腺病毒和编码其的核酸的新应用

摘要

本发明涉及病毒、优选腺病毒在生产药物中的应用。所述病毒在核内不含有YB-1的细胞中是复制缺陷型的，并且编码癌基因或癌基因产物，特别是癌基因蛋白质，其反式激活至少一个病毒基因，优选腺病毒基因，所述基因选自包含E1B55kDa，E4orf6，E4orf3，和E3ADP的组。

权利要求

1.腺病毒在制备用于治疗在核中具有YB-1的肿瘤的药物中的应用，其特征在于所述腺病毒在核内缺少YB-1的细胞中是复制缺陷型的，但在核内具有YB-1的细胞中复制，其中所述病毒编码癌基因蛋白质E1A，其反式激活至少一个病毒基因，其中所述病毒基因是腺病毒基因，其选自包含E1B55kDa，E4orf6，E4orf3，和E3ADP的组，所述癌基因蛋白质E1A不同于野生型E1A蛋白质。

2.按照权利要求1的应用，其特征在于所述病毒癌基因蛋白质E1A能够结合功能Rb肿瘤抑制基因产物。

3.按照权利要求1的应用，其特征在于所述病毒癌基因蛋白质E1A不能够结合功能Rb肿瘤抑制基因产物。

4.按照权利要求1的应用，其特征在于所述病毒癌基因蛋白质E1A不诱导YB-1的核定位。

5.按照权利要求1的应用，其特征在于所述药物是针对其细胞为Rb阳性或Rb阴性的患者。

6.按照权利要求5的应用，其特征在于所述形成肿瘤的细胞是Rb阳性的或Rb阴性的。

7.按照权利要求1的应用，其特征在于所述细胞是Rb-阴性的和细胞是YB-1核阳性的。

8.按照权利要求7的应用，其中所述YB-1核阳性的是独立于细胞周期的YB-1核阳性的。

9.按照权利要求1的应用，其特征在于形成肿瘤或其部分的细胞抗细胞生长抑制剂。

10.按照权利要求9的应用，其特征在于所述细胞显示过量表达膜结合转运蛋白P-糖蛋白。

11.按照权利要求1的应用，其特征在于所述细胞是p53-阳性或p53-阴性。

12.按照权利要求2的应用，其特征在于与野生型癌基因蛋白质E1A相比，所述癌基因蛋白质显示一个或数个突变或缺失，其特征在于所述缺失选自包含CR3区域的缺失，N末端的缺失和C-末端的缺失的组。

13.按照权利要求12的应用，其特征在于所述E1A癌基因蛋白质能够与Rb结合。

14.按照权利要求3的应用，其特征在于与野生型癌基因蛋白质相比，所述癌基因蛋白质包含一个或数个突变或缺失，其特征在于所述缺失优选为CR1区域和/或CR2区域中的缺失。

15.按照权利要求14的应用，其特征在于所述癌基因蛋白质E1A不能够结合Rb。

16.按照权利要求1的应用，其特征在于所述病毒癌基因蛋白质在组织和/或肿瘤特异性启动子的控制下。

17.按照权利要求16的应用，其特征在于所述病毒癌基因是E1A。

18.按照权利要求1的应用，其特征在于所述病毒编码YB-1。

19.按照权利要求18的应用，其特征在于YB-1在组织特异性和/或肿瘤特异性启动子的控制下。

20.按照权利要求1的应用，其特征在于所述细胞在核内含有YB-1。

21.按照权利要求20的应用，其特征在于形成肿瘤或其部分的细胞在核内含有YB-1。

22.按照权利要求1的应用，其特征在于在诱导YB-1转运至核内以后所述肿瘤在核内含有YB-1。

23.按照权利要求22的应用，其特征在于通过至少一种措施引发YB-1的转运，所述措施选自包含辐射，给药细胞生长抑制剂和过热的组。

24.按照权利要求23的应用，其特征在于将该措施应用于细胞，器官或生物体。

25.按照权利要求1的应用，其特征在于病毒选自包含AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，dl1119/1131，CB 016，dl520和缺少表达的病毒癌基因的病毒的组，该病毒癌基因能够与功能Rb肿瘤抑制基因产物结合。

说明书

腺病毒和编码其的核酸的新应用

[0001] 本发明涉及腺病毒以及编码其的核酸和重组病毒癌蛋白质的应用。

[0002] 当前在治疗肿瘤中使用许多治疗原理。除了使用外科手术以外，化学疗法和放射疗法是占优势的。然而所有这些技术与相当大的副作用相关。复制选择性溶瘤病毒的应用提供治疗肿瘤的新平台。与其相关引发病毒剂的选择性肿瘤内复制，导致病毒复制，受染肿瘤细胞的裂解和病毒向相邻肿瘤细胞的扩散。因为病毒复制能力限于肿瘤细胞，正常组织免于病毒复制和因此免于病毒裂解。

