D-氨基酰化酶突变体

摘要

本发明提供了一种突变型D-氨基酰化酶及其应用。该突变型D-氨基酰化酶不容易被底物所抑制并含有来自反硝化产碱菌木糖亚种MT-4菌株的D-氨基酰化酶的氨基酸序列，其特定位点的氨基酸残基被修饰。本发明突变体能抵抗底物的抑制作用并具有较高的反应特异性。本发明能够利用高浓度N-乙酰-DL-氨基酸作为底物以高产率生产D-氨基酸。本发明突变体尤其可用于生产D-色氨酸。

权利要求

1.具有在N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸存在的情况下产生D-色氨酸的活性的多肽，其氨基酸序列为具有如下特征的SEQ ID NO：1所示氨基酸序列：(a)位点347的甲硫氨酸被丙氨酸取代；或(b)位点347的甲硫氨酸被丙氨酸取代，和下列的任一个取代：(1)位点154的丙氨酸突变为缬氨酸；

(2)位点374的精氨酸突变为组氨酸；

(3)位点374的精氨酸突变为苯丙氨酸；

(4)位点154的丙氨酸突变为缬氨酸，和位点374的精氨酸突变为苯丙氨酸；

(5)位点154的丙氨酸突变为苏氨酸，和位点374的精氨酸突变为组氨酸；或(6)位点154的丙氨酸突变为苏氨酸，和位点374的精氨酸突变为苯丙氨酸。

2.权利要求1所述多肽，其以120g/l N-乙酰-DL-色氨酸为底物，特异性水解N-乙酰-D-色氨酸，因此以80％或更高产率产生D-色氨酸。

3.编码权利要求1所述多肽的多核苷酸。

4.如权利要求3所述多核苷酸，其为具有如下特征的SEQ ID NO：3所示核苷酸序列：(a)位点1039到1041的核苷酸序列ATG被核苷酸序列GCA取代；或(b)位点1039到1041的ATG被GCA取代，和下列的任一个取代：(1)位点460到462由GCG突变为GTA；

(2)位点1120到1122由CGC突变为CAC；

(3)位点1120到1122由CGC突变为TTT；

(4)位点460到462由GCG突变为GTA，并且位点1120到1122由CGC突变为TTT；

(5)位点460到462由GCG突变为ACA，并且位点1120到1122由CGC突变为CAC；或(6)位点460到462由GCG突变为ACA，并且位点1120到1122由CGC突变为TTT。

5.含有权利要求3所述多核苷酸作为插入子的载体。

6.包含权利要求5所述载体的转化体。

7.权利要求6所述转化体，所述转化体是带有权利要求4所述多核苷酸的大肠杆菌。

8.生产权利要求1所述多肽的方法，其含有培养权利要求6所述转化体。

说明书

D-氨基酰化酶突变体

技术领域

[0001] 本发明涉及D-氨基酰化酶突变体，编码突变体的基因，生产它们的方法，以及利用D-氨基酰化酶突变体生产D-氨基酸特别是D-色氨酸的方法。

背景技术

[0002] 酶不仅显示出高的催化活性，而且显示出特异性。所述特异性包括立体特异性以及底物特异性和反应特异性。尽管有一些例外，酶的立体特异性几乎是绝对的。

[0003] 近来的研究越来越依赖于高精度的技术。在这样的背景下，药物，杀虫剂，食品，调味料等领域中光学活性体的使用越来越重要。分离特异性光学异构体的技术非常重要，因
为光学异构体的生理活性有时是截然不同的。因此，如何分离(合成或分解)纯的光学对
映异构体成为产业上重要的目标。

[0004] D-氨基酸为非蛋白质氨基酸，很长时间里被认为天然存在于小环肽，细菌细胞壁肽聚糖和肽类抗生素中。最近，人们发现D-氨基酸作为结合物存在于神经肽，牙齿釉质蛋
白，晶状体和大脑蛋白的成分中，因此人们做了很多研究来阐释D-氨基酸的生理重要性以
及合成D-氨基酸的酶学方法。

[0005] D-氨基酸在杀虫剂，药物等的合成中被广泛的用作重要的中间体。D-色氨酸作为中间体用于合成治疗勃起障碍的药物。

[0006] 此前制造D-氨基酸的方法包括例如，如下几种：

[0007] (1)化学水解5-取代乙内酰脲，以便生产相应DL-氨基酸并通过旋光离析分离D-氨基酸的方法。

[0008] (2)一种生产D-氨基酸的方法，包括使能从5-取代乙内酰脲生产光学活性D-N-甲氨酰基氨基酸的微生物、其培养基或其加工产物，与5-取代乙内酰脲接触，并使用
亚硝酸钠或D-甲氨酰基转移酶来生产D-氨基酸(WO94/03613)。另一种方法包括，使能直
接从5-取代乙内酰脲生产D-氨基酸的微生物、其培养基或其加工产物，与5-取代乙内酰
脲接触。下述微生物能用于这种方法：

[0009] 假单胞菌属(Pseudomonas)(公开未审的日本专利申请(JP-A)No.Sho54-2398)

[0010] 莫拉氏菌属(Moraxella)(JP-A No.Sho 54-89089)

[0011] 汉逊酵母属(Hansenula)(JP-A No.Sho 61-177991)

[0012] (3)一种方法，包括使能分解L-氨基酸的微生物，其培养基或其加工产物与DL-氨基酸反应，和回收剩下的D-氨基酸(JP-A No.Hei 09-75097)。

[0013] (4)一种方法，包括将L-氨基酰化酶与N-乙酰-DL-氨基酸接触，以便水解DL-氨基酸的一种对映异构体N-乙酰-L-氨基酸，回收剩下的N-乙酰-D-氨基酸，并化学水解
N-乙酰-D-氨基酸生产D-氨基酸(Methods in Enzymology.3，554)。

[0014] (5)一种生产D-氨基酸的方法，包括使细胞或使微生物的加工产物与DL-氨基酸酰胺接触，所述细胞或所述微生物的加工产物具有能选择性水解DL-氨基酸酰胺中D-型氨
基酸的D-酰胺酶或D-酰胺酶活性(JP-A No.Hei02-234678)，或者一种生产D-氨基酸的方
法，包括使细胞或使微生物的加工产物与DL-氨基酸酰胺接触并化学水解剩余的D-氨基酸
酰胺，所述细胞或所述微生物的加工产物具有能选择性水解DL-氨基酸酰胺中L型氨基酸
的L-酰胺酶或有L-酰胺酶活性(JP-A No.Sho 57-013000)。

[0015] (6)一种包括从相应α-酮酸生产D-氨基酸的方法，该方法是在作为氨基供体的D-氨基酸存在的条件下，将D-氨基酸转氨酶与α-酮酸接触(JP-ANo.Sho 62-205790)。

[0016] (7)一种包括使DL-色氨酸与细胞或与微生物的加工产物接触，和回收剩下的D-色氨酸的方法，所述细胞或微生物的加工产物具有能选择性分解L-色氨酸的色氨酸酶
或色氨酸酶活性(JP-A No.Hei 11-042097)。

[0017] 然而，上述方法有各种问题，包括原料昂贵，过程复杂，产量过低，因此，用这些方法很难生产出低成本高产量的D-色氨酸。可将下述已知的D-氨基酸生产方法与上述这些
方法作一些比较。

[0018] (8)一种包括将D-氨基酰化酶与N-乙酰-DL-氨基酸接触以生产D-氨基酸的方法，其中D-氨基酰化酶仅仅水解DL-氨基酸中的一种旋光体N-乙酰-D-氨基酸(JP-A
No.Sho 53-059092)。

[0019] 用这种方法，D-色氨酸可以利用N-乙酰-DL-氨基酸为原料通过一步酶反应获得，N-乙酰-DL-氨基酸可从便宜的L-色氨酸和乙酸酐合成。

[0020] 生产D-氨基酰化酶的已知微生物的例子包括以下这些：

[0021] 假单胞菌属：

[0022] 假 单 胞 菌 AAA6029(pseudomonassp.AAA6029)(Chem Pharm.Bull，26，2698(1978))；

[0023] 假单胞菌1158(pseudomonassp.1158)(J.Antibiot，33，550(1980))；

[0024] 假 单 胞 菌 5f-1(pseudomonassp.5f-1)(Appl.Environ.Microbiol57，2540(1991))；

[0025] 链霉菌属(Stenotrophomonas)：

[0026] 橄榄链霉菌(streptomyces olivaceus)(Argric.Biol.chem，42，107(1978))；

[0027] 橄榄链霉菌62-3(streptomycesthermonitrificans62-3)(Argric.Biol.chem，44，1089(1980)))；

[0028] 橄榄链霉菌S-62(Streptomyces olivaceus S-62)(JP-A No.Sho53-59092)

[0029] 热 硝 化 链 霉 菌 CS5-9(Streptomycesthermonitrificans CS5-9)(JP-ANo.2002-45179))；

[0030] 产碱菌属(Alcaligenes)：

[0031] 反 硝 化 产 碱 菌 反 硝 化 亚 种 DA181(Alcaligenes denitrificanssubsp.denitrificansDA181)(Appl.Environ.Microbiol，54，984(1998))；

[0032] 粪 产 碱 菌 DA1(AlcaligenesfaecalisDA1)(Appl.Environ.Microbiol，57，1249(1991))；

[0033] 木 糖氧 化 产 碱 菌 木 糖 氧 化亚 种 A-6(Alcaligenesxylosoxidanssubsp.Xylosoxydans A-6)，具有一种作用于酸性N-酰基-D-氨基酸的酶(FEBS，289，44(1991))，
Biosci.Biotech.Biochem，57，1145(1993))和一种作用于中性N-酰基-D-氨基酸的酶
(Biosci.Biotech.Biochem，57，1149(1993))；

[0034] 反硝化产碱菌木糖亚种MI-4(Alcaligenes denitrificanssubsp.xylosoxydansMI-4)(J.Ferment.Bioeng，71，79(1991))。

[0035] 产碱菌(Alcaligenessp.)(WO00/23598)。

[0036] 其它：

[0037] 嗜 麦 芽 糖 寡 养 单 胞 菌 (Stenotrophomonas maltophilia)(J.IndustrialMicrobiol.Biotechnol，21，296(1998))

[0038] Arthrobacter hydrocarboglutamicus(JP-A No.Hei11-113592)

[0039] 东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientaris)(JP-A No.Hei11-98982)

[0040] Sebekia benihana(JP-A No.Hei11-318442)

[0041] Hypomyces mycophilus(JP-A NO.2000-41684)

[0042] 紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)

[0043] 简单脂肪杆菌(Pimelobactersimplex)(JP-A No.Hei06-22789)

[0044] 嗜中温甲基杆菌(Methylobacterium mesophilicum)

[0045] 热丁香类诺卡氏菌(Nocardioidesthermolilacinus)(WO02/061077)

[0046] Trichodermaharzianum

[0047] 从如上所述寡养单胞菌(Stenotrophomonas)，红球菌(Rhodococcus)和脂肪杆菌(Pimelobacter)所得酶没有被纯化，因此它们的特性有待阐明，从节杆菌属
(Arthrobacter)所得酶已被纯化，但它的特性仍有待阐明。

[0048] 从假单胞菌属所得N-酰基-D-谷氨酸氨基水解酶，从产碱菌A-6菌株所得N-酰-D-谷氨酸脱乙酰酶，N-酰基-D-天冬氨酸酰胺水解酶，D-氨基酰化酶据报道对N-乙
酰-D-色氨酸没有活性。

[0049] 根据参考文献，从假单胞菌属，链霉菌属，木霉属(Trichoderma)，拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)所得酶，对N-乙酰-D-色氨酸的活性为10U/mg或更低甚至没有该活性。

[0050] 而且，从产碱菌属的另一菌株DA1，以及从Hypomyces，从Sebekia所得酶的活性是100U/mg或更低。另一方面，从产碱菌DA1菌株所得酶对N-乙酰-D-色氨酸的活性据报道
约为600U/mg，但是它的立体选择性并不严格，因为这种酶对N-乙酰-L-色氨酸的活性约
11U/mg。

[0051] 有人报道了一种从产碱菌(Alcaligenes.sp.)所得新的D-氨基酰化酶(WO00/23598)可作用于N-乙酰-D-色氨酸。但是，该报道仅仅公开了该酶对25mMN-乙
酰-DL-色氨酸和10mMN-乙酰-D-色氨酸的水解活性，这种D-氨基酰化酶据报道是一种能
催化10g/l N-乙酰-D-色氨酸水解的新酶。

[0052] 另还发现，已知的从反硝化产碱菌木糖亚种MI-4菌株所得D-氨基酰化酶可以从底物150g/L N-乙酰-DL-色氨酸产生大约2.5g/L D-色氨酸，其相当于75g/L N-乙
酰-D-色氨酸，如图1所示。因此，可以确认这种酶有足够高的水解如此高浓度底物的活
性。

[0053] 有人报道了从嗜中温甲基杆菌和热丁香类诺卡氏菌所得D-氨基酰化酶作用于N-乙酰-D-色氨酸，该催化反应几乎不能被底物抑制，即使是高达100g/l浓度的底物也不
行。然而，这篇报道没有提到N-乙酰-L-色氨酸对这 两种酶的竞争性抑制，另外，没有任
何关于这两种酶的细节的信息，而且，从热丁香类诺卡氏菌所得酶既没有被纯化也没有进
行特征的描述。

