利用氧化还原反应的糖化蛋白质的测定方法及测定试剂盒转让专利
申请号 : CN03803156.6
文献号 : CN1625601B
文献日 : 2010-10-20
发明人 : 米原聪 , 石丸香 , 小森胤树
申请人 : 爱科来株式会社
摘要 :
本发明提供利用氧化还原反应的糖化蛋白质的测定方法，其测定精度及测定灵敏度优良。以除去试样中与糖化蛋白质分别存在的糖化氨基酸为目的，将糖化氨基酸预先在果糖基氨基酸氧化酶作用下分解，然后，在四唑鎓化合物及叠氮化钠存在下，使果糖基氨基酸氧化酶作用于试样中的糖化蛋白质，通过测定此氧化还原反应求出糖化蛋白质量。作为糖化蛋白质，优选为糖化血红蛋白。
权利要求 :
1.糖化蛋白质的测定方法，其通过使果糖基氨基酸氧化酶作用于试样中的糖化蛋白质，测定该氧化还原反应来测定糖化蛋白质的量，以除去上述试样中与糖化蛋白质分别存在的糖化氨基酸为目的，在上述氧化还原反应之前，使上述糖化氨基酸在果糖基氨基酸氧化酶作用下分解，在四唑鎓化合物及叠氮化钠存在下，进行上述氧化还原反应。
2.权利要求1所述的测定方法，其中糖化蛋白质为糖化血红蛋白。
3.权利要求1所述的测定方法，其中在果糖基氨基酸氧化酶作用于糖化氨基酸之前或作用之后，用蛋白酶分解糖化蛋白质，使作用于上述糖化蛋白质的果糖基氨基酸氧化酶作用于该分解物，进行上述氧化还原反应。
4.权利要求1所述的测定方法，其中上述氧化还原反应的测定是使果糖基氨基酸氧化酶作用于糖化蛋白质产生的过氧化氢与显色基质N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠通过氧化还原酶反应，通过测定上述显色基质的显色量确定过氧化氢量的过氧化氢量的测定，在表面活性剂存在下，将上述显色基质添加到反应溶液中，上述反应溶液中的四唑鎓化合物的浓度为0.5～8mmol/L的范围，叠氮化钠的浓度为0.08～0.8mmol/L的范围，表面活性剂浓度为0.3～10mmol/L的范围，且上述反应溶液的pH为7.0～8.5。
5.权利要求1所述的测定方法，其中作用于糖化氨基酸的果糖基氨基酸氧化酶特异性作用于糖化的α-氨基，作用于糖化蛋白质的果糖基氨基酸氧化酶特异性作用于糖化的α-氨基及氨基酸残基的糖化的侧链氨基。
6.权利要求1所述的测定方法，其中将含有四唑鎓化合物和叠氮化钠的溶液老化后添加到试样中。
7.权利要求1所述的测定方法，其中四唑鎓化合物为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。
8.血红蛋白糖化率的测定方法，其由糖化血红蛋白量和血红蛋白量求出血红蛋白糖化率，通过权利要求1所述的糖化蛋白质的测定方法测定试样中的糖化血红蛋白量，另一方面，测定上述试样中的血红蛋白量，由上述糖化血红蛋白量和上述血红蛋白量求出血红蛋白糖化率。
9.糖化蛋白质的测定试剂盒，其用于利用氧化还原反应测定糖化蛋白质，其包括含有果糖基氨基酸氧化酶的试样的预处理用试剂、含有果糖基氨基酸氧化酶、氧化还原酶及显色基质的显色用试剂。
10.权利要求9所述的测定试剂盒，其中糖化蛋白质为糖化血红蛋白。
11.权利要求9所述的测定试剂盒，其中预处理用试剂的果糖基氨基酸氧化酶为特异性作用于糖化的α-氨基的酶，显色用试剂的果糖基氨基酸氧化酶为特异性作用于糖化的α-氨基及氨基酸残基侧链的糖化的氨基的酶。
12.权利要求9所述的测定试剂盒，其进一步包括含有蛋白酶的蛋白酶试剂。
13.权利要求12所述的测定试剂盒，其中蛋白酶为选自金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶及氨基肽酶的至少一种蛋白酶。
14.权利要求12所述的测定试剂盒，其中蛋白酶为选择性分解糖化血红蛋白的蛋白酶，为选自金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来自猪胰腺的胰蛋白酶及来自枯草杆菌的蛋白酶的至少一种蛋白酶。
15.权利要求12所述的测定试剂盒，其中蛋白酶试剂进一步含有四唑鎓化合物和叠氮化钠。
16.权利要求15所述的测定试剂盒，其中蛋白酶试剂中的四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的含有比例以摩尔比计为C∶D＝20∶3～20∶12的范围。
17.权利要求12所述的测定试剂盒，其中蛋白酶试剂中，蛋白酶为金属蛋白酶，且所述蛋白酶试剂含有Ca和Na，金属蛋白酶浓度为100～40000KU/L，Ca浓度为0.1～50mmol/L，Na浓度为5～1000mmol/L。
18.权利要求9所述的测定试剂盒，其中显色基质为N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠。
19.权利要求9所述的测定试剂盒，其中预处理用试剂及显色用试剂的至少之一进一步含有表面活性剂。
20.权利要求12所述的测定试剂盒，其中蛋白酶试剂进一步含有表面活性剂。
21.权利要求19或20所述的测定试剂盒，其中表面活性剂为选自聚氧乙烯醚、聚氧乙烯苯酚醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯及聚氧乙烯烷基醚的至少一种表面活性剂。
22.权利要求9所述的测定试剂盒，其中预处理用试剂进一步含有选自CHES、MOPS、TAPS、EPPS、磷酸、HEPPSO、POPSO及硼酸的至少一种缓冲剂，其pH为8.0～10.0的范围。
23.权利要求9所述的测定试剂盒，其中显色用试剂进一步含有选自MES、Tris、磷酸、MOPS、TES、HEPES、HEPPSO及EPPS的至少一种缓冲剂，其pH为6.0～9.0的范围。
24.权利要求12所述的测定试剂盒，其中蛋白酶试剂进一步含有选自Tris、MES、DIPSO、TES、POPSO、HEPES、MOPSO、Bis-Tris、MOPS、ADA、PIPES、ACES及磷酸的至少一种缓冲剂，其pH为5.0～7.0的范围。
25.权利要求15所述的测定试剂盒，其中四唑鎓化合物为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。
26.权利要求9所述的测定试剂盒，其中预处理用试剂进一步含有尿酸酶及胆红素氧化酶的至少之一。
27.权利要求9所述的测定试剂盒，其中显色用试剂进一步含有叠氮化钠。
28.权利要求22所述的测定试剂盒，其中预处理用试剂中，果糖基氨基酸氧化酶为特异性作用于糖化的α-氨基的酶，其浓度为10～5000U/L的范围，缓冲剂浓度为5～200mmol/L的范围，pH为8.0～10.0的范围。
29.权利要求15所述的测定试剂盒，其中蛋白酶试剂进一步含有Ca、Na及缓冲剂，蛋白酶为金属蛋白酶，上述蛋白酶试剂中的金属蛋白酶的浓度为100～10000KU/L的范围，四唑鎓化合物浓度为0.1～10mmol/L的范围，叠氮化钠浓度为0.08～4mmol/L的范围，Ca浓度为0.1～50mmol/L的范围，N a浓度为5～1000mmol/L的范围，缓冲剂浓度为0.1～500mmol/L的范围，pH为5.0～7.0的范围。
30.权利要求23所述的测定试剂盒，其中显色用试剂中，果糖基氨基酸氧化酶为特异性作用于糖化的α-氨基及糖化的氨基酸残基侧链的酶，氧化还原酶为过氧化物酶，显色基质为N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠，上述显色试剂中的果糖基氨基酸氧化酶的浓度为100～50000U/L的范围，过氧化物酶浓度为0.1～400KU/L的范围，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠浓度为0.02～2mmol/L的范围，缓冲剂浓度为10～500mol/L的范围，pH为6～9的范围。
说明书 :
技术领域
本发明涉及利用氧化还原反应的糖化蛋白质的测定方法及测定试剂盒。
背景技术
糖化蛋白质中，例如，血液中的糖化血红蛋白(糖化Hb)，由于反映了生物中血糖值的过去的情况，因此被作为糖尿病的诊断和治疗等的重要指标。
这种糖化Hb，例如，采用高效液相色谱(HPLC)法、微柱法、免疫法、色素法等测定糖化率和糖化量。但是，上述HPLC法的场合，例如，需要测定糖化Hb的专用仪器，另外，免疫法和色素法的场合，例如，存在测定用的细胞污染和测定精度等问题。
因此，关于糖化Hb等糖化蛋白质，利用不需要特殊的测定仪器、操作也简便的酶进行的氧化还原反应的测定方法，例如，适用于生化分析和临床检查等。
利用上述氧化还原反应的糖化Hb的测定，例如，如以下所述进行。首先，将含有糖化Hb的试样用果糖基氨基酸氧化酶(以下称为FAOD)处理，使之作用于糖化Hb的糖化部分而产生过氧化氢。该过氧化氢量对应于上述糖化Hb量。然后，在该FAOD处理后的上述试样中添加过氧化物酶(以下称为POD)和还原剂，上述POD作为催化剂使上述过氧化氢和上述还原剂之间发生氧化还原反应。此时，作为上述还原剂，如果使用因氧化而显色的还原剂，便可通过测定其显色来测定上述过氧化氢量，结果，可知试样中的糖化Hb量。
这种糖化Hb，例如，采用高效液相色谱(HPLC)法、微柱法、免疫法、色素法等测定糖化率和糖化量。但是，上述HPLC法的场合，例如，需要测定糖化Hb的专用仪器，另外，免疫法和色素法的场合，例如，存在测定用的细胞污染和测定精度等问题。
因此，关于糖化Hb等糖化蛋白质，利用不需要特殊的测定仪器、操作也简便的酶进行的氧化还原反应的测定方法，例如，适用于生化分析和临床检查等。
利用上述氧化还原反应的糖化Hb的测定，例如，如以下所述进行。首先，将含有糖化Hb的试样用果糖基氨基酸氧化酶(以下称为FAOD)处理，使之作用于糖化Hb的糖化部分而产生过氧化氢。该过氧化氢量对应于上述糖化Hb量。然后，在该FAOD处理后的上述试样中添加过氧化物酶(以下称为POD)和还原剂，上述POD作为催化剂使上述过氧化氢和上述还原剂之间发生氧化还原反应。此时，作为上述还原剂，如果使用因氧化而显色的还原剂，便可通过测定其显色来测定上述过氧化氢量，结果，可知试样中的糖化Hb量。
发明内容
然而，这种现有的测定方法，测定灵敏度不充分。另外，关于测定精度，例如，由于产生与试样中实际含有的糖化Hb相对应的以上过氧化氢，观察到患者糖化Hb测定值暂时急剧增加的现象，所以要求进一步提高精度。
因此，本发明的目的是提供利用氧化还原反应测定试样中的糖化蛋白质的方法，其测定灵敏度和测定精度两者均优良。另外，提供用于上述糖化蛋白质的测定、测定精度、测定灵敏度、操作性优良的测定试剂盒。
为了达到上述目的，本发明的糖化蛋白质的测定方法是使FAOD作用于试样中的糖化蛋白质进行氧化还原反应，通过测定该氧化还原反应来测定糖化蛋白质的量的方法，其特征在于，以除去上述试样中与糖化蛋白质分别存在的糖化氨基酸为目的，在上述氧化还原反应之前，使上述糖化氨基酸在FAOD作用下分解，在四唑鎓化合物及叠氮化钠存在下，进行上述氧化还原反应。
再者，上述FAOD为一般名称，作为其底物，不限于糖化氨基酸，例如，也作用于糖化蛋白质和糖化肽。下面，在本发明中，将分解上述糖化氨基酸的FAOD称作“分解用FAOD”，将作用于上述糖化蛋白质进行测定的FAOD称作“测定用FAOD”。
本发明的发明人为提高测定精度进行了深入研究，结果弄清了下面的事情。即，在全血中，本来除糖化蛋白质外，还存在游离的糖化氨基酸，上述FAOD对这种糖化氨基酸也有作用。因此，使用上述FAOD测定糖化蛋白质时，不仅糖化蛋白质与FAOD发生氧化还原反应，糖化氨基酸与FAOD也发生氧化还原反应，表面上，糖化蛋白质的测定值增加。进一步，关于相同患者的全血试样，即使在完全相同的条件下用上述测定方法进行测定时，因患者采血时间不同测定值也有显著变化，关于这个问题，弄清了下面的事情。即，弄清了这种问题主要是接受点滴等的患者出现的现象，这种测定值之所以变化，是因为作为点滴等的成分，例如，含有葡萄糖等糖类及各种氨基酸时，由这些外来成分生成糖化氨基酸，糖化氨基酸暂时增加。因此，本发明的发明人首次发现，即使全血试样中存在稳定糖化氨基酸和暂时性的外来糖化氨基酸，根据本发明，如果预先将糖化氨基酸在分解用FAOD作用下分解，便可抑制上述糖化氨基酸引起的测定值的上升。因此，可以提高测定精度，而且，无论是否接受点滴，随时可以采血，所以也可以减轻患者负担。进一步地，如果在四唑鎓化合物及叠氮化钠存在下进行上述氧化还原反应，也可提高测定灵敏度，其作用机理尚不清楚。因此，根据这种测定精度和测定灵敏度优良的测定方法，各种糖化蛋白质作为指标的可靠性也增加，成为临床医疗等领域中有用的方法。
本发明中，作为上述糖化蛋白质，例如，优选糖化Hb。因为如果采用这种方法，可增加糖化Hb作为糖尿病诊断的指标的可靠性，在临床医疗等领域中有用。
作为本发明的测定方法，例如可列举，上述糖化氨基酸和上述糖化蛋白质使用不同底物特异性的FAOD的第1测定方法，和使用相同底物特异性的FAOD的第2测定方法。
再者，如后面所述，FAOD中，例如，有作用于α-氨基的糖化部分的、作用于赖氨酸和精氨酸等氨基酸残基的侧链氨基的糖化部分的，以及作用于上述两者的糖化部分的等，其底物特异性因FAOD的种类而有各种各样。例如，糖化蛋白质为糖化Hb时，糖化Hb的测定，使FAOD作用于上述α-氨基的糖化部分、上述侧链氨基的糖化部分或两者的糖化部分的任一种，都可以测定其量。
作为本发明的第1测定方法，优选作用于上述糖化氨基酸的分解用FAOD和作用于糖化蛋白质的测定用FAOD具有不同的底物特异性。据此，通过分解用FAOD分解上述糖化氨基酸，关于糖化蛋白质，由于可以使不同的底物特异性的测定用FAOD进一步作用于上述分解用FAOD不作用的糖化部分，所以不受糖化氨基酸的影响，可以提高测定精度。
具体地说，例如，优选上述分解用FAOD特异性作用于糖化α-氨基，上述测定用FAOD特异性作用于糖化α-氨基及糖化侧链氨基。由于上述测定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及侧链氨基糖化部分两者，如果按照现有的方法，如上所述，也作用于α-氨基被糖化的糖化氨基酸。但是，本发明中，由于上述糖化氨基酸预先通过特异性作用于上述糖化α-氨基的分解用FAOD得到分解，测定用FAOD不作用于它，抑制了表面上的测定值的增加，提高了精度。另外，如上所述，上述测定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及侧链氨基糖化部分两者，但是由于糖化蛋白质的α-氨基糖化部分也预先通过分解用FAOD得到分解，所以可使测定用FAOD只作用于糖化蛋白质的侧链氨基糖化部分。因此，特别是对于测定特征在于侧链氨基的糖化量的糖化Hb可以说是有用的方法。
这样，使用不同的FAOD时，优选在FAOD作用于上述糖化氨基酸之前或作用之后，将糖化蛋白质用蛋白酶分解，使作用于上述糖化蛋白质的测定用FAOD作用于该糖化蛋白质的分解物，进行上述氧化还原反应。之所以将糖化蛋白质用蛋白酶分解，是因为FAOD与糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸和更短的糖化肽片段。另外，蛋白酶处理的顺序不限于分解处理糖化氨基酸的前后，这是因为，如上所述，由于测定用FAOD作用于与分解用FAOD不同的糖化部分，糖化蛋白质的测定本身不受影响。
其次，作为本发明的第2测定方法，优选分解用FAOD作用于糖化氨基酸后，将糖化蛋白质用蛋白酶分解，再添加与上述分解用FAOD相同的FAOD，使之作用于上述蛋白酶分解物，进行上述氧化还原反应。即，分解用FAOD与测定用FAOD相同时的测定方法。
具体地说，优选通过上述蛋白酶使上述分解用FAOD失活。如上所述，FAOD具有与测定的糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸和更短的糖化肽片段的性质。因此，从酶的反应速度论来看，可以说即使添加分解用FAOD，在分解糖化氨基酸的处理时间内，也不怎么作用于糖化蛋白质。但是，如果接下来的糖化蛋白质的蛋白酶处理期间上述分解用FAOD活性还残存的话，与上述蛋白酶处理并行，残存的上述分解用FAOD可能作用于通过蛋白酶得到的糖化蛋白质分解物(即糖化氨基酸和糖化蛋白质的肽片段)。而且，之后，即使再添加测定用FAOD，已经成为上述残存的分解用FAOD作用于上述糖化蛋白质分解物的一部分的状态，反而可能会降低测定精度。因此，如上所述，通过分解糖化蛋白质的蛋白酶处理，使同时残存的上述分解用FAOD失活，通过蛋白酶处理得到的糖化蛋白质分解物，与上述分解用FAOD维持未反应的状态，可以与接下来添加的测定用FAOD反应。因此也可提高测定精度。
另一方面，作为第3测定方法，如上所述，即使用蛋白酶处理没有使分解用FAOD失活，例如通过调整上述分解用FAOD的添加量和测定用FAOD的添加量，也可以实现高精度测定。这种情况，例如，优选将上述分解用FAOD(A)与测定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)设定为A∶B＝1∶10～1∶1000的范围。如果是这种添加比例，进行蛋白酶处理时，从酶的反应速度论的观点看，上述分解用FAOD即使残存，也难以作用于糖化蛋白质分解物。
本发明的测定方法中，作为上述蛋白酶，可以使用金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶及氨基肽酶、来自枯草杆菌(Bacillus Subtillis)的蛋白酶等中的至少一种蛋白酶。
糖化蛋白质为糖化Hb时，上述蛋白酶优选选择性分解糖化Hb的、选自金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来自猪胰腺的胰蛋白酶及来自枯草杆菌的蛋白酶的至少一种蛋白酶。其中优选金属蛋白酶、来自枯草杆菌的蛋白酶，更加优选金属蛋白酶。测定对象物为糖化Hb时，如果使这种蛋白酶作用，由于糖化Hb以外的糖化蛋白质和糖化肽难以被分解，FAOD也难以作用于上述其他糖化蛋白质等，因此可能只测定糖化Hb。
本发明的测定方法中，优选四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的添加比例(摩尔比C∶D)为C∶D＝20∶3～20∶12的范围。另外，优选上述氧化还原反应溶液中的四唑鎓化合物的终浓度为0.5～2.5mmol/L的范围，上述反应溶液中的叠氮化钠的终浓度为0.13～1.3mmol/L的范围。
本发明的测定方法中，由于可以进一步提高灵敏度，所以优选将含有四唑鎓化合物和叠氮化钠的溶液老化后，添加到上述试样中。这时，老化的处理温度优选为20～60℃的范围，老化的处理时间优选为6～120小时的范围。
本发明中，作为上述氧化还原反应的测定，没有特别限制，例如，糖化蛋白质在FAOD作用下产生的过氧化氢与因氧化而显色的基质(显色基质)通过氧化还原酶进行反应，通过测定上述显色基质的显色量，确定过氧化氢量的过氧化氢量的测定等。作为上述显色基质，例如，可以使用N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠(以下也称为DA-64)。
使用上述DA-64时，在表面活性剂存在下，将上述DA-64添加到反应溶液中，优选上述反应溶液中的四唑鎓化合物浓度为0.5～8mmol/L的范围，叠氮化钠浓度为0.08～0.8mmol/L的范围，表面活性剂浓度为0.3～10mmol/L的范围，且上述反应溶液的pH为7.0～8.5。
本发明的特征之一是为了提高测定灵敏度，在四唑鎓化合物和叠氮化钠存在下进行上述氧化还原反应，但是，如上所述，显色基质使用DA-64时，由于该DA-64与四唑鎓化合物和叠氮化钠共存，DA-64有时发生误显色。这样，如果发生误显色，例如，显色量的测定中本底变高，另外，本来添加的足量的DA-64发生不足的问题。但是，如果在表面活性剂存在下添加DA-64，且各成分浓度设定为上述浓度范围，反应溶液的pH设定为上述范围，便可抑制上述本底升高，可进行更高精度的测定。
本发明的测定方法中，上述测定试样的种类没有特别限制，除全血、血浆、血清、血细胞等外，例如对尿、脊髓液等生物试样以及果汁等饮料水、酱油、调味汁等食品类等试样也适用，其中对全血试样、血细胞试样特别有用。例如，测定红细胞内的糖化Hb时，可以将全血直接溶血，或可将从全血中分离的红细胞溶血，将其作为测定试样。
作为测定对象物的糖化蛋白质，例如有前面所述的糖化Hb、糖化白蛋白等，优选糖化Hb。
其次，本发明的Hb糖化率的测定方法，是由糖化Hb量和Hb量求出Hb糖化率的测定方法，根据上述本发明的糖化蛋白质的测定方法测定试样中的糖化Hb量，另一方面，测定上述试样中的Hb量，由上述糖化Hb量和上述Hb量求出Hb糖化率。根据本发明，由于能够以高精度测定糖化Hb量，所以可以得到可靠性高的Hb糖化率。再者，“Hb量”包括糖化的Hb和未糖化的Hb两者。
本发明中，测定上述Hb量的方法没有特别限制，优选用四唑鎓化合物使试样中的Hb变性，在对得到的变性Hb特异的吸收波长下测定上述试样的吸光度，由该吸光度算出上述试样中的Hb量的方法。由于未变性的Hb，例如，根据与氧结合的状态及未结合的状态等其形态的不同，具有各种各样的吸收波长，因此，即使单纯地测定吸光度也难以准确求出Hb量。而通过四唑鎓化合物变性的变性Hb是稳定的，显示吸收最大的波长在一定范围之内，所以可以容易且以高精度求出Hb量。因此，可以由上述可靠性高的糖化Hb量和Hb量进一步求出可靠性高的Hb糖化率。
另外，采用本发明的糖化蛋白质的测定方法，也可以测定HbAlc。例如，该HbAlc的测定方法，是准备由上述本发明的糖化蛋白质的测定方法得到的糖化Hb量和HbAlc量的相关关系作成的校正曲线，将由上述本发明的糖化蛋白质的测定方法得到的试样中的糖化Hb量代入上述校正曲线中，从而求出上述试样中的HbAlc量的方法。
本发明的发明人深入研究的结果，发现根据上述本发明的糖化蛋白质的测定方法得到的全血中的糖化Hb量，与相同试样中的HbAlc量存在高的相关关系。HbAlc为Hb的β链N末端的α-氨基被糖化的糖化Hb，在糖化Hb中，也被作为糖尿病诊断等的特别重要的指标。根据现有的方法，测定HbAlc，需使FAOD特异性作用于糖化部分中的HbAlc的特征性结构部分β链N末端的α-氨基的糖化部分，测定其氧化还原反应。这种场合，例如，由于使用的FAOD对上述α-氨基糖化部分的底物特异性高，并要求充分作用于上述α-氨基糖化部分等，所以不得不采用特别的方法。但是，根据本发明，由于以高精度测定的糖化Hb量为基础，可以确定HbAlc量，所以能够准确且简便地测定HbAlc。因此，HbAlc的测定在临床检查等中能够实用化。
下面，本发明的糖化蛋白质的测定试剂盒，是利用氧化还原反应测定糖化蛋白质使用的测定试剂盒，其特征是包括含有FAOD的试样的预处理用试剂、含有FAOD、氧化还原酶及显色基质的显色用试剂。