[0003] 目前，几种病毒系统进行目的在于肿瘤裂解的临床试验。该腺病毒的一个实例是dl1520(Onyx-015)，其已经成功用于I期和II期临床(Khuri，F，等Nature Medicine6，879-885，2000)。Onyx-015是一种具有完全缺失E1B-55kDa基因的腺病毒。腺病毒的E1B-55kDa蛋白的完全缺失是基于发现即具有p53缺失的腺病毒载体可能导致细胞的复制和因此裂解(Kirn，D.等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.17，391a，1998)，其中正常细胞不受伤害。更具体地，E1B-55kDa基因产物涉及p53的抑制，病毒mRNA的转运和宿主细胞蛋白质合成的切断。p53的抑制是通过由p53和腺病毒编码的E1B-55kDa蛋白的复合体和/或由E1B-55kDa和E4orf6的复合体的形成而发生。由TP53编码的p53是复合体调节机制的起点(Zambetti，G.P.等，FASEB J.7，855-865，1993)，其尤其导致病毒如腺病毒细胞复制的有效抑制。基因TP53在约50％的所有人肿瘤中缺失或突变，导致由化学疗法或放射疗法导致的期望细胞调亡的缺乏，致使通常不成功的肿瘤治疗。

[0004] 肿瘤裂解腺病毒的另一原理是基于发现即如果E1A蛋白以特定的缺失形式存在或包含一个或多个突变而不影响Rb/E2F和/或p107/E2F和/或p130/E2F的结合，该腺病毒将不诱导感染的细胞进入S期和能够在不含有功能Rb蛋白的肿瘤细胞中复制。另外，E1A蛋白可以在N-末端缺失和在E1A蛋白的1-76的氨基酸位置上分别包含一个或多个突变，以便抑制E1A与p300的结合和因此提供在肿瘤细胞中的选择性复制。这些方法在欧洲专利EP 0 931 830中以例举的方式描述。这些病毒的实例是AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07和CB016(Howe，J.A.等，Molecular Therapy 2，485-495，2000；Fueyo，J.等，癌基因19，2-12，2000；Heise，C.等，Nature Medicine 6，11341139，2001；Balague，C.等，J.Virol.75，7602-7611，2001)。这些在现有技术中已知用于溶癌作用的腺病毒系统因此包含E1A蛋白中不同的缺失，其中在以下假设下进行这些缺失：功能Rb蛋白和由无活性的Rb蛋白和E2F组成的复合体分别将阻断有效的体内复制和以便提供仅在Rb-阴性/突变细胞中的腺病毒体内复制。按照现有技术的这些腺病毒系统是基于E1A以便使用早期E2启动子(engl.E2早期启动子)和自由E2F(Dyson，N.Genes &Development，12，2245-2262，1998)控制体内复制。

[0005] 肿瘤裂解腺病毒系统的另一种形式是基于对特异性表达病毒癌基因E1A的选择性启动子的使用，其提供在肿瘤细胞中的选择性复制(Rodriguez，R.等，Cancer Res.57，2559-2563，1997)。

[0006] 如上所述，适于构成作用方式基础的各种原理的细胞背景的选择对于腺病毒肿瘤裂解病毒的各种原理是重要的。换句话说，只有当实现不同的分子生物学先决条件时才能使用当前已知的各种腺病毒系统。这限制这些系统应用于不同的患者群。

[0007] 一旦患者发展所谓的多药耐药性(engl.multidrug resistance(MDR))，出现治疗肿瘤疾病中的一个特殊问题，该多药耐药性代表肿瘤对细胞生长抑制剂抗性研究特别详尽的形式(Gottesman和Pastan，Annu.Rev.Biochem.62，385-427，1993)。它是基于膜结合转运蛋白P-糖蛋白的过量表达，该蛋白属于所谓的ABC转运蛋白(Stein，U.等，JBC 276，28562-69，2001，J.Wijnholds，Novartis Found Symp.，243，69-79，2002)。Bargou，R.C.等和Oda，Y.等(Bargou，R.C.等，Nature Medicine 3，447-450，1997；Clin.Cancer Res.4，
2273-2277，1998)能够显示人转录因子YB-1的核定位直接涉及P-糖蛋白表达的激活。进一步的研究证实YB-1通过各种胁迫条件如UV照射、细胞生长抑制剂的给药(Koike，K.等，FEBS Lett 17，390-394，1997)和过热(Stein，U.等，JBC 276，28562-69，2001)而转运到核内。进一步的研究证实YB-1的核定位对另一个ABC转运蛋白具有影响。该ABC转运蛋白称为MRP(engl.multidrug resistance-related protein)和涉及所谓的非典型非P-糖蛋白依赖性多药耐药性(Stein，U.等，JBC 276，28562-69，2001)的形成。

