胆固醇脱氢酶的稳定方法、含胆固醇脱氢酶的组合物以及胆固醇检测试剂

摘要

本发明是以与原有的胆固醇脱氢酶的稳定方法不同的新的胆固醇脱氢酶的稳定方法为目的，并且，以提供新的含胆固醇组成物以及胆固醇检测试剂为目的的发明。通过添加下述式(I)所示甘氨酸系化合物达到该目的。R-(NH-CH2-CO)n-NH-CH2-COOH (I)式中R表示氢、可以具有取代基的烷基、可以具有取代基的苯基或可以具有取代基的羰基，n表示0～2。

权利要求

1.总胆固醇检测试剂，由第一液体试剂和第二液体试剂组成，并且第一液体试剂和第二液体试剂分别配制存放，所述第一液体试剂由辅酶、胆固醇游离酶和封闭Δ4-胆甾烯酮的酮基的化合物组成，所述第二液体试剂由选自甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸的甘氨酸系化合物以及胆固醇脱氢酶组成。

2.游离胆固醇检测试剂，由第一液体试剂和第二液体试剂组成，并且第一液体试剂和第二液体试剂分别配制存放，所述第一液体试剂由辅酶和封闭Δ4-胆甾烯酮的酮基的化合物组成，所述第二液体试剂由选自甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸的甘氨酸系化合物以及胆固醇脱氢酶组成。

3.脂蛋白胆固醇检测试剂，由第一液体试剂和第二液体试剂组成，并且第一液体试剂和第二液体试剂分别配制存放，所述第一液体试剂由能与脂蛋白形成复合体的化合物和辅酶组成，所述第二液体试剂由选自甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸的甘氨酸系化合物、以及胆固醇脱氢酶和胆固醇游离酶组成。

4.权利要求3所述的脂蛋白胆固醇检测试剂，所述能与脂蛋白形成复合体的化合物选自杯芳烃类、聚乙二醇、磷钨酸、葡聚糖硫酸和肝素中的至少1种。

5.权利要求3所述的脂蛋白胆固醇检测试剂，所述能与脂蛋白形成复合体的化合物是杯芳烃类。

6.权利要求1～3中任一项所述的胆固醇检测试剂，所述第二液体试剂中含有选自糖苷、胆酸、一磷酸腺苷中的至少1种。

7.权利要求3～5中任一项所述的脂蛋白胆固醇检测试剂，所述脂蛋白胆固醇检测试剂是高密度脂蛋白HDL胆固醇检测试剂、低密度脂蛋白LDL胆固醇检测试剂或超低密度脂蛋白VLDL胆固醇检测试剂。

8.高密度脂蛋白HDL胆固醇的检测方法，由以下工序组成：

将样品与权利要求3所述的第一液体试剂混合，使除HDL以外的脂蛋白和所述能与脂蛋白形成复合体的化合物形成复合体的工序；以及向前述混合物中添加权利要求3所述的第二液体试剂，进行HDL胆固醇检测的工序。

9.低密度脂蛋白LDL胆固醇的检测方法，由以下工序组成：

将样品与权利要求3所述的第一液体试剂混合，使LDL和所述能与脂蛋白形成复合体的化合物形成复合体的工序；消除LDL以外的脂蛋白胆固醇的工序；以及添加权利要求3所述的第二液体试剂，进行LDL胆固醇检测的工序。

10.超低密度脂蛋白VLDL胆固醇的检测方法，由以下工序组成：

将样品与权利要求3所述的第一液体试剂混合，使VLDL和所述能与脂蛋白形成复合体的化合物形成复合体的工序；消除VLDL以外的脂蛋白胆固醇的工序；以及添加权利要求3所述的第二液体试剂，进行VLDL胆固醇检测的工序。

