发酵方法

摘要

本发明涉及制备目的发酵产物的方法，其包括培养需氧微生物以生产该产物，其中在该微生物中呼吸链效率被提高；本发明还涉及转化的微生物以及新的核苷酸序列。

权利要求

1.制备核黄素的方法，其包括培养属于芽胞杆菌(Bacillus)属的微生物以生产该产物，其中通过在该微生物中引入多核苷酸而提高其呼吸链效率，所述多核苷酸能在该微生物中阻止或降低呼吸链的能量效率较低组分的表达，其中所述呼吸链的能量效率较低组分是细胞色素bd末端氧化酶。

2.依照权利要求的1的制备核黄素的方法，其包括培养属于芽胞杆菌属的微生物以生产核黄素，其中，该微生物在包含编码细胞色素bd末端氧化酶的多核苷酸cyd基因座上携带突变。

3.依照权利要求1或2所述的方法，其中，核黄素的生产较之芽胞杆菌属的野生型微生物增加至少0.1％。

4.多核苷酸，此多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，且此多核苷酸能在具有替代的呼吸链子链的革兰氏阳性宿主菌株中阻止或降低细胞色素bd末端氧化酶的表达。

5.用权利要求4的多核苷酸转化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主细胞，并且，所述宿主细胞是能超量生产核黄素。

说明书

发酵方法

[0001] 发明领域

[0002] 本发明涉及制备目的发酵产物的方法，涉及转化的微生物以及新核苷酸序列。 [0003] 更具体地，本发明提供制备目的发酵产物的方法，其包括培养需氧微生物以生产该产物，其中在该微生物中呼吸链效率被提高。

[0004] 背景技术

[0005] 在需氧条件下，腺苷三磷酸(ATP)形式的细胞能量主要通过呼吸作用产生，其中电子从还原形式的电子载体如NADH或FMNH2到氧的流动与质子跨细胞质膜的转运相偶联。呼吸作用涉及称为“呼吸链”的一套能可逆地氧化和还原的膜相关化合物。许多生物，包括埃希氏菌属(Escherichia)，芽孢杆菌属(Bacillus)，蓝细菌(Cyanobacter)，链霉菌属(Streptomyces)和棒状杆菌属(Corynebacterium)，例如大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣状芽孢杆菌(B.licheniformis)，B.ammoniagenes和谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，它们有能力在呼吸链的两条替代子链间转换。这些子链有一个共同组分即辅酶Q或甲基萘醌类，但末端氧化酶不同。例如枯草芽孢杆菌的呼吸链分为细胞色素C氧化酶子链和对苯二酚氧化酶子链。细胞色素C氧化酶子链的末端氧化酶是ctaCDEF编码的细胞色素aa3氧化酶，对苯二酚氧化酶子链的末端氧化酶不是细胞色素aa3氧化酶就是细胞色素bd氧化酶，它们分别由qoxABCD和cydAB所编码。在谷氨酸棒状杆菌中至少存在两条呼吸链子链。其中一条子链是由qcrABC编码的细胞色素bclc 复合体和ctaCDE编码的细胞色素aa3氧化酶所组成。另一子链是由cydAB编码的细胞色素bd氧化酶所组成。

[0006] 电子流动和质子转运的偶联程度以及因此的能量产生效率随子链的不同而不同。这种不同不仅仅是在整个子链之间的不同而且也是在子链特定组分之间的不同。例如，上述的细胞色素aa3氧化酶比细胞色素bd氧化酶更有效率，即当细胞色素aa3氧化酶参与时，每个电子可转运更多的质子。自然地，在给定的环境条件下细胞利用最适于生长的那条呼吸链子链。

发明内容

[0007] 为提高呼吸链的效率，可引入能量效率更高的呼吸链组分，或者，特别是在天然能够利用替代的呼吸链子链的微生物中，可以阻止或降低能量效率较低的子链组分的表达，从而引导电子流动至更有效率的子链。