[0008] 构成本发明基础的问题是提供一种技术教导和特别是一种方法，其允许具体地使用肿瘤裂解活性剂治疗生物体，更具体地分别治疗人类生物体和一组患者。构成本发明基础的另一问题是提供适于在患者中导致肿瘤裂解的方法，所述患者患有抗细胞生长抑制剂的肿瘤疾病，特别是具有多药耐药性的那些。

[0009] 按照本发明在第一方面，通过使用病毒、优选腺病毒制备药物来解决该问题，其中病毒在核内不含有YB-1的细胞中复制缺陷，病毒编码癌基因或癌基因产物，优选癌基因蛋白质，其在YB-1核阳性细胞中反式激活至少一个病毒基因，优选腺病毒基因，其中基因选自包含E1B55kDa，E4orf6，E4orf3和E3ADP的组。

[0010] 在第二方面，通过使用病毒、优选腺病毒在核内含有YB-1的细胞中复制来解决该问题，其中病毒在核内不含有YB-1的细胞中复制缺陷，病毒编码癌基因或癌基因产物，特别是癌基因蛋白质，其反式激活至少一个病毒基因，优选腺病毒基因，其中基因选自包含E1B55kDa，E4orf6，E4orf3和E3ADP的组。

[0011] 在按照本发明的两种应用的实施方案中，病毒，优选腺病毒在核内含有YB-1的细胞中复制。

[0012] 在按照本发明的两种应用的另一实施方案中，病毒癌基因蛋白质是E1A和/或癌基因是编码E1A的基因和/或癌基因蛋白质是E1A。

[0013] 在优选实施方案中，病毒癌基因蛋白质E1A能够与功能Rb肿瘤抑制基因产物结合。

[0014] 在备选实施方案中病毒癌基因蛋白质E1A不能够与功能Rb肿瘤抑制基因产物结合。

[0015] 在按照本发明的两种应用的另一实施方案中，病毒癌基因蛋白质E1A不诱导YB-1的核定位。

[0016] 在按照本发明的两种应用的还有的另一实施方案中，药物是针对其细胞为Rb-阳性或Rb-阴性的患者。

[0017] 在优选实施方案中，细胞是涉及受药物影响的病症形成的那些细胞。

[0018] 在按照本发明的两种应用的另一实施方案中，细胞是Rb-阴性的和在核内YB-1阳性的，优选是独立于细胞周期的在核内YB-1阳性的。

[0019] 在按照本发明的两种应用的还有的另一实施方案中，药物用于治疗肿瘤。

[0020] 在按照本发明的两种应用的还有的另一实施方案中，细胞，特别是形成肿瘤或其部分的细胞，抗药物，特别是具有多药耐药性，优选对抗肿瘤剂的抗性，更优选对细胞生长抑制剂的抗性。

[0021] 在按照本发明的两种应用的优选实施方案中，细胞表达、优选过量表达膜结合转运蛋白P-糖蛋白和/或MRP。

[0022] 在按照本发明的两种应用的另一实施方案中，细胞是p53-阳性或p53-阴性。

[0023] 在按照本发明的两种应用的一个实施方案中，与野生型癌基因蛋白质E1A相比，癌基因蛋白质具有一个或数个突变或缺失，其中该缺失优选选自包含CR3区域的缺失和N末端的缺失以及C-末端的缺失的组。与其相关，优选E1A癌基因蛋白质可以与Rb结合。

[0024] 在按照本发明的两种应用的另一实施方案中，与野生型癌基因蛋白质相比，癌基因蛋白质具有一个或数个突变或缺失，其中该缺失优选在CR1区域和/或CR2区域。癌基因蛋白质E1A不能够结合Rb在本发明范围内。

[0025] 在按照本发明的两种应用的一个实施方案中，病毒癌基因蛋白质，特别是E1A在组织特异性和/或肿瘤特异性启动子的控制下。

[0026] 在按照本发明的两种应用的另一实施方案中，病毒，特别是腺病毒，编码YB-1。

[0027] 在按照本发明的两种应用的还有的一个实施方案中，YB-1在组织特异性和/或肿瘤特异性启动子的控制下。

[0028] 在按照本发明的两种应用的优选实施方案中，病毒，特别是腺病毒，编码至少一种选自包含E4orf6，E4orf3，E1B55K和腺病毒E3ADP蛋白的组。