说明书

胆固醇脱氢酶的稳定方法、含胆固醇脱氢酶的组合物 以及

胆固醇检测试剂

技术领域

[0001] 本发明涉及胆固醇脱氢酶的稳定方法、含胆固醇脱氢酶的组合物以及胆固醇检测试剂。

背景技术

[0002] 历来，使用酶的测定方法由于具有反应特异性以及再现性良好、操作简便等特点，已被大量开发。特别是已经知道的在临床检查领域中血液样品成分的测定中有许多这样的方法。

[0003] 但是，最近在临床检查领域中，增加了脂质的检查，尤其是胆固醇是作为老年病的动脉硬化症的危险因子，很是重要，胆固醇的检测逐渐增加。胆固醇的检测方法现在一般是用酶法，这些方法中有已知的利用胆固醇氧化酶方法，同时也有利用胆固醇脱氢酶的方法(特开平5-176797号公告)。前一方法中，必须要将由酶反应产生过氧化氢在过氧化氢酶存在的情况下与发色底物发生反应形成醌类色素的工序，操作烦琐。另外，具有因测定的样品所含有的胆红素、抗坏血酸等而会产生误差的这样一种缺点。与此相对，后一方法是在NAD(P)的存在下，测定通过胆固醇与胆固醇脱氢酶的酶反应所产生的NAD(P)H量，所以只要测定所产生的NAD(P)H的吸光率就可以，操作简便，且具有试样中所带杂质对其结果的影响少的优点。

[0004] 但是，胆固醇脱氢酶是一种不稳定的酶，为配制测定用试剂人们已进行了多种努力。

[0005] 例如，提出了应用晶体蛋白稳定生理活性蛋白质的方法(特开平7-236483号公告)、应用糖苷稳定胆固醇脱氢酶的方法(特开平9-313178号公告)、应用螯合剂稳定生理活性物质的方法(特开2001-299385号公告)等。

发明内容

[0006] 本发明是以与原有的胆固醇脱氢酶的稳定方法不同的新的胆固醇脱氢酶的稳定方法为目的，提供新的含胆固醇的组合物以及胆固醇检测试剂为目的的发明。

[0007] 本发明的第一方面涉及胆固醇脱氢酶的稳定方法，其特征在于在胆固醇脱氢酶中添加下述式(I)所表示甘氨酸系化合物。

[0008] R-(NH-CH2-CO)n-NH-CH2-COOH (I)

[0009] (式中R表示氢、可以具有取代基的烷基、可以具有取代基的苯基或可以具有取代基的羰基，n表示0～2。)

[0010] 此外，本发明的第二方面涉及含有上述式(I)所表示甘氨酸系化合物以及胆固醇脱氢酶的含胆固醇脱氢酶组合物。

[0011] 还有，本发明的第三方面涉及含有上述式(I)所表示甘氨酸系化合物、胆固醇脱氢酶以及辅酶的胆固醇检测试剂。

具体实施方式

[0012] 含胆固醇脱氢酶的组合物由胆固醇脱氢酶以及式(I)所表示甘氨酸系化合物组成。

[0013] R-(NH-CH2-CO)n-NH-CH2-COOH (I)

[0014] (式中R表示氢、可以具有取代基的烷基、可以具有取代基的苯基或可以具有取代基的羰基，n表示0～2。)

[0015] 对胆固醇脱氢酶不进行特别限定，可列举来源于微生物、动物或者植物的酶，优选微生物来源的胆固醇脱氢酶。微生物中优选来自诺卡氏菌属(Nocardia sp.)的胆固醇脱氢酶。另外，也可以使用通过培养这些微生物、纯化而得到的胆固醇脱氢酶或由重组体得到的胆固醇脱氢酶。更进一步地，也可以是被糖或聚乙二醇等修饰的酶。

[0016] 用于胆固醇脱氢酶稳定化的甘氨酸系化合物以下述式(I)表示

[0017] R-(NH-CH2-CO)n-NH-CH2-COOH (I)

[0018] (式中R表示氢、可以具有取代基的烷基、可以具有取代基的苯基或可以具有取代基的羰基，n表示0～2。)