[0054] 有人报道，采用含有嗜中温甲基杆菌D-氨基酰化酶基因的DNA转化大肠杆菌(E.Coli)，将其与100g/L N-乙酰-DL-色氨酸一起保温时，可以从底物N-乙酰-D-色氨
酸获得约90％产率的D-色氨酸(WO02/061077)。但是，没有关于从较高浓度的上述底物
产生D-色氨酸的报道，在D-色氨酸的工业化生产中，人们期望能水解高浓度底物N-乙
酰-DL-色氨酸产生D-色氨酸。

[0055] 发明概述

[0056] 本发明的目的是提供能利用高浓度底物N-乙酰-DL-色氨酸确保立体选择性的生产高浓度D-色氨酸的D-氨基酰化酶突变体。另一目的是提供编码所述酶的基因。另一目
的是提供利用所述D-氨基酰化酶突变体及其编码基因生产D-氨基酸的方法。

[0057] 本发明者注意到，从反硝化产碱菌木糖亚种MI-4菌株所得D-氨基酰化酶对N-乙酰-D-甲硫氨酸有高度特异性活性(high specific activity，404U/mg)。根据参考文献，
这种酶对N-乙酰-D-色氨酸仅仅有20U/mg或更低的活性。本发明者将编码这种酶的基
因克隆到大肠杆菌中，对所克隆的酶进行纯化，测定它的特异性活性。与已报道的值相比，
这种酶对N-乙酰-D-色氨酸有非常高的特异性活性(528U/mg)。另外，这种酶对于N-乙
酰-L-色氨酸没有活性。因此，这种酶可用于从N-乙酰-DL-色氨酸生产D-色氨酸。

[0058] 本发明者利用上述D-氨基酰化酶水解N-乙酰-DL-色氨酸来生产D-色氨酸，然后发现当底物浓度超过一个临界值时D-色氨酸的产量降低。本发明者研究了D-色氨酸产量
降低的原因。结果发现，D-氨基酰化酶被超过临界浓度的底物N-乙酰-D-色氨酸或N-乙
酰-L-色氨酸抑制。

[0059] 工业规模生产D-氨基酸需要利用能产生尽可能高浓度的D-氨基酸的酶，这种酶应该能在高底物浓度时保持酶活，因此，为了生产D-色氨酸，需要提供一种D-氨基酰化酶，
其催化反应很难被N-乙酰-D-色氨酸抑制。

[0060] 最近在基因工程领域的技术进步，使得能通过人工修饰氨基酸序列来修饰蛋白质的多种特性(nature)，以使其在产业上更实用。本发明者修饰了一种从反硝化产碱菌木糖
亚种MI-4所得D-氨基酰化酶基因以达到上述目的。发明者成功获得了能从高浓度N-乙
酰-DL-色氨酸生产D-色氨酸的突变 型D-氨基酰化酶。

[0061] 而且，本发明者发现，用修饰的突变型D-氨基酰化酶与N-酰基-DL-色氨酸在适当的条件下保温，可以高效生产D-氨基酸。尤其是，本发明中突变型D-氨基酰化酶，与野
生型D-氨基酰化酶相比，较少地受到N-乙酰-D-色氨酸抑制。这种特征说明这些突变体
适用于生产高浓度D-色氨酸，具有工业实用性。

[0062] 具体地，本发明涉及下述的突变D-氨基酰化酶及其应用：

[0063] [1]具有在存在N-乙酰-D-色氨酸的情况下生产D-色氨酸的活性的多肽，包括：

[0064] (a)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中至少一个选自包括位点154的丙氨酸，位点347的甲硫氨酸，位点374的精氨酸的组的氨基酸残基被取代；或者

[0065] (b)(a)所述氨基酸序列，其中位点154，347，374之外的一个或更多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；

[0066] [2][1]所述多肽，包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中包括任何一个选自下组的氨基酸取代：

[0067] (A)位点154的丙氨酸被选自缬氨酸，半胱氨酸和苏氨酸中的任何一个氨基酸取代；

[0068] (B)位点347的甲硫氨酸被选自甘氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，天冬酰胺，丙氨酸，异亮氨酸和脯氨酸中的任何一个氨基酸取代；

[0069] (C)位点374的精氨酸被选自苯丙氨酸，赖氨酸，亮氨酸，酪氨酸，组氨酸，异亮氨酸和色氨酸中的任何一个氨基酸取代；

[0070] [3][1]所述多肽，包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中选自位点154的丙氨酸，位点347的甲硫氨酸和位点374的精氨酸中的两个或更多氨基酸残基被取代；

[0071] [4][3]所述多肽，包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中包括位点154的丙氨酸，位点347的甲硫氨酸，位点374的精氨酸的氨基酸取代；

[0072] [5][1]所述多肽，从底物120g/l N-乙酰-DL-色氨酸特异性水解N-乙酰-D-色氨酸以80％或更高产率生产D-色氨酸；

[0073] [6][1]所述多肽，具有在有N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸的情况下生产D-色氨酸的活性；

[0074] [7]一种包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽，其中包括：

[0075] (1)位点154的丙氨酸突变为缬氨酸，而且位点347的甲硫氨酸突变为丙氨酸；

[0076] (2)位点347的甲硫氨酸突变为丙氨酸，而且位点374的精氨酸突变为组氨酸；

[0077] (3)位点347的甲硫氨酸突变为丙氨酸，而且位点374的精氨酸突变为苯丙氨酸；

[0078] (4)位点347的甲硫氨酸突变为谷氨酰胺，而且位点374的精氨酸突变为组氨酸；

[0079] (5)位点154的丙氨酸突变为缬氨酸，位点347的甲硫氨酸突变为丙氨酸，而且位点374的精氨酸突变为苯丙氨酸；

[0080] (6)位点154的丙氨酸突变为缬氨酸，位点347的甲硫氨酸突变为谷氨酰胺，而且位点374的精氨酸突变为组氨酸；

[0081] (7)位点154的丙氨酸突变为苏氨酸，位点347的甲硫氨酸突变为丙氨酸，而且位点374的精氨酸突变为组氨酸；

[0082] (8)位点154的丙氨酸突变为苏氨酸，位点347的甲硫氨酸突变为丙氨酸，而且位点374的精氨酸突变为苯丙氨酸；

[0083] (9)位点154的丙氨酸突变为苏氨酸，位点347的甲硫氨酸突变为谷氨酰胺，而且位点374的精氨酸突变为组氨酸；

[0084] (10)位点154的丙氨酸突变为苏氨酸，位点347的甲硫氨酸突变为谷氨酰胺，而且位点374的精氨酸突变为苯丙氨酸；

[0085] [8]编码[1]或[7]所述多肽的多核苷酸；

[0086] [9][8]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，其中包括选自下组的核苷酸取代：

[0087] (a)位点460到462的核苷酸序列GCG被选自GTA，TGC和ACA中的一个核苷酸序列取代；

[0088] (b)位点1039到1041的核苷酸序列ATG被选自GGT，CAA，TCT，AAC，GCA，ATA，和CCC中的一个核苷酸序列取代，和；

[0089] (c)位点1120到1122的核苷酸序列CGC被选自TTT，AAA，CTT，TAT，CAC，ATA和TGG中的一个核苷酸序列取代；

[0090] [10][8]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，其在选自位点460到462的核苷酸序列GCG，位点1039到1041的核苷酸序列ATG，位点1120到1122的核苷酸序
列CGC的两个或更多个区域包含核苷酸取代；

[0091] [11][10]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，其中包括位点460到462的核苷酸序列GCG，位点1039到1041的核苷酸序列ATG，位点1120到1122的核苷
酸序列CGC的核苷酸取代；

[0092] [12]包含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的多核苷酸；

[0093] [13]插入了[8]所述多核苷酸的载体；

[0094] [14]包含[13]所述载体的转化体；

[0095] [15][14]所述转化体，所述转化体是带有[9]所述多核苷酸的大肠杆菌；

[0096] [16]生产[1]或[7]所述多肽的方法，包含培养[14]所述转化体；

[0097] [17]一种生产D-氨基酸的方法，包含将N-酰基-DL-氨基酸与选自下组的至少一种具有酶活的物质接触：

[0098] (a)[1]或[7]所述多肽；

[0099] (b)[14]所述转化体，而且；

[0100] (c)(b)所述转化体的加工产物；

[0101] 并且回收生产的D-氨基酸；

[0102] [18][17]所述生产方法，所述N-酰基-DL-氨基酸是N-酰基-DL-色氨酸；

[0103] [19][18]所述生产方法，所述N-酰基-DL-色氨酸是N-乙酰-DL-色氨酸；

[0104] [20][19]所述生产方法，所述N-乙酰-DL-色氨酸浓度是120g/l或更高；

[0105] [21][8]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，其中包含选自下组的核苷酸取代：

[0106] (a)位点460到462的核苷酸序列GCC被选自GTA，TGC和ACA中的一个核苷酸序列取代；

[0107] (b)位点1039到1041的核苷酸序列ATG被选自GGT，CAA，丁TCT，AAC，GCA，ATA，和CCC中的一个核苷酸序列取代，并且；

[0108] (c)位点1120到1122的核苷酸序列CGC被选自TTT，AAA，CTT，TAT，CAC，ATA和TGG中的一个核苷酸序列取代；

[0109] [22][8]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，其在选自位点460到462的核苷酸序列GCC，位点1039到1041的核苷酸序列ATG，位点1120到1122的核苷酸序
列CGC的两个或更多个区域包含核苷酸取代；

[0110] [23][22]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，其中含有位点460到462的核苷酸序列GCC，位点1039到1041的核苷酸序列ATG，位点1120到1122的核苷
酸序列CGC的核苷酸取代。

[0111] 附图说明

[0112] 图1显示，用生产野生型或突变型D-氨基酰化酶的重组大肠杆菌的培养基，通过水解15％N-乙酰-DL-色氨酸进行的D-色氨酸生产。纵坐标表示所生产的D-色氨酸的产
量(g/l)或产率(％)；横坐标表示反应时间(h)。

[0113] 图2显示了用生产突变型D-氨基酰化酶的重组大肠杆菌的培养基通过水解20％N-乙酰-DL-色氨酸进行的D-色氨酸生产。纵坐标表示所生产的D-色氨酸的产量(g/l)
或产率(％)；横坐标表示反应时间(h)。

[0114] 发明详述

[0115] 本发明提供了从反硝化产碱菌木糖亚种MI-4所得D-氨基酰化酶突变体。

[0116] 术语“D-氨基酰化酶”指一种从N-酰基-D-氨基酸催化生产有机酸和D-氨基酸的酶，“抑制D-氨基酰化酶”指N-乙酰-D-氨基酸的底物抑制和/或N-乙酰-L-氨基酸
的竞争性抑制。在本发明中，D-氨基酰化酶活性能被本领域熟练技术人员用常规手段检测
出。例如，D-氨基酰化酶活性可通过下述方法测定。

[0117] 将含有20mM N-乙酰-D-色氨酸(Sigma)，50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)和酶液的反应溶液1ml在30℃保温10分钟，来进行酶促反应。然后加入0.5ml含有TCA(包含
0.11M三氯乙酸，0.22M乙酸钠，0.33M乙酸)的终止液，D-色氨酸的产量可用TNBS法测定
(Biosci.Biotech.Biochem，58，24(1994))。

[0118] 例如，将0.25ml的100mM Na2B4O7加入0.25ml终止液，在该混合液中加入10μl的110mM TNBS(三硝基苯磺酸)溶液，马上搅拌，静置五分钟后，加入含有1.5mM Na2SO3的
1ml100mM NaHPO4以停止颜色反应，然后在420nm测定溶液的吸光率，一单位酶活定义为在
30℃一分钟内催化产生1μmol D-色氨酸的酶量。

[0119] 在本发明中，通过酶促反应或利用微生物细胞进行的反应生产的D-色氨酸可以通过高效液相色谱用ODS柱定量(柱：wakosil II5C18( 4.6×250nm)；Wako Pure
Chemical Industries；洗脱缓冲液CH3CN/50mMKH2PO4H3PO4(pH2.5)＝2∶8；检测波长，
A280nm；流速，1.0mL/min；柱温， 40℃)。D-色氨酸的滞留时间是3.8分钟，N-乙酰-D-色
氨酸的是10.7分钟。蛋白量可以通过BIO-RAD蛋白分析试剂盒(Bio-Rad Protein Assay
kit，Bio-Rad)测定。标准蛋白使用牛血浆白蛋白。

[0120] 本文中，氨基酸序列中氨基酸残基的修饰按照如下规则表述。氨基酸位置以SEQID NO：1的N末端残基为1开始编号。按照野生型氨基酸残基的单字母代码、位置编号、取
代氨基酸残基的单字母代码这种顺序从左排起。例如，位置154的Ala被氨基酸X取代表
述为A154X，同样，位置347的Met被氨基酸Y取代表述为M347Y，位置374的Arg被氨基酸
Z取代表述为R374Z。A154X/M347Y/R374Z表示这三个修饰同时发生。