[0029] 在按照本发明的两种应用的备选实施方案中，细胞在核内含有YB-1，特别是形成肿瘤或其部分的细胞在核内含有YB-1。

[0030] 在按照本发明的两种应用的另一实施方案中，经诱导YB-1转运至核内以后肿瘤在核内含有YB-1。

[0031] 在按照本发明的两种应用的优选实施方案中，通过至少一种选自以下各项的方法引发YB-1转运至核内：辐射，给药细胞生长抑制剂和过热。

[0032] 在按照本发明的两种应用的特别优选的实施方案中，将该方法应用于细胞，器官或生物体。

[0033] 在按照本发明的两种应用的优选实施方案中，病毒，特别是腺病毒，选自包含AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，dl1119/1131，CB 016，dl520的组和缺少表达的病毒E1A癌基因的病毒，该病毒E1A癌基因能够与功能Rb肿瘤抑制基因产物结合。

[0034] 在第三方面，通过使用病毒，优选腺病毒制备药物来解决该问题，其中设计病毒，优选腺病毒以便通过或借助YB-1通过激活E2-晚期启动子，优选主要通过激活E2-晚期启动子来控制复制。在一个实施方案中，YB-1是转基因YB-1或细胞的，特别是细胞解除管制的YB-1。转基因YB-1优选是指由载体在细胞中表达的YB-1，该载体优选为一种或上述的腺病毒。E2-晚期启动子优选是如在野生型腺病毒中存在的腺病毒E2-晚期启动子，或如本文所述与转基因表达相关的E2-晚期启动子。

[0035] 在第四方面，通过针对在核内含有YB-1的细胞的复制使用病毒，优选腺病毒来解决该问题，其中设计病毒，特别是腺病毒以便由YB-1通过激活E2-晚期启动子，优选主要通过激活E2-晚期启动子来控制复制。在一个实施方案中，YB-1是转基因YB-1或细胞的，特别是细胞解除管制的YB-1。在一个实施方案中，YB-1是转基因YB-1或细胞的，特别是细胞解除管制的YB-1。本文所用的转基因YB-1优选为在细胞中由载体表达的YB-1，该载体优选为一种或上述的腺病毒。E2-晚期启动子优选是如在野生型腺病毒中存在的腺病毒E2-晚期启动子，或如本文所述与转基因表达的应用相关的E2-晚期启动子。

[0036] 在本发明第三和/或第四方面的优选实施方案中，如本文所公开来设计腺病毒，特别是如此设计以便按照本发明使用。

[0037] 在第五方面，通过病毒癌基因蛋白质，特别是具有下列特性的分离的病毒癌基因蛋白质来解决该问题：

[0038] a)在YB-1核阳性细胞中反式激活至少一个病毒基因，该基因选自包含E1B-55K，E3ADP和E4orf6以及E4orf3的组；和

[0039] b)在核内，特别是在存在病毒癌基因蛋白质的细胞的核内缺乏YB-1的诱导。

[0040] 在一个实施方案中病毒癌蛋白质是E1A。

[0041] 在另一实施方案中，与野生型癌基因蛋白质相比，病毒癌基因蛋白质具有一个或数个突变或缺失，其中缺失优选选自包含CR3区域的缺失，N-末端的缺失和C-末端的缺失的组。

[0042] 在一个实施方案中，当E4orf6和/或E1B 55 kD不存在于显示核的细胞中时，缺乏通过病毒癌基因蛋白质的YB-1的诱导。

[0043] 与其相关，意欲病毒癌基因蛋白质能够结合Rb。

[0044] 在备选实施方案中，病毒癌基因蛋白质包含一个或数个突变或缺失，其中缺失优选在E1A癌基因蛋白质的CR1区域和/或CR2区域中。与其相关，意欲病毒癌基因蛋白质不能够结合Rb。

[0045] 在第六方面，本发明涉及病毒复制系统，优选腺病毒复制系统的应用，该病毒复制系统包含编码病毒、特别是按照本发明使用的腺病毒的核酸，并且包含一种辅助病毒的核酸，其中辅助病毒的核酸包含编码YB-1的核酸。

[0046] 在一个实施方案中，病毒核酸，特别是腺病毒核酸，和/或辅助病毒的核酸作为可以复制的载体存在。

[0047] 在第七方面，本发明涉及核酸在制备药物、特别是在制备治疗肿瘤的药物中的应用，该核酸编码病毒、特别是按照本发明使用的腺病毒。

[0048] 在一个实施方案中，细胞，特别是形成肿瘤或其部分的细胞对药物有抗性，特别是具有多药耐药性，所述药物优选抗肿瘤剂，更优选细胞生长抑制剂。

[0049] 在第八方面，本发明涉及核酸对核内含有YB-1的细胞的复制的应用，该核酸编码病毒、特别是按照本发明使用的腺病毒，其中病毒在核内不含有YB-1的细胞中复制缺陷，病毒编码癌基因或癌基因产物，其在YB-1核-阳性细胞中反式激活至少一个病毒基因，优选腺病毒基因，其中基因选自包含E1B55kDa，E4orf6，E4orf3和E3ADP的组。