[0008] 可用在本发明方法中的天然能够利用替代的呼吸链子链的微生物的例子包括上述提到的属中的成员。

[0009] 如此处所用，术语“引入呼吸链的组分”指引入编码所述组分的合适的多核苷酸序列到微生物中，并通过单或双交换机制使多核苷酸序列和微生物的基因组DNA重组。此多核苷酸可包含转录和翻译信号例如启动子序列和核糖体结合位点，它们连接于编码所述组分的基因上以允许此组分表达。为方便地挑选包含有此多核苷酸序列的微生物转化体，编码抗生素抗性标记物的基因或补充微生物的可能辅源营养的基因也可以同样由此多核苷酸序列编码。此外，此多核苷酸可在5’和/或3’末端包含来自待导入此多核苷酸序列的微生物基因组座位的例如至少50碱基对长度的DNA序列。可以将此多核苷酸序列导入微生物基因组中不对微生物生长所必需的功能及发酵产物的生产造成影响的任何座位上。 [0010] 如此处所用，术语“阻止或降低组分的表达”指微生物基因组内的改变，该改变干扰此组分的生物合成或导致氨基酸序列改变的蛋白质表达，此蛋 白质的功能与具有未改变的氨基酸序列的野生型对应物相比被全部或部分破坏。这种干扰可发生在转录、翻译或翻译后水平。微生物基因组内的这种改变例如可用包含改变的DNA序列通过单或双交换重组置换野生型DNA序列来获得。为方便地挑选其基因组内含有改变的微生物转化体，此改变可例如是一个编码抗生素抗性标记物的DNA序列或是补充微生物的可能辅源营养的基因。

[0011] 对呼吸链组分表达的阻止或降低也可以通过在微生物的任何遗传座位上导入一个与编码该组分的DNA序列互补的DNA序列，由此通过反义机制阻止或降低此组分的表达来实现。

[0012] 如此处所用，“目的发酵产物”指通过发酵产生的化合物，诸如核黄素，泛酸，生物素，硫胺素，叶酸，维生素B6和氨基酸。

[0013] 如此处所用，“培养需氧微生物以生产目的发酵产物”指将微生物接种至一个提供了生物体生长和发酵产物生产所需的所有底物的发酵培养基中。接种后的发酵培养基置于特定的物理化学参数下，诸如温度、pH和通气，这些将允许最适宜的生物量生长和产物累积。这些参数随培养微生物类型的不同而不同，且随生产的化合物的不同而不同。本领域技术人员公知经验性地确定这些参数的方法，其包括析因设计或复合设计。为进一步提高发酵产物累积，可在微生物培养过程中向发酵液提供生物量生长或产物形成所需的底物。例如，依照本发明的方法，微生物可进行采用指数和恒定补料曲线的补料分批培养和恒化培养。

[0014] 此发酵方法后可以通过分析确定方法参数，例如，可从如细胞悬液中通过离心收获细胞，用蒸馏水洗涤，并在如110℃干燥24小时至重量不变，测定细胞干重(cdw)。在生物反应器的进料气(feed gas)流出的气体中二氧化碳和氧气的浓度可使用如质谱仪(如Prima 600，Fisons Instruments)测定。葡萄糖浓度可通过如酶学方法使用如商品试剂盒(如Beckman)测定。在培养物上清液中的有机酸、3-羟基丁酮和二酰基的浓度可通过如 HPLC在配有如二级管阵列探测器(Perkin Elmer)的Supelcogel C610H柱(4.6×250mm)-1(Sigma)上测定。0.067M的磷酸可用作流动相，流速为0.3ml min ，温度40℃。目的发酵产物的浓度可被标准方法所测定，例如核黄素的浓度可例如按440nm(A440)时无细胞培养液的吸收值确定。如果A440超过0.6，可用例如0.5M的磷酸钾缓冲液(pH 6.8)稀释培养液，如果A440超过1.8，例如可将0.8ml的培养液与0.2ml的0.2M的NaOH混合，并用0.5M的磷酸钾缓冲液(pH 6.8)稀释至一个适当的浓度。

[0015] 可从微生物和/或培养基中分离目的发酵产物。如此处所用，术语“分离的”意味着此目的发酵产物通过采用包括如过滤，离心和/或萃取的方法被纯化或至少被部分纯化。可通过从水性的或有机的溶剂中重结晶或应用其它本领域已知方法例如离子交换层析、尺寸排阻层析或疏水作用层析法来进一步纯化此目的发酵产物。从发酵液中分离和纯化如核黄素的方法的详细描述见如EP 730,034。

[0016] 本发明进一步提供多核苷酸，此多核苷酸能在具有替代呼吸链子链的革兰氏阳性宿主菌株中阻止或降低能量效率较低的呼吸链组分的表达。优选的革兰氏阳性宿主菌株是枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌，其呼吸链中表达待被阻止或降低的组分是由cydAB编码的末端氧化酶。优选地此多核苷酸有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。 [0017] 可用延伸序列修饰SEQ ID NO：1的3’和5’末端，每个延伸序列长度为几百个碱基对。这可提高SEQ ID NO：1的转化效率。此延伸序列是随机序列，其优选与受体细胞的DNA序列少于80％同源性、从而阻止在非期望位置上的重组。然后，可用这样的多核苷酸序列转化能生产目的发酵产物的微生物。