[0121] 从反硝化产碱菌木糖亚种MI-4所得D-氨基酰化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，本发明中D-氨基酰化酶突变体具有SEQ ID NO：1所示序列，其中有选自位置154的
丙氨酸，位置347的甲硫氨酸，位置374的精氨酸中的至少一个氨基酸残基被其它氨基酸所
取代。本发明的突变酶能通过这三个氨基酸中至少一个的氨基酸取代而获得，例如，这三个
氨基酸残基中的任何一个或两个，或所有三个残基。

[0122] 位置154的取代氨基酸残基优选是缬氨酸，半胱氨酸或苏氨酸，更优选是缬氨酸。位置347的取代残基优选是甘氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，天冬酰胺，丙氨酸，异亮氨酸或脯氨
酸，更优选是丙氨酸。位置374的取代残基优选是苯丙氨酸，赖氨酸，亮氨酸，酪氨酸，组氨
酸，异亮氨酸或色氨酸，更优选是苯丙氨酸。

[0123] 本发明提供了含有氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽，所述序列中有选自位置154的丙氨酸，位置347的甲硫氨酸，位置374的精氨酸中的至少一个氨基酸残基被其它氨基
酸取代。本发明多肽有D-氨基酰化酶活性，与从反硝化产碱菌木糖亚种MI-4所得野生型
D-氨基酰化酶相比较少的被底物N-乙酰-D-色氨酸所抑制。下文中从反硝化产碱菌木糖
亚种MI-4中所得D-氨基酰化酶有时称“野生型D-氨基酰化酶”。本发明的一个具体实施
方案是，比野生型D-氨基酰化酶对上述N-乙酰-L-色氨酸的竞争抑制和底物抑制有更高
抗性的多肽。

[0124] 本发明多肽的优选氨基酸序列是从SEQ ID NO：1所得修饰的氨基酸序列，其中位置154的丙氨酸，位置347的甲硫氨酸，和位置374的精氨酸进行了表1所示的取代。这些
突变的多肽是优选的，因为它们对上文描述 的底物抑制和竞争性抑制有抗性。

[0125] 表1

[0126]

[0127] -：无取代

[0128] 本发明突变体除了包含上述突变，还可以包含其它突变，包括一个或更多氨基酸取代，缺失，添加和/或插入，只要它的氨基酸序列中包含上述突变，并且它比野生型酶对
N-乙酰-D-色氨酸和/或N-乙酰-L-色氨酸的抑制有更高抗性。这些突变可以是人工引
入的，也可以是自发生成的。本发明突变体包括人工突变体或自发突变体。本发明突变体
的突变氨基酸数目通常是50个或更少，优选是30个或更少，更优选是10个或更少(例如，
5个氨基酸或更少，3个氨基酸或更少)。

[0129] 当本发明突变体在除了位置154，347，374之外的位置具有诸如氨基酸缺失，添加或插入等突变时，这些从N末端算起的氨基酸位置可能改变。这种情况下，通过将处在相
应于位置154，347，374的氨基酸残基用不同氨基酸取代，可以将SEQ ID NO：1的更改后的
氨基酸序列转换成本发明突变体。换句话说，本发明多肽包括以下多肽：(1)包含氨基酸序
列SEQ ID NO：1，其中有选自相应于位置154的丙氨酸，位置347的甲硫氨酸，位置374的
精氨酸的至少一个氨基酸被其它氨基酸取代，和(2)在被N-乙酰-D-色氨酸和/或N-乙
酰-L-色氨酸抑制方面具有降低的趋势。

[0130] 所述相应位置可通过将改变的氨基酸序列中突变位置附近的氨基酸序列与SEQID NO：1中突变位置附近的氨基酸序列进行比对来发现。这样的 操作叫做氨基酸序列比
对。例如，BLAST就是进行这种比对的一种算法。本领域熟练者可以通过对比而在不同长
度的氨基酸序列中找到相应位置。因此，含有下述氨基酸序列的多肽是本发明的优选突变
体，所述多肽例如，在上述相应位置具有表1所列的取代的氨基酸残基。

[0131] 本发明中，那些除了在位置154的丙氨酸、位置347的甲硫氨酸、位置374的精氨酸之外还含有其它突变的氨基酸序列，优选保持与SEQ IDNO：1的高同源性。“高同源性”是
指，例如80％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，更优选95％或更高的同源性。

[0132] 本发明所述其它突变优选是指保守取代，一般来说，取代的氨基酸优选与被取代的氨基酸具有相似性质以保持蛋白质功能，这样的氨基酸取代叫做保守取代。

[0133] 例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸和色氨酸被分入非极性氨基酸，互相有相似的性质。不带电荷的氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半
胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺。酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸
包括赖氨酸，精氨酸，和组氨酸。

[0134] 本发明多肽的特征是，与从反硝化产碱菌木糖亚种MI-4所得野生型D-氨基酰化酶相比，对N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制和/或N-乙酰-L-色氨酸的竞争性抑制有更高的
抗性。那些希望弱化其底物抑制或竞争抑制的化合物并不仅限于上述这些。特别的，只要
本发明多肽能保持对N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制和/或N-乙酰-L-色氨酸的竞争抑制
的抗性，还可以削弱除了这些化合物之外的其它化合物的底物抑制或竞争性抑制。除了对
底物抑制和竞争抑制的抗性之外，本发明突变体可以通过另外的基因修饰获得其它表型。

[0135] 本发明多肽能从12％或更高浓度的N-乙酰-DL-色氨酸生产80％或更高产率的D-色氨酸。本发明优选的多肽能从15％或更高或17％浓度的N-乙酰-DL-色氨酸生产
80％或更高产率的D-色氨酸。

[0136] 另外，本发明一种优选多肽可以从20％或更高浓度的N-乙酰-DL-色氨酸生产50％或更高产率的D-色氨酸。更优选的多肽能从22％或更高浓度的N-乙酰-DL-色氨酸
生产50％或更高产率的D-色氨酸。

[0137] 上述80％或更高产率或50％或更高产率是指，在包含10U/ml酶的反应 液中、在pH8.0和30℃进行反应而从底物N-乙酰-D-色氨酸获得D-色氨酸的产率。

[0138] 野生型或突变型D-氨基酰化酶提取物可以例如，通过过滤和离心回收微生物细胞，并将它们悬浮在缓冲液中，使用Bead-Beater(BIOSPECPRODUCT)使它们破裂而获得。包
含10U/ml所得酶，300mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液的反应液，与12％，15％，17％，20％，或
22％N-乙酰-DL-色氨酸，在30℃振荡保温24小时。如此一来，D-色氨酸可从12％，15％，
或17％的浓度的底物获得80％或更高的产率，或从20％或22％的浓度的底物中获得50％
或更高产率。

[0139] 本发明还涉及编码本发明多肽的多核苷酸。编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明多核苷酸包括一种DNA，它包含编码氨基酸序
列SEQ ID NO：1的核苷酸序列，所述核苷酸序列中相应于154位的丙氨酸，347位的甲硫氨
酸，和374位的精氨酸的密码子被取代氨基酸残基的密码子所取代。编码氨基酸序列的核
苷酸序列通过选择遗传密码系统中氨基酸各自相对应的密码而设计。众所周知，由于遗传
密码的简并性，一个氨基酸不是被一个而是多个密码子编码。因此，编码氨基酸序列SEQ ID
NO：1的核苷酸序列不仅含有SEQ ID NO：2所述核苷酸序列，而且含有用同义密码子设计的
所有核苷酸序列。

[0140] 本发明提供了，通过将如上述获得的编码本发明D-氨基酰化酶的多核苷酸，插入已知表达载体而制备的D-氨基酰化酶表达载体。本发明D-氨基酰化酶可以是通过培养已
被上述载体转化的转化体而获得的重组多肽。

[0141] 本发明多肽可通过如下方法制备。例如，编码本发明多肽的基因可通过在野生型D-氨基酰化酶基因的所需氨基酸位置引入突变而获得。从野生型反硝化产碱菌木糖亚种
MI-4获得的D-氨基酰化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0142] 本发明多核苷酸可用于生产本发明多肽。包含目的氨基酸序列的多肽可以通过在适当的宿主中表达本发明多核苷酸而以重组多肽的形式获得。本发明多肽可以采用多种
方法修饰以提高其在宿主中表达时的生产力(productivity)。比如，可以从多核苷酸上移
除那些与宿主中罕见密码子相应的密码子，或依据与宿主中密码子使用习惯的兼容性和GC
含量来修饰多核苷酸。可以基于遗传密码的简并性，将原始密码子改变成编码同一种氨基
酸的另一密码子，从而在不改变多核苷酸编码的氨基酸序列的前提下修饰核苷酸序列。

[0143] 例如，可以修改多核苷酸的核苷酸序列来增加D-氨基酰化酶在大肠杆菌中的生产力，或提高D-氨基酰化酶基因在大肠杆菌中的稳定性。具体地，可以从多核苷酸上移除
那些在大肠杆菌中罕见的密码子，也可以依据大肠杆菌中密码子使用的兼容性和GC的含
量来修饰多核苷酸。含有编码本发明突变体的核苷酸序列、并且经过修饰适合在大肠杆菌
中表达的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码SEQ ID
NO：1所示的氨基酸序列。

[0144] 因而，适合于在大肠杆菌中表达本发明突变体的DNA，可以由修饰核苷酸序列SEQID NO：3而设计出的编码本发明突变体的DNA来制备。下列核苷酸序列是在154位、347位
和374位编码本发明优选的取代氨基酸残基的核苷酸序列示例。本发明优选的多核苷酸包
括含核苷酸序列SEQ IDNO：3的DNA，其中如下列所示的核苷酸序列已经取代为至少一个选
自核苷酸460-462，1039-1041或1120-1122的区域。

[0145] 154位： 缬氨酸/gta

[0146] (丙氨酸/460-gcg) 半胱氨酸/tgc

[0147] 苏氨酸/aca

[0148] 347位： 甘氨酸/ggt

[0149] (甲硫氨酸/1039-atg) 谷氨酰胺/caa

[0150] 丝氨酸/tct

[0151] 天冬酰胺/aac

[0152] 丙氨酸/gca

[0153] 异亮氨酸/ata

[0154] 脯氨酸/ccc

[0155] 374位： 苯丙氨酸/ttt

[0156] (精氨酸/1120-cgc) 赖氨酸/aaa

[0157] 亮氨酸/ctt

[0158] 酪氨酸/tat

[0159] 组氨酸/cac

[0160] 异亮氨酸/ata

[0161] 色氨酸/tgg

[0162] 包含核苷酸序列SEQ ID NO：3的DNA的质粒pSL-ADD6，已经被保藏在以下单位。插入该质粒中的DNA优选地用来在大肠杆菌中生产本发明突变体。

[0163] 保藏单位的名称和地址

[0164] 名 称：International Patent Organism Depositary，National InstituteofAdvanced Industrial Science and Technology(AIST)，IndependentAdminisrative
Institution.

[0165] ( 前 称：The National Institute of Bioscience and Human-Technology，ThcAgency of Industrial Science and Technology，The Ministry of
InternaltinalTrade and Industry)

[0166] 地 址：AISTTsukuba Central6，1-1-3Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566，Japan(邮政编码：302-8566)

[0167] 保藏日期：2003年10月17日(最初保藏于2002年11月12日)

[0168] 保藏号：FERM BP-08508

[0169] 通过使用本领域常规的诱变技术，例如定点诱变和随机诱变技术，将突变导入野生型基因，可以获得突变型D-氨基酰化酶。这些诱变技术包括，例如，容错
PCR(error-prone PCR)，定点饱和诱变(site-directed saturationrmutagenesis)，盒
式诱变(cassette mutagenesis)，DNA改组(DNA shufling)和StEP(Appl.Microbiol.
Biotechnol.，55，519，2001)。比如，将需要导入突变的目的DNA作为模板，通过使用低精确
度PCR方法(容错PCR)对DNA进行复制，可以随机导入突变，所述低精确度PCR方法中，Taq
DNA聚合酶掺入核苷酸的精确度被削弱了。

[0170] 特别地，削弱了Taq DNA聚合酶掺入核苷酸的精确度的那些容错PCR可以通过下列方式来实现：(1)增加PCR反应溶液中的MgCl2浓度；(2)在反应溶液中添加MnCl2；(3)
在反应溶液中以不同浓度使用四种核苷酸；(4)在反应溶液中添加核苷酸类似物。备选地，
使用容易发生核苷酸取代的模板DNA，例如具有高GC含量的DNA时，通过使用掺入核苷酸的
精确度较低的Taq DNA聚合酶，不需要上述程序就可以导入随机突变。

[0171] 通过将复制的DNA片段插入到已知的表达载体、并制备用该表达载体转化的转化体，可以获得突变体文库。例如，可以用增加了N-乙酰-L-色氨 酸的比例的N-乙
酰-DL-色氨酸混合物作为底物，通过使突变体和底物接触，并比较野生型和突变体的D-色
氨酸的产量，分离出所需突变体，其N-乙酰-L-色氨酸的竞争抑制和/或N-乙酰-D-色氨
酸的底物抑制被降低。

[0172] 例如，将转化体的培养基与5％N-乙酰-DL-色氨酸和1％N-乙酰-L-色氨酸的混合物(作为底物)一起保温，当一种突变体在反应溶液中产生D-色氨酸的量比野生型的
大时，选出该突变体，其N-乙酰-L-色氨酸的竞争抑制和/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑
制被降低。