[0050] 在第九方面，通过使用核酸制备药物来解决该问题，所述编码病毒、优选按照本发明使用的腺病毒，其中设计病毒以便由YB-1通过激活E2-晚期启动子，优选主要通过激活E2-晚期启动子来控制复制。在一个实施方案中，YB-1是转基因YB-1或细胞的，特别是细胞解除管制的YB-1。本文所用的转基因YB-1优选为在细胞中由载体表达的YB-1，该载体优选为一种或上述的腺病毒。E2-晚期启动子优选是如在野生型腺病毒中存在的腺病毒E2-晚期启动子，或如本文所述与转基因表达应用相关的E2-晚期启动子。

[0051] 在第十方面，通过针对细胞复制使用核酸解决该问题，该核酸编码病毒、特别是按照本发明使用的腺病毒，其中设计病毒以便由YB-1通过激活E2-晚期启动子，优选主要通过激活E2-晚期启动子来控制复制。在一个实施方案中，YB-1是转基因YB-1或细胞的，特别是细胞解除管制的YB-1。本文所用的转基因YB-1优选为在细胞中由载体表达的YB-1，该载体优选为一种或上述的腺病毒。E2-晚期启动子优选是如在野生型腺病毒中存在的腺病毒E2-晚期启动子，或如本文所述与转基因表达相关使用的E2-晚期启动子。

[0052] 在第十一方面，通过使用载体用于按照本发明第一或第二方面的应用来解决该问题，该载体包含一种前述核酸。

[0053] 在第十二方面，本发明涉及与YB-1相互作用的试剂在表征细胞、肿瘤组织细胞或患者中的应用，该表征是为了确定这些是否应当与病毒、特别是按照本发明使用的腺病毒接触和/或用其治疗。

[0054] 在一个实施方案中，试剂选自包含抗体，抗促成素(anticaline)，适体(aptamer)，aptazyme和spiegelmer的组。

[0055] 在第十三方面，通过使用按照本发明的病毒癌基因蛋白质或为此编码的核酸制备按照本发明第一和第二方面使用的病毒、特别是腺病毒来解决该问题。

[0056] 在一个实施方案中，病毒包含编码转基因的核酸。

[0057] 在另一实施方案中，病毒包含转基因的翻译产物和/或转录产物。

[0058] 在优选实施方案中腺病毒复制系统的核酸和/或辅助病毒的核酸包含转基因或编码转基因的核酸。

[0059] 在另外一个实施方案中，核酸包含转基因或编码转基因的核酸。

[0060] 在备选实施方案中转基因选自包含前药基因，细胞因子，诱导细胞调亡的基因，肿瘤抑制基因，金属蛋白酶抑制剂的基因和血管生成抑制剂的基因的组。

[0061] 在一个实施方案中，转基因选自包含关于siRNA、适体、反义分子和核酶的核酸的组，其中siRNA、适体、反义分子和/或核酶是靶向靶分子。

[0062] 在另一实施方案中，靶分子选自包含抗性相关因子，抗细胞调亡因子，癌基因，血管生成因子，DNA合成酶，DNA修复酶，生长因子和它们的受体，转录因子，金属蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶，和尿激酶类型的纤溶酶原激活物的组。在一个实施方案中，抗性相关因子优选选自包含P-糖蛋白，MRP和GST的组，而且还包含编码其的核酸。在一个实施方案中，抗细胞调亡因子选自包含BCL2的组，并且还包含编码其的核酸。在一个实施方案中，癌基因选自包含Ras，特别是突变的Ras，Rb和Myc的组，还包含编码其的核酸。在一个实施方案中，血管生成因子选自包含VEGF和HMG蛋白的组，还包含编码其的核酸。在一个实施方案中，DNA合成酶选自包含端粒酶的组，还包含编码其的核酸。在一个实施方案中DNA修复酶选自包含Ku-80的组，还包含编码其的核酸。在一个实施方案中，生长因子选自包含PDGF，EGF和M-CSF的组，还包含编码其的核酸。在一个实施方案中，受体特别是生长因子的受体，其中生长因子优选选自包含PDGF，EGF和M-CSF的组，还包含编码其的核酸。在一个实施方案中，转录因子选自包含YB-1的组，还包含编码其的核酸。在一个实施方案中，金属蛋白酶优选为基质金属蛋白酶。在优选实施方案中，基质金属蛋白酶选自包含MMP-1和MMP-2的组，还包含编码其的核酸。在一个实施方案中，尿激酶类型的纤溶酶原激活物选自包含uPa-R的组，还包含编码其的核酸。