[0019] R为可以具有取代基的烷基、可以具有取代基的苯基、可以具有取代基的羰基，烷基可以是甲基、乙基等，苯基可以是羟苯基等。另外，取代基可举出羟甲基、羟基、氨基、羧基、硝基、甲氧基和硫醇基等。式(I)所示甘氨酸系化合物也可以2种以上加以组合。另外，式(I)所示甘氨酸系化合物可以优选列举甘氨酸、甘氨酰甘氨酸以及三(羟甲基)甲基甘氨酸。这些甘氨酸系化合物具有缓冲作用，也可以同时发挥缓冲剂的作用。

[0020] 在含胆固醇脱氢酶的组合物中，与上述式(I)表示的甘氨酸系化合物同时，也可以添加的其它稳定化物质，例如，胆酸、糖苷、一磷酸腺苷、晶体蛋白或螯合剂或它们的衍生物。作为胆酸或其衍生物，可以列举例如，胆酸盐类(例如钠盐等)、脱氧胆酸或其盐类(例如钠盐等)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸(CHAPSO)、N，N-双(3-D-葡萄糖酰胺丙基)胆酰胺(Deoxy-BIGCHAP)等。糖苷或其衍生物可以列举例如正十二烷基-β-D-麦芽苷(十二烷基麦芽糖)、正庚基-β-D-硫代葡糖苷、正辛基-β-D-葡糖苷、正辛基-β-D-硫代葡糖苷、毛地黄皂苷、蔗糖单癸酸酯、蔗糖单月桂酸酯、2-乙基-己基葡糖苷、正辛酰基-N-甲基葡萄糖胺、正甲基葡萄糖胺、正壬酰基-N-甲基葡萄糖胺以及正癸酰基-N-甲基葡萄糖胺等。另外，一磷酸腺苷或其衍生物可以列举为，例如一磷酸腺苷或其盐(钠盐、钾盐等)。晶体蛋白或其衍生物可以列举例如α-晶体蛋白、β-晶体蛋白、γ-晶体蛋白和δ-晶体蛋白等。螯合剂可以列举例如乙二胺二乙酸(EDDA)、亚氨基二乙酸(IDA)、次氮基三乙酸(NTA)、羟基乙基亚氨基二乙酸(HIDA)、乙二胺二丙酸(EDDP)、乙二胺四亚甲基膦酸(EDTPO)、羟基乙基乙二胺四乙酸(EDTA-OH)、二氨基丙醇四乙酸(DPTA-OH)、次氮基三亚甲基膦酸(NTPO)、双(氨基苯基)乙二醇四乙酸(BAPTA)、次氮基三丙酸(NTP)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二醇醚二胺四乙酸(GEDTA)等。

[0021] 由式(I)中所示甘氨酸系化合物的胆固醇脱氢酶的稳定效果不仅在含胆固醇脱氢酶组合物处于液体状态下起显著的作用，在冷冻干燥状态下也能发挥显著的效果。在含胆固醇脱氢酶组合物中添加式(I)所示甘氨酸化合物的添加量，可以根据其种类、含胆固醇脱氢酶组合物中胆固醇脱氢酶的含量以及含胆固醇脱氢酶组合物的保存条件等适当地设定。例如，优选在含胆固醇脱氢酶组合物中添加的甘氨酸系化合物的浓度为0.001～2000mM，更优选为10～1500mM，再优选为100～1000mM。

[0022] 含胆固醇脱氢酶组合物在例如除测定总胆固醇、游离胆固醇之外，还可以应用在高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇或超低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇等脂蛋白胆固醇的测定中。

[0023] 总胆固醇测定试剂由第一试剂和第二试剂组成，其中第一试剂由胆固醇脱氢酶的反应中的必要辅酶(以下简称为辅酶)和胆固醇游离酶以及反应促进剂组成，第二试剂由含胆固醇脱氢酶组合物组成的第二试剂。另外，游离胆固醇测定试剂由第一试剂和第二试剂组成，其中第一试剂由辅酶和反应促进剂组成，第二试剂由含胆固醇脱氢酶组合物组成。