本发明的发明人，如上所述，弄清了发生测定精度的问题的原因。而且，本发明的发明人首次发现，即使全血试样中存在稳定糖化氨基酸和暂时性的外来糖化氨基酸，根据本发明，如果使试样的预处理用试剂中含有FAOD，通过在上述氧化还原反应之前添加上述预处理试剂，试样中的糖化氨基酸得到分解，便可抑制上述糖化氨基酸引起的测定值的上升。因此，如果使用本发明的测定试剂盒，就能够以优良的精度快速简便地利用氧化还原反应测定糖化蛋白质，而且，即使是接受点滴的患者的血液试样，也可以在同样的条件下进行测定。另外，使用本发明的测定试剂盒进行的测定，如上所述，由于测定精度优良，所以各种糖化蛋白质作为指标的可靠性也增加，成为临床医疗等领域中有用的测定试剂盒。
本发明的测定试剂盒，优选测定对象物例如为糖化Hb。因为通过这种测定试剂盒，糖化Hb作为糖尿病诊断的指标的可靠性增加，在临床医疗等领域中有用。
再者，本发明中，由于预处理试剂中含有的FAOD分解上述糖化氨基酸，所以，如上所述，下面也称作“分解用FAOD”，由于显色用试剂中含有的FAOD作用于糖化蛋白质，所以下面也称作“测定用FAOD”。
本发明的测定试剂盒，优选进一步包括含有蛋白酶的蛋白酶试剂。上述FAOD具有与糖化蛋白质相比更容易与糖化氨基酸和更短的糖化肽作用的性质。因此，如果用上述蛋白酶试剂分解试样中的糖化蛋白质，显色用试剂中的测定用FAOD变得更容易作用，也可以提高测定精度。再者，作为上述蛋白酶，可以使用与上述本发明的糖化蛋白质测定方法相同的蛋白酶。
本发明的测定试剂盒中，优选上述蛋白酶试剂进一步含有四唑鎓化合物和叠氮化钠。这样，如果使蛋白酶试剂中含有四唑鎓化合物和叠氮化钠，在可以提高测定灵敏度的同时，通过四唑鎓化合物，可以排除上述试样中含有的还原物质等对氧化还原反应的影响，也可提高测定精度。
另外，上述蛋白酶试剂中，作为蛋白酶，使用金属蛋白酶时，优选进一步含有Ca和Na，金属蛋白酶浓度为100~40000KUL,Ca浓度为0.1～50mmol/L，Na浓度为5～1000mmol/L。这样，为达到上述浓度范围，如果使金属蛋白酶、Ca及Na共存，可提高金属蛋白酶的稳定性，例如，不仅在低温条件下，在常温条件下也可防止金属蛋白酶失活，可稳定保存。再者，Ca和Na使用时可以分别离子化成Ca2+和Na+。
再者，上述蛋白酶试剂中的各物质的浓度不限于上述浓度范围，例如，优选其比例为与上述浓度范围同样的含有比例。根据上述蛋白酶试剂对反应溶液的添加比例(稀释率)，可以调整反应所需的上述各物质的添加量。再者，关于其他物质和其他试剂也同样。
作为本发明的测定试剂盒，上述预处理用试剂中含有的分解用FAOD和上述显色用试剂中含有的测定用FAOD，例如可列举使用不同底物特异性的FAOD的第1测定试剂盒、使用相同FAOD的第2及第3测定试剂盒。
本发明中，作为第1测定试剂盒，如上所述，优选预处理用试剂中含有的分解用FAOD和显色用试剂中含有的测定用FAOD使用不同底物特异性的FAOD。如果使用这种测定试剂盒，上述糖化氨基酸通过分解用FAOD得到分解，关于糖化蛋白质，由于可使上述测定用FAOD作用于上述分解用FAOD不作用的不同的糖化部分，所以不受糖化氨基酸的影响，可以提高测定精度。
具体地说，例如，优选上述分解用FAOD为特异性作用于糖化α-氨基的FAOD，上述测定用FAOD为特异性作用于糖化α-氨基及糖化侧链氨基的FAOD。由于上述测定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及侧链氨基糖化部分两者，如果按照现有的方法，如上所述，也作用于α-氨基被糖化的糖化氨基酸。但是，如果使用本发明的测定试剂盒，通过用预处理用试剂处理，上述糖化氨基酸预先被特异性作用于上述糖化α-氨基的分解用FAOD分解，所以测定用FAOD不作用于它，便可抑制表面上的测定值的增加，提高精度。另外，如上所述，测定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及侧链氨基糖化部分两者，但由于糖化蛋白质的α-氨基糖化部分也预先通过分解用FAOD得到分解，所以用本发明的上述显色用试剂处理，可以使测定用FAOD只作用于糖化蛋白质的侧链氨基糖化部分。因此，特别是对于测定特征在于侧链氨基的糖化量糖化Hb可以说是有用的测定试剂盒。再者，这种测定试剂盒可以用于上述本发明的第1糖化蛋白质的测定方法。
其次，上述第2测定试剂盒，作为预处理用试剂的上述分解用FAOD和显色用试剂的上述测定用FAOD，优选使用相同FAOD、包括含有分解糖化蛋白质，且使上述分解用FAOD消化失活的蛋白酶的蛋白酶试剂。
该第2测定试剂盒的使用方法，例如，首先将预处理用试剂添加到试样中，使分解用FAOD作用于糖化氨基酸后，添加蛋白酶试剂，将糖化蛋白质用蛋白酶分解，残存的分解用FAOD也通过蛋白酶一并消化分解。而且，可再添加上述显色用试剂，使测定用FAOD作用于上述蛋白酶分解物，进行上述氧化还原反应。
如上所述，FAOD具有与测定的糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸和更短的糖化蛋白质的肽片段的性质。因此，从酶的反应速度论看，可以说即使添加含有分解用FAOD的预处理用试剂，在分解糖化氨基酸的处理时间内，上述FAOD也不怎么作用于糖化蛋白质。但是，如果接下来的用蛋白酶试剂的处理期间上述分解用FAOD的活性还残存的话，与蛋白酶处理并行，上述分解用FAOD作用于通过蛋白酶得到的糖化蛋白质分解物(即糖化氨基酸和糖化蛋白质的肽片段)，然后，即使添加含有测定用FAOD的显色用试剂，由于已经成为分解用FAOD作用于上述糖化蛋白质的分解物的一部分的状态，反而可能会降低测定精度。因此，如上述第2测定试剂盒，如果含有分解糖化蛋白质、且使分解用FAOD消化失活的蛋白酶试剂，糖化蛋白质的分解物与上述分解用FAOD维持未反应的状态，可以与接着添加的显色用试剂中的测定用FAOD反应。因此也提高测定精度。再者，这种测定试剂盒可以用于上述本发明的第2糖化蛋白质的测定方法。
另外，第3测定试剂盒，即使是分解用FAOD和测定用FAOD使用相同FAOD的场合，如上述第2测定试剂盒，虽然用蛋白酶试剂没有使残存的分解用FAOD失活，但是，例如，通过调整预处理用试剂的上述分解用FAOD浓度和显色用试剂的上述测定用FAOD浓度，也可以实现高精度测定。这种场合，例如，优选设定预处理用试剂和显色用试剂的FAOD浓度，使最终的显色反应溶液中的上述分解用FAOD(A)与测定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)为A∶B＝1∶10～1∶1000的范围。如果是这种添加比例，用蛋白酶试剂处理时，从酶的反应速度论的观点看，上述分解用FAOD即使残存，也难以作用于糖化蛋白质。再者，这种测定试剂盒可以用于上述本发明的第3糖化蛋白质的测定方法。
本发明的测定试剂盒中，上述显色基质，例如，可以使用因氧化而显色的基质和因还原而显色的基质等，优选为因氧化而显色的基质，具体地，优选为N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠。
显色基质使用DA-64时，如果上述蛋白酶试剂含有四唑鎓化合物和叠氮化钠，这3种成分因在反应系统中混合，DA-64有时发生误显色。如果发生误显色，例如，测定显色量时本底变高，另外，添加的足量的DA-64发生不足的问题。但是，如上所述，如果各试剂以上述浓度范围含有各成分，便可防止反应系统中的DA-64的误显色。因此也可抑制上述本底升高，可进行更高精度的测定。
本发明的测定试剂盒中，上述预处理用试剂、蛋白酶试剂、显色用试剂也可进一步含有表面活性剂。
另外，上述各种试剂优选含有选自CHES、MOPS、MES、Tris、磷酸、TES、TAPS、HEPES、HEPPSO、硼酸、三乙醇胺、BES、MOPSO、EPPS、POPSO、ADA、PIPES、ACES、Bis-Tris的至少一种缓冲剂。由于上述各种试剂分别含有酶，通过添加缓冲剂，例如可以于最适pH下使上述酶作用。
具体地说，上述预处理用试剂优选进一步含有选自CHES、MOPS、TAPS、EPPS、磷酸、HEPPSO、POPSO、硼酸的至少一种缓冲剂，其pH优选为8.0～10.0的范围。
另外，上述蛋白酶试剂优选进一步含有选自Tris、MES、DIPSO、TES、POPSO、HEPES、MOPSO、Bis-Tris、MOPS、ADA、PIPES、ACES、磷酸的至少一种缓冲剂，其pH优选为5.0～7.0的范围。
另外，上述显色用试剂优选进一步含有选自MES、Tris、磷酸、MOPS、TES、HEPES、HEPPSO、EPPS的至少一种缓冲剂，其pH优选为6.0～9.0的范围。
上述显色用试剂，例如，由于可以防止DA-64等显色基质的误显色，优选进一步含有叠氮化钠。
上述预处理用试剂优选进一步含有尿酸酶及胆红素氧化酶的至少之一。如果含有尿酸酶，例如，可以分解测定试样中含有的尿酸，另外，如果含有胆红素氧化酶，可以分解胆红素。由于该尿酸和胆红素具有还原力，如果这样进行分解，可进一步排除还原物质带来的影响，可以提高测定精度。
本发明的测定试剂盒中各试剂的具体组成，例如可列举下面的组成。
上述预处理试剂，例如，优选果糖基氨基酸氧化酶为特异性作用于糖化的α-氨基的酶，其浓度为10～5000U/L的范围，缓冲剂浓度为5～200mmol/L的范围，pH为8.0～10.0的范围。
上述蛋白酶试剂，例如，优选金属蛋白酶的浓度为100～10000KU/L的范围，四唑鎓化合物浓度为0.1～10mmol/L的范围，叠氮化钠浓度为0.08～4mmol/L的范围，Ca浓度为0.1～50mmol/L的范围，Na浓度为5～1000mmol/L的范围，缓冲剂浓度为为0.1～500mmol/L的范围，pH为5.0～7.0的范围。
上述显色用试剂，例如，优选果糖基氨基酸氧化酶为特异性作用于糖化的α-氨基及糖化的氨基酸残基侧链的酶，其浓度为100～50000U/L的范围，过氧化物酶浓度为0.1～400KU/L的范围，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠浓度为0.02～2mmol/L的范围，缓冲剂浓度为10～500mol/L的范围，pH为6～9的范围。
本发明的测定试剂盒，可以适用于与上述本发明的糖化蛋白质的测定方法相同的试样。另外，其测定对象物也相同，优选为糖化Hb。
再者，本发明的测定试剂盒中的各种试剂，可以是将各成分在水性溶剂中溶解的液系试剂，也可以是使用前在水性溶剂中溶解使用的干系试剂。
因此，本发明的目的是提供利用氧化还原反应测定试样中的糖化蛋白质的方法，其测定灵敏度和测定精度两者均优良。另外，提供用于上述糖化蛋白质的测定、测定精度、测定灵敏度、操作性优良的测定试剂盒。
为了达到上述目的，本发明的糖化蛋白质的测定方法是使FAOD作用于试样中的糖化蛋白质进行氧化还原反应，通过测定该氧化还原反应来测定糖化蛋白质的量的方法，其特征在于，以除去上述试样中与糖化蛋白质分别存在的糖化氨基酸为目的，在上述氧化还原反应之前，使上述糖化氨基酸在FAOD作用下分解，在四唑鎓化合物及叠氮化钠存在下，进行上述氧化还原反应。
再者，上述FAOD为一般名称，作为其底物，不限于糖化氨基酸，例如，也作用于糖化蛋白质和糖化肽。下面，在本发明中，将分解上述糖化氨基酸的FAOD称作“分解用FAOD”，将作用于上述糖化蛋白质进行测定的FAOD称作“测定用FAOD”。
本发明的发明人为提高测定精度进行了深入研究，结果弄清了下面的事情。即，在全血中，本来除糖化蛋白质外，还存在游离的糖化氨基酸，上述FAOD对这种糖化氨基酸也有作用。因此，使用上述FAOD测定糖化蛋白质时，不仅糖化蛋白质与FAOD发生氧化还原反应，糖化氨基酸与FAOD也发生氧化还原反应，表面上，糖化蛋白质的测定值增加。进一步，关于相同患者的全血试样，即使在完全相同的条件下用上述测定方法进行测定时，因患者采血时间不同测定值也有显著变化，关于这个问题，弄清了下面的事情。即，弄清了这种问题主要是接受点滴等的患者出现的现象，这种测定值之所以变化，是因为作为点滴等的成分，例如，含有葡萄糖等糖类及各种氨基酸时，由这些外来成分生成糖化氨基酸，糖化氨基酸暂时增加。因此，本发明的发明人首次发现，即使全血试样中存在稳定糖化氨基酸和暂时性的外来糖化氨基酸，根据本发明，如果预先将糖化氨基酸在分解用FAOD作用下分解，便可抑制上述糖化氨基酸引起的测定值的上升。因此，可以提高测定精度，而且，无论是否接受点滴，随时可以采血，所以也可以减轻患者负担。进一步地，如果在四唑鎓化合物及叠氮化钠存在下进行上述氧化还原反应，也可提高测定灵敏度，其作用机理尚不清楚。因此，根据这种测定精度和测定灵敏度优良的测定方法，各种糖化蛋白质作为指标的可靠性也增加，成为临床医疗等领域中有用的方法。
本发明中，作为上述糖化蛋白质，例如，优选糖化Hb。因为如果采用这种方法，可增加糖化Hb作为糖尿病诊断的指标的可靠性，在临床医疗等领域中有用。
作为本发明的测定方法，例如可列举，上述糖化氨基酸和上述糖化蛋白质使用不同底物特异性的FAOD的第1测定方法，和使用相同底物特异性的FAOD的第2测定方法。
再者，如后面所述，FAOD中，例如，有作用于α-氨基的糖化部分的、作用于赖氨酸和精氨酸等氨基酸残基的侧链氨基的糖化部分的，以及作用于上述两者的糖化部分的等，其底物特异性因FAOD的种类而有各种各样。例如，糖化蛋白质为糖化Hb时，糖化Hb的测定，使FAOD作用于上述α-氨基的糖化部分、上述侧链氨基的糖化部分或两者的糖化部分的任一种，都可以测定其量。
作为本发明的第1测定方法，优选作用于上述糖化氨基酸的分解用FAOD和作用于糖化蛋白质的测定用FAOD具有不同的底物特异性。据此，通过分解用FAOD分解上述糖化氨基酸，关于糖化蛋白质，由于可以使不同的底物特异性的测定用FAOD进一步作用于上述分解用FAOD不作用的糖化部分，所以不受糖化氨基酸的影响，可以提高测定精度。
具体地说，例如，优选上述分解用FAOD特异性作用于糖化α-氨基，上述测定用FAOD特异性作用于糖化α-氨基及糖化侧链氨基。由于上述测定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及侧链氨基糖化部分两者，如果按照现有的方法，如上所述，也作用于α-氨基被糖化的糖化氨基酸。但是，本发明中，由于上述糖化氨基酸预先通过特异性作用于上述糖化α-氨基的分解用FAOD得到分解，测定用FAOD不作用于它，抑制了表面上的测定值的增加，提高了精度。另外，如上所述，上述测定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及侧链氨基糖化部分两者，但是由于糖化蛋白质的α-氨基糖化部分也预先通过分解用FAOD得到分解，所以可使测定用FAOD只作用于糖化蛋白质的侧链氨基糖化部分。因此，特别是对于测定特征在于侧链氨基的糖化量的糖化Hb可以说是有用的方法。
这样，使用不同的FAOD时，优选在FAOD作用于上述糖化氨基酸之前或作用之后，将糖化蛋白质用蛋白酶分解，使作用于上述糖化蛋白质的测定用FAOD作用于该糖化蛋白质的分解物，进行上述氧化还原反应。之所以将糖化蛋白质用蛋白酶分解，是因为FAOD与糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸和更短的糖化肽片段。另外，蛋白酶处理的顺序不限于分解处理糖化氨基酸的前后，这是因为，如上所述，由于测定用FAOD作用于与分解用FAOD不同的糖化部分，糖化蛋白质的测定本身不受影响。
其次，作为本发明的第2测定方法，优选分解用FAOD作用于糖化氨基酸后，将糖化蛋白质用蛋白酶分解，再添加与上述分解用FAOD相同的FAOD，使之作用于上述蛋白酶分解物，进行上述氧化还原反应。即，分解用FAOD与测定用FAOD相同时的测定方法。
具体地说，优选通过上述蛋白酶使上述分解用FAOD失活。如上所述，FAOD具有与测定的糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸和更短的糖化肽片段的性质。因此，从酶的反应速度论来看，可以说即使添加分解用FAOD，在分解糖化氨基酸的处理时间内，也不怎么作用于糖化蛋白质。但是，如果接下来的糖化蛋白质的蛋白酶处理期间上述分解用FAOD活性还残存的话，与上述蛋白酶处理并行，残存的上述分解用FAOD可能作用于通过蛋白酶得到的糖化蛋白质分解物(即糖化氨基酸和糖化蛋白质的肽片段)。而且，之后，即使再添加测定用FAOD，已经成为上述残存的分解用FAOD作用于上述糖化蛋白质分解物的一部分的状态，反而可能会降低测定精度。因此，如上所述，通过分解糖化蛋白质的蛋白酶处理，使同时残存的上述分解用FAOD失活，通过蛋白酶处理得到的糖化蛋白质分解物，与上述分解用FAOD维持未反应的状态，可以与接下来添加的测定用FAOD反应。因此也可提高测定精度。
另一方面，作为第3测定方法，如上所述，即使用蛋白酶处理没有使分解用FAOD失活，例如通过调整上述分解用FAOD的添加量和测定用FAOD的添加量，也可以实现高精度测定。这种情况，例如，优选将上述分解用FAOD(A)与测定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)设定为A∶B＝1∶10～1∶1000的范围。如果是这种添加比例，进行蛋白酶处理时，从酶的反应速度论的观点看，上述分解用FAOD即使残存，也难以作用于糖化蛋白质分解物。
本发明的测定方法中，作为上述蛋白酶，可以使用金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶及氨基肽酶、来自枯草杆菌(Bacillus Subtillis)的蛋白酶等中的至少一种蛋白酶。
糖化蛋白质为糖化Hb时，上述蛋白酶优选选择性分解糖化Hb的、选自金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来自猪胰腺的胰蛋白酶及来自枯草杆菌的蛋白酶的至少一种蛋白酶。其中优选金属蛋白酶、来自枯草杆菌的蛋白酶，更加优选金属蛋白酶。测定对象物为糖化Hb时，如果使这种蛋白酶作用，由于糖化Hb以外的糖化蛋白质和糖化肽难以被分解，FAOD也难以作用于上述其他糖化蛋白质等，因此可能只测定糖化Hb。
本发明的测定方法中，优选四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的添加比例(摩尔比C∶D)为C∶D＝20∶3～20∶12的范围。另外，优选上述氧化还原反应溶液中的四唑鎓化合物的终浓度为0.5～2.5mmol/L的范围，上述反应溶液中的叠氮化钠的终浓度为0.13～1.3mmol/L的范围。
本发明的测定方法中，由于可以进一步提高灵敏度，所以优选将含有四唑鎓化合物和叠氮化钠的溶液老化后，添加到上述试样中。这时，老化的处理温度优选为20～60℃的范围，老化的处理时间优选为6～120小时的范围。
本发明中，作为上述氧化还原反应的测定，没有特别限制，例如，糖化蛋白质在FAOD作用下产生的过氧化氢与因氧化而显色的基质(显色基质)通过氧化还原酶进行反应，通过测定上述显色基质的显色量，确定过氧化氢量的过氧化氢量的测定等。作为上述显色基质，例如，可以使用N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠(以下也称为DA-64)。
使用上述DA-64时，在表面活性剂存在下，将上述DA-64添加到反应溶液中，优选上述反应溶液中的四唑鎓化合物浓度为0.5～8mmol/L的范围，叠氮化钠浓度为0.08～0.8mmol/L的范围，表面活性剂浓度为0.3～10mmol/L的范围，且上述反应溶液的pH为7.0～8.5。
本发明的特征之一是为了提高测定灵敏度，在四唑鎓化合物和叠氮化钠存在下进行上述氧化还原反应，但是，如上所述，显色基质使用DA-64时，由于该DA-64与四唑鎓化合物和叠氮化钠共存，DA-64有时发生误显色。这样，如果发生误显色，例如，显色量的测定中本底变高，另外，本来添加的足量的DA-64发生不足的问题。但是，如果在表面活性剂存在下添加DA-64，且各成分浓度设定为上述浓度范围，反应溶液的pH设定为上述范围，便可抑制上述本底升高，可进行更高精度的测定。
本发明的测定方法中，上述测定试样的种类没有特别限制，除全血、血浆、血清、血细胞等外，例如对尿、脊髓液等生物试样以及果汁等饮料水、酱油、调味汁等食品类等试样也适用，其中对全血试样、血细胞试样特别有用。例如，测定红细胞内的糖化Hb时，可以将全血直接溶血，或可将从全血中分离的红细胞溶血，将其作为测定试样。
作为测定对象物的糖化蛋白质，例如有前面所述的糖化Hb、糖化白蛋白等，优选糖化Hb。
其次，本发明的Hb糖化率的测定方法，是由糖化Hb量和Hb量求出Hb糖化率的测定方法，根据上述本发明的糖化蛋白质的测定方法测定试样中的糖化Hb量，另一方面，测定上述试样中的Hb量，由上述糖化Hb量和上述Hb量求出Hb糖化率。根据本发明，由于能够以高精度测定糖化Hb量，所以可以得到可靠性高的Hb糖化率。再者，“Hb量”包括糖化的Hb和未糖化的Hb两者。
本发明中，测定上述Hb量的方法没有特别限制，优选用四唑鎓化合物使试样中的Hb变性，在对得到的变性Hb特异的吸收波长下测定上述试样的吸光度，由该吸光度算出上述试样中的Hb量的方法。由于未变性的Hb，例如，根据与氧结合的状态及未结合的状态等其形态的不同，具有各种各样的吸收波长，因此，即使单纯地测定吸光度也难以准确求出Hb量。而通过四唑鎓化合物变性的变性Hb是稳定的，显示吸收最大的波长在一定范围之内，所以可以容易且以高精度求出Hb量。因此，可以由上述可靠性高的糖化Hb量和Hb量进一步求出可靠性高的Hb糖化率。
另外，采用本发明的糖化蛋白质的测定方法，也可以测定HbAlc。例如，该HbAlc的测定方法，是准备由上述本发明的糖化蛋白质的测定方法得到的糖化Hb量和HbAlc量的相关关系作成的校正曲线，将由上述本发明的糖化蛋白质的测定方法得到的试样中的糖化Hb量代入上述校正曲线中，从而求出上述试样中的HbAlc量的方法。
本发明的发明人深入研究的结果，发现根据上述本发明的糖化蛋白质的测定方法得到的全血中的糖化Hb量，与相同试样中的HbAlc量存在高的相关关系。HbAlc为Hb的β链N末端的α-氨基被糖化的糖化Hb，在糖化Hb中，也被作为糖尿病诊断等的特别重要的指标。根据现有的方法，测定HbAlc，需使FAOD特异性作用于糖化部分中的HbAlc的特征性结构部分β链N末端的α-氨基的糖化部分，测定其氧化还原反应。这种场合，例如，由于使用的FAOD对上述α-氨基糖化部分的底物特异性高，并要求充分作用于上述α-氨基糖化部分等，所以不得不采用特别的方法。但是，根据本发明，由于以高精度测定的糖化Hb量为基础，可以确定HbAlc量，所以能够准确且简便地测定HbAlc。因此，HbAlc的测定在临床检查等中能够实用化。
下面，本发明的糖化蛋白质的测定试剂盒，是利用氧化还原反应测定糖化蛋白质使用的测定试剂盒，其特征是包括含有FAOD的试样的预处理用试剂、含有FAOD、氧化还原酶及显色基质的显色用试剂。