[0173] 通过这样的随机诱变实验，一旦鉴定出产生期望效果的突变位置(氨基酸取代的位置)，下一个步骤就是，用以下方法进行位点特异性氨基酸取代和随机氨基酸取代，从中
选出最合适的氨基酸取代。例如，如果NNN(N代表A，T，C和G的混合物)表示相应于将要
引入氨基酸取代的位置上的密码子，可以设计和合成出覆盖了NNN位置的64种引物的混合
物。合成另一个引物，使该引物含有野生型相应位置的核苷酸序列，与前述的一种引物组成
一对。优选的，在每一个引物的5’末端都设计了一个识别位点，如限制性酶位置。使用这
样的引物对，用野生型DNA作为模板进行PCR，可以制备出一个文库，其中包含编码特定位
置的天然氨基酸的所有类型密码子的DNA片段。

[0174] 扩增的DNA片段的两端都使用适当的限制酶或类似的酶进行降解。将片段和表达载体连接，表达载体包含了用相同步骤处理的野生型DNA。通过用上述表达载体进行转化，
制备出转化体，从而制备出转化体文库，每一转化体表达所述酶，该酶中特定位置的氨基酸
被另一天然氨基酸所取代。通过使用增加了N-乙酰-L-色氨酸的比例的N-乙酰-DL-色
氨酸混合物作为底物，选出能高水平产生D-色氨酸的突变体，可以选出能最有效降低N-乙
酰-L-色氨酸的竞争抑制和/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制的氨基酸取代。

[0175] 例如，转化体的培养基与5％N-乙酰-DL-色氨酸和2％N-乙酰-L-色氨酸的混合物(作为底物)一起保温，当一个突变体在反应溶液中D-色氨酸的产量比野生型的大时，
可将该突变体选出，其包含最适于降低N-乙酰-L-色氨酸的竞争抑制和/或N-乙酰-D-色
氨酸的底物抑制的氨基酸残基。一旦鉴定出一个或多个优选的氨基酸取代位置和优选的取
代的氨基酸残基，就可以通过有目的的或随机的组合这些氨基酸取代来获得目的特性得到
改进的突 变体。例如，想将三个氨基酸位置的氨基酸取代随机组合时，包含所述三个突变
酶之一的基因的每一个质粒在三个适当的位置用限制酶等消化，然后纯化和回收覆盖所述
氨基酸取代位置的DNA片段。

[0176] 将所有处理过的DNA组合，以覆盖所述突变酶基因的全长。通过使用T4连接酶随机连接该混合物，可以制备出突变体的质粒文库，该质粒文库包括了在这三个位置的氨基
酸取代的所有可能组合。通过使用上述三个氨基酸取代位置之一的野生型DNA片段，可以
同时制备出包含两个氨基酸取代突变体的质粒文库和只包含一个氨基酸取代的突变体的
质粒文库。这样一来，通过用上述质粒文库进行转化，可以获得一个转化体文库，其中的转
化体表达包含一至三个氨基酸取代的突变酶。

[0177] 能有效降低N-乙酰-L-色氨酸的竞争抑制和/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制程度的最佳组合氨基酸取代可以通过如下的方法选出：使用含有增加了N-乙酰-L-色氨酸
比例的N-乙酰-DL-色氨酸混合物作为底物，选出高水平生产D-色氨酸的突变体。

[0178] 例如，可以将转化体的培养基与由2％N-乙酰-DL-色氨酸和3.5％N-乙酰-L-色氨酸组成的作为底物的混合物一起保温，当一种突变体在反应溶液中产生D-色氨酸的量
比野生型大时，将该突变体选出，作为包含了最适于降低N-乙酰-L-色氨酸的竞争抑制和
/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制程度的氨基酸取代组合的突变体。

[0179] 对用于表达本发明D-氨基酰化酶的转化微生物的类型没有特别限制，只要该微生物能被含有编码本发明D-氨基酰化酶的多核苷酸的重组载体转化，并能表达该酶。本发
明包括这样的转化体和生产本发明D-氨基酰化酶的方法，所述方法包括培养所述转化体。
可以作为宿主用于制备所述转化体的微生物包括，例如，下列微生物：

[0180] 开发了宿主载体系统的细菌：

[0181] 埃希氏菌属(Escherichia)，

[0182] 芽胞杆菌属(Bacillus)，

[0183] 假单胞菌属(Pseudomonas)，

[0184] 沙雷氏菌属(Serratia)，

[0185] 短杆菌属(Brevibacterium)，

[0186] 棒状杆菌属(Corynebacterium)，

[0187] 链球菌属(Streptococcus)，或

[0188] 乳杆菌属(Lactobacillus)。

[0189] 开发了宿主载体系统的放线菌：

[0190] 红球菌属(Rhodococcus)，或

[0191] 链霉菌属(Streptomyces)。

[0192] 开发了宿主载体系统的酵母：

[0193] 糖酵母属(Saccharomyces)，

[0194] 克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，

[0195] 裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，

[0196] 单孢菌属(Zygosaccharomyces)，

[0197] Yarrowia属(Yarrowia)，

[0198] Trichosporon属(Trichosporon)，

[0199] Rhodosporidium属(Rhodosporidium)，

[0200] 毕赤氏酵母属(Pichia)，或

[0201] 假丝酵母属(Candiada)。

[0202] 开发了宿主载体系统的真菌：

[0203] 链孢霉属(Neurospora)，

[0204] 曲霉属(Aspergillus)，

[0205] 头孢霉属(Cephalosporium)，或

[0206] 木霉属(Trichoderma)。

[0207] 产生转化体和构建适合于宿主的重组载体的步骤，可以依照分子生物学、生物工程学和基因工程学领域的已知标准技术来进行(例如，Sambrooketal，Molucular Cloning，
Cold Spring Harbor Laboratories)。

[0208] 为了在微生物细胞中表达本发明D-氨基酰化酶突变基因或D-氨基酰化酶修饰基因，将本发明多核苷酸插入稳定存在于微生物中的质粒载体或噬菌体载体中，
并对遗传信息进行转录和翻译。可以将调节转录和翻译的启动子插入本发明多核苷
酸的5’上游，优选还在所述多核苷酸的3’下游插入终止子。启动子和终止子应当
在用作宿主细胞的微生物中具有功能。在不同微生物中具有功能的载体、启动子和
终 止 子 可 参 见“BiseibutsugakuKisokouza(Basic Course of Microbiology)Vol.8
Idenshikougaku(Genetic Engineering)，Kyritsu Shuppan Co，Ltd.”，对于酵母菌的，记载
于“Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)，Yeast8，423-488(1992)”等。

[0209] 例如，象pBR和pUC系列这样的质粒载体，和诸如β-半乳糖苷酶(lac)，色氨酸操纵子(trp)，tac，trc(lac和trp的融合)等的启动子，以及来源于λ-噬菌体的那些PL，
PR等，可以用于埃希氏菌属，特别是大肠杆菌。来自trpA，噬菌体和rrnB核糖体RNA的终
止子也可以使用。

[0210] 诸如pUB110和pC194系列等载体可以用于芽胞杆菌属，并可整合到染色体上。可以使用的启动子和终止子如碱性蛋白酶(apr)、中性蛋白酶(npr)和amy(α-淀粉酶)的启
动子和终止子。

[0211] 假单孢菌属，特别是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和葱头假单胞菌(Pseudomonas cepacia)的宿主-载体系统已开发出来。可以使用宽宿主范围的载体
pKT240(包含自我复制所必需的来源于RSF1010的基因)，它基于质粒TOL，其参与甲苯化合
物的降解。可以使用脂肪酶(JP-AHei5-284973)基因的启动子和终止子及其类似物。

[0212] 质粒载体如pAJ43(Gene39，281(1985))可以应用于短杆菌属，特别是乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)。用于埃希氏菌属的启动子和终止子可以用于这种
微生物中。

[0213] 质粒载体如pCS11(JP-A Sho57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175，(1984))可以用于棒杆菌属，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

[0214] 质粒载体如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett，26，239，(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))可以用于链球菌属。

[0215] 对于乳杆菌属，可以使用为链球菌属开发的pAMβ1(J.Bacteriol.137，614(1979))，以及为埃希氏菌属开发的一些启动子。

[0216] 对于红球菌属，可以使用分离自玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)或类似菌株的质粒载体(J.Gen.Microbiol.138，1003(1992))。

[0217] 在链霉菌属中有 功能的质粒可以用描 述于“Genetic ManipulationofStreptomyces：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories byHopwood et
al.(1985)”的方法来构建。例如，可以使用pIJ486(Mol.Gen.Genet.203，468-478(1986))，
pKC1064(Gene103，97-99(1991))，和pUWL-KS(Gene165，149-150(1995))，特别是用于变青
链霉菌(Streptomyces lividans)。这些 质粒也可以用于弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces
virginiae)(Actinomycetol.11，46-53(1997))。

[0218] 质粒如YRp，YEp，YCp和YIp系列可以用于糖酵母属，特别是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。与基因组DNA中核糖体DNA的多个拷贝进行同源重组的整
合载体(如EP537456)，由于它们能将多个基因拷贝导入宿主基因组并能稳定维持这些基
因，因此非常有用。还可以使用乙醇脱氢酶(ADH)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、酸性
磷酸酶(pHO)、半乳糖苷酶(GAL)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、烯醇酶(ENO)等的启动子和终止
子。

[0219] 来源于啤酒糖酵母的2μm质粒系列、pKD1质粒系列(J.Bacteriol.145，382-390(1981))、来源于pGK11的与杀伤活性有关的质粒、包含来源于克鲁维酵母属的自
我复制基因的KARS质粒系列、能通过与核糖体DNA进行同源重组而整合到染色体中的载体
质粒(如EP537456)，他们都能用于克鲁维酵母属，特别是乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces
lactis)。还可以使用来源于ADH和PGK的启动子和终止子。

[0220] 裂殖酵母属可以使用下述质粒载体，它包含来源于粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)ARS(一个与自我复制有关的基因)，并包含能弥补啤酒糖酵
母营养缺陷型的选择标记(Mol.Cell.Biol.6，80(1986))。此外，来源于粟酒裂殖糖酵母的
ADH启动子是可应用的(EMBO J.6，729(1987))。特别地，pAUR224可以从Takara Shuzo购
得。

[0221] 单孢菌属可以使用诸如源自Zygosaccharomyces rouxii的pSB3(NucleicAcidsRes.13，4267(1985))等质粒载体。也可以使用源自啤酒糖酵母的pHO5启动子和源自
Zygosaccharomyces rouxii的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP-Zr)的启动子(Agri.Biol.
Chem.54，2521(1990))等。

[0222] 在毕赤氏酵母属中，已经开发了针对Pichia angusta(曾用名：多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))的宿主-载体系统。可使用的载体包括了源自Pichia angusta
的与自我复制有关的基因(HARS1和HARS2)，但它们是相对不稳定的。因此，将该基因的多
个拷贝插入到染色体中是有效的(Yeast7，431-443(1991))。由甲醇等诱导的AOX(醇氧化
酶)和FDH(甲酸脱氢酶)的启动子也可以利用。已经使用源自毕赤氏酵母的与自我复制
有关的PARS1和PARS2等基因，开发了巴斯德毕赤氏酵母(Pachia pastoris)的宿主-载
体系统 (Mol.Cell.Biol.5，2276(1985))。启动子如由高密度培养物和甲醇诱导的强启动
活性AOX启动子是可应用的(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。

[0223] 对假丝酵母属而言，已经开发了针对麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)，白色假丝酵母(Candida albicans)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，产朊假丝酵母(Candida
utilis)等的宿主-载体系统。可以用从麦芽糖假丝酵母克隆的ARS开发该菌的载体
(Agri.Biol.Chem.51，51，1587(1987))。针对产朊假丝酵母的、能整合到染色体中的载体的
强启动子已经开发出来(JP-A Hei08-173170)。

[0224] 在曲霉菌属中，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)已经进行了大量的研究。目前已有能整合到染色体中的质粒，还有源自胞外蛋白酶和淀粉酶
的启动子(Trends in Biotechnology7，283-287(1989))。

[0225] 对于木霉菌属，已开发出基于Trichoderma reesie的宿主-载体系统，并能获得源自胞外纤维素酶基因的启动子(Biotechnology7，596-603(1989))。

[0226] 除了微生物之外，已经开发了针对植物和动物的各种各样的宿主-载体系统。特别地，在昆虫特别是家蚕中(Nature315，592-594(1985))以及在植物如油菜籽(rape
seed)、玉米(corn)和马铃薯中，生产大量外源蛋白的表达系统已经被开发出来，并且是可
获得的。

[0227] 本发明D-氨基酰化酶可以用包含编码该酶的多核苷酸的重组载体转化微生物细胞并按常规培养方法培养微生物细胞而获得。合成培养基和天然培养基都可以使用，只要
它们包含适当量的碳源、氮源、无机物和其它营养物质。培养基可以是固态的或是液态的。