[0024] 作为辅酶，可以列举氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氧化型硫代-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(t-NAD)、氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP)、氧化型硫代-烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(t-NADP)等。由于胆固醇的存在，这些辅酶被分别转变成各自的还原型，即NADH、t-NADH、NADPH、t-NADPH。

[0025] 作为反应促进剂，只要是能够封闭胆固醇经胆固醇脱氢酶氧化得到的产物Δ4-胆甾烯酮的酮基的就可以，并没有特别的限定，可以列举肼、其水合物、其盐以及其衍生物。作为肼衍生物应该是以肼为基本骨架的化合物。具体例子可列举肼水合物有肼(1水合物)，肼衍生物有优选二氯化 、一溴化 、硫酸 ，此外氯化苯 、苯肼-对磺酸、硫酸苯 、肼吡啶等。

[0026] 添加的肼、其水合物、其盐、其衍生物的量，因其种类、组成以及其它条件的不同而有所不同，通常按将样品、第一试剂和第二试剂混合时浓度计，为5～500mM，优选20～200mM。

[0027] 作为胆固醇游离酶，只要是具有能游离与脂蛋白成酯键的胆固醇作用的都可以，并没有特别的限定。具体的可以列举胆固醇酯酶、脂蛋白脂酶等。

[0028] 脂蛋白胆固醇的测定试剂由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂由反应控制物质和辅酶组成，第二试剂由含胆固醇脱氢酶组合物以及胆固醇游离酶组成。

[0029] 作为脂蛋白，有HDL、LDL、VLDL、CM以及剩余的脂蛋白质(レムナント様リポ蛋白質)等，通过添加与这些脂蛋白形成复合体的反应控制物质可以测定这些脂蛋白质的胆固醇。

[0030] 反应控制物质可以列举杯芳烃类、聚乙二醇(PEG)、磷钨酸、葡聚糖硫酸、肝素等，而且这些物质可以与Mg++、Mn++、Ca++、Li++、Ni++等阳离子组合使用。

[0031] 反应控制剂优选杯芳烃类。以下说明使用杯芳烃类测定脂蛋白质的胆固醇的方法。

[0032] 杯芳烃类是以酚作为基本骨架，酚的4-8个分子以亚甲基环状聚合形成的环状低聚物。杯芳烃类可以列举杯(4)芳烃(Calix(4)arene)、杯(6)芳烃、杯(8)芳烃、硫酸杯(4)芳烃、硫酸杯(6)芳烃、硫酸杯(8)芳烃、乙酸杯(4)芳烃、乙酸杯(6)芳烃、乙酸杯(8)芳烃、羧基杯(4)芳烃、羧基杯(6)芳烃、羧基杯(8)芳烃、杯(4)芳烃胺、杯(6)芳烃胺、杯(8)芳烃胺等。可以使用选自这些杯芳烃类中的1种或2种以上。

[0033] 辅酶和胆固醇游离酶可以使用上述的辅酶以及胆固醇游离酶。

[0034] 第一试剂中的杯芳烃的浓度，有必要根据分析对象、杯芳烃类的种类以及pH等测定条件来决定，其最适宜浓度可以实验性地设定。

[0035] 为了根据要求为去除游离胆固醇或非测定对象的脂蛋白中的胆固醇，可以在第一试剂中添加胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶，优选使用胆固醇氧化酶。

[0036] 例如，测定HDL中的胆固醇时，在第一反应中添加杯芳烃类，形成HDL以外的脂蛋白和杯芳烃类的复合体从而使之稳定，在第二反应中添加酶等，就可以测定HDL中的胆固醇的浓度。

[0037] 测定LDL中的胆固醇时，先前所述的条件组合在一起，第一反应中形成LDL与杯芳烃的复合体从而使之稳定，同时预先反应并消除HDL以及VLDL中的胆固醇和游离胆固醇，在第二反应中测定剩下的LDL中的胆固醇。