本发明的发明人，如上所述，弄清了发生测定精度的问题的原因。而且，本发明的发明人首次发现，即使全血试样中存在稳定糖化氨基酸和暂时性的外来糖化氨基酸，根据本发明，如果使试样的预处理用试剂中含有FAOD，通过在上述氧化还原反应之前添加上述预处理试剂，试样中的糖化氨基酸得到分解，便可抑制上述糖化氨基酸引起的测定值的上升。因此，如果使用本发明的测定试剂盒，就能够以优良的精度快速简便地利用氧化还原反应测定糖化蛋白质，而且，即使是接受点滴的患者的血液试样，也可以在同样的条件下进行测定。另外，使用本发明的测定试剂盒进行的测定，如上所述，由于测定精度优良，所以各种糖化蛋白质作为指标的可靠性也增加，成为临床医疗等领域中有用的测定试剂盒。
本发明的测定试剂盒，优选测定对象物例如为糖化Hb。因为通过这种测定试剂盒，糖化Hb作为糖尿病诊断的指标的可靠性增加，在临床医疗等领域中有用。
再者，本发明中，由于预处理试剂中含有的FAOD分解上述糖化氨基酸，所以，如上所述，下面也称作“分解用FAOD”，由于显色用试剂中含有的FAOD作用于糖化蛋白质，所以下面也称作“测定用FAOD”。
本发明的测定试剂盒，优选进一步包括含有蛋白酶的蛋白酶试剂。上述FAOD具有与糖化蛋白质相比更容易与糖化氨基酸和更短的糖化肽作用的性质。因此，如果用上述蛋白酶试剂分解试样中的糖化蛋白质，显色用试剂中的测定用FAOD变得更容易作用，也可以提高测定精度。再者，作为上述蛋白酶，可以使用与上述本发明的糖化蛋白质测定方法相同的蛋白酶。
本发明的测定试剂盒中，优选上述蛋白酶试剂进一步含有四唑鎓化合物和叠氮化钠。这样，如果使蛋白酶试剂中含有四唑鎓化合物和叠氮化钠，在可以提高测定灵敏度的同时，通过四唑鎓化合物，可以排除上述试样中含有的还原物质等对氧化还原反应的影响，也可提高测定精度。
另外，上述蛋白酶试剂中，作为蛋白酶，使用金属蛋白酶时，优选进一步含有Ca和Na，金属蛋白酶浓度为100~40000KUL,Ca浓度为0.1～50mmol/L，Na浓度为5～1000mmol/L。这样，为达到上述浓度范围，如果使金属蛋白酶、Ca及Na共存，可提高金属蛋白酶的稳定性，例如，不仅在低温条件下，在常温条件下也可防止金属蛋白酶失活，可稳定保存。再者，Ca和Na使用时可以分别离子化成Ca2+和Na+。
再者，上述蛋白酶试剂中的各物质的浓度不限于上述浓度范围，例如，优选其比例为与上述浓度范围同样的含有比例。根据上述蛋白酶试剂对反应溶液的添加比例(稀释率)，可以调整反应所需的上述各物质的添加量。再者，关于其他物质和其他试剂也同样。
作为本发明的测定试剂盒，上述预处理用试剂中含有的分解用FAOD和上述显色用试剂中含有的测定用FAOD，例如可列举使用不同底物特异性的FAOD的第1测定试剂盒、使用相同FAOD的第2及第3测定试剂盒。
本发明中，作为第1测定试剂盒，如上所述，优选预处理用试剂中含有的分解用FAOD和显色用试剂中含有的测定用FAOD使用不同底物特异性的FAOD。如果使用这种测定试剂盒，上述糖化氨基酸通过分解用FAOD得到分解，关于糖化蛋白质，由于可使上述测定用FAOD作用于上述分解用FAOD不作用的不同的糖化部分，所以不受糖化氨基酸的影响，可以提高测定精度。
具体地说，例如，优选上述分解用FAOD为特异性作用于糖化α-氨基的FAOD，上述测定用FAOD为特异性作用于糖化α-氨基及糖化侧链氨基的FAOD。由于上述测定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及侧链氨基糖化部分两者，如果按照现有的方法，如上所述，也作用于α-氨基被糖化的糖化氨基酸。但是，如果使用本发明的测定试剂盒，通过用预处理用试剂处理，上述糖化氨基酸预先被特异性作用于上述糖化α-氨基的分解用FAOD分解，所以测定用FAOD不作用于它，便可抑制表面上的测定值的增加，提高精度。另外，如上所述，测定用FAOD作用于α-氨基糖化部分及侧链氨基糖化部分两者，但由于糖化蛋白质的α-氨基糖化部分也预先通过分解用FAOD得到分解，所以用本发明的上述显色用试剂处理，可以使测定用FAOD只作用于糖化蛋白质的侧链氨基糖化部分。因此，特别是对于测定特征在于侧链氨基的糖化量糖化Hb可以说是有用的测定试剂盒。再者，这种测定试剂盒可以用于上述本发明的第1糖化蛋白质的测定方法。
其次，上述第2测定试剂盒，作为预处理用试剂的上述分解用FAOD和显色用试剂的上述测定用FAOD，优选使用相同FAOD、包括含有分解糖化蛋白质，且使上述分解用FAOD消化失活的蛋白酶的蛋白酶试剂。
该第2测定试剂盒的使用方法，例如，首先将预处理用试剂添加到试样中，使分解用FAOD作用于糖化氨基酸后，添加蛋白酶试剂，将糖化蛋白质用蛋白酶分解，残存的分解用FAOD也通过蛋白酶一并消化分解。而且，可再添加上述显色用试剂，使测定用FAOD作用于上述蛋白酶分解物，进行上述氧化还原反应。
如上所述，FAOD具有与测定的糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸和更短的糖化蛋白质的肽片段的性质。因此，从酶的反应速度论看，可以说即使添加含有分解用FAOD的预处理用试剂，在分解糖化氨基酸的处理时间内，上述FAOD也不怎么作用于糖化蛋白质。但是，如果接下来的用蛋白酶试剂的处理期间上述分解用FAOD的活性还残存的话，与蛋白酶处理并行，上述分解用FAOD作用于通过蛋白酶得到的糖化蛋白质分解物(即糖化氨基酸和糖化蛋白质的肽片段)，然后，即使添加含有测定用FAOD的显色用试剂，由于已经成为分解用FAOD作用于上述糖化蛋白质的分解物的一部分的状态，反而可能会降低测定精度。因此，如上述第2测定试剂盒，如果含有分解糖化蛋白质、且使分解用FAOD消化失活的蛋白酶试剂，糖化蛋白质的分解物与上述分解用FAOD维持未反应的状态，可以与接着添加的显色用试剂中的测定用FAOD反应。因此也提高测定精度。再者，这种测定试剂盒可以用于上述本发明的第2糖化蛋白质的测定方法。
另外，第3测定试剂盒，即使是分解用FAOD和测定用FAOD使用相同FAOD的场合，如上述第2测定试剂盒，虽然用蛋白酶试剂没有使残存的分解用FAOD失活，但是，例如，通过调整预处理用试剂的上述分解用FAOD浓度和显色用试剂的上述测定用FAOD浓度，也可以实现高精度测定。这种场合，例如，优选设定预处理用试剂和显色用试剂的FAOD浓度，使最终的显色反应溶液中的上述分解用FAOD(A)与测定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)为A∶B＝1∶10～1∶1000的范围。如果是这种添加比例，用蛋白酶试剂处理时，从酶的反应速度论的观点看，上述分解用FAOD即使残存，也难以作用于糖化蛋白质。再者，这种测定试剂盒可以用于上述本发明的第3糖化蛋白质的测定方法。
本发明的测定试剂盒中，上述显色基质，例如，可以使用因氧化而显色的基质和因还原而显色的基质等，优选为因氧化而显色的基质，具体地，优选为N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠。
显色基质使用DA-64时，如果上述蛋白酶试剂含有四唑鎓化合物和叠氮化钠，这3种成分因在反应系统中混合，DA-64有时发生误显色。如果发生误显色，例如，测定显色量时本底变高，另外，添加的足量的DA-64发生不足的问题。但是，如上所述，如果各试剂以上述浓度范围含有各成分，便可防止反应系统中的DA-64的误显色。因此也可抑制上述本底升高，可进行更高精度的测定。
本发明的测定试剂盒中，上述预处理用试剂、蛋白酶试剂、显色用试剂也可进一步含有表面活性剂。
另外，上述各种试剂优选含有选自CHES、MOPS、MES、Tris、磷酸、TES、TAPS、HEPES、HEPPSO、硼酸、三乙醇胺、BES、MOPSO、EPPS、POPSO、ADA、PIPES、ACES、Bis-Tris的至少一种缓冲剂。由于上述各种试剂分别含有酶，通过添加缓冲剂，例如可以于最适pH下使上述酶作用。
具体地说，上述预处理用试剂优选进一步含有选自CHES、MOPS、TAPS、EPPS、磷酸、HEPPSO、POPSO、硼酸的至少一种缓冲剂，其pH优选为8.0～10.0的范围。
另外，上述蛋白酶试剂优选进一步含有选自Tris、MES、DIPSO、TES、POPSO、HEPES、MOPSO、Bis-Tris、MOPS、ADA、PIPES、ACES、磷酸的至少一种缓冲剂，其pH优选为5.0～7.0的范围。
另外，上述显色用试剂优选进一步含有选自MES、Tris、磷酸、MOPS、TES、HEPES、HEPPSO、EPPS的至少一种缓冲剂，其pH优选为6.0～9.0的范围。
上述显色用试剂，例如，由于可以防止DA-64等显色基质的误显色，优选进一步含有叠氮化钠。
上述预处理用试剂优选进一步含有尿酸酶及胆红素氧化酶的至少之一。如果含有尿酸酶，例如，可以分解测定试样中含有的尿酸，另外，如果含有胆红素氧化酶，可以分解胆红素。由于该尿酸和胆红素具有还原力，如果这样进行分解，可进一步排除还原物质带来的影响，可以提高测定精度。
本发明的测定试剂盒中各试剂的具体组成，例如可列举下面的组成。
上述预处理试剂，例如，优选果糖基氨基酸氧化酶为特异性作用于糖化的α-氨基的酶，其浓度为10～5000U/L的范围，缓冲剂浓度为5～200mmol/L的范围，pH为8.0～10.0的范围。
上述蛋白酶试剂，例如，优选金属蛋白酶的浓度为100～10000KU/L的范围，四唑鎓化合物浓度为0.1～10mmol/L的范围，叠氮化钠浓度为0.08～4mmol/L的范围，Ca浓度为0.1～50mmol/L的范围，Na浓度为5～1000mmol/L的范围，缓冲剂浓度为为0.1～500mmol/L的范围，pH为5.0～7.0的范围。
上述显色用试剂，例如，优选果糖基氨基酸氧化酶为特异性作用于糖化的α-氨基及糖化的氨基酸残基侧链的酶，其浓度为100～50000U/L的范围，过氧化物酶浓度为0.1～400KU/L的范围，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠浓度为0.02～2mmol/L的范围，缓冲剂浓度为10～500mol/L的范围，pH为6～9的范围。
本发明的测定试剂盒，可以适用于与上述本发明的糖化蛋白质的测定方法相同的试样。另外，其测定对象物也相同，优选为糖化Hb。
再者，本发明的测定试剂盒中的各种试剂，可以是将各成分在水性溶剂中溶解的液系试剂，也可以是使用前在水性溶剂中溶解使用的干系试剂。
附图说明
图1是表示本发明的测定方法的一个实施例中，通过酶法测定的HbAlc量与通过HPLC法测定的HbAlc量的相关关系的图。
具体实施方式
本发明的测定方法及测定试剂盒中使用的FAOD，优选为催化下式(1)所示的反应的FAOD，例如可举出，特异性作用于α-氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下称为FAOD-α)、特异性作用于氨基酸残基的侧链氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下称为FAOD-S)、特异性作用于α-氨基被糖化的糖化胺及上述侧链氨基被糖化的糖化胺之任一种的FAOD(以下称为FAOD-αS)等。再者，“糖化胺”是指糖化蛋白质、糖化肽及糖化氨基酸等。
R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2→R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2 …(1)
上述式(1)中，R1表示羟基或来自糖化反应前的糖的残基(糖残基)。当反应前的糖为醛糖时，上述糖残基(R1)为醛糖残基，而反应前的糖为酮糖时，则为酮糖残基。例如，当反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多利(Amadori)重排，使反应后的结构为果糖结构，但此时，糖残基(R1)变成葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R1)例如可以用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，n为0～6的整数。
上述式(1)中，R2没有特别限制，但是，在糖化胺为糖化氨基酸或糖化肽(包括糖化蛋白质)的场合、α-氨基被糖化的场合、除此以外的氨基(氨基酸侧链的氨基)被糖化的场合是不同的。
上述式(1)中，α-氨基被糖化的场合，R2为下式(2)表示的氨基酸残基或肽残基。在这种情况下，特异性催化上式(1)的反应的是上述FAOD-α和FAOD-αS。
-CHR3-CO-R4 …(2)
上述式(2)中，R3表示氨基酸侧基，R4表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(3)表示。下式(3)中，n为0以上的整数，R3与上述相同，表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以完全相同，也可以不同。
-(NH-CR3H-CO)n-OH …(3)
另外，上述式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸侧基被糖化)的场合，R2可以用下式(4)表示。在这种场合，特异性催化上式(1)的反应的是上述FAOD-S和FAOD-αS。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7 …(4)
上述式(4)中，R5表示氨基酸侧基中被糖化的氨基以外的部分。例如，被糖化的氨基酸为赖氨酸时，R5为-CH2-CH2-CH2-CH2-，例如，被糖化的氨基酸为精氨酸时，R5为-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
另外，上述式(4)中，R6为氢、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(5)表示。再者，下式(5)中，n为0以上的整数，R3与上述相同，表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以完全相同，也可以不同。
-(CO-CR3H-NH)n-H …(5)
另外，上述式(4)中，R7为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(6)表示。再者，下式(6)中，n为0以上的整数，R3与上述相同，表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以完全相同，也可以不同。
-(NH-CHR3-CO)n-OH …(6)
作为特异性作用于上述糖化α-氨基的FAOD-α，例如可列举，市售的商品名为Fructosyl-Amino Acid Oxidase(FAOX-E)(Kikkoman公司生产)、来自青霉属的FAOD(特开平8-336386号公报)等。作为特异性作用于上述糖化的氨基酸侧链的FAOD-S，例如有来自镰刀菌属的FAOD(日本生物工学会大会平成12年度“来自镰刀菌的氨基酸氧化酶的底物特异性转化；藤原真纪等”)等。另外，作为作用于上述糖化α-氨基及糖化氨基酸侧基两者的FAOD-αS，例如有市售的商品名为FOD(旭化成公司生产)、来自赤霉菌属的FAOD(特开平8-154672号公报)、来自镰刀菌属的FAOD(特开平7-289253号公报)、来自曲霉属的FAOD(WO 99/20039)等。
作为本发明中的四唑鎓化合物，例如，优选为在四唑环的至少2个位置上具有环结构取代基的结构，更加优选为在3个位置上具有环结构取代基的结构。
上述四唑鎓化合物，如上所述，在上述四唑环的至少2个位置上具有环结构取代基的场合，优选在上述四唑环的2位及3位上有上述取代基。另外，当四唑鎓化合物在3个位置上具有环结构取代基时，优选在上述四唑环的2位、3位及5位上具有上述取代基。
另外，四唑鎓化合物优选至少2个环结构取代基的环结构为苯环。作为除了上述苯环以外的环结构取代基，例如可举出，在环骨架中含有S或O、且为共振结构的取代基，例如，噻吩基、噻唑基等。
另外，上述四唑鎓化合物优选在四唑环的至少3个位置上具有环结构取代基，上述环结构取代基的至少2个环结构取代基的环结构为苯环。
另外，优选至少1个环结构取代基具有官能团，更加优选上述官能团的数目多。
作为上述官能团，优选为吸电子性官能团，例如有卤素基、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基、磺基等。其他例如有氢过氧基、氧基(oxy)、环氧基、环二氧基、氧代基(oxo)等含氧的特性基及巯基、烷硫基、甲基硫甲基、硫代基、亚磺基、苯磺酰基(benzenesulfonyl)、苯基磺酰基(phenylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(p-toluenesulfonyl)、对甲苯基磺酰基(p-tolylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(tosyl)、氨磺酰基、异硫氰酸酯基等含硫的特性基等。这些吸电子性官能团中，优选硝基、磺基、卤素基、羧基、羟基、甲氧基、乙氧基。另外，除了上述吸电子性官能团外，例如还有苯基(C6H5-)、苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)等不饱和烃基等。再者，上述官能团也可以通过离解而离子化。
上述四唑鎓化合物优选在四唑环的2位及3位上具有苯环，上述苯环中的至少一个具有选自卤素基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基及乙氧基的至少1种官能团。再者，上述两个苯环具有上述官能团也可以。上述苯环中，在任一位置(邻位、间位、对位)上有上述官能团也可以。另外，对官能团的数目没有特别限制，可以具有相同的官能团，也可以具有不同的官能团。
上述四唑鎓化合物，例如，作为在上述四唑环的2位、3位及5位上具有苯环结构取代基的化合物，例如可以举出，2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐(以下也称作WST-3)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3，3’-(1，1’-联苯-4，4’-二基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯)-4，4’-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐]、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)-四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓盐及2，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓盐等。
另外，上述四唑鎓化合物并不限于上述那些化合物，除此之外，也可以使用在上述四唑环的2个位置上具有苯环结构取代基及1个位置上具有其他的环结构取代基的化合物，例如有2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓盐、2，2’-二苯并噻唑-5，5’-双[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-亚联苯基)二四唑鎓盐及3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。
另外，也可以使用在上述四唑环的2个位置上有苯环结构取代基及1个位置上有非环结构取代基的四唑鎓化合物，例如有2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐等。
上述四唑鎓化合物中，如上所述，优选具有3个环结构取代基的化合物，更加优选有3个环结构为苯环的取代基，且含有较多吸电子性官能团的化合物，特别优选WST-3。再者，这样的四唑鎓化合物，例如可以是盐，也可以是离子化的状态等。另外，该四唑鎓化合物可以使用一种，也可以2种以上并用。
下面关于本发明的糖化蛋白质的测定方法，以测定血细胞中的糖化Hb为例在下述实施方式A-1～A-5中进行说明。
(实施方式A-1)
该实施方式是分解上述糖化氨基酸使用FAOD-α、测定糖化Hb使用FAOD-αS，在四唑鎓化合物及叠氮化钠存在下，进行上述氧化还原反应的例子。
首先，将全血直接溶血，或用离心分离等常用方法从全血分离出血细胞成分，将其溶血，配制溶血试样。该溶血方法没有特别限制，例如，可以使用采用表面活性剂的方法、采用超声波的方法、利用渗透压差的方法等。其中，从操作的简便性等的理由看，上述采用表面活性剂的方法是优选的。
作为上述表面活性剂，例如，可以使用聚氧乙烯对叔辛基苯基醚(Triton类表面活性剂等)、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯(Tween类表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij类表面活性剂等)非离子型表面活性剂，具体例如有TritonX-100、Tween-20、Brij35等。上述采用表面活性剂的处理条件，通常，当处理溶液中的血细胞浓度为1～10体积％时，添加上述表面活性剂使得在上述处理溶液中的浓度达0.01～5重量％，室温下，搅拌数秒(约5秒)～10分钟。
然后，在上述溶血试样中，添加四唑鎓化合物及叠氮化钠。
例如，当处理溶液中的血细胞浓度为0.2～2体积％时，优选添加上述四唑鎓化合物使浓度达到0.005～400mmol/L的范围，更加优选0.02～100mmol/L的范围，特别优选0.1～50mmol/L的范围。具体地说，上述四唑鎓化合物为WST-3时，优选添加以使浓度达到0.004～16mmol/L的范围，更加优选0.02～10mmol/L的范围，特别优选0.1～5mmol/L的范围。再者，上述四唑鎓化合物可以使用一种，也可以2种以上并用。这样，通过添加四唑鎓化合物及叠氮化钠，与不添加的场合相比，其灵敏度提高约1.2～3倍。
另外，上述四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的添加比例(摩尔比C∶D)，例如为C∶D＝20∶3～20∶12的范围，优选为20∶5～20∶11的范围，更加优选为20∶6～20∶10的范围。
上述四唑鎓化合物和叠氮化钠可以直接添加到上述溶血试样中。但是，从操作的简便性等观点来看，优选使用溶解在溶剂中的四唑鎓化合物溶液和叠氮化钠溶液，或使用含有四唑鎓化合物和叠氮化钠两者的溶液(四唑鎓化合物·叠氮化钠混合液)。