[0018] 本发明的多核苷酸序列可例如包含来自枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌cyd座位并具有缺失-插入突变的DNA片段，参见例如实施例中的更 详细阐述。细胞色素bd氧化酶的两个亚基由cydA和cydB所编码。在枯草芽孢杆菌基因组的340o处cydA和cydB连同cydC及cydD包含操纵子。

[0019] 本发明的另一个实施方案是转化了多核苷酸的枯草芽孢杆菌宿主细胞或谷氨酸棒状杆菌宿主细胞，此多核苷酸能阻止或降低宿主细胞呼吸链中细胞色素bd末端氧化酶的表达。

[0020] 例如，可以首先在大肠杆菌中构建编码枯草芽孢杆菌cyd操纵子的多核苷酸序列，该多核苷酸具有从cydB的3’末端和cydC的5’末端替换1376bp的插入的抗生素抗性基因。用该多核苷酸序列转化天然感受态枯草芽孢杆菌微生物，导致含有cyd缺失的枯草芽孢杆菌突变体。从此突变体制备的PBS1噬菌体裂解物继而可用于通过普遍性转导将cyd缺失引入包含工程化rib操纵子pRF69的多重拷贝的生产性微生物RB50中。标准重组DNA技术可用于构建多核苷酸序列和枯草芽孢杆菌突变体。

[0021] 可运用标准的选择方案选择缺失-插入突变的阳性转化株。例如，用于转化微生物的多核苷酸序列可包括各种选择标记物，包括如抗生素抗性标记物、生色标记物等。优选的标记物是新霉素抗性标记物，对期望转化的筛选包括鉴定微生物是否能在补充了新霉素的发酵培养基中生长，并可使诸如核黄素这样的目的发酵产物超量生产。 [0022] 优选地，其呼吸链效率提高的需氧微生物是重组产生的、能超量生产核黄素的微生物。如此处所用，术语“超量生产”意味着微生物从用作碳源的底物以高于至少0.1％(w/w)，优选地高于1％(w/w)，例如高于4％(w/w)的产率生产目的发酵产物。 [0023] 这种需氧宿主细胞的一个例子是生产核黄素的枯草芽孢杆菌RB50细胞，命名为RB50::[pRF69]n，其包含编码以强噬菌体SPOI启动子(P15)修饰(以增强rib基因转录)的rib操纵子的pRF69的多重(n)拷贝(例如约5到约20个拷贝)。此重组产生的微生物可比野生型微生物生产显著更多的核黄素。

[0024] 枯草芽孢杆菌RB50依据布达佩斯条约于1989年5月23日保藏在农业研究机构保藏中心(NRRL)，Peoria，IL；保藏号B 18502。质粒pRF69于1990年6月6日被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，保藏号ATCC 68338。

[0025] 本发明也包括RB50::[pRF69]衍生物，如此处所用，RB50::[pRF69]“衍生物”是包含有pRF69的工程化rib操纵子或与pRF69的工程化rib操纵子至少25％相同、优选与pRF69的工程化rib操纵子至少50％相同的多核苷酸序列以及导致核黄素生物合成基因表达发生改变的任何其它遗传修饰的任何枯草芽孢杆菌细胞。在本发明中，采用BLAST程序和国家生物技术信息中心(Bethesda，MD，USA)的服务程序来测定多核苷酸序列同一性的百分比。RB50::[pRF69]“衍生物”也可在RB50::[pRF69]基因组中包含将影响核黄素生物合成之前体化合物的生物合成的改变。此外，营养缺陷型RB50::[pRF69]突变体也被认为是RB50::[pRF69]“衍生物”。术语营养缺陷型突变体是指通过例如突变修饰过的微生物，其需要添加外源性化合物才能生长，而在突变之前此微生物能自我生产该化合物。 [0026] 因此，本发明提供：

[0027] (1)制备目的发酵产物的方法，其包括培养需氧微生物以生产该产物，其中在该微生物中呼吸链效率被提高，所述提高优选地通过引入能量效率较高的组分或阻止或降低子链中能量效率较低的组分来实现，此需氧微生物是细菌属埃希氏菌属，芽孢杆菌属，蓝细菌，链霉菌属和棒状杆菌属的成员，优选的是大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，淀粉液化芽孢杆菌，地衣状芽孢杆菌，B.ammoniagenes或谷氨酸棒状杆菌；