[0063] 在还有另一实施方案中，药物另外包含至少一种药物活性化合物。

[0064] 在优选实施方案中，药物活性化合物选自包含细胞因子，金属蛋白酶抑制剂，血管生成抑制剂，细胞生长抑制剂和细胞周期抑制剂的组。

[0065] 本发明是基于意外的发现即，E1A-修饰的腺病毒在YB-1核阳性肿瘤细胞中的DNA复制是基于E2-晚期启动子的激活。本文所用的E1A-修饰的腺病毒是这种腺病毒，其(a)在YB-1核-阴性细胞中不复制或与各种野生型相比，在YB-1核-阴性细胞中显示减少的优选强烈减少的复制，(b)反式激活至少一种病毒基因，其中基因特别选自包含E1B-55kDa，E4orf6，E4orf3和E3ADP的组，和/或(c)不将细胞YB-1通过腺病毒转移至核内。任选地按照本发明使用的腺病毒具有另外的特性即，腺病毒编码的E1A蛋白的结合干扰E2F与Rb的结合和能够分别分解由E2F和Rb组成的各种复合体。具有一个或数个前述特征a)至c)、优选全部特征a)至c)的腺病毒在核内不含有YB-1的细胞中复制缺陷。

[0066] 在一个实施方案中，本文所用的强烈减少的复制具体地是指与野生型相比，复制减少2倍，优选5倍，更优选10倍和最优选100倍。在优选实施方案中，使用相同或相似的细胞系，相同或相似的感染的病毒效价(感染复数，MOI，或蚀斑形成单位，pfu)和/或相同或相似的常规实验条件来进行这种复制比较。本文所用的复制特别是指颗粒的形成。在另一实施方案中复制的测量可以是病毒核酸合成的程度。测定病毒核酸合成的程度的方法以及测定颗粒形成的方法为本领域技术人员所已知。

[0067] 本文所述的发现，方法，应用或核酸，蛋白质，复制系统等不一定限于腺病毒。原则上，这些系统还存在于也包含于此的其它病毒中。

[0068] 当按照本发明使用病毒时或当使用按照本发明于此所述的病毒时，在与按照现有技术10-100pfu/细胞相比的1-10pfu/细胞的感染率下可以实现比得上野生型复制的复制。

[0069] 本文所用的细胞YB-1应当是指由细胞编码和优选还由细胞表达的任何YB-1，其中优选在用腺病毒优选如本文所述的腺病毒和/或辅助病毒感染各个细胞之前该YB-1存在细胞中。然而，细胞YB-1是引入细胞的或通过施加外部措施如例如用病毒、特别是腺病毒感染以后由这些细胞生产的YB-1也属于本发明的范围内。

[0070] 以下不希望受此束缚，本发明人假定E2-早期启动子，即早期E2启动子不通过与按照本发明本文所用的病毒复制相关的人细胞E2F转录因子开放。复制的开关独立于细胞的Rb状态，即意味着使用本文公开的病毒感染的和优选随后裂解的肿瘤细胞可以包含功能的以及无活性的Rb蛋白。另外，当使用本文公开的腺病毒或在本文公开的条件下时，腺病毒复制不需要任何功能p53蛋白，也不受其存在的影响。如此，该技术教导背离构成肿瘤消解或肿瘤裂解的腺病毒的应用基础的原理，所述腺病毒为AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB016类型或例如在欧洲专利EP 0 931 830中描述的那些腺病毒，其中在以下假设下在E1A蛋白中已经引入一个或数个缺失：完好的功能Rb蛋白是体内有效复制的阻碍物，因此分别仅在Rb-阴性和Rb-突变细胞中提供腺病毒的体内复制。按照现有技术的这些腺病毒系统是基于E1A以便通过早期E2启动子(E2早期启动子)和“自由E2F”控制腺病毒的体内复制。然而，按照本发明可以使用按照现有技术的这些病毒，即用于在核内包含YB-1的细胞的独立于细胞周期的复制。