上述各种溶液中的四唑鎓化合物或叠氮化钠的浓度，可以根据添加到上述溶血试样时的稀释倍率等适当确定，四唑鎓化合物的浓度例如为0.1～10mmol/L的范围，优选为0.6～5mmol/L的范围，更加优选为0.7～2.7mmol/L的范围。叠氮化钠的浓度例如为0.1～4mmol/L的范围，优选为0.15～1.8mmol/L的范围，更加优选为0.2～1.5mmol/L的范围。另外，上述混合液的场合，四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的配合比例(摩尔比C∶D)为C∶D＝20∶3～20∶12的范围，优选为20∶5～20∶11的范围，更加优选为20∶6～20∶10的范围。
作为上述溶液的溶剂，例如可以使用MOPS、MES、MOPSO、DIPSO、TES、POPSO、HEPES、磷酸等缓冲液，优选为MOPS、MES。上述溶剂的pH，例如为5.0～7.0的范围，优选为5.5～6.5的范围。另外，上述缓冲液的浓度，例如为0.1mmol/L～10mmol/L的范围，优选为1～5mmol/L的范围，更加优选为1～3mmol/L的范围。添加到上述溶血试样的场合的处理溶液的最终浓度，例如为0.7～9mmol/L的范围，优选为0.8～4.5mmol/L的范围，更加优选为0.8～2.7mmol/L的范围。
另外，由于可进一步提高灵敏度，优选将配制的上述四唑鎓化合物·叠氮化钠混合液在添加到上述溶血试样之前通过放置一定时间进行老化。通过该老化处理，与不老化的场合相比，灵敏度例如提高约1.2～3倍。
上述老化中，例如，处理温度优选为40～60℃的范围，更加优选为50～60℃的范围。处理时间例如为6～72小时的范围，优选为15～20小时的范围。
对于上述溶血试样，直接或作为上述溶液添加四唑鎓化合物及叠氮化钠后，通常，处理温度为40～60℃的范围，保温6～72小时，进行上述试样的预处理。试样通过用四唑鎓化合物及叠氮化钠预处理，如上所述，在可以提高灵敏度的同时，通过四唑鎓化合物可以排除上述试样中含有的还原物质等对氧化还原反应的影响，也可提高测定精度。这样，四唑鎓化合物也有助于提高测定精度，本发明的目的之一是为了提高测定精度，不只是四唑鎓化合物，也需要叠氮化钠共存，据此本发明可达到特有的效果。
接着，将添加了四唑鎓化合物及叠氮化钠的预处理过的溶血试样进行蛋白酶处理。因为这样用于后面的处理的FAOD易作用于测定对象物。另外，如上所述，因为在四唑鎓化合物存在下进行蛋白酶处理，糖化Hb的分解也可以快速进行。
作为上述蛋白酶，例如可以使用丝氨酸蛋白酶、硫赶蛋白酶(thiolproteases)、金属蛋白酶等，具体地说，可以使用胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶等，优选选择性分解上述糖化Hb的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来自猪胰腺的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来自枯草杆菌的蛋白酶等。作为上述来自枯草杆菌的蛋白酶，例如有商品名为Protease N(例如Fulka公司生产)、商品名为Protease N“Amano”(天野制药公司生产)等。作为上述金属蛋白酶，例如有来自芽孢杆菌属的金属蛋白酶(EC 3.4.24.4)(例如，东洋纺公司生产：商品名为Toyoteam)等。其中更加优选金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，特别优选金属蛋白酶。这样，如果使用选择性分解的蛋白酶，可以选择性调制糖化Hb分解物。上述蛋白酶处理通常在缓冲液中进行，其处理条件根据使用的蛋白酶的种类、糖化Hb的浓度等适当确定。
作为上述缓冲液，例如可以使用CHES缓冲液、CAPSO缓冲液、CAPS缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、EPPS缓冲液、HEPES缓冲液等。其pH例如为6～13的范围，优选为8～12的范围，更加优选为9～11的范围。另外，蛋白酶处理溶液中的上述缓冲液的最终浓度例如为1.0～10mmol/L的范围。
具体地说，例如，作为上述蛋白酶，使用金属蛋白酶处理上述预处理过的溶血试样时，通常，反应液中的金属蛋白酶浓度为0.1～40MU/L，反应液中的血细胞浓度为0.05～15体积％，反应温度为15～37℃，反应时间为1分钟～24小时，pH为6～12的范围。
另外，例如，作为上述蛋白酶，使用蛋白酶K处理上述预处理过的溶血试样时，通常，反应液中的蛋白酶浓度为10～300KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.05～15体积％，反应温度为15～37℃，反应时间为1分钟～24小时，pH为6～12的范围。另外，上述缓冲液的种类也没有特别限制，例如可以使用Tris-盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液等。
然后，将上述蛋白酶处理的溶血试样用催化上述式(1)的反应，具体地说是催化下式(7)的反应的FAOD-α(分解用FAOD)处理。
R1-CO-CH2-NH-CHR3-COOH+H2O+O2
→R1-CO-CHO+NH2-CHR3-COOH+H2O2 …(7)
上述式(7)中，R1表示与上述相同的糖残基，R3表示与上述相同的氨基酸侧链。
通过该处理，上述溶血试样中含有的α-氨基被糖化的糖化氨基酸以及上述糖化Hb分解物中α-氨基的糖化部分得到分解。
再者，通过上述FAOD-α处理，糖化氨基酸中侧链氨基被糖化的氨基酸没有被分解而残存下来。但是，即使从该侧链被糖化的氨基酸相对于糖化氨基酸总体的比例，及相对于糖化Hb中具有糖化的侧链氨基的氨基酸残基的比例考虑，可以说残存的糖化氨基酸的影响小，可充分提高测定精度。
作为处理条件，例如，反应液中的FAOD-α浓度为10～5000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.5～20体积％，反应温度为20～50℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。该处理通常在缓冲液中进行，可以使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。
然后，将上述FAOD-α处理的上述溶血试样进一步用FAOD-αS处理。如上所述，该FAOD-αS作用于糖化的α-氨基及糖化的侧链氨基两者。但是，由于糖化Hb分解物预先通过分解用FAOD-α处理，所以可使测定用FAOD-αS只作用于糖化侧链氨基。
该FAOD-αS处理优选在与上述蛋白酶处理相同的缓冲液中进行，作为上述缓冲液，没有特别限制，可以使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。
作为处理条件，例如，反应液中的FAOD-αS浓度为10～30000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.1～5体积％，反应温度为20～50℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。
接着，将用上述FAOD-αS处理生成的过氧化氢使用氧化酶及显色基质通过进一步氧化还原反应进行测定。
作为上述显色基质，例如有DA-64、邻苯二胺(OPD)、Trinder试剂与4-氨基安替比林组合的基质等。作为上述Trinder试剂，例如有苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除了上述氨基安替比林之外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。这些显色性基质中，如上所述，特别优选DA-64。
作为上述氧化酶，例如优选POD。
上述氧化还原反应通常在缓冲液中进行，其条件根据上述生成的过氧化氢的浓度等适当确定。通常，反应液中的POD浓度为10～100000IU/L，显色基质浓度为0.005～30mmol/L，反应温度为15～37℃，反应时间为0.1～30分钟，pH为5～9。另外，上述缓冲液没有特别限制，例如，可以使用与上述蛋白酶处理及FAOD处理等相同的缓冲液等。
上述氧化还原反应中，例如，使用上述显色基质时，通过用分光光度计测定上述反应液的显色程度(吸光度)，可以测定过氧化氢的量。而且，例如，用预先准备的表示过氧化氢量与糖化Hb量的相关关系的校正曲线和测定的过氧化氢量，可以求出试样中的糖化Hb量。
再者，由于由开始添加的分解用FAOD-α生成的过氧化氢因血液试样(溶血试样)中开始存在的过氧化氢酶而消失，所以对测定来自通过FAOD-αS生成的测定对象物的过氧化氢没有影响。另外，也可以添加过氧化氢酶使之消失。这样，通过上述过氧化氢酶消去过氧化氢时，为了防止连后面进行的用测定用FAOD-αS处理生成的过氧化氢也消去，优选与添加FAOD-αS一起添加过剩量的POD及显色性基质。这种场合，相对于上述过氧化氢酶的添加量(U)，例如优选添加POD 5～100倍的活性(U)量。
另外，用分解用FAOD处理溶血试样时，例如，也可以进一步添加尿酸酶、胆红素氧化酶进行同样的处理。这样，如果用尿酸酶处理，可以进一步分解上述试样中含有的尿酸，另外，如果用胆红素氧化酶处理，可以分解胆红素。由于该尿酸和胆红素具有还原力，通过这种处理，可进一步除去还原物质带来的影响，可以提高测定精度。
上述尿酸酶或胆红素氧化酶的添加比例，反应液中的血细胞浓度为0.2～2体积％时，例如，上述反应液中的尿酸酶浓度为0.1～5000U/L，胆红素氧化酶浓度为0.1～5000U/L，优选尿酸酶浓度为1～2000U/L，胆红素氧化酶浓度为0.5～1000U/L，更加优选尿酸酶浓度为5～1000U/L，胆红素氧化酶浓度为2～1000U/L。另外，作为其处理条件，例如，可以与上述分解用FAOD同样地进行。
该测定中，如上所述，上述蛋白酶处理不限于在上述分解用FAOD-α处理前进行，例如，也可以在上述FAOD-α处理后进行。如上所述，上述蛋白酶处理是为了使FAOD易作用而进行的，由于上述FAOD-α处理是以分解糖化氨基酸为目的而进行的，所以，FAOD-α处理前即使糖化Hb通过蛋白酶没有被分解，也可以充分得到本发明的效果。
另外，本发明的测定方法，不限于本实施方式的操作顺序，例如，也有可以同时进行的工序。例如，溶血处理、四唑鎓化合物及叠氮化钠处理和分解用FAOD处理可以同时进行，另外，蛋白酶处理与四唑鎓化合物及叠氮化钠处理也可以同时进行。再者，不限于这些组合。
再者，上述过氧化氢量，除了采用上述POD等的酶方法外，例如，也可以通过电学方法测定。
(实施方式A-2)
该实施方式是分解糖化氨基酸和测定糖化Hb使用相同FAOD的例子。作为FAOD没有特别限制，例如，可以使用FAOD-α、FAOD-S、FAOD-αS之任一种。再者，只要没有特别表示，就与上述实施方式A-1同样地进行测定。
在添加了四唑鎓化合物及叠氮化钠的预处理过的溶血试样中添加分解用FAOD。
作为具体的处理条件，例如，反应液中的分解用FAOD浓度为10～5000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.5～20体积％，反应温度为20～50℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。该处理通常在缓冲液中进行，可以使用与上述相同的缓冲液。
然后，对分解用FAOD处理的试样进行蛋白酶处理。该蛋白酶处理的第1个目的，与上述相同，是为了分解来自血细胞的糖化Hb，使后面的工序中进一步添加的测定用FAOD易作用。而且，第2个目的是为了使上述分解用FAOD消化失活。
由于FAOD与糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸，所以上述分解用FAOD处理时，糖化氨基酸得到分解。但是，该分解用FAOD处于残存的状态，如果将上述糖化Hb进行蛋白酶处理，残存的分解用FAOD与糖化Hb分解物的糖化部分发生反应，存在不能准确测定的问题。因此，用蛋白酶使该残存的分解用FAOD失活，防止与上述糖化Hb分解物反应。因此，需要添加使开始添加的分解用FAOD迅速失活、且只能分解糖化Hb的蛋白酶。
作为上述蛋白酶，没有特别限制，可以使用与上述相同的蛋白酶。另外，其处理条件，例如，根据使用的蛋白酶的种类、糖化Hb的浓度、分解用FAOD的种类及其量等适当确定。
对于分解用FAOD 100U/L而言，蛋白酶处理的反应溶液中的蛋白酶的添加量例如为1～1000000KU/L的范围，优选为10～300000KU/L的范围，更加优选为100～100000KU/L的范围。
具体地说，作为蛋白酶，使用胰蛋白酶处理上述试样时，例如，反应液中的蛋白酶浓度为1000～30000KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.2～5体积％，反应液中的FAOD浓度为10～1000U/L，反应温度为20～50℃，反应时间为10分钟～20小时，pH为6～9的范围。
然后，向通过上述蛋白酶处理得到的糖化Hb分解物中添加与分解用FAOD相同的FAOD，作为再度测定用FAOD进行处理。由于该测定用FAOD可能因上述蛋白酶而失活，所以需添加足够量。
该测定用FAOD处理与上述相同，也优选在缓冲液中进行。作为上述缓冲液，没有特别限制，可以使用与上述蛋白酶处理同样的缓冲液。
对于蛋白酶10000KU/L而言，测定用FAOD处理的反应溶液中的测定用FAOD的添加量例如为10～1000000U/L的范围，优选为100～200000U/L的范围，更加优选为500～50000U/L的范围。
作为具体的处理条件，例如，反应液中的测定用FAOD浓度为500～20000U/L，反应液中的蛋白酶浓度为100～30000KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.01～1体积％，反应温度为15～40℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。
(实施方式A-3)
该实施方式是分解糖化氨基酸和测定糖化Hb使用相同FAOD的例子。只要没有特别表示，就与上述实施方式A-1同样地进行测定。
但是，该实施方式与上述实施方式A-2不同，为没有必要必须用蛋白酶使分解用FAOD失活的实施方式。由于酶有底物特异性，根据蛋白酶和FAOD的组合，有时出现用蛋白酶难以使FAOD失活的情况。在这种场合，本实施方式的方法有效。再者，如果开始添加的分解用FAOD与通过蛋白酶生成的糖化Hb分解物反应，由于不能提高测定精度，所以，如下所述，调整FAOD的添加比例变得重要。
在添加了四唑鎓化合物及叠氮化钠的预处理过的溶血试样中添加分解用FAOD。
用蛋白酶难以使分解用FAOD失活时，即使其活性残存，蛋白酶处理期间，需要在不作用于生成的糖化Hb分解物的范围内添加。另外，由于利用FAOD易作用于糖化氨基酸、难作用于糖化蛋白质的性质，所以优选只作用于糖化氨基酸程度的添加量和反应时间。
作为FAOD处理的条件，例如，反应液中的FAOD浓度为10～5000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.2～20体积％，反应温度为20～50℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。该处理通常在缓冲液中进行，可以使用与上述相同的缓冲液。
然后，对上述FAOD处理的试样进行蛋白酶处理。如上所述，由于该实施方式是蛋白酶难以作用于上述FAOD的场合的例子，所以蛋白酶的添加量没有特别限制。
作为上述蛋白酶没有特别限制，可以使用与上述同样的蛋白酶。其处理条件与上述相同，根据使用的蛋白酶的种类、糖化Hb的浓度、使用的蛋白酶对FAOD的底物特异性等适当确定。
作为适应于这种实施方式的FAOD与蛋白酶的组合，例如有商品名为FOD(旭化成公司生产)和商品名为Toyoteam(东洋纺公司生产)、上述来自赤霉菌属的FAOD及商品名为Proteinase K(Roche公司生产)的蛋白酶等。
作为蛋白酶，使用胰蛋白酶处理上述试样时，例如，反应液中的蛋白酶浓度为100～6000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.2～5体积％，反应液中的FAOD浓度为1～100U/L，反应温度为20～50℃，反应时间为10分钟～20小时，pH为6～9的范围。
接下来，向通过上述蛋白酶处理得到的分解物中再次添加相同的FAOD作为测定用FAOD。
该测定用FAOD处理与上述相同，也优选在缓冲液中进行，作为上述缓冲液，没有特别限制，可以使用与上述蛋白酶处理同样的缓冲液。
这样，本实施方式中，分解用FAOD(A)与测定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)，例如，如上所述，为A∶B＝1∶50000～1∶10的范围，优选为1∶5000～1∶25的范围，更加优选为1∶500～1∶50的范围。如果这样设定，与上述实施方式A-2不同，反应液中残存上述分解用FAOD，但是由于该残存的FAOD的反应速度非常慢，蛋白酶处理工序中，残存FAOD作用于生成的糖化Hb分解物没有达到影响测定的程度。
作为处理条件，例如，反应液中的测定用FAOD浓度为500～20000U/L，反应液中的蛋白酶浓度为100～30000KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.01～1体积％，反应温度为15～40℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。
(实施方式A-4)
该实施方式是显色基质使用DA-64，测定通过上述测定用FAOD处理生成的过氧化氢的例子。再者，只要没有特别表示，就与上述实施方式A-1同样地进行测定。
显色基质使用DA-64时，为了防止DA-64的误显色，将DA-64、四唑鎓化合物、叠氮化钠及表面活性剂在上述氧化还原反应溶液中的终浓度分别设定为以下范围。通常，各成分的终浓度为DA-64为1～10000μmol/L，表面活性剂为0.01～200mmol/L，四唑鎓化合物为0.05～20mmol/L，叠氮化钠为0.01～5mmol/L的范围，优选DA-64为2～1000μmol/L，表面活性剂为0.05～30mmol/L，四唑鎓化合物为0.01～10mmol/L，叠氮化钠为0.02～2mmol/L的范围，更加优选DA-64为3～300μmol/L，表面活性剂为0.1～10mmol/L，四唑鎓化合物为0.5～8mmol/L，叠氮化钠为0.08～0.8mmol/L的范围。作为上述表面活性剂，没有特别限制，例如，可以使用上述及后述的表面活性剂。
该氧化还原反应溶液的pH优选为6.0～10.0的范围，更加优选为6.5～9.0的范围，特别优选为7.0～8.5的范围。
上述表面活性剂的添加例如可以在添加DA-64之前或同时进行，如果为配制溶血试样添加表面活性剂时，也可以预先添加，使氧化还原反应时表面活性剂达到上述浓度范围。
上述DA-64由于通过氧化还原反应而显色，关于该反应液，例如，如果用分光光度计测定检测波长600～780nm范围的吸光度(显色程度)，可以测定过氧化氢的量。
(实施方式A-5)
下面，关于本发明的Hb糖化率的测定方法，举以全血作为试样时的例子进行说明。
首先，与上述实施方式A-1相同，将全血溶血，测定溶血试样中的糖化Hb量，另一方面，测定上述溶血试样中的Hb量。
例如可如以下所示测定Hb量。首先，向上述溶血试样中添加上述四唑鎓化合物，使Hb变性。其添加比例，例如，当上述溶血试样中的血细胞浓度为0.2～2体积％时，优选添加以使浓度达到0.005～400mmol/L的范围，更加优选为0.02～100mmol/L的范围，特别优选为0.1～50mmol/L的范围。具体地说，上述四唑鎓化合物为WST-3时，优选添加以使浓度达到0.004～16mmol/L的范围，更加优选为0.02～10mmol/L的范围，特别优选为0.1～5mmol/L的范围。
上述四唑鎓化合物也可以直接使用，但从操作的简便性和处理效率等方面来看，优选使用溶解在溶剂中的四唑鎓化合物溶液。上述溶液的浓度根据四唑鎓化合物的种类(例如分子量等)等适当确定，例如为0.01～120mmol/L的范围，优选为0.1～50mmol/L的范围，更加优选为0.2～20mmol/L的范围。作为上述溶剂，例如可以使用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等，作为上述缓冲液，例如可以使用上述缓冲液。再者，上述四唑鎓化合物可以使用一种，也可以2种以上并用。
对采用上述四唑鎓化合物的处理条件没有特别限制，例如温度为4～50℃的范围，处理时间为20秒～60分钟的范围，优选温度为15～40℃的范围，处理时间为20秒～20分钟的范围，更加优选温度为25～37℃的范围，处理时间为30秒～6分钟的范围。
另外，该四唑鎓化合物处理优选在表面活性剂存在下进行。因为这样可以进一步促进Hb的变性。因此，从操作的简便性等来看，在上述试样溶血时，预先添加四唑鎓化合物也可以。
作为上述表面活性剂，例如可以使用聚氧乙烯醚、聚氧乙烯苯酚醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯、聚氧乙烯烷基醚等。优选聚氧乙烯醚等。该聚氧乙烯醚[CLHM-O-(CH2CH2O)NH]是聚氧乙烯链与烃链进行醚键合，作为上述烃链例如有烷基、烷基苯基等。优选上述聚氧乙烯链的重均聚合度(N)为8～23的范围，另一方的烃链的碳数(L)为8～18的范围，更加优选上述重均聚合度(N)为8～15的范围，烃链的碳数(L)为8～16的范围，特别优选上述重均聚合度(N)为8～10的范围，烃链的碳数(L)为8～14的范围。另外，上述烃链，例如，可以是直链，也可以有支链。作为上述聚氧乙烯醚的具体例子，例如有聚氧乙烯对叔辛基苯基醚、聚乙二醇(10)月桂醚、聚乙二醇(9)月桂醚等。
更具体地说，例如可以使用市售的Triton类表面活性剂聚氧乙烯对叔辛基苯基醚等、市售的Tween类表面活性剂聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯等、市售的Brij类表面活性剂聚氧乙烯烷基醚等。除此以外，例如，也可以使用聚氧乙烯(10)月桂醚、商品名Nikkol BL-9EX(聚氧乙烯的重均聚合度N为9，和光纯药工业公司生产)等之类的聚氧乙烯(9)月桂醚、商品名Tergitol NPX(聚氧乙烯的重均聚合度N为约10.5，Nacalai Tesque公司生产)及商品名Tergitol NP-40(聚氧乙烯的重均聚合度N为20，Nacalai Tesque公司生产)等之类的聚氧乙烯辛基苯基醚等。再者，这些表面活性剂也可以作为溶血用的表面活性剂使用。