[0228] 特别地，可以使用一种、两种或者多种碳源，这些碳源可以从常规使用的碳源中适当的选择，包括：糖，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、淀粉、淀粉水解物、糖蜜和黑糖蜜；天
然的碳水化合物，如小麦和玉米；醇类，如甘油、甲醇和乙醇；脂肪酸，如乙酸、葡萄糖酸、丙
酮酸和柠檬酸；烃类，如正链烷烃(normal paraffin)；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺和天冬
酰胺。可以使用一种、两种或者多种氮源，这些氮源可以从有机含氮化合物中适当的选择，
例如肉浸汁、蛋白胨、酵母提取物、大豆水解物、奶酪(milk casein)、酪蛋白氨基酸、各种氨
基酸、玉米浸汁，动物、植物和微生物的其它水解物等；以及无机含氮化合物，例如铵盐，如
氨、硝酸铵、硫酸铵和氯化铵；硝酸盐，如硝酸钠；和尿素。

[0229] 此外，使用少量的一种、两种或多种无机盐，可以适当的选自镁、锰、钾、钙、钠、铜、锌等的磷酸盐、氢氯酸盐、硝酸盐、醋酸盐和其它盐类。如果有需要，可以使用消泡剂，包括
植物油、表面活性剂(detergent)和硅。

[0230] 细胞可以用常规培养方法在包含上述成分的培养基中培养，如振荡培养、通气搅拌培养、连续培养和流加培养。

[0231] 对培养条件没有限制，只要微生物菌株能够生长并产生D-氨基酰化酶。培养条件可以依据培养类型、培养方法和其它的因素来适当选择。通常，将起始培养的pH值调到
4-10(优选6-8)，然后于15-50℃(更优选25-35℃)进行培养。

[0232] 待微生物细胞充分生长之后或在细胞生长期间，将转化体置于允许诱导外源基因表达的条件下。例如，外源基因位于lac启动子的下游时，通过添加IPTG来诱导其表达。备
选地，当使用温度敏感的启动子时，将细胞置于能表达外源基因的温度下培养。

[0233] 对培养的持续时间没有限制，只要培养能够产生具有足够高的D-氨基酰化酶活性的微生物细胞。通常，培养时间为1-14天，优选为1-3天。由基因表达所产生和积聚的
本发明D-氨基酰化酶，可以通过下述方法收集和回收。

[0234] 当D-氨基酰化酶在微生物细胞内聚集时，在培养后，通过过滤和离心等方法收集细胞。用生理盐水等缓冲液洗涤细胞，然后单独或组合使用物理方法、生物化学方法和化
学方法进行细胞溶解，物理方法如冻融、超声破碎、压力处理、渗透压差处理和碾磨；生物化
学方法如用溶菌酶等细胞壁溶解酶进行处理；化学处理如使用表面活性剂进行处理。从而
提取出D-氨基酰化酶。如此所得粗制D-氨基酰化酶可以通过单独或组合使用以下手段来
纯化：盐析、使用溶剂等进行分级沉淀；各种层析分离方法，包括盐析层析、离子交换层析、
凝胶过滤层析、疏水层析、染料层析(dyechromatography)、羟基磷灰石层析、亲和层析等，
使用开放柱、中压层析或高效液相色谱(HPLC)；电泳分离方法，如等电聚焦、非变性凝胶电
泳，等。

[0235] 具体地，例如，将过滤或离心所收集的微生物细胞冷冻或者裂解，然后悬浮在缓冲液中。将细胞用Bead-Beater(BIOSPEC PRODUCT)进行裂解，制备野生型或突变型D-氨基
酰化酶的提取物。然后，用硫化铵对该提取物 进行盐析处理。通过进行Phenyl-Sepharose
FF疏水层析和Mono Q离子交换层析，可以纯化出均一的酶(在聚丙烯酰胺凝胶电泳中是单
一泳带)。

[0236] 由如此纯化的反硝化产碱菌木糖亚种MI-4野生型D-氨基酰化酶和本发明D-氨基酰化酶突变体催化的与N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸反应的速率常数，可以
通过描述于“Lectures for Biochemical Experiments21：Introduction to Experimental
Approach to Enzyme Kinetics”和“BasicExperimental Methods for Proteins and
nd
Enzymes，2 Ed.”的方法进行测定。Km为米氏常数(Michaelis constant)，最大速率是Vmax，
抑制常数是Ki，过量底物的反应抑制常数是Ks’。

[0237] 本发明还包括一种使用本发明D-氨基酰化酶生产D-氨基酸的方法，一种表达所述D-氨基酰化酶或其加工后产物的转化体。

[0238] 本发明D-氨基酰化酶可以利用各种N-酰基-D-氨基酸来生产D-氨基酸。在D-氨基酸的工业规模生产中，本发明D-氨基酰化酶是有用的。例如，本发明D-氨基酰化酶可以
允许作用于N-酰基-DL-氨基酸(D型和L型的混合物)而特异地生产D-氨基酸。更具体
地，本发明涉及一种生产D-氨基酸的方法，包括使N-酰基-DL-氨基酸与选自如下(a)至
(c)的至少一种酶活性物质相接触和回收所得的D-氨基酸的步骤：

[0239] (a)本发明D-氨基酰化酶蛋白；

[0240] (b)表达本发明D-氨基酰化酶的转化体；和

[0241] (c)表达本发明D-氨基酰化酶的转化体的加工产物。

[0242] 本发明中使用的N-酰基-DL-氨基酸的类型没有限制，这样的氨基酸可以选自较宽范围的化合物。代表性的N-酰基-DL-氨基酸列于式(I)中。

[0243] 式(I)：

[0244]

[0245] 其中，R1和R2是相同或不同的，选自烷基、链烯基、链炔基(alkynyl)、环烷基、烯丙基和芳烷基。这些基团可以用卤素原子、单链烷氧基、硝基、羟基或这类基团取代。更具体
地，R2的优选取代基包括甲基、氯甲基和苯 基。优选的R1包括如下所列的取代基。包含每
种取代基的N-酰基-DL-氨基酸的名称在括号中说明。

[0246] 吲哚基(N-酰基-DL-色氨酸)

[0247] 苯甲基(N-酰基-DL-苯丙氨酸)

[0248] 硫代甲基乙基(N-酰基-DL-甲硫氨酸)

[0249] 异丙基(N-酰基-DL-缬氨酸)

[0250] 2-甲基-丙基(N-酰基-DL-亮氨酸)

[0251] 本发明中，优选的N-酰基-DL-氨基酸包括N-乙酰-DL-氨基酸。N-乙酰-DL-氨基酸的具体例子如下所述。在这些N-乙酰-DL-氨基酸中，N-乙酰-DL-色氨酸是生产D-色
氨酸的特别有用的底物，而D-色氨酸是一种重要的工业用化合物。

[0252] N-乙酰-DL-甲硫氨酸

[0253] N-乙酰-DL-缬氨酸

[0254] N-乙酰-DL-色氨酸

[0255] N-乙酰-DL-天冬酰胺

[0256] N-乙酰-DL-苯丙氨酸

[0257] N-乙酰-DL-丙氨酸

[0258] N-乙酰-DL-亮氨酸

[0259] 上述(a)至(c)的任何一种有酶活性的物质，都能被用于本发明的生产方法。可以使用的具有酶活性的物质包括部分纯化的酶、能产生D-氨基酰化酶的转化体及其除纯
化的酶之外的加工产物。特别地，可以通过使N-乙酰-DL-氨基酸与能产生D-氨基酰化酶
的转化体或其加工产物直接接触来生产D-氨基酸。

[0260] 这里所使用的术语“转化体的加工产物”是指，对转化体进行如下处理所获得的产物：物理处理，如冻融、超声破碎、压力处理、渗透压差处理或碾磨；或生物化学处理，如用
溶菌酶等细胞壁溶解酶处理；或化学处理，如用表面活性剂，或甲苯、二甲苯、丙酮等有机溶
剂进行处理。通过这些处理而改变了细胞膜通透性的微生物；通过用玻璃珠或酶裂解微生
物 细胞而获得的无细胞提取物；以及它们经过部分纯化获得的物质；都被包括在所述加
工产物中。

[0261] 一般地，酶和微生物通过固定化来稳定。固定化可以通过已知的技术来实现，例如聚丙烯酰胺凝胶法、硫酸化多糖凝胶法(角叉藻聚糖凝胶法)、藻酸盐凝胶法和琼脂凝胶
法，包括与离子交换树脂结合。与固定化酶或微生物进行反应所需的时间，取决于D-氨基
酰化酶和底物这两者的量。本领域的技术人员可以根据这些参数，凭经验选择最适条件。一
般通过10-100小时的温育，可以高效的获得目的反应产物。

[0262] 可以选择本发明D-氨基酰化酶、能表达D-氨基酰化酶的转化体或其加工产物，与N-酰基-D-氨基酸进行温育的条件，使得有利于D-氨基酰化酶的活性和稳定性以及能产
生D-氨基酰化酶的转化体菌株的反应性。本发明D-氨基酰化酶的活性有时被二价金属离
2+ 2+ 2+
子(如Zn 、Ni 、和Co )增强或者抑制。如果酶被二价金属离子抑制，可以向反应溶液中
添加螯合剂，如EDTA。

[0263] 对作为反应底物的N-酰基-DL-氨基酸的浓度没有限制。通常使用的底物浓度大约0.1％-50％，优选1％-40％，更优选5％-30％。在使用本发明的酶或细胞进行的反
应中，作为底物的N-酰基-DL-氨基酸是N-酰基-D-氨基酸和N-酰基-L-氨基酸的混合
物。对混合物中L型和D型的比例(D型∶L型)没有限制。通常的比例范围从10∶90
到90∶10，优选25∶75到75∶25，更优选50∶50。当比例为50∶50时，这一混合物
被称为外消旋的N-酰基-氨基酸。

[0264] 这里所使用的术语“N-乙酰-DL-色氨酸的高浓度”是指120g/l或更高的N-乙酰-DL-色氨酸浓度，优选的150g/l或更高，更优选的200g/l或更高。

[0265] 这里使用的单位“％”是指“重量/体积(w/v)”。当反应溶液中的所有N-乙酰-D-色氨酸分子都被转变为D-色氨酸时，“反应产率”达到100％。

[0266] 底物添加到反应溶液中，可以在反应一开始的时候即刻添加，或持续的、或分步的添加。使用的D-氨基酰化酶的浓度，通常约为0.01-100000U/ml，优选约为0.1-10000U/ml，
更优选为1-1000U/ml。对反应温度没有限制，只要在这一温度本发明的酶具有活性并因此
使反应能继续下去。反应温度的范围通常为5-70℃，优选为10-50℃，更优选为20-40℃。
对反应的pH值也没有限制，只要在这一pH值下本发明的酶是有活性的并因此使反应能继
续 下去。通常，反应中的pH值的范围为3-11，优选5-10，更优选6-9。反应能在溶液被搅
拌或静止的情况下进行。

[0267] 例如，通过将40％N-乙酰-DL-色氨酸和转化体的培养基等量的混合，使混合物在30℃搅拌温育24小时，可以生产出产率达80％或更高的D-色氨酸；其中所述转化体能
表达突变型D-氨基酰化酶，该D-氨基酰化酶含有A154V/M347A/R374F突变。

[0268] 在反应溶液中产生的D-氨基酸可以用已知的方法提取，例如，浓缩、通过等电点沉淀等方法直接结晶、用离子交换树脂处理、过滤等。例如，当以N-乙酰-DL-色氨酸作为
底物生产出D-色氨酸时，使反应溶液流经用于吸附D-色氨酸的强酸性阳离子交换树脂，用
水洗涤树脂，然后用0.5N的氨水洗脱，可以从反应溶液中分离出D-色氨酸。将通过浓缩洗
脱液获得的粗制D-色氨酸结晶粉末，溶解在少量的热的1∶1乙醇-水中，然后使用活性
炭脱色。冷却这一混合物，获得D-色氨酸的结晶。

[0269] 使用本发明的D-氨基酸生产方法，N-酰基-L-氨基酸在反应中不被消耗。残留的N-酰基-L-氨基酸可以通过外消旋作用转换成N-酰基-DL-氨基酸来重复利用。使用酶反
应(JP-A No.Hei1-137973)或化学反应(Biochem.Z.，203，280(1929))对N-乙酰-L-氨基
酸进行外消旋的方法已经被公开。

[0270] 本发明能够高效的生产突变型D-氨基酰化酶，其N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制和/或N-乙酰-L-色氨酸的竞争抑制是降低的。

[0271] 本发明的突变型D-氨基酰化酶可以用于立体选择性的水解较高浓度的N-乙酰-DL-色氨酸，生产具有改进活性的D-色氨酸。本发明D-氨基酰化酶的底物抑制和竞争
抑制被削弱了，致使所述酶能够水解高浓度(如200g/l)N-乙酰-DL-色氨酸中的底物N-乙
酰-D-色氨酸，以80％或更高的产率生产D-色氨酸。在此之前，还没有得到过这样的D-氨
基酰化酶。用本发明D-氨基酰化酶以高产率合成的D-色氨酸，可以作为起始材料用于生
产药剂或其它化合物。

