卵的明显改善(从0天的距中心9.71mm改善至7天的5.61mm，在0.0001水平上具有显著意义)，并且将卵贮存10天没有进一步明显改善胚盘位置。

[0183] 白蛋白浓度被认为是影响胚盘位置的变量之一；较浓的白蛋白限制了卵黄的转动。白蛋白以Haugh单位进行测量。在一个分立实验中，对不同时间长度进行了白蛋白浓度的测量。对来自55周龄的禽群的Bovan卵进行了称重并且在平板上贮存0、3、6、10、13或17天后测定Haugh单位。随着贮存时间的增加，白蛋白重量或者Haugh单位表现出明显的降低。

[0184] 进行了一个实验以测定贮存时间以及白蛋白浓度对于胚盘离中心位置的影响。对来自于37周龄禽群的Hyline卵进行了称重，并且在60F以及75％相对湿度下在固定器中贮存(钝端朝上)2、6、9、12或15天。保存6天的组被称为参照组。进行了以胚盘位置为因变量，贮存时间(天数)固定的协方差分析。另一独立分析中，Haugh单位被作为因变量，贮存时间作为固定变量。随后通过SNK分析对各个贮存时间的平均胚盘位置或平均Haugh单位进行比较。如下文表5所示，胚盘距中心位置随着贮存时间的增加而显著地减少，12天和15天的平均位置明显低于2天，6天和9天居中(6天的平均位置实际上低于9天，12天低于15天)。进一步，Haugh单位也随着贮存时间而降低，表现出比胚盘位置更为明显的影响。

[0185] 表5

[0186]

[0187] 总体上，使白蛋白稀薄表现得允许了卵黄更为自由的转动，并且由此而使胚盘的定位更为接近固定于钝端朝上的竖直位置的卵的“上止点(top dead center)”。

[0188] 实施例9

[0189] 还进行了一些研究以测定在贮存期间调节卵的朝向对胚盘的影响。对侧向摆放7天的卵进行的初步实验并未改善胚盘定位。但是，这些实验的实施通过将这些卵置于平板表面并且允许它们在侧向自由地朝向而进行。

[0190] 在本研究中，这些卵在不同的位置上根据实施例7中的描述贮存于固定器中以测定对胚盘定位的影响，该固定器限制了侧向移动和滚动。该固定器将这些卵保持于固定的水平或者竖直位置。对这些卵进行贮存的不同的朝向以及进行胚盘位置测量时这些卵的朝向如下：

[0191] 1.侧置(Bovan和Hy-Line W-36)，并且侧置测量。

[0192] 2.倒置(即，钝端朝下)3天(Hy-Line W-36)，随后钝端朝上3-4天，并且钝端朝上测量。

[0193] 3.倒置(即，钝端朝下)6-7天并且钝端朝上测量(Bovan)。

[0194] 4.倒置(即，钝端朝下)6-7天并且倒置测量(Hy-Line W-36)。

[0195] 结果概括于表6之中。

[0196] 表6

[0197]

[0198]

[0199] 卵的侧置贮存对于各个类型的卵并未产生显著改善的结果；尽管胚盘距离有所降低，离中心太远的胚盘数量也有增加。将卵倒置贮存3天获得了显著意义，但实际上增加了胚盘距卵中心的距离(p≤.057)。对倒置贮存的卵进行的合适一端朝上或者倒置测量均产生了显著性差异，但较大提高了胚盘到卵中心的距离，对Bovan和Hy-Line W-36均是如此。

[0200] 实施例10

[0201] 贮存温度和相对湿度对胚盘位置的影响也受到了研究。温度据信是影响白蛋白性质(即，浓度)的重要因素，白蛋白性质随之可影响卵黄的移动或者移动性，并因此而影响胚盘的位置。初步实验表明，在较高温度下对卵进行贮存可能辅助将胚盘朝向卵黄表面中心进行“定向”。

[0202] 来自47周龄禽群的Hyline卵在60(商业孵化场所条件)或者70华氏度(15.5或者21.1摄氏度)进行7天的贮存。胚盘距70度下贮存的卵中心的位置低于在60度下保存的卵(在p＝.063approachedsignificance)。