表面活性剂的添加量没有特别限制，例如上述溶血试样中的血细胞浓度为0.2～1体积％时，优选添加以使浓度达到0.05～50mmol/L的范围，更加优选为0.2～30mmol/L的范围，特别优选为0.3～10mmol/L的范围。具体地说，当上述表面活性剂为商品名TritonX-100时，优选添加以使浓度达到0.2～100mmol/L的范围，更加优选为1～30mmol/L的范围，特别优选为2～20mmol/L的范围。另外，当为商品名Brij35时，优选添加以使浓度达到0.1～50mmol/L的范围，更加优选为0.5～20mmol/L的范围，特别优选为1～10mmol/L的范围。
另外，对于0.5～5mmol上述四唑鎓化合物而言，例如，可以添加上述表面活性剂达到0.1～70mmol的范围，优选为0.3～50mmol的范围，更加优选为0.4～20mmol的范围。具体地说，当上述表面活性剂为商品名TritonX-100时，对于1mmol四唑鎓化合物而言，优选添加使之达到0.2～15mmol的范围，更加优选为0.5～10mmol的范围，特别优选为0.7～5mmol的范围。另外，当为商品名Brij35时，对于1mmol四唑鎓化合物而言，优选添加使之达到0.1～10mmol的范围，更加优选为0.2～8mmol的范围，特别优选为0.3～4mmol的范围。再者，在试样溶血时，预先添加能够促进Hb变性的足够量的表面活性剂也可以。
接下来，进行上述变性Hb的吸光度测定。如上所述，优选测定波长为520～670nm的范围，更加优选为550～660nm的范围。另外，在以上述波长为主波长进行双波长测定的场合，优选副波长为730～900nm的范围，更加优选为800～900nm的范围，特别优选为800～850nm的范围。
然后，由所测定的变性Hb的吸光度与预先作成的校正曲线求出Hb量，由上述所测定的糖化Hb量与Hb量可以算出Hb糖化率。
上述校正曲线，例如，可以用上述的Hb测定方法及公知的测定方法测定含有已知量的Hb的标准试样，由这些测定值作成。作为上述公知的测定方法，只要是测定精度优良的方法，没有特别的限制，例如，优选国际标准HiCN法。
再者，为求出Hb量进行的变性Hb的吸光度测定，例如，可以如下进行：分取为测定糖化Hb配制的溶血试样的一部分，将其作为Hb测定用试样。但是，从简便快速地进行操作的观点看，优选在糖化Hb的测定工序中进行。具体地说，例如，测定上述实施方式A-1所示的上述糖化Hb时，向上述溶血试样中添加四唑鎓化合物后，向上述溶血试样中添加四唑鎓化合物及叠氮化钠后、进行蛋白酶处理后、或进行测定用FAOD处理后等，可以测定变性Hb的吸光度。
(实施方式A-6)
下面关于本发明的HbAlc的测定方法，举以全血作为试样时的例子进行说明。
首先，关于全血试样，与上述实施方式A-1相同，测定糖化Hb量。另一方面，准备糖化Hb中HbAlc量已知的糖化Hb标准液，与上述相同，测定糖化Hb量，作成表示该标准液的测定值(糖化Hb量)与HbAlc量关系的校正曲线。如上所述，由于上述糖化Hb的测定值与HbAlc量存在相关关系，将上述全血试样中的糖化Hb量的测定值代入该校正曲线，可以求出上述全血试样中的HbAlc量。
再者，校正曲线的作成中，作为上述糖化Hb量的测定值，不只是最终求得的糖化Hb量，也可以是测定上述糖化Hb量时通过POD处理得到的反应液的吸光度的值，也可以使用由上述吸光度求得的过氧化氢量。
下面，关于本发明的测定试剂盒，举测定对象物为糖化Hb的例子进行说明。
(实施方式B-1)
该实施方式是预处理用试剂的分解用FAOD使用FAOD-α，显色用试剂的测定用FAOD使用FAOD-αS的上述第1测定试剂盒的一例。
该测定试剂盒由含有分解用FAOD的预处理用试剂、含有蛋白酶的蛋白酶试剂，及含有测定用FAOD、氧化还原酶和显色基质的显色用试剂组成。
这些预处理用试剂、蛋白酶试剂、显色用试剂可分别通过在水性溶剂中溶解所含有的成分而配制。
(预处理用试剂)
在最终的显色反应溶液中，将预处理用试剂例如稀释10～200倍，优选稀释20～100倍。因此，预处理用试剂中含有的FAOD等的浓度例如可根据该稀释倍率等适当确定。另外，根据测定试样中的测定对象物或分解的糖化氨基酸的量，通过改变预处理用试剂在试样中的添加量，也可以调整反应系统中的FAOD等的量。
具体地说，预处理用试剂中的分解用FAOD浓度例如为10～5000U/L的范围。
作为上述水性溶剂，没有特别限制，例如有水、含有上述各种缓冲剂的缓冲液等。上述缓冲剂中，优选CHES、MOPS、TAPS、EPPS、磷酸、HEPPSO、POPSO、硼酸，更加优选CHES、MOPS、TAPS、磷酸。上述缓冲液的浓度例如为5～200mol/L的范围，优选为20～150mol/L的范围。另外，上述缓冲液的pH例如为8～10的范围，优选为8.5～10.0的范围。
另外，该预处理用试剂，除分离用FAOD外，也可以进一步含有以下成分。
含有表面活性剂时，例如可以使用上述各种表面活性剂，优选聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基苯基醚。另外，表面活性剂浓度例如为0.03～200mmol/L的范围，优选为0.1～50mmol/L的范围。
含有尿酸酶时，其浓度例如为1～2000U/L的范围，另外，含有胆红素氧化酶时，其浓度例如为1～2000U/L的范围。再者，也可以含有这两者。
(蛋白酶试剂)
下面，在最终的显色反应溶液中，将蛋白酶试剂例如稀释1.1～3倍。因此，与上述预处理用试剂相同，各成分的浓度可根据该稀释倍率等适当确定，另外，根据试样中的糖化Hb量，通过改变在试样中的添加量，也可以调整反应系统中的蛋白酶量。
作为蛋白酶，例如可以使用上述蛋白酶。当蛋白酶为金属蛋白酶时，蛋白酶试剂中的蛋白酶浓度例如为0.5～100MU/L的范围，优选为1～40MU/L的范围。
作为上述水性溶剂，没有特别限制，例如有水、含有上述各种缓冲剂的缓冲液等。上述缓冲剂中，优选MES、MOPS，更加优选MES。上述缓冲液的浓度例如为1～20mmol/L的范围，优选为1～5mmol/L的范围。另外，上述缓冲液的pH例如为5.0～7.0的范围，优选为5.5～6.5的范围。
另外，该蛋白酶试剂，除上述蛋白酶外，也可以进一步含有以下成分。
作为其他成分，例如有四唑鎓化合物及叠氮化钠。这时，上述蛋白酶试剂，例如四唑鎓化合物浓度为0.1～10mmol/L的范围，叠氮化钠浓度为0.05～4mmol/L的范围，优选四唑鎓化合物浓度为0.6～5mmol/L的范围，叠氮化钠浓度为0.15～1.8mmol/L的范围。另外，四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的添加比例(摩尔比C∶D)优选为C∶D＝20∶3～20∶12的范围，更加优选为C∶D＝20∶5～20∶11的范围，特别优选为C∶D＝20∶6～20∶10的范围。
另外，作为蛋白酶，使用金属蛋白酶时，也可以进一步含有Ca化合物和Na化合物。作为上述Ca化合物和Na化合物，只要是在上述水性溶剂中离子化成Ca2+和Na+的化合物，没有特别限制。作为上述Ca化合物，例如可以使用氯化钙(CaCl2)、CaSO4、(CH3COO)2Ca等，优选CaCl2、CaSO4。另外，作为上述Na化合物，例如可以使用氯化钠(NaCl)、CH3COONa、Na2SO4、NaNO3等，优选NaCl、Na2SO4。这些Ca化合物和Na化合物分别可以使用一种，也可二种以上并用。
如上所述，金属蛋白酶的浓度为0.5～100MU/L的范围，优选为1～40MU/L的范围。
另一方面，为使离解的Ca2+浓度达0.1～5mmol/L的范围，上述Ca化合物的浓度为0.1～50mmol/L的范围。另外，为使离解的Na+浓度达5～1000mmol/L的范围，Na化合物的浓度为5～1000mmol/L的范围，优选为10～300mmol/L的范围。
(显色用试剂)
下面，在最终的显色反应溶液中，将显色用试剂例如稀释2～20倍，优选稀释3～10倍，更加优选稀释4～8倍。这时也与上述相同，各成分的浓度可根据该稀释倍率等适当确定。另外，根据试样中的糖化Hb及产生的过氧化氢的量，通过改变添加量，可以调整反应系统中的各成分的量。
显色用试剂中的测定用FAOD的浓度，例如为1～200KU/L的范围，优选为5～100KU/L的范围。
氧化还原酶的浓度，例如为1～1000KU/L的范围，优选为10～200KU/L的范围。作为上述氧化还原酶，如上所述，例如有POD。
上述显色基质的浓度，例如为0.001～100mmol/L的范围，优选为0.005～10mmol/L的范围，更加优选为0.02～1mmol/L的范围。作为上述显色基质，例如有如上所述的显色基质。
作为上述水性溶剂，没有特别限制，例如有水、含有上述各种缓冲剂的缓冲液等。上述缓冲剂中，优选Tris、磷酸。上述缓冲液的浓度例如为20～1000mmol/L的范围，优选为50～500mmol/L的范围。另外，上述缓冲液的pH例如为pH6～9的范围，优选为6.5～8的范围。
(使用方法)
下面，对使用这种测定试剂盒测定血细胞中的糖化Hb的方法进行说明。
首先，与上述实施方式A-1相同，从全血配制溶血试样，向该溶血试样中添加上述预处理用试剂，使分解用FAOD作用于试样中的糖化氨基酸，进行分解。
通过该分解用FAOD-α的作用，上述溶血试样中含有的α-氨基被糖化的糖化氨基酸、以及上述糖化Hb分解物中α-氨基的糖化部分得到分解。再者，通过上述FAOD-α处理，糖化氨基酸中侧链氨基被糖化的氨基酸没有被分解而残存下来。但是，即使从该侧链被糖化的氨基酸相对于糖化氨基酸总体的比例，及相对于糖化Hb中被糖化的侧链氨基的比例考虑，可以说残存的糖化氨基酸的影响小，可充分提高测定精度。
对于血细胞浓度为30～60体积％的30μL溶血试样而言，上述预处理用试剂的添加量例如为300～3000μL的范围，优选为600～2400μL的范围。对于血细胞浓度1体积％而言，优选添加上述预处理用试剂的预处理反应液使上述分解用FAOD浓度达到10～5000Umol/L的范围。另外，上述处理溶液的pH优选为8～10的范围，更加优选为8.5～10的范围。
该预处理优选从添加上述预处理用试剂开始保温，其条件例如为10～37℃、0.1～20分钟，优选为15～37℃、0.1～5分钟。
再者，该预处理用试剂含有表面活性剂时，例如，没有必要另行进行上述溶血处理来配制溶血试样。即，通过将预处理用试剂添加到全血或血细胞试样中，可以进行表面活性剂的溶血处理和分解用FAOD的糖化氨基酸的分解处理两者。
这种情况，对于血细胞浓度1体积％而言，优选添加上述预处理用试剂的预处理反应液，使上述表面活性剂浓度达到0.05～50mmol/L的范围，更加优选为0.2～30mmol/L的范围，特别优选为0.3～10mmol/L的范围。
另外，上述预处理用试剂含有上述尿酸酶、胆红素氧化酶时，对于血细胞浓度1体积％而言，上述处理用试剂优选使上述尿酸酶浓度达到0.4～4000U/L的范围，胆红素氧化酶浓度达到0.4～4000U/L的范围，更加优选尿酸酶浓度为3～1500U/L的范围，胆红素氧化酶浓度为1～700U/L的范围，特别优选尿酸酶浓度为5～1000U/L的范围，胆红素氧化酶浓度为2～700U/L的范围。
然后，向上述预处理反应液中添加蛋白酶试剂，试样中的糖化Hb在分解用FAOD作用下进行分解。
例如，对于血细胞浓度1体积％的10μL上述预处理反应液而言，蛋白酶试剂的添加量例如为50～300μL的范围，优选为60～180μL的范围。对于血细胞浓度0.1体积％而言，优选添加上述蛋白酶试剂的蛋白酶反应液，使上述蛋白酶浓度达到100～50000KU/L的范围，更加优选为300～30000KU/L的范围。另外，上述蛋白酶反应液的pH优选为6～9的范围，更加优选为7～8.5的范围。
该蛋白酶处理，优选在添加上述蛋白酶试剂开始保温，其条件例如为25～37℃、3～30分钟，优选为25～37℃、3～10分钟，更加优选为30～37℃、3～5分钟。
另外，该蛋白酶试剂含有上述四唑鎓化合物及叠氮化钠时，对于上述蛋白酶浓度为100～10000 KU/L的范围而言，上述蛋白酶反应液，例如，四唑鎓化合物为0.1～10mmol/L的范围，叠氮化钠为0.08～4.0mmol/L的范围，优选四唑鎓化合物为0.6～5mmol/L的范围，叠氮化钠为0.15～1.8mmol/L的范围。具体地说，四唑鎓化合物为WST-3时，优选在蛋白酶反应液中的浓度为0.2～6mmol/L的范围，更加优选为0.6～4mmol/L的范围，特别优选为0.7～2.7mmol/L的范围。这样通过添加四唑鎓化合物及叠氮化钠，与不添加的场合相比，其灵敏度提高约1.2～3倍。
另外，如上所述，该蛋白酶试剂含有金属蛋白酶、进一步含有Ca化合物和Na化合物时，对于上述金属蛋白酶浓度为100～10000KU/L的范围而言，上述蛋白酶反应液，例如，Ca化合物为0.1～50mmol/L的范围，Na化合物为5～1000mmol/L的范围，优选Ca化合物为0.2～10mmol/L的范围，Na化合物为10～500mmol/L的范围，更加优选Ca化合物为0.2～5mmol/L的范围，Na化合物为30～500mmol/L的范围。
然后，向上述蛋白酶反应液中添加上述显色用试剂，使测定用FAOD作用于糖化Hb分解物，通过上述式(1)的反应，生成过氧化氢，其与显色基质通过氧化还原酶反应，通过氧化使上述显色基质显色。
如上所述，测定用的FAOD-αS作用于糖化的α-氨基及糖化的侧链氨基两者。但是，由于预先通过预处理用试剂中的分解用FAOD-α处理，可使测定用FAOD-αS只作用于糖化的侧链氨基。
例如，对于100μL上述蛋白酶反应液而言，显色用试剂的添加量例如为5～100μL的范围，优选为8～50μL的范围，更加优选为10～30μL的范围。添加上述显色用试剂的显色反应溶液，优选测定用FAOD浓度为0.5～200KU/L的范围，氧化还原酶浓度为1～1000KU/L的范围，显色基质的浓度为0.001～100mmol/L的范围，更加优选测定用FAOD浓度为1～100KU/L的范围，氧化还原酶浓度为5～200KU/L的范围，显色基质的浓度为0.005～10mmol/L的范围，更加优选测定用FAOD浓度为2～100KU/L的范围，氧化还原酶浓度为5～200KU/L的范围，显色基质的浓度为0.01～1mmol/L的范围。另外，上述显色反应溶液的pH优选为6～9的范围，更加优选为6.5～8的范围。
该显色反应优选从添加上述显色用试剂开始保温一定时间，其条件例如为15～37℃、1～30分钟，优选为25～37℃、3～10分钟，更加优选为30～37℃、3～5分钟。
然后，测定显色基质的显色。例如，可以用分光光度计测定显色反应溶液的显色程度(吸光度)，由该吸光度确定过氧化氢的量。而且，例如，用预先准备的表示过氧化氢量与糖化Hb量的相关关系的校正曲线和测定的过氧化氢量，可以求出试样中的糖化Hb量。
再者，由于由上述本发明的糖化蛋白质开始添加的分解用FAOD-α生成的过氧化氢因血液试样(溶血试样)中开始存在的过氧化氢酶而消失，所以对测定由FAOD-αS生成的来自测定对象物的过氧化氢没有影响。但是，为了充分消去上述过氧化氢，预处理用试剂中也可以进一步含有过氧化氢酶。这样，通过上述过氧化氢酶消去过氧化氢时，为了防止连通过后面添加的显色用试剂中的测定用FAOD-αS处理生成的过氧化氢也因上述过氧化氢酶而消去，优选显色用试剂中含有过剩量的POD及显色基质。
这种场合，预处理用试剂中的过氧化氢酶浓度，例如为5～300U/L的范围，优选为10～100U/L的范围，更加优选为10～70U/L的范围。另外，上述预处理反应液中的过氧化氢酶浓度，例如为1.5～50U/L的范围，优选为1.5～30U/L的范围，更加优选为1.5～15U/L的范围。上述显色反应溶液中的过氧化氢酶浓度，例如为1～50U/L的范围，优选为1～30U/L的范围，更加优选为1～10U/L的范围。
另外，显色用试剂中的POD浓度，例如为5～1000KU/L的范围，优选为10～200KU/L的范围，更加优选为20～200KU/L的范围。显色反应溶液中的POD浓度，例如为3～300KU/L的范围，优选为5～200KU/L的范围，更加优选为10～100KU/L的范围。
另外，显色反应溶液中的过氧化氢酶(E)与POD(F)的比例(活性比E∶F)，例如为E∶F＝1∶2～1∶40的范围，优选为1∶3～1∶20的范围，更加优选为1∶4～1∶10的范围。
另外，显色用试剂中的显色基质浓度，例如为0.01～200mol/L的范围，优选为0.02～20mol/L的范围，更加优选为0.04～5mol/L的范围。显色反应溶液中的显色基质的浓度，例如为0.001～100mmol/L的范围，优选为0.005～10mmol/L的范围，更加优选为0.01～1mmol/L的范围。
使用该测定试剂盒进行测定时，各试剂的添加不限于上述顺序，也有可以同时添加的试剂。具体地说，例如，在试样中，可以添加预处理用试剂后，同时添加蛋白酶试剂和显色用试剂，也可以同时添加预处理用试剂和蛋白酶试剂后，添加显色用试剂。另外，例如，在试样中，例如也可以添加蛋白酶试剂后，添加预处理用试剂，然后添加显色用试剂。
再者，如果使用本发明的测定试剂盒，也可以快速简便地高精度测定HbAlc量。这是由于使用本发明的测定试剂盒测定的糖化Hb量与HbAlc存在高的相关关系。具体地说，由通过本发明的测定试剂盒测定的糖化Hb量与HbAlc量的相关关系作成校正曲线，通过上述测定试剂盒测定试样中的糖化Hb量，将该测定值代入上述校正曲线中，可以求出HbAlc量。
(实施方式B-2)
该实施方式是预处理用试剂的分解用FAOD和显色用试剂的测定用FAOD使用相同FAOD第2测定试剂盒的一例。作为FAOD，没有特别限制，例如，可以使用FAOD-α、FAOD-S、FAOD-αS之任一种。再者，本实施方式的测定试剂盒，只要没有特别表示，就与上述实施方式B-1相同，另外，可以同样地用于测定糖化Hb。
如上所述，由于FAOD与糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸，通过上述分解用FAOD，糖化氨基酸得到分解。但是，与上述实施方式B-1不同，如果分解用FAOD和测定用FAOD使用相同FAOD，发生以下问题。即，预处理反应液中，在分解用FAOD残存的状态下添加蛋白酶试剂，如果分解上述糖化Hb，残存的FAOD与糖化Hb分解物的糖化部分反应，则发生不能准确测定的问题。因此，使用相同FAOD时，需通过蛋白酶试剂的蛋白酶分解糖化Hb，且使上述预处理反应液中残存的分解用FAOD失活，防止与上述糖化Hb分解物反应。因此，蛋白酶试剂中需含有使预处理试剂的分解用FAOD迅速失活、且只能分解糖化Hb的蛋白酶。
上述蛋白酶的种类及含有量没有特别限制，例如，优选根据使用的FAOD的种类及量、蛋白酶对于FAOD的底物特异性、糖化Hb量等、添加到反应溶液中的稀释比例适当确定。作为这种FAOD与蛋白酶的组合，例如有商品名为FOD(旭化成公司生产)和商品名为Toyoteam(东洋纺公司生产)、上述来自赤霉菌属的FAOD及商品名为Proteinase K(Roche公司生产)的蛋白酶等。
具体地说，对于上述分解用FAOD 100U/L而言，例如，优选添加上述蛋白酶试剂使蛋白酶反应液中的蛋白酶浓度达到1～1000000KU/L的范围，更加优选蛋白酶浓度为10～300000KU/L的范围，特别优选为100～100000KU/L的范围。具体地说，作为蛋白酶，使用胰蛋白酶时，例如，优选添加上述蛋白酶试剂使上述蛋白酶反应液中的胰蛋白酶浓度达到1000～30000KU/L，血细胞浓度达到0.2～5体积％，分解用FAOD浓度达到10～100U/L。另外，作为反应条件，例如，温度为20～50℃，时间为10分钟～20小时，pH为6～9。
另外，本实施方式中，由于通过上述蛋白酶可能连显色用试剂中的测定用FAOD也失活，所以需添加足够量的上述测定用FAOD。
具体地说，对于10000KU/L蛋白酶而言，例如，优选添加上述显色用试剂使测定用FAOD处理的反应溶液中的测定用FAOD浓度达到10～1000000U/L的范围，更加优选添加上述显色用试剂使测定用FAOD浓度达到100～200000U/L的范围，特别优选测定用FAOD浓度达到500～50000U/L的范围。
作为具体的处理条件，例如，优选添加上述显色用试剂使反应液中的测定用FAOD浓度达到500～20000U/L，反应液中的蛋白酶浓度达到100～30000KU/L，反应液中的血细胞浓度达到0.01～1体积％。另外，作为反应条件，例如，温度为15～40℃，时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。
(实施方式B-3)
该实施方式是预处理用试剂的分解用FAOD和显色用试剂的测定用FAOD使用相同FAOD的第3测定试剂盒的一例。但是，该实施方式与上述实施方式B-2不同，无需必须通过蛋白酶使预处理用试剂的分解用FAOD失活。由于酶具有底物特异性，通过蛋白酶与FAOD的组合，有时用蛋白酶难以使FAOD失活。这种情况下，本实施方式的测定试剂盒有效。再者，如果预处理用试剂中的分解用FAOD与糖化Hb分解物反应，由于不能提高测定精度，所以，如下所示，调整预处理用试剂和显色用试剂中的FAOD的添加比例变得重要。
作为上述FAOD，没有特别限制，例如可以使用FAOD-α、FAOD-S、FAOD-αS之任一种。另外，本实施方式的测定试剂盒，只要没有特别表示，就与上述实施方式B-1相同，另外，可以同样地用于测定糖化Hb。
作为适应于这种实施方式的FAOD与蛋白酶的组合，例如有商品名为FOD(旭化成公司生产)及来自赤霉菌属的FAOD(Arkray公司生产，特开平-154672号公报)、商品名为TrypsiN(Sigma公司生产)及商品名为Proteinase K(和光纯药工业公司生产)等。
上述分解用FAOD，即使其活性残存，蛋白酶处理期间，需要在不作用于糖化Hb分解物的范围内添加，而且，由于利用易作用于糖化氨基酸、难作用于糖化蛋白质的性质，优选只作用于糖化氨基酸程度的添加量。
具体地说，预处理用试剂中的分解用FAOD浓度，例如为10～20000U/L的范围，优选为20～10000U/L的范围，更加优选为100～5000U/L的范围。显色用试剂中的测定用FAOD浓度为0.5～200KU/L的范围，优选为1～100KU/L的范围，更加优选为2～100KU/L的范围。
而且，例如，优选添加上述预处理试剂，使预处理反应液中分解用FAOD浓度达到10～5000U/L，血细胞浓度达到0.2～20体积％。
使用该测定试剂盒时，含有分解用FAOD的预处理用试剂进行的处理，由于利用FAOD易作用于糖化氨基酸、难作用于糖化蛋白质的性质，例如，优选只作用于糖化氨基酸程度的反应时间。具体地说，优选反应温度为20～37℃，反应时间为1分钟～60分钟，更加优选反应温度为25～37℃，反应时间为2分钟～30小时，特别优选反应温度为30～37℃，反应时间为3分钟～10小时。