[0272] 实施例

[0273] 以下引用实施例对本发明进行详细的说明，但并不构成对本发明的限制。

[0274] 实施例1：反硝化产碱菌木糖亚种MI-4菌株的染色体DNA的制备

[0275] 按照Nuclei acids Res.8，4321(1980)所描述的方法，从反硝化产碱菌木糖亚种MI-4菌株(FERM P-9413)制备染色体DNA。

[0276] 实施例2：通过PCR从反硝化产碱菌木糖亚种MI-4菌株克隆D-氨基酰化酶基因

[0277] 依据参考文献(Biosci.Biotech.Biochem，59，2115(1995))中的描述，合成出正义引物ADD-ATG1(SEQ ID NO：4)和反义引物ADD-TGA1(SEQ NOID：5)，它们对应于木糖氧化
产碱菌木糖氧化亚种A-6(Alcaligenesxylosoxydans subsp.xylosoxydans A-6)的D-氨
基酰化酶基因的5’-和3’-非翻译区。进行PCR反应，使用50-μl反应溶液，其中含有
70ng反硝化产碱菌木糖亚种MI-4菌株的染色体DNA、1.0U ExTaq DNA聚合酶、Taq聚合酶
缓冲液、0.2mM dNTP、5％DMSO、以及引物ADD-ATG1和ADD-TGA1(各10pmol)，在94℃变性
30秒、72℃延伸2分钟，进行30个循环。PCR获得了高度特异的约1.5kbp的PCR产物。

[0278] 实施例3：PCR产物的测序。

[0279] 实施例2所得DNA片段用GFX试剂盒(Pharmacia)纯化。分析纯化的DNA片段的核苷酸序列。DNA的核苷酸序列分析通过PCR，使用BigDyeTerminator Cycle Sequening
ready Reaction Kit(Applied Bio Systems)在PRISM310基因分析仪(Applied Bio
Systems)中进行。使用的引物是ADD-189R(SEQ ID NO：6)，ADD-524R(SEQ ID NO：7)，
ADD-466F(SEQ ID NO：8)，ADD-1032R(SEQ ID NO：9)，ADD-987F(SEQ ID NO：10)， 和
ADD-TGA1。

[0280] 所得序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。将这个D-氨基酰化酶的核苷酸序列，与已知的木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种A-6菌株D-氨基酰化酶克隆进行比
较。以起始密码子ATG的第一个字母A为1，在这两个克隆之间，只发现了两处核苷酸取
代，360-T->C和435-C->T。氨基酸序列彼此完全相同。此外，将此D-氨基酰化酶与产
碱菌CMC3352和CMC3353菌株的D-氨基酰化酶进行了比较。显示出11个核苷酸变化，
2 3 14 78
4-T->G(Ser->Ala)，7-C->G(Gln->Glu)，41-C->T(Ala ->Val)，234-T->C(Arg ->Arg)，
102 121 123
306-G->A(Ala ->Ala)，363-T->G(Ser ->Ser)，369-T->C(Arg ->Arg)，
150 2 240
450-A->G(Ser ->Ser)，676-G->C(Gly ->Arg)，718-G->C(Gly ->Arg)， 和
242
724-G->A(Glu ->Lys)，在这11个取代中，6个使氨基酸发生改变。

[0281] 实施例4：通过PCR从反硝化产碱菌木糖亚种MI-4菌株中克隆D-氨基酰化酶基因-2-

[0282] 根据实施例3中确定的DNA片段的核苷酸序列，合成出正义引物ADD-ATG2(SEQ IDNO：11)和反义引物ADD-TAA2(SEQ ID NO：12)。进行PCR反应，使用50-μl反应溶液，其中
含有10ng的实施例2中所得PCR产物作为模板、2.5U PfuTurbo DNA聚合酶、PfuTurbo缓
冲液、0.2mM dNTP、5％DMSO、以及引物ADD-ATG2和ADD-TGA2(各10pmol)，在95℃变性30
秒、72℃延伸160秒，进行30个循环。PCR获得高度特异的约1.5kbp的PCR产物。

[0283] 实施例5：构建包含所述D-氨基酰化酶基因的表达载体。

[0284] 实施例4所得DNA片段用GFX试剂盒(Pharmacia)纯化，然后用限制酶EcoRI和HindIII进行双水解。使DNA在琼脂糖凝胶中进行电泳。从凝胶上切割下目的条带，用
Sephaglas(Pharmacia)进行纯化。

[0285] 使用T4DNA连接酶，所得DNA片段被连接到用同样的限制酶进行了双水解的pSE420D(JP-A No.2000-189170)上。用连接好的DNA转化大肠杆菌JM109菌株的细胞。

[0286] 转化体生长在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板中，从一些菌落中纯化出质粒，测定插入片段的核苷酸序列。每一个含有D-氨基酰化酶基因的质粒被分别命名为
pSL-ADD2，pSL-ADD3，pSL-ADD4和pSL-ADD5。质粒中的D-氨基酰化酶基因的核苷酸序列与
由实施例2中得到的PCR产物的核苷酸序列(反硝化产碱菌木糖亚种MT-4的D-氨基酰化
酶基因的核苷酸序列)进行比较后发现，当把开放阅读框架(ORF)的起始密码子ATG的第
一个碱基A作为1时，在质粒pSL-ADD2中，D-氨基酰化酶基因核苷酸序列的第679位密码
227 331
子GAG取代为GGG(Glu ->Gly)，第99l位的密码子AAG被取代为AGG(Lys ->Arg)；在质粒
338
pSL-ADD4中，第1012位的密码子CTG被取代为CCG(Leu ->Pro)。并且在这两种质粒中，
D-氨基酰化酶的活性几乎测不到。这些氨基酸取代导致D-氨基酰化酶的催化活性丧失。

[0287] 然而在质粒pSL-ADD3中，第103位的密码子GGC被取代为GAC(Gly35->Asp)，634位212 325
的密码子AGC被取代为AGT(Ser ->Ser)，973位的密码子GCC被取代为GCT(Ala ->Ala)；
15
在质粒pSL-ADD5中，第43位的密码子GGC被取代为GGA(Gly ->Gly)，1009位的密码子GAG
337
被取代为GGG(Glu ->Gly)，然而由这两种质粒编码的酶具有D-氨基酰化酶活性，可见这
些氨基酸取代对D-氨基酰化酶的催化活性没有影响。

[0288] 实施例6：制备与大肠杆菌的密码子使用习惯相容的修饰型D-氨基酰化酶基因

[0289] (1)构建包含修饰的D-氨基酰化酶基因的表达质粒

[0290] 反硝化产碱菌木糖亚种MT-4菌株的D-氨基酰化酶基因，在其编码区内存在着对于大肠杆菌来说非常稀有的密码子，而且该基因的GC含量非常高。为了提高在大肠杆菌内
D-氨基酰化酶基因表达的稳定性以及效力，对实施例4所述PCR过程中产生的核苷酸取代
进行校正，并且那些在大肠杆菌中非常稀有的密码子也需要从D-氨基酰化酶基因中缺失。
另外，改变密码子使之与宿主大肠杆菌的密码子使用习惯相容，编码区的GC含量也进行调
节使其适用于大肠杆菌。对核苷酸序列进行再构建，但确保不因核苷酸序列取代而改变其
所编码的氨基酸序列。所得的DNA序列见SEQ ID NO：3。

[0291] 双链DNA的合成基于修饰的D-氨基酰化酶基因的核苷酸序列的信息，该基因经过设计在其两端分别含有PciI和XbaI识别位点。双链DNA通过oligo-DNA装配法整合到pUC
载体中。在确认该克隆的核苷酸序列后，该DNA被PciI和XbaI双酶切，再用T4DNA连接酶
将该DNA片段连接到已经NcoI和XbaI双酶切的质粒pSE420D中，得到能表达修饰型D-氨
基酰化酶基因的质粒pSL-ADD6。该质粒含有修饰型D-氨基酰化酶基因，于2002年11月12
日保藏在International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced
Industrial Science and Technology(AIST)，IndependentAdministrative Institution，
保藏号为FERMBP-08508。用该质粒转化大肠杆菌JM109菌株。

[0292] (2)检测修饰型D-氨基酰化酶基因所表达的D-氨基酰化酶活性

[0293] 实施例6(1)所得转化体在含有氨苄青霉素(50ug/ml)的液体LB培养基中26℃振荡培养过夜，加入0.1mMIPTG，然后在30℃振荡温育4小时。细菌细胞经离心收集后，悬
浮在含0.02％2-巯基乙醇的100mMTris-HCl缓冲液(pH9.0)中。细胞在密闭的超声波仪
UCD-200TM(cosmoBio)中进行3分钟超声裂解。细胞裂解物离心，回收上清液，将其作为细
胞提取液用来进行D-氨基酰化酶活性分析。野生型D-氨基酰化酶活性为34U/mg，而修饰
型 D-氨基酰化酶活性为86U/mg，可见核苷酸序列修饰对提高该酶的特异性活性有贡献。

[0294] 实施例7：反硝化产碱菌木糖亚种MT-4的D-氨基酰化酶的PCR诱变

[0295] 用低保真DNA聚合酶和实施例6中构建的D-氨基酰化酶表达载体pSL-ADD6，通过PCR法复制D-氨基酰化酶基因，从而在D-氨基酰化酶基因中引入随机核苷酸取代。转
化体通过转化大肠杆菌JM109细胞而获得。

[0296] 用引物ADD-ATG2和ADD-TAA2扩增目的DNA片段。PCR反应在50μl的反应液中进行，该反应液中含有Taq聚合酶缓冲液，0.2mM dNTP和引物ADD-ATG2和ADD-TAA2(各
10pmol)，2.0U Taq DNA聚合酶以及125ng的质粒pSL-ADD6，在94℃变性30秒，72℃延伸
105秒，进行30个循环。所得PCR片段用EcoRI和HindIII双酶切，再用T4DNA连接酶与经
EcoRI和HindIII双酶切的质粒pSE420D连接，得到含有不同的随机核苷酸取代的D-氨基
酰化酶基因的质粒文库。用该质粒文库转化大肠杆菌JM109菌株，得到含有突变型D-氨基
酰化酶基因的转化体的文库。

[0297] 实施例8：筛选突变体。

[0298] 大肠杆菌转化体细胞在LB琼脂平板上进行温育，在平板上长出菌落，将每一菌落用牙签接种到微滴板(microtiter plate)上含有150μl LB培养基的孔中温育，所述培养
基含有50μg/ml氨苄青霉素和0.02mM IPTG。微滴板用可透气的密闭膜(Nalgene)覆盖，
37℃振荡温育18个小时。将10μl培养基溶液加入微滴板含有下述反应液的孔中，所述反
应液含有300mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)，0.1％鲸蜡基溴化吡啶鎓，5％N-乙酰-DL-色氨
酸，1％N-乙酰-L-色氨酸以及蒸馏水。然后平板在25℃振荡温育1小时。由N-乙酰-D-色
氨酸产生的D-色氨酸按TNBS法进行比色定量。

[0299] 野生型菌株同时进行反应，反应后选出D-色氨酸生产活性高于野生型菌株者。约3000个菌落中选出了4个突变菌株，这4个突变菌株在含有50μg/ml氨苄青霉素和0.02mM
IPTG的LB培养基中30℃振荡培养18个小时。该液体培养基在5％N-乙酰-DL-色氨酸
和1％N-乙酰-L-色氨酸存在下温育。与野生型菌株释放的D-色氨酸量相比较，N-乙
酰-L-色氨酸对D-色氨酸生产的抑制程度减弱。因此，通过上述方法得到4种突变型D-氨
基酰化酶AD-0103，AD-1064，AD-1089，和AD-1927。

[0300] 实施例9：分析突变型D-氨基酰化酶的突变位点

[0301] 用常规的方法从大肠杆菌转化体纯化含有突变基因的重组DNA，分析这些突变酶基因(其抑制作用已减弱)的核苷酸序列。结果显示，在突变型D-氨基酰化酶AD-0103和
AD-1089中，第347位的甲硫氨酸残基(ATG)被取代为缬氨酸残基(GTG)。在突变型D-氨
基酰化酶AD-1064中，第154位的丙氨酸残基(GCC)被取代为缬氨酸残基(GTC)。在突变型
D-氨基酰化酶AD-1927中，第154位的丙氨酸残基(GCC)被取代为苏氨酸残基(ACC)，374
位的精氨酸残基(CGC)被取代为组氨酸残基(CAC)。在这之前，产碱菌属的D-氨基酰化酶
的任一种氨基酸序列中还未发现过这些氨基酸取代。

[0302] 实施例10：突变体对较高浓度N-乙酰-DL-色氨酸的转变的影响

[0303] 用实施例8所得的抑制作用已减弱的突变型D-氨基酰化酶AD-0103，AD-1064和AD-1927的表达质粒转化大肠杆菌HB101菌株。大肠杆菌细胞在30℃的液体LB培养基中温
育过夜。然后将转化体接种到2x YT培养基(含2％细菌用胰蛋白胨，1％细菌用酵母提取
物，1％氯化钠，pH7.2)中30℃温育18小时。收获大肠杆菌细胞，用于水解N-乙酰-D-色
氨酸。