[0071] 按照本发明可以使用在所述欧洲专利EP 0 931 830中描述的病毒和特别是腺病毒。更具体地，在所述专利中描述的病毒是复制缺陷的和缺乏表达的能够结合功能Rb肿瘤抑制基因产物的病毒癌蛋白质。腺病毒可以具体地为缺乏表达的病毒E1A癌蛋白质的腺病毒，该E1A癌蛋白质能够结合功能肿瘤抑制基因产物，特别是Rb。病毒E1A癌蛋白质可以包含失活突变，例如在CR1结构域中Ad5的氨基酸位点30-85，核苷酸位点697-790和/或CR2结构域中Ad5的氨基酸位点120-139，核苷酸位点920-967，其涉及p105 Rb蛋白，p130和p107蛋白的结合。还可以意欲腺病毒是类型2的dl 312或腺病毒是类型5的NT dl 1010。

[0072] 当使用按照本发明的腺病毒制备药物，特别是制备治疗肿瘤疾病的药物时，和当使用按照本发明的腺病毒用于在核内含有YB-1的细胞的复制时，复制最终在核内包含YB-1的细胞中发生，该细胞优选独立于细胞周期，其因此是YB-1核-阳性。特别值得注意的是，如此的腺病毒在核内不含有YB-1而基本上仅在细胞质中含有YB-1的细胞中不复制或以显著降低的水平上复制。因此对于这些病毒的成功复制在核内需要YB-1存在。例如如在下面更详细地概述，这可以通过对细胞施加措施导致YB-1在核内表达或YB-1在核内存在来实现。各种措施可以例如分别是YB-1通过按照本发明使用的腺病毒的编码和表达，该腺病毒除了腺病毒基因以外还包含编码YB-1和特别是YB-1表达的遗传信息。导致细胞核内YB-1转运、诱导或表达的其它措施是胁迫条件如向细胞和包含该细胞的生物体施加细胞生长抑制剂，照射，过热等。

[0073] 进一步表征按照本发明使用的、特别是用于肿瘤裂解的腺病毒，以使它们在核内不含有YB-1的、换句话说YB-1核-阴性的细胞中不复制。

[0074] 按照本发明使用的腺病毒的另一特征是它们编码在此也称为癌基因蛋白质的病毒癌蛋白质，其中癌基因蛋白质优选为E1A，其中癌基因蛋白质能够激活至少一个对病毒复制和/或受病毒感染细胞的细胞裂解有影响的病毒基因。优选对复制的影响是这样的即，与其中各种病毒的癌基因蛋白质缺失的情形相比在癌基因蛋白质存在下病毒复制更好。该过程在本文中也称为反式激活和当反式激活是通过E1A介导时具体地E1A反式激活。术语“转活”或“反式激活”优选描述以下过程，即各种病毒癌蛋白质对一个或多个不同于编码病毒癌蛋白质基因本身的其它基因的表达和/或转录有影响，即优选控制其表达和/或翻译，特别是激活这/这些。这些病毒基因分别优选为E1B55kDa，E4orf6，E4orf3和E3ADP以及前述基因和基因产物的任何组合。

[0075] 按照本发明使用的腺病毒的另一个尽管优选任选的特征是结合肿瘤抑制剂Rb。原则上按照本发明使用的腺病毒与Rb结合或不与Rb结合也在本发明范围内。两种腺病毒备选实施方案的应用可能独立于待处理细胞的Rb状态。

[0076] 为了赋予不与Rb结合的能力，E1A癌蛋白质的下列缺失例如是可能的：CR1区域(Ad5中氨基酸位点30-85)的缺失和CR2区域(AD5中氨基酸位点120-139)的缺失。在进行过程中，CR3区域被保持和可具有其对其它早期病毒基因的反式激活功能。

[0077] 与此对比，为了给予E1A结合Rb的能力，下列对E1A癌蛋白质的缺失原则上是可能的：CR3区域(氨基酸位点140-185)的缺失；N-末端(氨基酸位点1-29)的缺失；氨基酸位点85-119的缺失；和C-末端(氨基酸位点186-289)的缺失。这里所述的区域不干扰E2F与Rb的结合。然而与野生型Ad5相比反式作用功能仍然降低。

[0078] 在现有技术中已知的这些病毒通常认为是复制缺陷型。然而本发明人的贡献在于他已经发现它们仍然能够在适当背景下特别是细胞背景下复制。YB-1在核内的存在，优选独立于细胞周期的YB-1在核内的存在产生或提供该适当的细胞背景。本文所用的术语细胞或细胞系统包含细胞碎片或细胞裂解物的级分以及体外、体内或原位的细胞。其中，术语细胞系统或细胞还包含分别存在于细胞培养物、组织培养物、器官培养物或其它任何体内和原位组织或器官中的细胞，其为分离的，成组或作为组织、器官或生物体的一部分，或者也如此在优选的活体中存在。生物体优选为脊椎生物和更优选哺乳动物。特别优选生物体是人生物体。