[0203] 在后续的研究中，探讨了卵贮存期间的温度和相对湿度条件的多种排列组合对胚盘位置的影响。对根据实施例7的描述贮存于固定器中6-7天的卵使用了温度和相对湿度的不同组合，以60华氏度和70％相对湿度作为参照处理。对一些不同的处理条件进行了评估：

[0204] 1.正常温度(60F)，而相对湿度(75％)被降至50％(Hy-Line W-36卵)。

[0205] 2.最初5天为正常温度(60F)和相对湿度(75％)，随后在贮存的最后2天提高温度至80度(75％RH)(Bovan)。

[0206] 3.正常温度(60F)，但相对湿度被设为90％(Hy-Line W-36)。

[0207] 4.温度被设为70F，相对湿度被设为50％(Hy-Line W-36)。

[0208] 5.温度被设为70F，相对湿度正常(Hy-Line W-36)。

[0209] 6.温度被设为70F，相对湿度被设为90％(Bovan和Hy-Line W-36)。

[0210] 7.温度被设为80F，相对湿度正常(Hy-Line W-36)。

[0211] 结果概括于下文表7之中；

[0212] 表7

[0213]

[0214] 简而言之，70F的温度在所有的情况下表现出对胚盘定位的改善，并且对于除Hy-Line W-36卵在90％的相对湿度之外的所有情况，在p≤0.05之下具有显著性。仅仅相对湿度的变化对于胚盘的位置鲜有影响(注意在所有的情况下，若不考虑显著性，参照组具有较高的胚盘距中心距离)。Haugh单位的结果类似，同参照条件相比，该单位对于所有的处理组均有所降低(注意并未就正常温度和90％相对湿度的研究进行Haugh单位的收集)。Haugh数据显示出比胚盘位置数据更高的显著性意义，而仅仅正常温度和50％相对湿度组并未显示出显著性效果。

[0215] 实施例11

[0216] 对外部环境进行调节是影响胚盘位置的一种方法。卵对氨气的暴露已被证明使白蛋白变稀。Benton和Brake(2000)已经证明，同参照相比(0mg/kg)，卵对高水平的NH3(2747和6052mg/kg)进行一小时的暴露表现出白蛋白高度(height)的明显降低，伴之以白蛋白pH的提高。由于白蛋白高度的降低同白蛋白流动性的增加正相关，因此对NH3处理是否将胚盘定位到接近于卵中心的位置进行估测。

[0217] 在第一个实验中，来自38周龄的Hyline禽只的卵(卵类型W36；禽群标识：PL2506)被收取并且在60°F和75％RH下维持1天。18枚卵(三批共54枚卵)依其水
平轴被置于玻璃干燥器(直径250mm，具盖)(Fisher Scientific)中的一个瓷平板之上。
将一升NH4OH溶液(14.8M)(Sigma)或者双蒸水(参照)倒入干燥器中。14.8M的NH4OH溶液据估计可释放出6052mg/kg的NH3(Benton和Brake，2000)。将这些卵在各自水平的NH3中暴露1小时。随后将卵取出，并且对胚盘位置、白蛋白高度和pH进行测量。结果见表8：

[0218] 表8

[0219]

[0220] 这些结果显示，NH3处理导致了白蛋白pH同其各自的参照相比的明显提高。在NH3处理组中白蛋白高度较低(即，较低的Haugh单位值)，这显示了白蛋白的稀薄。

[0221] 在另一个实验中，在对氨气进行暴露之后对这些卵进行了贮存。对这些卵(68周龄的Bovans)使用两种浓度的NH3(2747和142mg/kg的NH3)。参照被暴露于0mg/kg的NH3。总计50枚卵被用于NH3处理，48枚卵被用于参照。对一升NH4OH溶液(14.8M)(Sigma)进行了一系列稀释以产生2747和142mg/kg的NH3。对于参照，双蒸水(1L)被倒入了干燥器。
将这些卵在各自水平的NH3中暴露1小时。随后将卵取出，置于固定器中且无转动或者侧向移动，并且在60F和75％RH下贮存6天。6天的贮存之后进行测量以测定胚盘位置、白蛋白高度和pH。结果示于下文表9：