[0304] 从5ml液体培养基制备每种大肠杆菌转化体的细胞，将其置于10ml含300mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)和5％或10％N-乙酰-DL-色氨酸的反应液中，25℃搅拌温育。用
含有携带野生型D-氨基酰化酶的质粒pSL-ADD6的大肠杆菌HB 101菌株作为对照。以5％
N-乙酰-DL-色氨酸为底物时，野生型的产率约为50％，而4个突变型都约为100％；以10％
N-乙酰-DL-色氨酸为底物时，野生型的产率约为15％，突变型AD-0103和AD-1089的约为
25％，AD-1064的约为40％，AD-1927的约为60％。可见，实施例8所得抑制作用减弱的突
变体，在较高浓度N-乙酰-DL-色氨酸的转变中，有更高的处理能力(processibility)。

[0305] 实施例11：制备第二代突变体

[0306] 在154位的丙氨酸，347位的甲硫氨酸和374位的精氨酸处引入随机突变，实施例9已发现这些位点的突变消弱了底物的抑制作用和/或竞争性抑制作用。然后从中筛选出
更为有效的氨基酸残基。

[0307] 合成下述引物：引物ADDm-55(SEQ ID NO：13)和ADDm-460mix(SEQID NO：14)用于将反硝化产碱菌木糖亚种MT-4菌株D-氨基酰化酶第154位的丙氨酸随机取代为另一个氨
基酸；引物ADDm-627F(SEQ ID NO：15)和ADDm-1039mix(SEQ ID NO：16)用于将第347位的
甲硫氨酸随机取代为另一 个氨基酸；引物ADDm-627F和ADDm-1120mix(SEQ ID NO：17)用
于将第374位的精氨酸随机取代为另一个氨基酸。利用实施例6中含有修饰型D-氨基酰
化酶基因的表达载体pSL-ADD6和上述引物，通过PCR法将随机氨基酸取代引入目的位点。

[0308] 以质粒pSL-ADD6为膜板，用每一对引物进行PCR反应，95℃变性30秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共进行25个循环。引物对ADDm-55和ADDm-460mix所得PCR扩增片
段用AvaI和BglII双酶切；引物对ADDm-627F和ADDm-1039mix所得PCR扩增片段用BlpI
和BsrGI双酶切；引物对ADDm-627F和ADDm-1120mix所得PCR扩增片段用BlpI和KpnI双
酶切。然后用T4DNA连接酶将经过消化的上述每一PCR扩增片段与经相同限制性内切酶双
酶切的质粒pSL-ADD6连接，获得3种不同质粒混合物，其中第154位的丙氨酸，第347位的
甲硫氨酸和第374位的精氨酸分别被随机取代为另一个氨基酸。然后将这3种质粒分别转
化大肠杆菌JM109菌株，以构建3种类型的文库。

[0309] 实施例12：筛选第二代突变体

[0310] 将实施例11所得3种大肠杆菌转化体文库接种到LB琼脂平板中，在平板上长出菌落。将每一菌落用牙签接种到微滴板上含有150μl LB培养基的孔中温育，所述培养基含
有50μg/ml氨苄青霉素和0.02mM IPTG。微滴板用可透气的密闭膜(Nalgene)覆盖。37℃
振荡温育18个小时。将10μl培养基溶液加入微滴板上含有下述反应液的孔中，所述反应
液含有300mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)，0.1％鲸蜡基溴化吡啶鎓，5％N-乙酰-DL-色氨酸，
1％N-乙酰-L-色氨酸以及蒸馏水。然后平板在25℃振荡温育1小时。从N-乙酰-D-色
氨酸产生的D-色氨酸按TNBS法进行比色定量。同时用野生型大肠杆菌菌株进行同样的反
应。分离出与野生型菌株相比，产生D-色氨酸的能力提高的突变株作为抑制作用减弱的突
变株。结果在约200个菌落里分离出若干个竞争性抑制减弱的突变株。

[0311] 实施例13：分析第二代D-氨基酰化酶突变体的突变位点。

[0312] 检测实施例12所得3种第二代突变酶(其抑制作用已减弱)基因的核苷酸序列。分析每一组大肠杆菌转化体中抑制作用已减弱的菌株。选出最佳的(top)7株A154X，18株
M347X和18株R374X，分析每一个位点上何种 氨基酸被取代。含有各自突变基因的重组
DNA通过常规的方法纯化，测定重组DNA中的突变型D-氨基酰化酶基因的核苷酸序列。

[0313] 突变体中的氨基酸取代以及该氨基酸取代的效果，通过在5％N-乙酰-DL-色氨酸和2％N-乙酰-L-色氨酸存在时D-色氨酸的生产活性来评估，见表2。这里用到的“活性”
是指，反应结束时通过TNBS法(Abs.420)测出的反应液比色值/细菌生长程度(OD600)。

[0314] 表2

[0315]D-氨基酰化酶 460-GCG154-Ala 1039-ATG34/-Met 1120-CGC3/4-Arg D-色氨酸生产活性
野生型 - - - 2.58
A154-0043 GTA Val - - 3.34
A154-0170 TGC Cys - - 3.03
A154-0183 ACA Thr - - 3.28
M347-0025 - GGT GIy - 7.99
M347-0033 - AAC Asn - 4.86
M347-0073 - CAA Gln - 9.69
M347-0078 - ATA Ile - 5.26
M347-0086 - TCT Ser - 6.86
M347-0130 - CCC Pro - 5.94
M347-0146 - GCA Ala - 9.00
R374-0017 - - TTT Phe 8.54
R374-0030 - - AAA Lys 3.47
R374-0036 - - CTT Leu 3.70
R374-0062 - - CAC His 6.88
R374-0092 - - ATC Ile 3.22
R374-0132 - - TGG Trp 4.40
R374-0177 - - TAT Tyr 5.86

[0316] [0315] 实施例14：制备第三代突变体。

[0317] 从实施例13的每一组第二代突变株中选出2种含有氨基酸取代并且抑制作用进一步减弱的突变D-氨基酰化酶，即A154-0043(含氨基酸取代A154V)和A154-0183(含氨
基酸取代A154T)；M347-0073(含氨基酸取代M347Q)和M347-0133(含氨基酸取代M347A)；
R374-0017(含氨基酸取代R374F)和R374-0062(含氨基酸取代R374H)。将这些位点的突
变组合，鉴定出抑制作用进一步减弱的第三代突变酶。后文中，将含有编码酶A154-0043的
DNA的质粒称为“pA154-0043”，含有编码酶A154-0183的DNA的质粒称为“pA154-0183”，含
有编码酶M347-0073的DNA的质粒称为“pM347-0073”，含有编码酶M347-0133的DNA的质
粒称为“pM347-0133”，含有编码酶R374-0017的DNA的质粒称为“pR374-0017”，含有编码
酶R374-0062的DNA的质粒称为“pR374-0062”。

[0318] 质粒pA154-0043和pA154-0183被限制性内切酶AvaI和BlpI双酶切，乙醇沉淀后进行琼脂糖凝胶电泳，约0.6kbp的泳带从凝胶中切出，DNA用Sephagls
BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯 化 并 回 收。 来 自 质 粒pA154-0043和
pA154-0183的约0.6kbp的DNA片段分别含有突变A154V和A154T，于是被分别称为
pA154-0043/AvaI/BlpI和pA154-0183/AvaI/BlpI。质粒pM347-0073和pM347-0133被限
制性内切酶BlpI和BsrGI双酶切，乙醇沉淀后进行琼脂糖凝胶电泳，约0.4kbp的泳带被从
凝胶中切出，DNA片段用Sephagls BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)纯化并回收。

[0319] 来自质粒pM347-0073和pM347-0133的约0.4kbp的DNA片段分别含有突变M347Q和M347A，因此被分别称为pM347-0073/BlpI/BsrGI和pM347-0133/BlpI/BsrGI。质粒
pR374-0017和pR374-0062被3种限制性内切酶AvaI，BlpI和BsrGI消化。乙醇沉淀后回
收DNA。来自质粒pM374-0017和pM374-0062的DNA片段分别约为0.6kbp，0.4kbp和5kbp，
这3种片段的混合物分别被称为pR374-0017/AvaI/BlpI/BsrGI和pR374-0062/AvaI/BlpI/
BsrGI。这2种混合物中约5kbp的片段分别具有突变R374F和R374H。质粒pSL-ADD6用3
种限制性内切酶AvaI，BlpI和BsrGI消化。乙醇沉淀后回收DNA。来自质粒pSL-ADD6的
DNA片段包含约0.6kbp，0.4kbp和5kbp的片段，它们都不含有氨基酸取代。这3种片段的
混合物被称为pSL-ADD6/AvaI/BlpI/BsrGI。

[0320] [pR374-0017/AvaI/BlpI/BsrGI，pR374-0062/AvaI/BlpI/BsrGI，pSL-ADD6/AvaI/BlpI/BsrGI]，[pA154-0043/AvaI/BlpI，pA154-0183/AvaI/BlpI]，和 [pM347-0073/BlpI/
BsrGI，pM347-0133/BlpI/BsrGI]以1∶3∶3摩尔比混合在一起，混合物用T4DNA连接酶
随机连接。通过上述步骤得到了一种质粒混合物，该混合物包含以下突变体，它们分别含有
在3个位点之一随机组合三种突变而产生的2个和3个氨基酸取代。用所述质粒混合物转
化大肠杆菌JM109菌株，得到了转化体。

[0321] 实施例15：筛选第三代突变体。

[0322] 将实施例9所得大肠杆菌转化体细胞接种到LB琼脂平板中，在平板上长出菌落。将每一菌落用牙签接种到微滴板上含有150μl LB培养基的孔中温育，所述培养基含有
50μg/ml氨苄青霉素和0.02mM IPTG。微滴板用可透气的密闭膜(Nalgene)覆盖。37℃
振荡温育18个小时。将10μl培养基溶液加入微滴板上含有下述反应液的孔中，所述反
应液含有300mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，0.1％鲸蜡基溴化吡啶鎓，2％N-乙酰-DL-色
氨酸，3.5％N-乙酰-L-色氨酸以及蒸馏水。然后平板在25℃振荡温育30分钟。从N-乙
酰-D-色氨酸产生的D-色氨酸按TNBS法进行比色定量，用D-色氨酸作为标准。同时用野
生型大肠杆菌菌株进行同样的反应。分离出与野生型菌株相比，产生D-色氨酸的能力提高
的突变株作为抑制作用减弱的突变株。结果在约200个菌落里分离出若干个竞争性抑制减
弱的突变株。

[0323] 实施例16：分析第三代D-氨基酰化酶突变体的突变位点

[0324] 检测实施例15所得第三代突变酶(其抑制作用已经减弱)基因的核苷酸序列。按照常规的方法，从选自每一组大肠杆菌转化体的20个最佳菌株(其抑制作用已减弱)中纯
化出含有所述突变基因的重组DNA。测定这些重组DNA中突变型D-氨基酰化酶基因的核苷
酸序列。

[0325] 每一突变体的氨基酸取代见表3。

[0326] 表3D-aminoacylase 460-GCG 1039-ATG 1120-CGC Activity of producingD-tryptophan
154-Ala 347-Met 374-Arg
wild-type - - - 2.65
3AD-0004 ACA GCA TTT 3.78
Thr Ala Phe
3AD-0013 - CAA CAC 5.72
Gln His
3AD-0029 - GCA TTT 3.69
Ala Phe
3AD-0041 - GCA CAC 7.32
Ala His
3AD-0063 GTA GCA 3.06
Val Ala
3AD-0089 GTA GCA TTT 8.14
Val Ala Phe
3AD-0093 ACA CAA TTT 7.03
Thr Gln Phe
3AD-0109 ACA GCA CAC 5.87
Thr Ala His
3AD-0136 GTA CAA CAC 8.43
Val Gln His
3AD-0149 ACA Thr CAA CAC His 6.36
Gln

[0327] 实施例17：评价第三代D-氨基酰化酶突变体的反应活性。

[0328] 通过常规的方法，从实施例16所得总共10株大肠杆菌JM109转化体纯化出重组质粒DNA。用这些重组质粒DNA转化大肠杆菌HB101细胞，以制备转化体。将平板上长出的每
一菌落用牙签接种到微滴板上含有150μlLB培养基的孔中温育，所述培养基含有50μg/
ml氨苄青霉素和0.02mMIPTG。微滴板用可透气的密闭膜(Nalgene)覆盖。37℃振荡温育
18个小时。该反应用微滴板每孔中总共200μl的反应液进行，该反应液含有100μl培养
基溶液，300mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，7％N-乙酰-DL-色氨酸和蒸馏水。然后平板在
25℃振荡温育8小时。当底物中所有的N-乙酰-D-色氨酸被转变为D-色氨酸时，将该产
率当作100％。野生型的产率为约70％，实施例16所得第三代突变体的产率约为100％。
可见，竞争性抑制作用在第三代突变体中减弱。

[0329] 实施例18：选择最优选的突变体

[0330] 3AD-0013(M347Q/R374H)和3AD-0089(A154V/M347A/R374P)分别是实施例16中第3代突变体的具有2个和3个氨基酸取代的突变体。用表达这2种突变体的质粒转化大肠
杆菌HB101细胞，将细胞接种在液体LB培养基中，30℃培养过夜。然后将大肠杆菌细胞接
种在培养基(2x YT)中30℃温育18小时，收获细胞，用于水解N-乙酰-D-色氨酸。