本实施方式中，例如，优选添加上述预处理用试剂及显色用试剂使显色反应溶液中的分解用FAOD(G)与测定用FAOD(H)的比例(活性比G∶H)达到G∶H＝1∶3～1∶100的范围，更加优选为G∶H＝1∶5～1∶50的范围，特别优选为G∶H＝1∶10～1∶40的范围。如果这样设定，与上述实施方式2不同，蛋白酶反应溶液中残存上述分解用FAOD，但是由于该残存的FAOD的反应速度非常慢，蛋白酶处理工序中，残存FAOD作用于生成的糖化Hb分解物没有达到影响测定的程度。
(实施方式B-4)
该实施方式是作为显色用试剂的显色基质，使用DA-64的例子。再者，本实施方式的测定试剂盒，只要没有特别表示，就与上述实施方式B-1组成相同，另外，可以同样地用于测定糖化Hb。
如上所述，为了提高测定灵敏度，蛋白酶试剂含有四唑鎓化合物和叠氮化钠，显色用试剂含有显色基质DA-64时，显色反应溶液中，由于上述四唑鎓化合物、叠氮化钠及DA-64共存，如上所述，DA-64发生误显色。因此，为了防止该误显色，优选设定以下组成。
优选预处理用试剂、蛋白酶试剂及显色用试剂中至少任一者含有表面活性剂。作为上述表面活性剂，例如可以使用上述表面活性剂。
使预处理用试剂中含有时，其浓度为0.03～200mmol/L的范围，优选为0.1～50mmol/L的范围。使蛋白酶试剂中含有时，其浓度为0.01～50mmol/L的范围，优选为0.05～20mmol/L的范围。使显色用试剂中含有时，其浓度为0.06～30mol/L的范围，优选为0.1～20mol/L的范围。
而且，为使显色反应溶液中的各成分达到以下的浓度范围，可以添加测定试剂盒的各试剂。上述显色反应溶液中，例如，优选DA-64为0.001～100mmol/L，表面活性剂为0.002～50mmol/L，四唑鎓化合物为0.1～10mmol/L，叠氮化钠为0.08～4mmol/L的范围，更加优选DA-64为0.005～10mmol/L，表面活性剂为0.005～20mmol/L，四唑鎓化合物为0.6～5mmol/L，叠氮化钠为0.15～1.8mmol/L的范围，特别优选DA-64为0.01～1mmol/L，表面活性剂为0.02～10mmol/L，四唑鎓化合物为0.7～2.7mmol/L，叠氮化钠为0.2～1.5mmol/L的范围。
另外，该显色反应溶液的pH优选为6.0～9.0的范围，更加优选为6.5～8.5的范围，特别优选为7.0～8.0的范围。
由于上述DA-64通过氧化还原反应显色，关于该反应液，例如，如果用分光光度计测定检测波长650～750nm范围的吸光度(显色程度)，可以测定过氧化氢的量。
实施例
(实施例1)
从患者采集全血试样(患者数163名)，使红细胞自然沉降回收。而且，向10μL该沉降的红细胞部分中添加600μL下述预处理用试剂，配制溶血试样(n＝163)。再者，该试样由于使用使红细胞自然沉降的部分，所以也含有血浆。
(预处理用试剂：pH 9.4)
CHAPS 50mmol/L
表面活性剂(商品名NIKKOL-BL9EX， 9g/L
Nikko Chemical公司生产)
FAOD(商品名FAOX，Kikkoman公司生产) 1KU/L
然后，将得到的20μL溶血试样与76μL下述蛋白酶试剂混合，于37℃下保温5分钟。接着，再添加19μL下述显色试剂，于37℃下保温3分钟，测定这时的波长751nm及波长571nm处的吸光度。测定吸光度使用自动分析装置(商品名JCA-BM8、日本电子公司制造)。
(蛋白酶试剂：pH 5.5)
四唑鎓化合物(商品名WST-3，同仁化学公司生产) 2mmol/L
NaN3 0.6mmol/L
NaCl 100mmol/L
CaCl2 2mmol/L
中性蛋白酶(Arkray公司生产) 4MU/L
MES 1mmol/L
(显色试剂：pH 7.0)
商品名DA-64(和光纯药工业公司生产) 80μmol/L
FAOD(Arkray株式会社生产) 36KU/L
Tris-HCl 380mmol/L
NaN3 0.5mmol/L
而且，将测定的各吸光度代入预先作成的表示Hb浓度(g/L)或HbAlc浓度(g/L)与吸光度的关系的各校正曲线，求出HbAlc浓度及Hb浓度，根据下式算出HbAlc％。再者，Hb浓度可以由波长751nm处的吸光度求出，HbAlc浓度可以由波长571nm处的吸光度求出。
HbAlc(％)＝(HbAlc浓度/Hb浓度)×100
再者，上述校正曲线通过下述方法作成。首先，关于Hb浓度为已知的各种浓度的标准液，通过使用HbAlc测定装置(商品名HA-8150：Arkray公司制造)的HPLC法测定HbAlc浓度及Hb浓度。另一方面，关于上述各标准液，通过与上述实施例同样的测定方法，测定与Hb浓度和HbAlc浓度相当的吸光度。而且，由上述自动测定仪得到的测定值和上述吸光度作成一次回归式，将其作为校正曲线。
另外，作为对照例，将上述实施例1中配制的溶血试样(n＝163)作为试样，使用通过上述HPLC法测定的值。
以上结果如图1所示。该图是表示通过酶法测定的实施例1的HbAlc(％)与通过HPLC法的对照例HbAlc(％)的关系图。该图中，实施例的相关式为“y＝1.031x-0.09”，相关系数为“0.981”。
这样，根据本发明的实施例，得到与对照例的值非常接近的值，由于其相关系数(0.981)也非常高，因此可知可以优良的精度测定糖化Hb。
产业上的可利用性
如上所述，本发明的糖化蛋白质的测定方法及测定试剂盒，由于排除共存的糖化氨基酸的影响，测定精度优良。因此，如果将本发明例如应用于测定红细胞中的糖化Hb、HbAlc，可以得到比以往可靠性高的测定值，所以，进一步提高糖化Hb和HbAlc作为糖尿病诊断等的指标物质的重要性。
R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2→R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2 …(1)
上述式(1)中，R1表示羟基或来自糖化反应前的糖的残基(糖残基)。当反应前的糖为醛糖时，上述糖残基(R1)为醛糖残基，而反应前的糖为酮糖时，则为酮糖残基。例如，当反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多利(Amadori)重排，使反应后的结构为果糖结构，但此时，糖残基(R1)变成葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R1)例如可以用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，n为0～6的整数。
上述式(1)中，R2没有特别限制，但是，在糖化胺为糖化氨基酸或糖化肽(包括糖化蛋白质)的场合、α-氨基被糖化的场合、除此以外的氨基(氨基酸侧链的氨基)被糖化的场合是不同的。
上述式(1)中，α-氨基被糖化的场合，R2为下式(2)表示的氨基酸残基或肽残基。在这种情况下，特异性催化上式(1)的反应的是上述FAOD-α和FAOD-αS。
-CHR3-CO-R4 …(2)
上述式(2)中，R3表示氨基酸侧基，R4表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(3)表示。下式(3)中，n为0以上的整数，R3与上述相同，表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以完全相同，也可以不同。
-(NH-CR3H-CO)n-OH …(3)
另外，上述式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸侧基被糖化)的场合，R2可以用下式(4)表示。在这种场合，特异性催化上式(1)的反应的是上述FAOD-S和FAOD-αS。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7 …(4)
上述式(4)中，R5表示氨基酸侧基中被糖化的氨基以外的部分。例如，被糖化的氨基酸为赖氨酸时，R5为-CH2-CH2-CH2-CH2-，例如，被糖化的氨基酸为精氨酸时，R5为-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
另外，上述式(4)中，R6为氢、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(5)表示。再者，下式(5)中，n为0以上的整数，R3与上述相同，表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以完全相同，也可以不同。
-(CO-CR3H-NH)n-H …(5)
另外，上述式(4)中，R7为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(6)表示。再者，下式(6)中，n为0以上的整数，R3与上述相同，表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以完全相同，也可以不同。
-(NH-CHR3-CO)n-OH …(6)
作为特异性作用于上述糖化α-氨基的FAOD-α，例如可列举，市售的商品名为Fructosyl-Amino Acid Oxidase(FAOX-E)(Kikkoman公司生产)、来自青霉属的FAOD(特开平8-336386号公报)等。作为特异性作用于上述糖化的氨基酸侧链的FAOD-S，例如有来自镰刀菌属的FAOD(日本生物工学会大会平成12年度“来自镰刀菌的氨基酸氧化酶的底物特异性转化；藤原真纪等”)等。另外，作为作用于上述糖化α-氨基及糖化氨基酸侧基两者的FAOD-αS，例如有市售的商品名为FOD(旭化成公司生产)、来自赤霉菌属的FAOD(特开平8-154672号公报)、来自镰刀菌属的FAOD(特开平7-289253号公报)、来自曲霉属的FAOD(WO 99/20039)等。
作为本发明中的四唑鎓化合物，例如，优选为在四唑环的至少2个位置上具有环结构取代基的结构，更加优选为在3个位置上具有环结构取代基的结构。
上述四唑鎓化合物，如上所述，在上述四唑环的至少2个位置上具有环结构取代基的场合，优选在上述四唑环的2位及3位上有上述取代基。另外，当四唑鎓化合物在3个位置上具有环结构取代基时，优选在上述四唑环的2位、3位及5位上具有上述取代基。
另外，四唑鎓化合物优选至少2个环结构取代基的环结构为苯环。作为除了上述苯环以外的环结构取代基，例如可举出，在环骨架中含有S或O、且为共振结构的取代基，例如，噻吩基、噻唑基等。
另外，上述四唑鎓化合物优选在四唑环的至少3个位置上具有环结构取代基，上述环结构取代基的至少2个环结构取代基的环结构为苯环。
另外，优选至少1个环结构取代基具有官能团，更加优选上述官能团的数目多。
作为上述官能团，优选为吸电子性官能团，例如有卤素基、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基、磺基等。其他例如有氢过氧基、氧基(oxy)、环氧基、环二氧基、氧代基(oxo)等含氧的特性基及巯基、烷硫基、甲基硫甲基、硫代基、亚磺基、苯磺酰基(benzenesulfonyl)、苯基磺酰基(phenylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(p-toluenesulfonyl)、对甲苯基磺酰基(p-tolylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(tosyl)、氨磺酰基、异硫氰酸酯基等含硫的特性基等。这些吸电子性官能团中，优选硝基、磺基、卤素基、羧基、羟基、甲氧基、乙氧基。另外，除了上述吸电子性官能团外，例如还有苯基(C6H5-)、苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)等不饱和烃基等。再者，上述官能团也可以通过离解而离子化。
上述四唑鎓化合物优选在四唑环的2位及3位上具有苯环，上述苯环中的至少一个具有选自卤素基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基及乙氧基的至少1种官能团。再者，上述两个苯环具有上述官能团也可以。上述苯环中，在任一位置(邻位、间位、对位)上有上述官能团也可以。另外，对官能团的数目没有特别限制，可以具有相同的官能团，也可以具有不同的官能团。
上述四唑鎓化合物，例如，作为在上述四唑环的2位、3位及5位上具有苯环结构取代基的化合物，例如可以举出，2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐(以下也称作WST-3)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3，3’-(1，1’-联苯-4，4’-二基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯)-4，4’-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐]、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)-四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓盐及2，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓盐等。
另外，上述四唑鎓化合物并不限于上述那些化合物，除此之外，也可以使用在上述四唑环的2个位置上具有苯环结构取代基及1个位置上具有其他的环结构取代基的化合物，例如有2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓盐、2，2’-二苯并噻唑-5，5’-双[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-亚联苯基)二四唑鎓盐及3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。
另外，也可以使用在上述四唑环的2个位置上有苯环结构取代基及1个位置上有非环结构取代基的四唑鎓化合物，例如有2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐等。
上述四唑鎓化合物中，如上所述，优选具有3个环结构取代基的化合物，更加优选有3个环结构为苯环的取代基，且含有较多吸电子性官能团的化合物，特别优选WST-3。再者，这样的四唑鎓化合物，例如可以是盐，也可以是离子化的状态等。另外，该四唑鎓化合物可以使用一种，也可以2种以上并用。
下面关于本发明的糖化蛋白质的测定方法，以测定血细胞中的糖化Hb为例在下述实施方式A-1～A-5中进行说明。
(实施方式A-1)
该实施方式是分解上述糖化氨基酸使用FAOD-α、测定糖化Hb使用FAOD-αS，在四唑鎓化合物及叠氮化钠存在下，进行上述氧化还原反应的例子。
首先，将全血直接溶血，或用离心分离等常用方法从全血分离出血细胞成分，将其溶血，配制溶血试样。该溶血方法没有特别限制，例如，可以使用采用表面活性剂的方法、采用超声波的方法、利用渗透压差的方法等。其中，从操作的简便性等的理由看，上述采用表面活性剂的方法是优选的。
作为上述表面活性剂，例如，可以使用聚氧乙烯对叔辛基苯基醚(Triton类表面活性剂等)、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯(Tween类表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij类表面活性剂等)非离子型表面活性剂，具体例如有TritonX-100、Tween-20、Brij35等。上述采用表面活性剂的处理条件，通常，当处理溶液中的血细胞浓度为1～10体积％时，添加上述表面活性剂使得在上述处理溶液中的浓度达0.01～5重量％，室温下，搅拌数秒(约5秒)～10分钟。
然后，在上述溶血试样中，添加四唑鎓化合物及叠氮化钠。
例如，当处理溶液中的血细胞浓度为0.2～2体积％时，优选添加上述四唑鎓化合物使浓度达到0.005～400mmol/L的范围，更加优选0.02～100mmol/L的范围，特别优选0.1～50mmol/L的范围。具体地说，上述四唑鎓化合物为WST-3时，优选添加以使浓度达到0.004～16mmol/L的范围，更加优选0.02～10mmol/L的范围，特别优选0.1～5mmol/L的范围。再者，上述四唑鎓化合物可以使用一种，也可以2种以上并用。这样，通过添加四唑鎓化合物及叠氮化钠，与不添加的场合相比，其灵敏度提高约1.2～3倍。
另外，上述四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的添加比例(摩尔比C∶D)，例如为C∶D＝20∶3～20∶12的范围，优选为20∶5～20∶11的范围，更加优选为20∶6～20∶10的范围。
上述四唑鎓化合物和叠氮化钠可以直接添加到上述溶血试样中。但是，从操作的简便性等观点来看，优选使用溶解在溶剂中的四唑鎓化合物溶液和叠氮化钠溶液，或使用含有四唑鎓化合物和叠氮化钠两者的溶液(四唑鎓化合物·叠氮化钠混合液)。
上述各种溶液中的四唑鎓化合物或叠氮化钠的浓度，可以根据添加到上述溶血试样时的稀释倍率等适当确定，四唑鎓化合物的浓度例如为0.1～10mmol/L的范围，优选为0.6～5mmol/L的范围，更加优选为0.7～2.7mmol/L的范围。叠氮化钠的浓度例如为0.1～4mmol/L的范围，优选为0.15～1.8mmol/L的范围，更加优选为0.2～1.5mmol/L的范围。另外，上述混合液的场合，四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的配合比例(摩尔比C∶D)为C∶D＝20∶3～20∶12的范围，优选为20∶5～20∶11的范围，更加优选为20∶6～20∶10的范围。
作为上述溶液的溶剂，例如可以使用MOPS、MES、MOPSO、DIPSO、TES、POPSO、HEPES、磷酸等缓冲液，优选为MOPS、MES。上述溶剂的pH，例如为5.0～7.0的范围，优选为5.5～6.5的范围。另外，上述缓冲液的浓度，例如为0.1mmol/L～10mmol/L的范围，优选为1～5mmol/L的范围，更加优选为1～3mmol/L的范围。添加到上述溶血试样的场合的处理溶液的最终浓度，例如为0.7～9mmol/L的范围，优选为0.8～4.5mmol/L的范围，更加优选为0.8～2.7mmol/L的范围。
另外，由于可进一步提高灵敏度，优选将配制的上述四唑鎓化合物·叠氮化钠混合液在添加到上述溶血试样之前通过放置一定时间进行老化。通过该老化处理，与不老化的场合相比，灵敏度例如提高约1.2～3倍。
上述老化中，例如，处理温度优选为40～60℃的范围，更加优选为50～60℃的范围。处理时间例如为6～72小时的范围，优选为15～20小时的范围。
对于上述溶血试样，直接或作为上述溶液添加四唑鎓化合物及叠氮化钠后，通常，处理温度为40～60℃的范围，保温6～72小时，进行上述试样的预处理。试样通过用四唑鎓化合物及叠氮化钠预处理，如上所述，在可以提高灵敏度的同时，通过四唑鎓化合物可以排除上述试样中含有的还原物质等对氧化还原反应的影响，也可提高测定精度。这样，四唑鎓化合物也有助于提高测定精度，本发明的目的之一是为了提高测定精度，不只是四唑鎓化合物，也需要叠氮化钠共存，据此本发明可达到特有的效果。
接着，将添加了四唑鎓化合物及叠氮化钠的预处理过的溶血试样进行蛋白酶处理。因为这样用于后面的处理的FAOD易作用于测定对象物。另外，如上所述，因为在四唑鎓化合物存在下进行蛋白酶处理，糖化Hb的分解也可以快速进行。
作为上述蛋白酶，例如可以使用丝氨酸蛋白酶、硫赶蛋白酶(thiolproteases)、金属蛋白酶等，具体地说，可以使用胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶等，优选选择性分解上述糖化Hb的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来自猪胰腺的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来自枯草杆菌的蛋白酶等。作为上述来自枯草杆菌的蛋白酶，例如有商品名为Protease N(例如Fulka公司生产)、商品名为Protease N“Amano”(天野制药公司生产)等。作为上述金属蛋白酶，例如有来自芽孢杆菌属的金属蛋白酶(EC 3.4.24.4)(例如，东洋纺公司生产：商品名为Toyoteam)等。其中更加优选金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，特别优选金属蛋白酶。这样，如果使用选择性分解的蛋白酶，可以选择性调制糖化Hb分解物。上述蛋白酶处理通常在缓冲液中进行，其处理条件根据使用的蛋白酶的种类、糖化Hb的浓度等适当确定。
作为上述缓冲液，例如可以使用CHES缓冲液、CAPSO缓冲液、CAPS缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、EPPS缓冲液、HEPES缓冲液等。其pH例如为6～13的范围，优选为8～12的范围，更加优选为9～11的范围。另外，蛋白酶处理溶液中的上述缓冲液的最终浓度例如为1.0～10mmol/L的范围。
具体地说，例如，作为上述蛋白酶，使用金属蛋白酶处理上述预处理过的溶血试样时，通常，反应液中的金属蛋白酶浓度为0.1～40MU/L，反应液中的血细胞浓度为0.05～15体积％，反应温度为15～37℃，反应时间为1分钟～24小时，pH为6～12的范围。
另外，例如，作为上述蛋白酶，使用蛋白酶K处理上述预处理过的溶血试样时，通常，反应液中的蛋白酶浓度为10～300KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.05～15体积％，反应温度为15～37℃，反应时间为1分钟～24小时，pH为6～12的范围。另外，上述缓冲液的种类也没有特别限制，例如可以使用Tris-盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液等。
然后，将上述蛋白酶处理的溶血试样用催化上述式(1)的反应，具体地说是催化下式(7)的反应的FAOD-α(分解用FAOD)处理。
R1-CO-CH2-NH-CHR3-COOH+H2O+O2
→R1-CO-CHO+NH2-CHR3-COOH+H2O2 …(7)
上述式(7)中，R1表示与上述相同的糖残基，R3表示与上述相同的氨基酸侧链。
通过该处理，上述溶血试样中含有的α-氨基被糖化的糖化氨基酸以及上述糖化Hb分解物中α-氨基的糖化部分得到分解。