[0028] (2)制备目的发酵产物，如核黄素，泛酸，生物素，硫胺素，叶酸，维生素B6或氨基酸的方法，其包括培养需氧微生物以生产该产物，其中在该微生物中呼吸链效率被提高； [0029] (3)多核苷酸，此多核苷酸能在具有替代的呼吸链子链的革兰氏阳性宿主菌株如枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌中阻止或降低呼吸链中能量效率较低组分的表达，所述组分例如由cydAB编码的末端氧化酶；

[0030] (4)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其任选地用延伸序列在其3’和5’末端修饰，每个延伸序列长度为几百个碱基对，此延伸序列是随机序列，且与受体细胞DNA序列的同源性少于80％；

[0031] (5)多核苷酸，其包含来自枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌cyd座位具有缺失-插入突变的DNA片段；

[0032] (6)用多核苷酸转化的枯草芽孢杆菌宿主细胞或谷氨酸棒状杆菌宿主细胞，此多核苷酸能阻止或降低宿主细胞呼吸链中细胞色素bd末端氧化酶的表达，例如其中该多核苷酸编码枯草芽孢杆菌cyd操纵子并具有一个从cydB的3’末端和cydC的5’末端替换1376bp的插入的抗生素抗性基因，和任选地编码另一选择标记物，例如抗生素抗性标记物如新霉素抗性标记物或生色标记物；

[0033] (7)如(6)中的宿主细胞，其是重组产生的、能超量生产核黄素的微生物； [0034] (8)如(6)中的宿主细胞，其中微生物从用作碳源的底物以高于至少0.1％(w/w)，优选地高于1％(w/w)，例如高于4％(w/w)的产率生产目的发酵产物；

[0035] (9)如(6)中的宿主细胞，其是枯草芽孢杆菌RB50细胞，命名为RB50::[pRF69]n，其包含编码以强噬菌体SPOI启动子(P15)修饰以增强rib基因转录的rib操纵子的pRF69的多重(n)拷贝(例如约5到约20个拷贝)；和

[0036] (10)如(6)中的宿主细胞，其是RB50::[pRF69]衍生物，例如包含pRF69的工程化rib操纵子或包含与pRF69的工程化rib操纵子至少25％、优选的是至少50％相同的多核苷酸序列的枯草芽孢杆菌细胞。

[0037] 下面的实施例将举例阐述本发明的方法、多核苷酸和宿主细胞。这些实施例仅只是例证性的，不应以任何方式将其视为对发明范围的限制。例如，本发明可进行变化，使用任何天然能够利用替代呼吸链且呼吸链中一个组分的表达被阻止的微生物来实施发酵方法以生产目的发酵产物。依照本发明该方法可以在大规模工业发酵罐中以连续培养方式或以分批或补料分批方式完成，稀释速率从0.3l/h到0.001l/h变化，提高发酵培养基中组分的浓度或提高葡萄糖浓度至400g/l。对于所有这些变通方案，培养基中的组分和所需的物理化学参数可以由本领域的技术人员来确定并调整。

[0038] 实施例1：构建含有cyd缺失的枯草芽孢杆菌RB50::pRF69的呼吸突变株 [0039] 构建cydBC缺失-插入突变株：从枯草芽孢杆菌微生物1012[Saito等，Mol.Gen.Genet.170：117-122(1979)]的DNA中扩增一段3.4kb的DNA片段，采用引物如SEQ ID NO：2所示的CydA+1和SEQ ID NO：3所示的CydC-1，PCR反应条件为：95℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸4.5分钟，循环30个周期。此PCR产物采用Wizard PCR纯化试剂盒(Promega Corp.)纯化。将此PCR产物连接于pGEM-Teasy载体(Promega Corp.)上，形成质粒pNMR20。

[0040] 质粒pBEST501[Itaya等，Nucl.Acids.Res.17：4410(1989)]上1.2kb的新霉素抗性盒采用如SEQ ID NO：4所示的引物pBESTBcl+1和如SEQID NO：5所示的引物pBESTBcl-1来扩增。其采用的PCR反应条件同上。扩增后的新霉素抗性盒纯化后用Bcl I消化，并克隆至经Bcl I消化过的pNMR20中，得到如SEQ ID NO：1所示的质粒pNMR21，此质粒包含了插入cydBC的新霉素抗性盒，其方向与cyd转录方向相同。用PstI使质粒pNMR21线性化，-1然后转化进枯草芽孢杆菌野生型菌株1012中，在包含最终浓度5mg x ml 新霉素的TBAB平板上挑选以得到枯草芽孢杆菌微生物NM18。