[0331] 从5ml培养基溶液制备大肠杆菌细胞，将其置于10ml含300mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)和15％N-乙酰-DL-色氨酸的反应液中，25℃搅拌温育24小时。用含有野生型
pSL-ADD6的大肠杆菌HB101菌株作为对照。野生型的产率约为15％，含有2个氨基酸取代
的突变体3AD-0013和含有3个氨基酸取代的突变体3AD-0089的产率分别为大约30％和大
约80％。可见，实施例15所得第三代突变体，在水解较高浓度N-乙酰-DL-色氨酸时有更
高的处理能力(processibility)。

[0332] 实施例19：纯化野生型D-氨基酰化酶

[0333] 将含有携带野生型D-氨基酰化酶编码DNA的质粒pSL-ADD6的大肠杆菌转化体接种在液体LB培养基中，30℃温育过夜。然后将大肠杆菌细胞接种在培养基(2x YT)中，30℃
温育过夜。离心收集细胞，所得细胞在含有100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，0.02％2-巯基乙醇
和2mM苯甲烷磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的混合液中悬浮。然后将
细胞用beadbeater(Biospec)破碎，经离心去除细胞残渣，得到无细胞提取物，向其中加入
硫酸鱼精蛋白。提取物经离心去除核酸。加入硫酸铵至30％饱和。将混合物加载到已经用
含30％硫酸铵的标准缓冲液(含10mM的磷酸缓冲液(pH8.0)，0.01％2-巯基乙醇和10％
甘油)平衡的phenyl-Sepharose HP柱(2.6cm×10cm)中，用30％至0％的硫酸铵梯度进
行洗脱，在一个级分中检测到样品。D-氨基酰化酶活性用该梯度洗脱，回收洗脱的峰级分并
进行超滤浓缩。

[0334] 浓缩的酶溶液在标准缓冲液中透析后，见所得溶液加载到用相同缓冲液平衡的Mono-Q柱(1.6cm×10cm)中，用0至0.5mM的氯化钠梯度洗脱，回收活性级分，并进行超滤
浓缩，得到浓缩的酶溶液。

[0335] 纯化的酶的特异性活性为528U/mg。

[0336] 实施例20：纯化突变型D-氨基酰化酶A154-0043(含有氨基酸取代A154V)

[0337] 用实施例19所述方法，将从含有质粒pSL-AD07的大肠杆菌转化体中纯化突变型D-氨基酰化酶A154-0043，该质粒含有编码突变型D-氨基酰化酶A154-0043的DNA。

[0338] 纯化的酶的特异性活性为758U/mg。

[0339] 实施例21：纯化突变型D-氨基酰化酶M347-0133(含有氨基酸取代M347A)

[0340] 用实施例19所述方法，从含有质粒pSL-AD08的大肠杆菌转化体中纯化突变型D-氨基酰化酶M347-0133，该质粒含有编码突变型D-氨基酰化酶M347-0133的DNA。

[0341] 纯化的酶的特异性活性为1099U/mg。

[0342] 实施例22：纯化突变型D-氨基酰化酶R374-0017(含有氨基酸取代R374F)

[0343] 用实施例19所述方法，从含有质粒pSL-AD09的大肠杆菌转化体中纯化突变型D-氨基酰化酶R374-0017，该质粒含有编码突变型D-氨基酰化酶R374-0017的DNA。

[0344] 纯化的酶的特异性活性为855U/mg。

[0345] 实施例23：纯化突变型D-氨基酰化酶3AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)

[0346] 用实施例19中所述方法，从含有质粒pSL-AD10的大肠杆菌转化体中纯化突变型D-氨基酰化酶3AD-0089，该质粒含有编码突变型D-氨基酰化酶3AD-0089的DNA。

[0347] 纯化的酶在纯度约70％时的特异性活性为324U/mg。

[0348] 实施例24：检测突变型D-氨基酰化酶的N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸抑制作用

[0349] 检测实施例20-23所得突变型D-氨基酰化酶的N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸抑制作用。N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸的反应速率常数按照
“Lectures for Biochemical Experiments 21：Introduction toExperimental Approach
to Enzyme Kinetics” 和“Basic Experimental MethodsforProteins and Enzymes，
第2版”所述进行。米氏常数用Km来代表，最大反应速率用Vmax代表，抑制常数用Ki代
表，过量的底物对反应的抑制常数用Ks’表示，Km和Vmax通过Lineweaver-Burk倒推作图
(reciprocalplot)获得，Ki通过二阶作图(second-order plot)(Royer)得出，Ks’通过
[S]-1/V作图确定，结果见表4。

[0350] 结果证实，使用任一种突变型D-氨基酰化酶进行反应，N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制作用和N-乙酰-L-色氨酸的竞争性抑制作用都减弱了。

[0351] 特别的，当应用3AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)时，在99mM的N-乙酰-D-色氨酸存在的情况下，底物抑制作用甚至检测不到，在89mM的N-乙酰-L-色氨
酸存在的情况下，竞争性抑制作用也检测不到，可见这些突变对抑制作用的减弱起到了很
大的作用。

[0352] 表4

[0353]F47
3RA7
9800 43MV )d )d
-DA3 451A 64.1 753 .D.N .D.N
710 F473
0-47 R 49 00 64 00.
3R .1 01 .7 39
33 A74
10-7 3M 2 0 72 00
43M 4.1 001 .21 .77
V
3400 451A
-451 44. 130 04. 76.3
A 3 1 6 1
型生 35 5 06 92
野 - .2 86 .2 .1
)
)
图
酶化酰基氨-D 代取酸基氨 b 图作推倒kruB-revaeweniL()Km b 作推倒kruB-revaeweniL()Vxam c )2891，reyoR；图作阶二()Ki b )tolp v/1-]S[()’Ks[0354] a)30℃，pH7.5的测量值

[0355] b)N-乙酰-D-色氨酸的反应常数

[0356] c)N-乙酰-L-色氨酸的反应常数

[0357] d)N.D.：未检测

[0358] 实施例25：使用野生型和突变型D-氨基酰化酶从N-乙酰-LD-色氨酸应得到D-色氨酸

[0359] 含有5个单位的无细胞提取物(在实施例19或23所述酶纯化步骤中获得)的0.5ml反应液与12％，15％，17％，20％或22％N-乙酰-DL-色氨酸，以及300mMTris-HCl
缓冲液(pH8.0)在30℃搅拌温育24小时。结果见表5。使用野生型时，在任意的底物浓度
下，D-色氨酸的产率都低于10％，而当使用突变型3AD-0089时，在底物浓度高达17％情况
下，D-色氨酸的产率为80％或更多。而且，当底物浓度为20％时，这些突变体能以66％的
产率产生D-色氨酸，底物浓度为22％时，D-色氨酸的产率为58％。

[0360] 表5

[0361]

[0362] a)N-Ac-DL-Trp：N-乙酰-DL-色氨酸，D-Trp：D-色氨酸

[0363] b)Wild-type：野生型D-氨基酰化酶，3AD-0089：突变型D-氨基酰化酶

[0364] 实施例26：使用含有质粒pSL-AD10的重组大肠杆菌从高浓度N-乙酰-DL-色氨酸获得D-色氨酸，该质粒含有编码突变型D-氨基酰化酶3AD-0089(含有氨基酸取代A154V/
M347A/R374F)的DNA

[0365] 用实施例18所得的表达突变型D-氨基酰化酶3AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)的质粒pSL-AD10转化大肠杆菌HB101细胞。将转化体接种在液体LB培养基
中，30℃温育过夜。然后将大肠杆菌接种在培养基(2x YT)中，30℃温育18小时，之后用大
肠杆菌培养基溶液水解N-乙酰-D-色氨酸。

[0366] 含有大肠杆菌培养基溶液和15％N-乙酰-DL-色氨酸的400ml反应液在30℃搅拌温育24小时。用含有野生型质粒pSL-ADD1的大肠杆菌HB101菌株作为对照。结果见图
1，野生型的产率为约4％，而含有质粒pSL-AD10的重组大肠杆菌的产率为90％或更高(见
图1)。

[0367] 实施例27：使用含有质粒DSL-AD10的重组大肠杆菌从高浓度N-乙酰-DL-色氨酸得到D-色氨酸，该质粒含有编码突变型D-氨基酰化酶3AD-0089(含有氨基酸取代A154V/
M347A/R374F)的DNA-2-

[0368] 使用与实施例26中相同的方法在20％N-乙酰-DL-色氨酸存在的条件下进行水解，结果见图2。含有质粒pSL-AD10的重组大肠杆菌的产率为90％或更高，该质粒含有编
码突变型D-氨基酰化酶3AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)的DNA。所产生
的色氨酸的光学纯度用下述的步骤分析：将样品加载到CROWNPAK CR(+)(Daicel化工有限
公司)中。然后用HClO4溶液(pH2.0)作为洗脱缓冲液在40℃以1.0ml/min的流速洗脱。
检测洗脱液在280nm的光密度。D型和L型的滞留时间分别为16和19分钟。所产生的色
氨酸经证实为D型，因为其光学纯度接近100％e.e。可见，引入的突变对立体选择性没有
影响(见图2)。

[0369] 序列表

[0370] <110>大赛璐化学工业株式会社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD)

[0371] <120>D-氨基酰化酶突变体

[0372] <130>D1-A0207

[0373] <150>JP2002-372624

[0374] <151>2002-12-24

[0375] <160>17

[0376] <170>PatentIn version3.1

[0377] <210>1

[0378] <211>484

[0379] <212>PRT

[0380] <213>反 硝 化 产 碱 菌 木 糖 亚 种 (Alcaligenes deni trificans subsp.Xylosoxydans)MI-4

[0381] <400>1

[0382]

[0383]

[0384] <210>2

[0385] <211>1455

[0386] <212>DNA

[0387] <213>反硝化产碱菌木糖亚种(Alcaligenesdenitrificanssubsp.Xylosoxydans)MI-4

[0388] <400>2

[0389]

[0390] <210>3

[0391] <211>1455

[0392] <212>DNA

[0393] <213>人工的

[0394] <220>

[0395] <223>人工合成的序列

[0396] <400>3

[0397]

[0398]

[0399] <210>4

[0400] <211>28

[0401] <212>DNA

[0402] <213>人工的

[0403] <220>

[0404] <223>人工合成的引物序列

[0405] <400>4

[0406] <210>5

[0407] <211>26

[0408] <212>DNA

[0409] <213>人工的

[0410] <220>

[0411] <223>人工合成的引物序列

[0412] <400>5

[0413]

[0414]

[0415] <210>6

[0416] <211>26

[0417] <212>DNA

[0418] <213>人工的

[0419] <220>

[0420] <223>人工合成的引物序列

[0421] <400>6

[0422]

[0423] <210>7

[0424] <211>17

[0425] <212>DNA

[0426] <213>人工的

[0427] <220>

[0428] <223>人工合成的引物序列

[0429] <400>7

[0430]

[0431] <210>8

[0432] <211>18

[0433] <212>DNA

[0434] <213>人工的

[0435] <220>

[0436] <223>人工合成的引物序列

[0437] <400>8

[0438]

[0439] <210>9

[0440] <211>21

[0441] <212>DNA

[0442] <213>人工的

[0443] <220>

[0444] <223>人工合成的引物序列

[0445] <400>9

[0446]

[0447] <210>10

[0448] <211>19

[0449] <212>DNA

[0450] <213>人工的

[0451] <220>

[0452] <223>人工合成的引物序列

[0453] <400>10

[0454]

[0455] <210>11

[0456] <211>49

[0457] <212>DNA

[0458] <213>人工的

[0459] <220>

[0460] <223>人工合成的引物序列

[0461] <400>11

[0462]

[0463] <210>12

[0464] <211>48

[0465] <212>DNA

[0466] <213>人工的

[0467] <220>

[0468] <223>人工合成的引物序列

[0469] <400>12

[0470]

[0471] <210>13

[0472] <211>29

[0473] <212>DNA

[0474] <213>人工的

[0475] <220>

[0476] <223>人工合成的引物序列

[0477] <400>13

[0478]

[0479] <210>14

[0480] <211>34

[0481] <212>DNA

[0482] <213>人工的

[0483] <220>

[0484] <223>人工合成的引物序列

[0485] <220>

[0486] <221>misc_feature

[0487] <222>(21)..(23)

[0488] <223>n是指g，a，c或t任意之一

[0489] <400>14

[0490]

[0491] <210>15

[0492] <211>32

[0493] <212>DNA

[0494] <213>人工的

[0495] <220>

[0496] <223>人工合成的引物序列

[0497] <400>15

[0498]

[0499] <210>16

[0500] <211>38

[0501] <212>DNA

[0502] <213>人工的

[0503] <220>

[0504] <223>人工合成的引物序列

[0505] <220>

[0506] <221>misc_feature

[0507] <222>(24)..(26)

[0508] <223>n是指g，a，c或t任意之一

[0509] <400>16

[0510]

[0511] <210>17

[0512] <211>41

[0513] <212>DNA

[0514] <213>人工的

[0515] <220>

[0516] <223>人工合成的引物序列

[0517] <220>

[0518] <221>misc-feature

[0519] <222>(28)..(30)

[0520] <223>n是指g，a，c或t任意之一

[0521] <400>17

[0522]