[0038] 测定VLDL中的胆固醇时，先前所述的条件组合在一起，第一反应中形成VLDL与杯芳烃的复合体从而使之稳定，同时预先反应并消除其它胆固醇，在第二反应中测定剩下的VLDL中的胆固醇。

[0039] 样品可以列举血清、血浆、尿、唾液和精液等。

[0040] 实施例

[0041] 以下举出实施例，但本发明并不局限于这些实施例。

[0042] 实施例1

[0043] 配制含有0.7U/mL胆固醇脱氢酶、0.5M表1所示的化合物以及2mg/mL胆酸钠的负荷液(pH8.8)，37℃下放置3日后，通过以下所示的方法求得胆固醇脱氢酶的残余活性。以样品刚配制之后的酶活性为100％计，保存后的残余活性以相对值表示的结果显示在表
1中。如表1所示，通过添加甘氨酸、甘氨酰甘氨酸或三(羟甲基)甲基甘氨酸之类的甘氨酸系化合物，明显地达到了酶的稳定化。

[0044] 1.胆固醇脱氢酶活性的测定方法。

[0045] 配制以下组成的试剂。

[0046] 试剂A：

[0047] 胆固醇 1mg/mL

[0048] Triton X-100 20mg/mL

[0049] 试剂B：

[0050] β-NAD 3mg/mL

[0051] Tris缓冲液(pH8.5) 0.3M

[0052] 稀释液：

[0053] 胆酸钠 3mg/mL

[0054] 磷酸缓冲液(pH7.0) 20mM

[0055] 2.测定方法

[0056] 将用稀释液稀释10倍的负荷液作为样品液。200μL试剂A中混合10μL样品液，25℃下恒温5分钟。恒温后的混合液中添加100μL的试剂B，求得25℃340nm下每分钟吸光度的变化量。同样，以添加10μL稀释液来取代样品液，求得试剂的空白。

[0057] 表1试剂名称 残留率(％)
甘氨酸 52
甘氨酰甘氨酸 50
三(羟甲基)甲基甘氨酸 48
TAPS 28
N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine) 23
HEPES 15
CHES 1
三(羟乙基)氨基甲烷 4
2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇 0
二乙醇胺 1
焦磷酸钾 9
硼酸 9

[0058] 实施例2

[0059] 对表2所示化合物进行浓度的探讨。除了各化合物的浓度在0.1-0.5M范围内变化以外，其他与实施例1相同。其结果显示在表2中。如表2所示，确认了在0.1-0.5M范围内的充分的稳定效果。

[0060] 表2 单位：残留率(％)

[0061] 实施例3

[0062] 通过甘氨酸与甘氨酰甘氨酸合并使用对胆固醇脱氢酶稳定化进行探讨。

[0063] 配制添加有2U/mL胆固醇脱氢酶、14mM十二烷基麦芽糖、0.5M甘氨酰甘氨酸以及各浓度甘氨酸的负荷液(pH8.8)，探讨在37℃保存一定时期后的胆固醇脱氢酶的残余率。以实施例1所示方法进行胆固醇脱氢酶残留活性的测定。

[0064] 刚配制好的负荷液的酶活性为100％，保存后的残留活性量为相对值表示的结果显示在表3中。如表3所示，确认了甘氨酸添加进一步提高了稳定的效果。

[0065] 表3

[0066] 单位：残留率(％)甘氨酰甘氨酸(M) 甘氨酸(M) 37℃ 1日 37℃ 2日0.5 0.00 66.7 54.0
0.5 0.05 67.8 73.8
0.5 0.10 69.3 62.2
0.5 0.20 72.1 67.0
0.5 0.30 74.3 65.8
0.5 0.40 75.8 68.5
0.5 0.50 77.3 71.0
0.5 0.60 79.4 80.2

[0067] 实施例4

[0068] 通过同时使用糖苷十二烷基麦芽糖、核苷一磷酸(AMP)，进行胆固醇脱氢酶稳定化的探讨。

[0069] 配制在2U/mL胆固醇脱氢酶、0.5M甘氨酰甘氨酸以及0.5M甘氨酸中添加有各种浓度的十二烷基麦芽糖以及AMP的负荷液(pH8.8)，探讨在37℃保存一定时期后的胆固醇脱氢酶的残留率。