[0041] 枯草芽孢杆菌微生物NM18是用于制备PBS1噬菌体裂解物的供体微生物。这种裂解物被用于转导核黄素生产性微生物RB50，该微生物RB50含有修饰过的核黄素操纵子pRF69。RB50指宿主微生物枯草芽孢杆菌，其包含几种引入以提高核苷酸和核黄素产量的突变。pRF69指通过在pRF50的rib座位引入强噬菌体启动子来修饰的rib操纵子。修饰后的操纵子pRF69被扩增达到高拷贝数量。关于微生物RB50和修饰后的rib操纵子pRF69的详细描述见EP 405,370。得到许多新霉素抗性菌落。PCR和Southern杂交已分析了这些克隆中的三个，显示它们包含有cyd缺失。其中一个克隆被挑选出来重新命名为RB50::[pRF69]DcydBC，Southern印迹杂交显示了pRF69的存在。

[0042] RB50::[pRF69]DcydBC在补充10mg/ml的氯霉素的丰富复杂培养基(VY培养基：25g/l的Difco小牛肉浸汁中加上5g/l酵母提取物)中培养至光密度OD 660＝1。将1ml这种培养液转移至20毫升补充了30mg/ml氯霉素的VY培养基中，在达到OD为1后，再将
1ml培养物转移至20ml补充了60mg/ml氯霉素的VY培养基中。同样的传代采用包含80mg/ml氯霉素的VY培养基重复。在OD达到1后，在这种培养物中补充15％(Vol/Vol)的甘油，将1ml等分试样在-80℃冰冻。利用这种逐步提高抗生素浓度的方法挑选含有增加拷贝数量的修饰过的rib操纵子pRF69的细菌(EP 405,370)。

[0043] 实施例2：补料分批培养RB50::[pRF69]DcydBC和亲本菌株RB50::[pRF69] [0044] 为制备种子培养物，可解冻实施例1中冰冻RB50::[pRF69]DcydBC细菌悬液的等分试样或亲本菌株RB50::[pRF69]悬液，并转移至100ml补充了80mg/ml氯霉素的VY培养基中。此培养物在37℃培养直到OD达到10(一般在12至15小时后)。

[0045] 主发酵开始于将50ml的种子培养物各接种到800ml发酵培养基中，此培养基具有下列组成(每升ddH2O中)：27.3g葡萄糖x H2O；0.75g谷氨酸钠；0.23g NH4Cl；1.41g(NH4)2SO4；4.11g Na2HPO4 x 2H2O；4.71g KH2PO4；4.71g K2HPO4；11.77g酵母提取物；
1g MgSO4x 7H2O；62.5mg CaCl2x 2H2O；40mg FeSO4x 7H2O；14.6mg MnSO4x H2O；4mg ZnSO4x
7H2O；0.8mg CuCl2x 2H2O；4mg CoCl2x 6H2O；0.3mgNa2MoO4x 2H2O；和1mg AlCl3x 6H2O。进料泵在通过CO2产生下降指示的葡萄糖耗尽之前不久被打开。此补料培养基(655.2g葡萄糖x H2O；1.5g MgSO4x 7H2O；11mg MnSO4x H2O；和3mg ZnSO4x 7H2O)在补料阶段开始后以-1 -1 -1 -1
13.3mL L h 供给2小时，然后以14.7mL L h 供给。发酵在2L LH discovery 210系列反应器(Adaptive Biosystems)中、39℃条件下完成。搅拌器速度设定为1,500rpm，气流保-1
持在3-5L min 之间，从而保证在整个培养过程中溶解氧的水平在15％以上。 [0046] 实施例3：RB50::[pRF69]DcydBC和亲本菌株RB50::[pRF69]的核黄素生产 [0047] 将200ul的0.2M NaOH溶液立即加入到刚从发酵反应器中收集的实施例2的
0.8ml发酵样品中。将样品在室温孵育20秒以溶解样品中的核黄素晶体。将该悬液的等分试样用0.5M磷酸钾缓冲液(pH 6.8)稀释及中和。此样品在台式Eppendorff离心机中以
14,000rpm离心5分钟，并测定上清液在440nm处的吸收值(A440)。调整样品的稀释度以达到0.1到0.6个吸收单位的读数。核黄素的浓度通过比较样品和核黄素标准品(Sigma，St.Luis，MO，USA)的吸收值来计算。

[0048] 这个实施例的结果表明：上述引入cyd缺失以阻止微生物采用呼吸链细胞色素bd末端氧化酶子链的RB50::[pRF69]DcydBC可在发酵48小时后生产15.5g/l核黄素，而此时亲本菌株RB50::[pRF69]相比产生14.0g/l。在发酵的24小时，cyd缺失菌株优于亲本菌株的优势更显著，产量分别为9.8g/l和7.5g/l。