再者，通过上述FAOD-α处理，糖化氨基酸中侧链氨基被糖化的氨基酸没有被分解而残存下来。但是，即使从该侧链被糖化的氨基酸相对于糖化氨基酸总体的比例，及相对于糖化Hb中具有糖化的侧链氨基的氨基酸残基的比例考虑，可以说残存的糖化氨基酸的影响小，可充分提高测定精度。
作为处理条件，例如，反应液中的FAOD-α浓度为10～5000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.5～20体积％，反应温度为20～50℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。该处理通常在缓冲液中进行，可以使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。
然后，将上述FAOD-α处理的上述溶血试样进一步用FAOD-αS处理。如上所述，该FAOD-αS作用于糖化的α-氨基及糖化的侧链氨基两者。但是，由于糖化Hb分解物预先通过分解用FAOD-α处理，所以可使测定用FAOD-αS只作用于糖化侧链氨基。
该FAOD-αS处理优选在与上述蛋白酶处理相同的缓冲液中进行，作为上述缓冲液，没有特别限制，可以使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。
作为处理条件，例如，反应液中的FAOD-αS浓度为10～30000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.1～5体积％，反应温度为20～50℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。
接着，将用上述FAOD-αS处理生成的过氧化氢使用氧化酶及显色基质通过进一步氧化还原反应进行测定。
作为上述显色基质，例如有DA-64、邻苯二胺(OPD)、Trinder试剂与4-氨基安替比林组合的基质等。作为上述Trinder试剂，例如有苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除了上述氨基安替比林之外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。这些显色性基质中，如上所述，特别优选DA-64。
作为上述氧化酶，例如优选POD。
上述氧化还原反应通常在缓冲液中进行，其条件根据上述生成的过氧化氢的浓度等适当确定。通常，反应液中的POD浓度为10～100000IU/L，显色基质浓度为0.005～30mmol/L，反应温度为15～37℃，反应时间为0.1～30分钟，pH为5～9。另外，上述缓冲液没有特别限制，例如，可以使用与上述蛋白酶处理及FAOD处理等相同的缓冲液等。
上述氧化还原反应中，例如，使用上述显色基质时，通过用分光光度计测定上述反应液的显色程度(吸光度)，可以测定过氧化氢的量。而且，例如，用预先准备的表示过氧化氢量与糖化Hb量的相关关系的校正曲线和测定的过氧化氢量，可以求出试样中的糖化Hb量。
再者，由于由开始添加的分解用FAOD-α生成的过氧化氢因血液试样(溶血试样)中开始存在的过氧化氢酶而消失，所以对测定来自通过FAOD-αS生成的测定对象物的过氧化氢没有影响。另外，也可以添加过氧化氢酶使之消失。这样，通过上述过氧化氢酶消去过氧化氢时，为了防止连后面进行的用测定用FAOD-αS处理生成的过氧化氢也消去，优选与添加FAOD-αS一起添加过剩量的POD及显色性基质。这种场合，相对于上述过氧化氢酶的添加量(U)，例如优选添加POD 5～100倍的活性(U)量。
另外，用分解用FAOD处理溶血试样时，例如，也可以进一步添加尿酸酶、胆红素氧化酶进行同样的处理。这样，如果用尿酸酶处理，可以进一步分解上述试样中含有的尿酸，另外，如果用胆红素氧化酶处理，可以分解胆红素。由于该尿酸和胆红素具有还原力，通过这种处理，可进一步除去还原物质带来的影响，可以提高测定精度。
上述尿酸酶或胆红素氧化酶的添加比例，反应液中的血细胞浓度为0.2～2体积％时，例如，上述反应液中的尿酸酶浓度为0.1～5000U/L，胆红素氧化酶浓度为0.1～5000U/L，优选尿酸酶浓度为1～2000U/L，胆红素氧化酶浓度为0.5～1000U/L，更加优选尿酸酶浓度为5～1000U/L，胆红素氧化酶浓度为2～1000U/L。另外，作为其处理条件，例如，可以与上述分解用FAOD同样地进行。
该测定中，如上所述，上述蛋白酶处理不限于在上述分解用FAOD-α处理前进行，例如，也可以在上述FAOD-α处理后进行。如上所述，上述蛋白酶处理是为了使FAOD易作用而进行的，由于上述FAOD-α处理是以分解糖化氨基酸为目的而进行的，所以，FAOD-α处理前即使糖化Hb通过蛋白酶没有被分解，也可以充分得到本发明的效果。
另外，本发明的测定方法，不限于本实施方式的操作顺序，例如，也有可以同时进行的工序。例如，溶血处理、四唑鎓化合物及叠氮化钠处理和分解用FAOD处理可以同时进行，另外，蛋白酶处理与四唑鎓化合物及叠氮化钠处理也可以同时进行。再者，不限于这些组合。
再者，上述过氧化氢量，除了采用上述POD等的酶方法外，例如，也可以通过电学方法测定。
(实施方式A-2)
该实施方式是分解糖化氨基酸和测定糖化Hb使用相同FAOD的例子。作为FAOD没有特别限制，例如，可以使用FAOD-α、FAOD-S、FAOD-αS之任一种。再者，只要没有特别表示，就与上述实施方式A-1同样地进行测定。
在添加了四唑鎓化合物及叠氮化钠的预处理过的溶血试样中添加分解用FAOD。
作为具体的处理条件，例如，反应液中的分解用FAOD浓度为10～5000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.5～20体积％，反应温度为20～50℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。该处理通常在缓冲液中进行，可以使用与上述相同的缓冲液。
然后，对分解用FAOD处理的试样进行蛋白酶处理。该蛋白酶处理的第1个目的，与上述相同，是为了分解来自血细胞的糖化Hb，使后面的工序中进一步添加的测定用FAOD易作用。而且，第2个目的是为了使上述分解用FAOD消化失活。
由于FAOD与糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸，所以上述分解用FAOD处理时，糖化氨基酸得到分解。但是，该分解用FAOD处于残存的状态，如果将上述糖化Hb进行蛋白酶处理，残存的分解用FAOD与糖化Hb分解物的糖化部分发生反应，存在不能准确测定的问题。因此，用蛋白酶使该残存的分解用FAOD失活，防止与上述糖化Hb分解物反应。因此，需要添加使开始添加的分解用FAOD迅速失活、且只能分解糖化Hb的蛋白酶。
作为上述蛋白酶，没有特别限制，可以使用与上述相同的蛋白酶。另外，其处理条件，例如，根据使用的蛋白酶的种类、糖化Hb的浓度、分解用FAOD的种类及其量等适当确定。
对于分解用FAOD 100U/L而言，蛋白酶处理的反应溶液中的蛋白酶的添加量例如为1～1000000KU/L的范围，优选为10～300000KU/L的范围，更加优选为100～100000KU/L的范围。
具体地说，作为蛋白酶，使用胰蛋白酶处理上述试样时，例如，反应液中的蛋白酶浓度为1000～30000KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.2～5体积％，反应液中的FAOD浓度为10～1000U/L，反应温度为20～50℃，反应时间为10分钟～20小时，pH为6～9的范围。
然后，向通过上述蛋白酶处理得到的糖化Hb分解物中添加与分解用FAOD相同的FAOD，作为再度测定用FAOD进行处理。由于该测定用FAOD可能因上述蛋白酶而失活，所以需添加足够量。
该测定用FAOD处理与上述相同，也优选在缓冲液中进行。作为上述缓冲液，没有特别限制，可以使用与上述蛋白酶处理同样的缓冲液。
对于蛋白酶10000KU/L而言，测定用FAOD处理的反应溶液中的测定用FAOD的添加量例如为10～1000000U/L的范围，优选为100～200000U/L的范围，更加优选为500～50000U/L的范围。
作为具体的处理条件，例如，反应液中的测定用FAOD浓度为500～20000U/L，反应液中的蛋白酶浓度为100～30000KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.01～1体积％，反应温度为15～40℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。
(实施方式A-3)
该实施方式是分解糖化氨基酸和测定糖化Hb使用相同FAOD的例子。只要没有特别表示，就与上述实施方式A-1同样地进行测定。
但是，该实施方式与上述实施方式A-2不同，为没有必要必须用蛋白酶使分解用FAOD失活的实施方式。由于酶有底物特异性，根据蛋白酶和FAOD的组合，有时出现用蛋白酶难以使FAOD失活的情况。在这种场合，本实施方式的方法有效。再者，如果开始添加的分解用FAOD与通过蛋白酶生成的糖化Hb分解物反应，由于不能提高测定精度，所以，如下所述，调整FAOD的添加比例变得重要。
在添加了四唑鎓化合物及叠氮化钠的预处理过的溶血试样中添加分解用FAOD。
用蛋白酶难以使分解用FAOD失活时，即使其活性残存，蛋白酶处理期间，需要在不作用于生成的糖化Hb分解物的范围内添加。另外，由于利用FAOD易作用于糖化氨基酸、难作用于糖化蛋白质的性质，所以优选只作用于糖化氨基酸程度的添加量和反应时间。
作为FAOD处理的条件，例如，反应液中的FAOD浓度为10～5000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.2～20体积％，反应温度为20～50℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。该处理通常在缓冲液中进行，可以使用与上述相同的缓冲液。
然后，对上述FAOD处理的试样进行蛋白酶处理。如上所述，由于该实施方式是蛋白酶难以作用于上述FAOD的场合的例子，所以蛋白酶的添加量没有特别限制。
作为上述蛋白酶没有特别限制，可以使用与上述同样的蛋白酶。其处理条件与上述相同，根据使用的蛋白酶的种类、糖化Hb的浓度、使用的蛋白酶对FAOD的底物特异性等适当确定。
作为适应于这种实施方式的FAOD与蛋白酶的组合，例如有商品名为FOD(旭化成公司生产)和商品名为Toyoteam(东洋纺公司生产)、上述来自赤霉菌属的FAOD及商品名为Proteinase K(Roche公司生产)的蛋白酶等。
作为蛋白酶，使用胰蛋白酶处理上述试样时，例如，反应液中的蛋白酶浓度为100～6000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.2～5体积％，反应液中的FAOD浓度为1～100U/L，反应温度为20～50℃，反应时间为10分钟～20小时，pH为6～9的范围。
接下来，向通过上述蛋白酶处理得到的分解物中再次添加相同的FAOD作为测定用FAOD。
该测定用FAOD处理与上述相同，也优选在缓冲液中进行，作为上述缓冲液，没有特别限制，可以使用与上述蛋白酶处理同样的缓冲液。
这样，本实施方式中，分解用FAOD(A)与测定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)，例如，如上所述，为A∶B＝1∶50000～1∶10的范围，优选为1∶5000～1∶25的范围，更加优选为1∶500～1∶50的范围。如果这样设定，与上述实施方式A-2不同，反应液中残存上述分解用FAOD，但是由于该残存的FAOD的反应速度非常慢，蛋白酶处理工序中，残存FAOD作用于生成的糖化Hb分解物没有达到影响测定的程度。
作为处理条件，例如，反应液中的测定用FAOD浓度为500～20000U/L，反应液中的蛋白酶浓度为100～30000KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.01～1体积％，反应温度为15～40℃，反应时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。
(实施方式A-4)
该实施方式是显色基质使用DA-64，测定通过上述测定用FAOD处理生成的过氧化氢的例子。再者，只要没有特别表示，就与上述实施方式A-1同样地进行测定。
显色基质使用DA-64时，为了防止DA-64的误显色，将DA-64、四唑鎓化合物、叠氮化钠及表面活性剂在上述氧化还原反应溶液中的终浓度分别设定为以下范围。通常，各成分的终浓度为DA-64为1～10000μmol/L，表面活性剂为0.01～200mmol/L，四唑鎓化合物为0.05～20mmol/L，叠氮化钠为0.01～5mmol/L的范围，优选DA-64为2～1000μmol/L，表面活性剂为0.05～30mmol/L，四唑鎓化合物为0.01～10mmol/L，叠氮化钠为0.02～2mmol/L的范围，更加优选DA-64为3～300μmol/L，表面活性剂为0.1～10mmol/L，四唑鎓化合物为0.5～8mmol/L，叠氮化钠为0.08～0.8mmol/L的范围。作为上述表面活性剂，没有特别限制，例如，可以使用上述及后述的表面活性剂。
该氧化还原反应溶液的pH优选为6.0～10.0的范围，更加优选为6.5～9.0的范围，特别优选为7.0～8.5的范围。
上述表面活性剂的添加例如可以在添加DA-64之前或同时进行，如果为配制溶血试样添加表面活性剂时，也可以预先添加，使氧化还原反应时表面活性剂达到上述浓度范围。
上述DA-64由于通过氧化还原反应而显色，关于该反应液，例如，如果用分光光度计测定检测波长600～780nm范围的吸光度(显色程度)，可以测定过氧化氢的量。
(实施方式A-5)
下面，关于本发明的Hb糖化率的测定方法，举以全血作为试样时的例子进行说明。
首先，与上述实施方式A-1相同，将全血溶血，测定溶血试样中的糖化Hb量，另一方面，测定上述溶血试样中的Hb量。
例如可如以下所示测定Hb量。首先，向上述溶血试样中添加上述四唑鎓化合物，使Hb变性。其添加比例，例如，当上述溶血试样中的血细胞浓度为0.2～2体积％时，优选添加以使浓度达到0.005～400mmol/L的范围，更加优选为0.02～100mmol/L的范围，特别优选为0.1～50mmol/L的范围。具体地说，上述四唑鎓化合物为WST-3时，优选添加以使浓度达到0.004～16mmol/L的范围，更加优选为0.02～10mmol/L的范围，特别优选为0.1～5mmol/L的范围。
上述四唑鎓化合物也可以直接使用，但从操作的简便性和处理效率等方面来看，优选使用溶解在溶剂中的四唑鎓化合物溶液。上述溶液的浓度根据四唑鎓化合物的种类(例如分子量等)等适当确定，例如为0.01～120mmol/L的范围，优选为0.1～50mmol/L的范围，更加优选为0.2～20mmol/L的范围。作为上述溶剂，例如可以使用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等，作为上述缓冲液，例如可以使用上述缓冲液。再者，上述四唑鎓化合物可以使用一种，也可以2种以上并用。
对采用上述四唑鎓化合物的处理条件没有特别限制，例如温度为4～50℃的范围，处理时间为20秒～60分钟的范围，优选温度为15～40℃的范围，处理时间为20秒～20分钟的范围，更加优选温度为25～37℃的范围，处理时间为30秒～6分钟的范围。
另外，该四唑鎓化合物处理优选在表面活性剂存在下进行。因为这样可以进一步促进Hb的变性。因此，从操作的简便性等来看，在上述试样溶血时，预先添加四唑鎓化合物也可以。
作为上述表面活性剂，例如可以使用聚氧乙烯醚、聚氧乙烯苯酚醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯、聚氧乙烯烷基醚等。优选聚氧乙烯醚等。该聚氧乙烯醚[CLHM-O-(CH2CH2O)NH]是聚氧乙烯链与烃链进行醚键合，作为上述烃链例如有烷基、烷基苯基等。优选上述聚氧乙烯链的重均聚合度(N)为8～23的范围，另一方的烃链的碳数(L)为8～18的范围，更加优选上述重均聚合度(N)为8～15的范围，烃链的碳数(L)为8～16的范围，特别优选上述重均聚合度(N)为8～10的范围，烃链的碳数(L)为8～14的范围。另外，上述烃链，例如，可以是直链，也可以有支链。作为上述聚氧乙烯醚的具体例子，例如有聚氧乙烯对叔辛基苯基醚、聚乙二醇(10)月桂醚、聚乙二醇(9)月桂醚等。
更具体地说，例如可以使用市售的Triton类表面活性剂聚氧乙烯对叔辛基苯基醚等、市售的Tween类表面活性剂聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯等、市售的Brij类表面活性剂聚氧乙烯烷基醚等。除此以外，例如，也可以使用聚氧乙烯(10)月桂醚、商品名Nikkol BL-9EX(聚氧乙烯的重均聚合度N为9，和光纯药工业公司生产)等之类的聚氧乙烯(9)月桂醚、商品名Tergitol NPX(聚氧乙烯的重均聚合度N为约10.5，Nacalai Tesque公司生产)及商品名Tergitol NP-40(聚氧乙烯的重均聚合度N为20，Nacalai Tesque公司生产)等之类的聚氧乙烯辛基苯基醚等。再者，这些表面活性剂也可以作为溶血用的表面活性剂使用。
表面活性剂的添加量没有特别限制，例如上述溶血试样中的血细胞浓度为0.2～1体积％时，优选添加以使浓度达到0.05～50mmol/L的范围，更加优选为0.2～30mmol/L的范围，特别优选为0.3～10mmol/L的范围。具体地说，当上述表面活性剂为商品名TritonX-100时，优选添加以使浓度达到0.2～100mmol/L的范围，更加优选为1～30mmol/L的范围，特别优选为2～20mmol/L的范围。另外，当为商品名Brij35时，优选添加以使浓度达到0.1～50mmol/L的范围，更加优选为0.5～20mmol/L的范围，特别优选为1～10mmol/L的范围。
另外，对于0.5～5mmol上述四唑鎓化合物而言，例如，可以添加上述表面活性剂达到0.1～70mmol的范围，优选为0.3～50mmol的范围，更加优选为0.4～20mmol的范围。具体地说，当上述表面活性剂为商品名TritonX-100时，对于1mmol四唑鎓化合物而言，优选添加使之达到0.2～15mmol的范围，更加优选为0.5～10mmol的范围，特别优选为0.7～5mmol的范围。另外，当为商品名Brij35时，对于1mmol四唑鎓化合物而言，优选添加使之达到0.1～10mmol的范围，更加优选为0.2～8mmol的范围，特别优选为0.3～4mmol的范围。再者，在试样溶血时，预先添加能够促进Hb变性的足够量的表面活性剂也可以。
接下来，进行上述变性Hb的吸光度测定。如上所述，优选测定波长为520～670nm的范围，更加优选为550～660nm的范围。另外，在以上述波长为主波长进行双波长测定的场合，优选副波长为730～900nm的范围，更加优选为800～900nm的范围，特别优选为800～850nm的范围。
然后，由所测定的变性Hb的吸光度与预先作成的校正曲线求出Hb量，由上述所测定的糖化Hb量与Hb量可以算出Hb糖化率。
上述校正曲线，例如，可以用上述的Hb测定方法及公知的测定方法测定含有已知量的Hb的标准试样，由这些测定值作成。作为上述公知的测定方法，只要是测定精度优良的方法，没有特别的限制，例如，优选国际标准HiCN法。
再者，为求出Hb量进行的变性Hb的吸光度测定，例如，可以如下进行：分取为测定糖化Hb配制的溶血试样的一部分，将其作为Hb测定用试样。但是，从简便快速地进行操作的观点看，优选在糖化Hb的测定工序中进行。具体地说，例如，测定上述实施方式A-1所示的上述糖化Hb时，向上述溶血试样中添加四唑鎓化合物后，向上述溶血试样中添加四唑鎓化合物及叠氮化钠后、进行蛋白酶处理后、或进行测定用FAOD处理后等，可以测定变性Hb的吸光度。
(实施方式A-6)
下面关于本发明的HbAlc的测定方法，举以全血作为试样时的例子进行说明。
首先，关于全血试样，与上述实施方式A-1相同，测定糖化Hb量。另一方面，准备糖化Hb中HbAlc量已知的糖化Hb标准液，与上述相同，测定糖化Hb量，作成表示该标准液的测定值(糖化Hb量)与HbAlc量关系的校正曲线。如上所述，由于上述糖化Hb的测定值与HbAlc量存在相关关系，将上述全血试样中的糖化Hb量的测定值代入该校正曲线，可以求出上述全血试样中的HbAlc量。
再者，校正曲线的作成中，作为上述糖化Hb量的测定值，不只是最终求得的糖化Hb量，也可以是测定上述糖化Hb量时通过POD处理得到的反应液的吸光度的值，也可以使用由上述吸光度求得的过氧化氢量。
下面，关于本发明的测定试剂盒，举测定对象物为糖化Hb的例子进行说明。
(实施方式B-1)
该实施方式是预处理用试剂的分解用FAOD使用FAOD-α，显色用试剂的测定用FAOD使用FAOD-αS的上述第1测定试剂盒的一例。
该测定试剂盒由含有分解用FAOD的预处理用试剂、含有蛋白酶的蛋白酶试剂，及含有测定用FAOD、氧化还原酶和显色基质的显色用试剂组成。
这些预处理用试剂、蛋白酶试剂、显色用试剂可分别通过在水性溶剂中溶解所含有的成分而配制。
(预处理用试剂)
在最终的显色反应溶液中，将预处理用试剂例如稀释10～200倍，优选稀释20～100倍。因此，预处理用试剂中含有的FAOD等的浓度例如可根据该稀释倍率等适当确定。另外，根据测定试样中的测定对象物或分解的糖化氨基酸的量，通过改变预处理用试剂在试样中的添加量，也可以调整反应系统中的FAOD等的量。
具体地说，预处理用试剂中的分解用FAOD浓度例如为10～5000U/L的范围。
作为上述水性溶剂，没有特别限制，例如有水、含有上述各种缓冲剂的缓冲液等。上述缓冲剂中，优选CHES、MOPS、TAPS、EPPS、磷酸、HEPPSO、POPSO、硼酸，更加优选CHES、MOPS、TAPS、磷酸。上述缓冲液的浓度例如为5～200mol/L的范围，优选为20～150mol/L的范围。另外，上述缓冲液的pH例如为8～10的范围，优选为8.5～10.0的范围。
另外，该预处理用试剂，除分离用FAOD外，也可以进一步含有以下成分。
含有表面活性剂时，例如可以使用上述各种表面活性剂，优选聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基苯基醚。另外，表面活性剂浓度例如为0.03～200mmol/L的范围，优选为0.1～50mmol/L的范围。
含有尿酸酶时，其浓度例如为1～2000U/L的范围，另外，含有胆红素氧化酶时，其浓度例如为1～2000U/L的范围。再者，也可以含有这两者。
(蛋白酶试剂)