[0070] 刚配制好的样品的酶活性为100％，保存后的残留活性量以相对值表示的结果显示在表4中。如表4所示，确认了十二烷基麦芽糖以及AMP的添加进一步提高了稳定效果。

[0071] 表4 单位：残留率(％)十二烷基麦芽糖 AMP 37℃ 1日 37℃ 2 37℃ 3日
5.9mM 5mM 84.2 75.7 69.9
7.5mM 84.9 78.1 73.1
10mM 87.5 80.5 76.4
7.8mM 5mM 88.8 82.3 77.8
7.5mM 91.0 86.1 80.4
10mM 90.7 87.1 81.9
9.8mM 5mM 91.9 87.6 82.2
7.5mM 91.8 87.0 83.4
10mM 93.9 90.3 85.2

[0072] 实施例5

[0073] 总胆固醇检测试剂的稳定性

[0074] 使用作为胆固醇脱氢酶的稳定剂的甘氨酸的总胆固醇检测试剂表示如下。该检测试剂由含第一试剂的溶液(pH7.0)和含第二试剂的溶液(pH8.5)构成，其第一试剂为PIPES25mM、二氯化 100mM、NonionA-10R0.5％、Triton X-100 0.5％、胆酸钠2mM、β-NAD 5mM、胆固醇酯酶5U/mL；第二试剂为甘氨酸200mM、胆酸钠5mM、胆固醇脱氢酶14U/mL。另外，作为对照，配制用TAPS代替上述第二试剂中的甘氨酸的不含甘氨酸的总胆固醇检测试剂。

[0075] 使用甘氨酸的总胆固醇检测试剂的稳定性比不含甘氨酸的总胆固醇检测试剂的好。

[0076] 实施例6

[0077] HDL胆固醇检测试剂的稳定性

[0078] 使用作为胆固醇脱氢酶的稳定剂的甘氨酸的HDL胆固醇检测试剂如下表示。该检测试剂由含第一试剂的溶液(pH6.5)和含有第二试剂的溶液(pH8.5)构成，其第一试剂为HEPES 50mM、二氯化 80mM、硫酸杯(8)芳烃2mM、β-NAD 5.0mM、胆固醇氧化酶0.5U/mL；第二试剂为甘氨酸200mM、胆固醇脱氢酶20U/mL、胆固醇酯酶6U/mL。另外，作为对照，配制用TAPS代替上述第二试剂中的甘氨酸的不含甘氨酸的HDL胆固醇检测试剂。

[0079] 使用甘氨酸的HDL胆固醇检测试剂的稳定性比不含甘氨酸的HDL胆固醇检测试剂的好。

[0080] 实施例7

[0081] LDL胆固醇检测试剂的稳定性的确认

[0082] 使用作为胆固醇脱氢酶的稳定剂的甘氨酸的LDL胆固醇检测试剂如下表示。该检测试剂由含第一试剂的溶液(pH7.0)和含第二试剂的溶液(pH8.5)构成，其第一试剂为HEPES 50mM、硫酸杯(6)芳烃1.2mM、胆酸钠2mM、胆固醇氧化酶0.5U/mL、β-NAD 5mM、胆固醇酯酶1U/mL，第二试剂为甘氨酸200mM、二氯化 300mM、胆固醇脱氢酶20U/mL。另外，作为对照，配制用TAPS代替上述第二试剂中的甘氨酸的不含甘氨酸的LDL胆固醇检测试剂。

[0083] 使用甘氨酸的LDL胆固醇检测试剂的稳定性比不含甘氨酸的LDL胆固醇检测试剂的好。

[0084] 实施例8

[0085] VLDL胆固醇检测试剂的稳定性

[0086] 使用作为胆固醇脱氢酶的稳定剂的甘氨酸的VLDL胆固醇检测试剂如下表示。该