[0222] 表9

[0223]

[0224] 同参照相比，在以2747mg/kg的NH3进行处理的卵中的胚盘距中心位置同卵钝端上止点更为接近。有趣的是，这些卵的pH同参照相近。NH3处理和参照卵在Haugh单位上无差异。同参照相比，较低浓度的NH3(142mg/kg)在受测参数上无变化。

[0225] 对以2747mg/kg的NH3处理组的胚所观察到的变化之一是，这些卵具有“经过烹制的”外观并且看起来不似活体。因此，以高水平的氨气进行的处理可用作为使胚受损的方法。

[0226] 实施例12

[0227] 对多种方法进行了评估以测定是否胚盘可被主动地“定向于”卵中心。

[0228] 离心

[0229] 重力据信在胚定位于卵的最上部位置中起着重要的作用。离心是产生人工重力或者增加重力的质量力的一种途径。为测定离心导致的较大的力是否可改善胚的位置进行了研究。

[0230] 对来自于27周龄禽群的Hyline卵进行了称重，如实施例7所述将其置于固定器中，并且贮存共计7天。在贮存的第5天，将这些卵置于Sorval RC 5C离心筒中并且在50rpm下旋转3分钟，该过程中这些卵保持于固定器中，其长轴同整个旋转中的人工重力平行。随后将这些卵再贮存2天，并且随后对胚盘据乱中心的位置进行测量。未注意到胚盘位置由于离心有明显变化。

[0231] 在进一步的研究中，对卵(Hy-Line)进行了称重，在固定器中贮存5天，在300rpm(Beckman Allegra 6KR centrifuge)下旋转30分钟并且随后在进行胚盘位置测量之前贮存1天。使用以位置作为因变量，离心固定的协方差分析。如下文表10中所示，在胚盘位置上无显著性差异，并且事实上经离心的卵所表现出的胚盘位置距中心略远。

[0232] 表10

[0233]

[0234] 转动

[0235] 在卵贮存期间进行转动对胚盘朝向卵顶部中心的定向的影响受到了评估。在60F，75％RH下将卵置于Hovabator转动器之中6-7天。该转动器使卵进行与竖向呈正负45度的运动，一个从0至+45度到0至-45度并回到0度的完整循环耗时4小时。未处理卵在平板(纸板)上贮存用于比较(以同转动器中的卵相比)。结果示于下文表11：

[0236] 表11

[0237]

[0238] 协方差分析表明，对于Bovan或者Hy-Line卵，处理组之间的结果均无显著性，尽管转动卵的平均离中心距离较低。

[0239] 旋转

[0240] 在贮存期间对卵进行旋转对于胚盘朝向卵顶部中心的定向的影响受到了评估。根据实施例7将卵贮存于固定器中并且同未经旋转但也在固定器中进行贮存的卵进行比较。对本试验，将这些卵贮存5天，在300rpm下旋转30分钟，并且随后在进行胚盘位置测量之前贮存一天。旋转组所具有的胚盘距中心位置略有提高，尽管距中心太远以致难于观察的的胚盘百分比略有改善。结果见下文表12：

[0241] 表12

[0242]

[0243] 协方差分析表明，处理组内的结果无显著性差异，尽管旋转卵的平均离中心距离略低。

[0244] 振荡

[0245] 探索了在贮存期间对卵进行振荡对于胚盘朝向卵上止点的定向。根据实施例6将卵贮存于固定器中，并且同未经振荡但也在固定器中进行贮存的卵进行比较。

[0246] 对于上述的不同处理，在进行胚盘位置测量的同时还对胚盘的直径进行了测量。结果表明对于任何处理胚盘大小均无变化。

[0247] 尽管通过以明确和理解为目的进行说明和例示对本发明进行了较详细的描述，很明显特定的变化和改动可在权利要求及其等效物的范围内进行实施。