下面，在最终的显色反应溶液中，将蛋白酶试剂例如稀释1.1～3倍。因此，与上述预处理用试剂相同，各成分的浓度可根据该稀释倍率等适当确定，另外，根据试样中的糖化Hb量，通过改变在试样中的添加量，也可以调整反应系统中的蛋白酶量。
作为蛋白酶，例如可以使用上述蛋白酶。当蛋白酶为金属蛋白酶时，蛋白酶试剂中的蛋白酶浓度例如为0.5～100MU/L的范围，优选为1～40MU/L的范围。
作为上述水性溶剂，没有特别限制，例如有水、含有上述各种缓冲剂的缓冲液等。上述缓冲剂中，优选MES、MOPS，更加优选MES。上述缓冲液的浓度例如为1～20mmol/L的范围，优选为1～5mmol/L的范围。另外，上述缓冲液的pH例如为5.0～7.0的范围，优选为5.5～6.5的范围。
另外，该蛋白酶试剂，除上述蛋白酶外，也可以进一步含有以下成分。
作为其他成分，例如有四唑鎓化合物及叠氮化钠。这时，上述蛋白酶试剂，例如四唑鎓化合物浓度为0.1～10mmol/L的范围，叠氮化钠浓度为0.05～4mmol/L的范围，优选四唑鎓化合物浓度为0.6～5mmol/L的范围，叠氮化钠浓度为0.15～1.8mmol/L的范围。另外，四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的添加比例(摩尔比C∶D)优选为C∶D＝20∶3～20∶12的范围，更加优选为C∶D＝20∶5～20∶11的范围，特别优选为C∶D＝20∶6～20∶10的范围。
另外，作为蛋白酶，使用金属蛋白酶时，也可以进一步含有Ca化合物和Na化合物。作为上述Ca化合物和Na化合物，只要是在上述水性溶剂中离子化成Ca2+和Na+的化合物，没有特别限制。作为上述Ca化合物，例如可以使用氯化钙(CaCl2)、CaSO4、(CH3COO)2Ca等，优选CaCl2、CaSO4。另外，作为上述Na化合物，例如可以使用氯化钠(NaCl)、CH3COONa、Na2SO4、NaNO3等，优选NaCl、Na2SO4。这些Ca化合物和Na化合物分别可以使用一种，也可二种以上并用。
如上所述，金属蛋白酶的浓度为0.5～100MU/L的范围，优选为1～40MU/L的范围。
另一方面，为使离解的Ca2+浓度达0.1～5mmol/L的范围，上述Ca化合物的浓度为0.1～50mmol/L的范围。另外，为使离解的Na+浓度达5～1000mmol/L的范围，Na化合物的浓度为5～1000mmol/L的范围，优选为10～300mmol/L的范围。
(显色用试剂)
下面，在最终的显色反应溶液中，将显色用试剂例如稀释2～20倍，优选稀释3～10倍，更加优选稀释4～8倍。这时也与上述相同，各成分的浓度可根据该稀释倍率等适当确定。另外，根据试样中的糖化Hb及产生的过氧化氢的量，通过改变添加量，可以调整反应系统中的各成分的量。
显色用试剂中的测定用FAOD的浓度，例如为1～200KU/L的范围，优选为5～100KU/L的范围。
氧化还原酶的浓度，例如为1～1000KU/L的范围，优选为10～200KU/L的范围。作为上述氧化还原酶，如上所述，例如有POD。
上述显色基质的浓度，例如为0.001～100mmol/L的范围，优选为0.005～10mmol/L的范围，更加优选为0.02～1mmol/L的范围。作为上述显色基质，例如有如上所述的显色基质。
作为上述水性溶剂，没有特别限制，例如有水、含有上述各种缓冲剂的缓冲液等。上述缓冲剂中，优选Tris、磷酸。上述缓冲液的浓度例如为20～1000mmol/L的范围，优选为50～500mmol/L的范围。另外，上述缓冲液的pH例如为pH6～9的范围，优选为6.5～8的范围。
(使用方法)
下面，对使用这种测定试剂盒测定血细胞中的糖化Hb的方法进行说明。
首先，与上述实施方式A-1相同，从全血配制溶血试样，向该溶血试样中添加上述预处理用试剂，使分解用FAOD作用于试样中的糖化氨基酸，进行分解。
通过该分解用FAOD-α的作用，上述溶血试样中含有的α-氨基被糖化的糖化氨基酸、以及上述糖化Hb分解物中α-氨基的糖化部分得到分解。再者，通过上述FAOD-α处理，糖化氨基酸中侧链氨基被糖化的氨基酸没有被分解而残存下来。但是，即使从该侧链被糖化的氨基酸相对于糖化氨基酸总体的比例，及相对于糖化Hb中被糖化的侧链氨基的比例考虑，可以说残存的糖化氨基酸的影响小，可充分提高测定精度。
对于血细胞浓度为30～60体积％的30μL溶血试样而言，上述预处理用试剂的添加量例如为300～3000μL的范围，优选为600～2400μL的范围。对于血细胞浓度1体积％而言，优选添加上述预处理用试剂的预处理反应液使上述分解用FAOD浓度达到10～5000Umol/L的范围。另外，上述处理溶液的pH优选为8～10的范围，更加优选为8.5～10的范围。
该预处理优选从添加上述预处理用试剂开始保温，其条件例如为10～37℃、0.1～20分钟，优选为15～37℃、0.1～5分钟。
再者，该预处理用试剂含有表面活性剂时，例如，没有必要另行进行上述溶血处理来配制溶血试样。即，通过将预处理用试剂添加到全血或血细胞试样中，可以进行表面活性剂的溶血处理和分解用FAOD的糖化氨基酸的分解处理两者。
这种情况，对于血细胞浓度1体积％而言，优选添加上述预处理用试剂的预处理反应液，使上述表面活性剂浓度达到0.05～50mmol/L的范围，更加优选为0.2～30mmol/L的范围，特别优选为0.3～10mmol/L的范围。
另外，上述预处理用试剂含有上述尿酸酶、胆红素氧化酶时，对于血细胞浓度1体积％而言，上述处理用试剂优选使上述尿酸酶浓度达到0.4～4000U/L的范围，胆红素氧化酶浓度达到0.4～4000U/L的范围，更加优选尿酸酶浓度为3～1500U/L的范围，胆红素氧化酶浓度为1～700U/L的范围，特别优选尿酸酶浓度为5～1000U/L的范围，胆红素氧化酶浓度为2～700U/L的范围。
然后，向上述预处理反应液中添加蛋白酶试剂，试样中的糖化Hb在分解用FAOD作用下进行分解。
例如，对于血细胞浓度1体积％的10μL上述预处理反应液而言，蛋白酶试剂的添加量例如为50～300μL的范围，优选为60～180μL的范围。对于血细胞浓度0.1体积％而言，优选添加上述蛋白酶试剂的蛋白酶反应液，使上述蛋白酶浓度达到100～50000KU/L的范围，更加优选为300～30000KU/L的范围。另外，上述蛋白酶反应液的pH优选为6～9的范围，更加优选为7～8.5的范围。
该蛋白酶处理，优选在添加上述蛋白酶试剂开始保温，其条件例如为25～37℃、3～30分钟，优选为25～37℃、3～10分钟，更加优选为30～37℃、3～5分钟。
另外，该蛋白酶试剂含有上述四唑鎓化合物及叠氮化钠时，对于上述蛋白酶浓度为100～10000 KU/L的范围而言，上述蛋白酶反应液，例如，四唑鎓化合物为0.1～10mmol/L的范围，叠氮化钠为0.08～4.0mmol/L的范围，优选四唑鎓化合物为0.6～5mmol/L的范围，叠氮化钠为0.15～1.8mmol/L的范围。具体地说，四唑鎓化合物为WST-3时，优选在蛋白酶反应液中的浓度为0.2～6mmol/L的范围，更加优选为0.6～4mmol/L的范围，特别优选为0.7～2.7mmol/L的范围。这样通过添加四唑鎓化合物及叠氮化钠，与不添加的场合相比，其灵敏度提高约1.2～3倍。
另外，如上所述，该蛋白酶试剂含有金属蛋白酶、进一步含有Ca化合物和Na化合物时，对于上述金属蛋白酶浓度为100～10000KU/L的范围而言，上述蛋白酶反应液，例如，Ca化合物为0.1～50mmol/L的范围，Na化合物为5～1000mmol/L的范围，优选Ca化合物为0.2～10mmol/L的范围，Na化合物为10～500mmol/L的范围，更加优选Ca化合物为0.2～5mmol/L的范围，Na化合物为30～500mmol/L的范围。
然后，向上述蛋白酶反应液中添加上述显色用试剂，使测定用FAOD作用于糖化Hb分解物，通过上述式(1)的反应，生成过氧化氢，其与显色基质通过氧化还原酶反应，通过氧化使上述显色基质显色。
如上所述，测定用的FAOD-αS作用于糖化的α-氨基及糖化的侧链氨基两者。但是，由于预先通过预处理用试剂中的分解用FAOD-α处理，可使测定用FAOD-αS只作用于糖化的侧链氨基。
例如，对于100μL上述蛋白酶反应液而言，显色用试剂的添加量例如为5～100μL的范围，优选为8～50μL的范围，更加优选为10～30μL的范围。添加上述显色用试剂的显色反应溶液，优选测定用FAOD浓度为0.5～200KU/L的范围，氧化还原酶浓度为1～1000KU/L的范围，显色基质的浓度为0.001～100mmol/L的范围，更加优选测定用FAOD浓度为1～100KU/L的范围，氧化还原酶浓度为5～200KU/L的范围，显色基质的浓度为0.005～10mmol/L的范围，更加优选测定用FAOD浓度为2～100KU/L的范围，氧化还原酶浓度为5～200KU/L的范围，显色基质的浓度为0.01～1mmol/L的范围。另外，上述显色反应溶液的pH优选为6～9的范围，更加优选为6.5～8的范围。
该显色反应优选从添加上述显色用试剂开始保温一定时间，其条件例如为15～37℃、1～30分钟，优选为25～37℃、3～10分钟，更加优选为30～37℃、3～5分钟。
然后，测定显色基质的显色。例如，可以用分光光度计测定显色反应溶液的显色程度(吸光度)，由该吸光度确定过氧化氢的量。而且，例如，用预先准备的表示过氧化氢量与糖化Hb量的相关关系的校正曲线和测定的过氧化氢量，可以求出试样中的糖化Hb量。
再者，由于由上述本发明的糖化蛋白质开始添加的分解用FAOD-α生成的过氧化氢因血液试样(溶血试样)中开始存在的过氧化氢酶而消失，所以对测定由FAOD-αS生成的来自测定对象物的过氧化氢没有影响。但是，为了充分消去上述过氧化氢，预处理用试剂中也可以进一步含有过氧化氢酶。这样，通过上述过氧化氢酶消去过氧化氢时，为了防止连通过后面添加的显色用试剂中的测定用FAOD-αS处理生成的过氧化氢也因上述过氧化氢酶而消去，优选显色用试剂中含有过剩量的POD及显色基质。
这种场合，预处理用试剂中的过氧化氢酶浓度，例如为5～300U/L的范围，优选为10～100U/L的范围，更加优选为10～70U/L的范围。另外，上述预处理反应液中的过氧化氢酶浓度，例如为1.5～50U/L的范围，优选为1.5～30U/L的范围，更加优选为1.5～15U/L的范围。上述显色反应溶液中的过氧化氢酶浓度，例如为1～50U/L的范围，优选为1～30U/L的范围，更加优选为1～10U/L的范围。
另外，显色用试剂中的POD浓度，例如为5～1000KU/L的范围，优选为10～200KU/L的范围，更加优选为20～200KU/L的范围。显色反应溶液中的POD浓度，例如为3～300KU/L的范围，优选为5～200KU/L的范围，更加优选为10～100KU/L的范围。
另外，显色反应溶液中的过氧化氢酶(E)与POD(F)的比例(活性比E∶F)，例如为E∶F＝1∶2～1∶40的范围，优选为1∶3～1∶20的范围，更加优选为1∶4～1∶10的范围。
另外，显色用试剂中的显色基质浓度，例如为0.01～200mol/L的范围，优选为0.02～20mol/L的范围，更加优选为0.04～5mol/L的范围。显色反应溶液中的显色基质的浓度，例如为0.001～100mmol/L的范围，优选为0.005～10mmol/L的范围，更加优选为0.01～1mmol/L的范围。
使用该测定试剂盒进行测定时，各试剂的添加不限于上述顺序，也有可以同时添加的试剂。具体地说，例如，在试样中，可以添加预处理用试剂后，同时添加蛋白酶试剂和显色用试剂，也可以同时添加预处理用试剂和蛋白酶试剂后，添加显色用试剂。另外，例如，在试样中，例如也可以添加蛋白酶试剂后，添加预处理用试剂，然后添加显色用试剂。
再者，如果使用本发明的测定试剂盒，也可以快速简便地高精度测定HbAlc量。这是由于使用本发明的测定试剂盒测定的糖化Hb量与HbAlc存在高的相关关系。具体地说，由通过本发明的测定试剂盒测定的糖化Hb量与HbAlc量的相关关系作成校正曲线，通过上述测定试剂盒测定试样中的糖化Hb量，将该测定值代入上述校正曲线中，可以求出HbAlc量。
(实施方式B-2)
该实施方式是预处理用试剂的分解用FAOD和显色用试剂的测定用FAOD使用相同FAOD第2测定试剂盒的一例。作为FAOD，没有特别限制，例如，可以使用FAOD-α、FAOD-S、FAOD-αS之任一种。再者，本实施方式的测定试剂盒，只要没有特别表示，就与上述实施方式B-1相同，另外，可以同样地用于测定糖化Hb。
如上所述，由于FAOD与糖化蛋白质相比更易作用于糖化氨基酸，通过上述分解用FAOD，糖化氨基酸得到分解。但是，与上述实施方式B-1不同，如果分解用FAOD和测定用FAOD使用相同FAOD，发生以下问题。即，预处理反应液中，在分解用FAOD残存的状态下添加蛋白酶试剂，如果分解上述糖化Hb，残存的FAOD与糖化Hb分解物的糖化部分反应，则发生不能准确测定的问题。因此，使用相同FAOD时，需通过蛋白酶试剂的蛋白酶分解糖化Hb，且使上述预处理反应液中残存的分解用FAOD失活，防止与上述糖化Hb分解物反应。因此，蛋白酶试剂中需含有使预处理试剂的分解用FAOD迅速失活、且只能分解糖化Hb的蛋白酶。
上述蛋白酶的种类及含有量没有特别限制，例如，优选根据使用的FAOD的种类及量、蛋白酶对于FAOD的底物特异性、糖化Hb量等、添加到反应溶液中的稀释比例适当确定。作为这种FAOD与蛋白酶的组合，例如有商品名为FOD(旭化成公司生产)和商品名为Toyoteam(东洋纺公司生产)、上述来自赤霉菌属的FAOD及商品名为Proteinase K(Roche公司生产)的蛋白酶等。
具体地说，对于上述分解用FAOD 100U/L而言，例如，优选添加上述蛋白酶试剂使蛋白酶反应液中的蛋白酶浓度达到1～1000000KU/L的范围，更加优选蛋白酶浓度为10～300000KU/L的范围，特别优选为100～100000KU/L的范围。具体地说，作为蛋白酶，使用胰蛋白酶时，例如，优选添加上述蛋白酶试剂使上述蛋白酶反应液中的胰蛋白酶浓度达到1000～30000KU/L，血细胞浓度达到0.2～5体积％，分解用FAOD浓度达到10～100U/L。另外，作为反应条件，例如，温度为20～50℃，时间为10分钟～20小时，pH为6～9。
另外，本实施方式中，由于通过上述蛋白酶可能连显色用试剂中的测定用FAOD也失活，所以需添加足够量的上述测定用FAOD。
具体地说，对于10000KU/L蛋白酶而言，例如，优选添加上述显色用试剂使测定用FAOD处理的反应溶液中的测定用FAOD浓度达到10～1000000U/L的范围，更加优选添加上述显色用试剂使测定用FAOD浓度达到100～200000U/L的范围，特别优选测定用FAOD浓度达到500～50000U/L的范围。
作为具体的处理条件，例如，优选添加上述显色用试剂使反应液中的测定用FAOD浓度达到500～20000U/L，反应液中的蛋白酶浓度达到100～30000KU/L，反应液中的血细胞浓度达到0.01～1体积％。另外，作为反应条件，例如，温度为15～40℃，时间为1分钟～1小时，pH为6～9的范围。
(实施方式B-3)
该实施方式是预处理用试剂的分解用FAOD和显色用试剂的测定用FAOD使用相同FAOD的第3测定试剂盒的一例。但是，该实施方式与上述实施方式B-2不同，无需必须通过蛋白酶使预处理用试剂的分解用FAOD失活。由于酶具有底物特异性，通过蛋白酶与FAOD的组合，有时用蛋白酶难以使FAOD失活。这种情况下，本实施方式的测定试剂盒有效。再者，如果预处理用试剂中的分解用FAOD与糖化Hb分解物反应，由于不能提高测定精度，所以，如下所示，调整预处理用试剂和显色用试剂中的FAOD的添加比例变得重要。
作为上述FAOD，没有特别限制，例如可以使用FAOD-α、FAOD-S、FAOD-αS之任一种。另外，本实施方式的测定试剂盒，只要没有特别表示，就与上述实施方式B-1相同，另外，可以同样地用于测定糖化Hb。
作为适应于这种实施方式的FAOD与蛋白酶的组合，例如有商品名为FOD(旭化成公司生产)及来自赤霉菌属的FAOD(Arkray公司生产，特开平-154672号公报)、商品名为TrypsiN(Sigma公司生产)及商品名为Proteinase K(和光纯药工业公司生产)等。
上述分解用FAOD，即使其活性残存，蛋白酶处理期间，需要在不作用于糖化Hb分解物的范围内添加，而且，由于利用易作用于糖化氨基酸、难作用于糖化蛋白质的性质，优选只作用于糖化氨基酸程度的添加量。
具体地说，预处理用试剂中的分解用FAOD浓度，例如为10～20000U/L的范围，优选为20～10000U/L的范围，更加优选为100～5000U/L的范围。显色用试剂中的测定用FAOD浓度为0.5～200KU/L的范围，优选为1～100KU/L的范围，更加优选为2～100KU/L的范围。
而且，例如，优选添加上述预处理试剂，使预处理反应液中分解用FAOD浓度达到10～5000U/L，血细胞浓度达到0.2～20体积％。
使用该测定试剂盒时，含有分解用FAOD的预处理用试剂进行的处理，由于利用FAOD易作用于糖化氨基酸、难作用于糖化蛋白质的性质，例如，优选只作用于糖化氨基酸程度的反应时间。具体地说，优选反应温度为20～37℃，反应时间为1分钟～60分钟，更加优选反应温度为25～37℃，反应时间为2分钟～30小时，特别优选反应温度为30～37℃，反应时间为3分钟～10小时。
本实施方式中，例如，优选添加上述预处理用试剂及显色用试剂使显色反应溶液中的分解用FAOD(G)与测定用FAOD(H)的比例(活性比G∶H)达到G∶H＝1∶3～1∶100的范围，更加优选为G∶H＝1∶5～1∶50的范围，特别优选为G∶H＝1∶10～1∶40的范围。如果这样设定，与上述实施方式2不同，蛋白酶反应溶液中残存上述分解用FAOD，但是由于该残存的FAOD的反应速度非常慢，蛋白酶处理工序中，残存FAOD作用于生成的糖化Hb分解物没有达到影响测定的程度。
(实施方式B-4)
该实施方式是作为显色用试剂的显色基质，使用DA-64的例子。再者，本实施方式的测定试剂盒，只要没有特别表示，就与上述实施方式B-1组成相同，另外，可以同样地用于测定糖化Hb。
如上所述，为了提高测定灵敏度，蛋白酶试剂含有四唑鎓化合物和叠氮化钠，显色用试剂含有显色基质DA-64时，显色反应溶液中，由于上述四唑鎓化合物、叠氮化钠及DA-64共存，如上所述，DA-64发生误显色。因此，为了防止该误显色，优选设定以下组成。
优选预处理用试剂、蛋白酶试剂及显色用试剂中至少任一者含有表面活性剂。作为上述表面活性剂，例如可以使用上述表面活性剂。
使预处理用试剂中含有时，其浓度为0.03～200mmol/L的范围，优选为0.1～50mmol/L的范围。使蛋白酶试剂中含有时，其浓度为0.01～50mmol/L的范围，优选为0.05～20mmol/L的范围。使显色用试剂中含有时，其浓度为0.06～30mol/L的范围，优选为0.1～20mol/L的范围。
而且，为使显色反应溶液中的各成分达到以下的浓度范围，可以添加测定试剂盒的各试剂。上述显色反应溶液中，例如，优选DA-64为0.001～100mmol/L，表面活性剂为0.002～50mmol/L，四唑鎓化合物为0.1～10mmol/L，叠氮化钠为0.08～4mmol/L的范围，更加优选DA-64为0.005～10mmol/L，表面活性剂为0.005～20mmol/L，四唑鎓化合物为0.6～5mmol/L，叠氮化钠为0.15～1.8mmol/L的范围，特别优选DA-64为0.01～1mmol/L，表面活性剂为0.02～10mmol/L，四唑鎓化合物为0.7～2.7mmol/L，叠氮化钠为0.2～1.5mmol/L的范围。
另外，该显色反应溶液的pH优选为6.0～9.0的范围，更加优选为6.5～8.5的范围，特别优选为7.0～8.0的范围。
由于上述DA-64通过氧化还原反应显色，关于该反应液，例如，如果用分光光度计测定检测波长650～750nm范围的吸光度(显色程度)，可以测定过氧化氢的量。
实施例
(实施例1)
从患者采集全血试样(患者数163名)，使红细胞自然沉降回收。而且，向10μL该沉降的红细胞部分中添加600μL下述预处理用试剂，配制溶血试样(n＝163)。再者，该试样由于使用使红细胞自然沉降的部分，所以也含有血浆。
(预处理用试剂：pH 9.4)
CHAPS 50mmol/L
表面活性剂(商品名NIKKOL-BL9EX， 9g/L
Nikko Chemical公司生产)
FAOD(商品名FAOX，Kikkoman公司生产) 1KU/L
然后，将得到的20μL溶血试样与76μL下述蛋白酶试剂混合，于37℃下保温5分钟。接着，再添加19μL下述显色试剂，于37℃下保温3分钟，测定这时的波长751nm及波长571nm处的吸光度。测定吸光度使用自动分析装置(商品名JCA-BM8、日本电子公司制造)。
(蛋白酶试剂：pH 5.5)
四唑鎓化合物(商品名WST-3，同仁化学公司生产) 2mmol/L
NaN3 0.6mmol/L
NaCl 100mmol/L
CaCl2 2mmol/L
中性蛋白酶(Arkray公司生产) 4MU/L
MES 1mmol/L
(显色试剂：pH 7.0)
商品名DA-64(和光纯药工业公司生产) 80μmol/L
FAOD(Arkray株式会社生产) 36KU/L
Tris-HCl 380mmol/L
NaN3 0.5mmol/L
而且，将测定的各吸光度代入预先作成的表示Hb浓度(g/L)或HbAlc浓度(g/L)与吸光度的关系的各校正曲线，求出HbAlc浓度及Hb浓度，根据下式算出HbAlc％。再者，Hb浓度可以由波长751nm处的吸光度求出，HbAlc浓度可以由波长571nm处的吸光度求出。
HbAlc(％)＝(HbAlc浓度/Hb浓度)×100
再者，上述校正曲线通过下述方法作成。首先，关于Hb浓度为已知的各种浓度的标准液，通过使用HbAlc测定装置(商品名HA-8150：Arkray公司制造)的HPLC法测定HbAlc浓度及Hb浓度。另一方面，关于上述各标准液，通过与上述实施例同样的测定方法，测定与Hb浓度和HbAlc浓度相当的吸光度。而且，由上述自动测定仪得到的测定值和上述吸光度作成一次回归式，将其作为校正曲线。
另外，作为对照例，将上述实施例1中配制的溶血试样(n＝163)作为试样，使用通过上述HPLC法测定的值。
以上结果如图1所示。该图是表示通过酶法测定的实施例1的HbAlc(％)与通过HPLC法的对照例HbAlc(％)的关系图。该图中，实施例的相关式为“y＝1.031x-0.09”，相关系数为“0.981”。
这样，根据本发明的实施例，得到与对照例的值非常接近的值，由于其相关系数(0.981)也非常高，因此可知可以优良的精度测定糖化Hb。
产业上的可利用性
如上所述，本发明的糖化蛋白质的测定方法及测定试剂盒，由于排除共存的糖化氨基酸的影响，测定精度优良。因此，如果将本发明例如应用于测定红细胞中的糖化Hb、HbAlc，可以得到比以往可靠性高的测定值，所以，进一步提高糖化Hb和HbAlc作为糖尿病诊断等的指标物质的重要性。