[0079] 另外，还属于本发明范围内的是，基于本文提供的技术教导，产生新病毒，该病毒具有本文所述腺病毒以及YB-1核-阳性细胞中现有技术的腺病毒之一的复制特性。换句话说，优选从已经已知的腺病毒开始，可以设计另外的病毒，其具有对于按照本发明应用所需的本文定义的特征。

[0080] 与本发明相关，按照本发明使用的各种腺病毒的修饰的E1A癌蛋白质能够在YB-1核-阳性细胞中反式激活早期病毒基因，如例如E1B55K，E4orf3，E4orf6，E3ADP。与其相关，优选对病毒基因组无另外的其它改变，各种腺病毒可以另外对应于野生型的腺病毒或其衍生物。

[0081] 在本文中公开的编码反式激活本发明意义上的癌基因蛋白质或包含该癌基因蛋白质的病毒，包含例如腺病毒AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB106和/或在欧洲专利EP0 931 380中所述的腺病毒，其各自能够反式激活早期基因，如E1B，E2，E3和/或E4，并且比得上野生型腺病毒，特别是野生型Ad5。E1A蛋白的特定区域负责这些情形中的反式激活。在各种腺病毒血清型中在E1A蛋白中存在3个高度保守的区域。氨基酸位点41-80的CR1区域，氨基酸位点120-139的CR2区域和氨基酸位点140-188的CR3区域。反式激活功能主要基于E1A蛋白中CR3区域的存在。CR3的氨基酸序列在前述腺病毒中未改变。这导致早期基因E1B，E2，E3和E4的反式激活，其独立于核或细胞质中YB-1的存在。

[0082] 然而在重组腺病毒dl520中，CR3区域已经缺失。因此dl520表达所谓的E1A12S蛋白，其不包含CR3区域的氨基酸序列。结果，dl520仅可以发挥极弱的反式激活功能，特别是对E2区域，因此在YB-1核-阴性细胞中不复制。在YB-1核-阳性细胞中YB-1反式激活E2区域和因此允许dl520的有效复制。这分别是为了本文公开目的的系统如dl520和基于dl520的系统的应用基础。前述腺病毒组，即δ24(本文也称为AdΔ24)和dl520间的另一重要区别在于事实即与YB-1核-阴性细胞相比，在YB-1核-阳性细胞中早期基因E1B，E3和E4被dl520更强烈地反式激活。相反，使用δ24没有或仅有微小差异。然而，与野生型腺病毒相比，dl520和更具体地E1A12S蛋白的反式激活作用显著降低。然而该反式激活是足够的，以便允许在YB-1核-阳性细胞中有效复制，如实施例10所示。在此和特别是在上下文中描述的E1A蛋白和编码其的核酸的设计以便E1A蛋白与野生型癌基因蛋白质E1A相比具有一个或数个缺失和/或突变，其中缺失优选是选自包含CR3区域的缺失和N-末端的缺失和C-末端的缺失的组，包括和特别优选如与dl520或AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB106相关所述的E1A蛋白的那些实施方案，和/或在欧洲专利EP 0 931 830中所述腺病毒，这些是病毒特别是腺病毒的实施方案，其复制由YB-1通过激活E2-晚期启动子、优选主要通过激活E2-晚期启动子控制。基于本文提供的公开内容本领域技术人员可以产生E1A蛋白的另外的允许这种腺病毒复制形式的实施方案。

[0083] 在新构建的另外的腺病毒中，其在本文中也称为衍生物和可以按照本发明使用，典型地具有E1缺失，E1/E3缺失和/或E4缺失，即相应的腺病毒分别不能产生功能活性的E1和/或E3和/或E4表达产物和各自的产物，或者换句话说，这些腺病毒仅能够产生在功能上无活性的E1，E3和/或E4表达产物，其中功能上无活性的E1，E3和/或E4表达产物因而或者作为表达产物根本不存在，无论是转录水平和/或翻译水平，或者它以至少缺少一种在野生型腺病毒中具有的功能的形式存在。野生型腺病毒表达产物的功能为本领域技术人员所已知，例如在Russell，W.C.，Journal of Virology，81，2573-2604，2000中描述。Russell(上文)也描述构建腺病毒和腺病毒载体的原理，其结合于此作为参考。还属于本发明范围内的是，修饰的E1A癌蛋白质，E1B-55K，E4orf6和/或E3ADP(腺病毒死亡蛋白(ADP))(Tollefson，A.等，J.Virology，70，2296-2306，1996)在这样的载体中单独或以任何组合表达。与其相关，单独命名的基因以及本文公开的转基因可以克隆到E1和/或E3和/或E4区域中，并且可以借助适当启动子或在适当启动子的控制下单独地表达。基本上，区域E1，E3和E4类似地适合作为腺病毒核酸内的克隆位点。适当的启动子尤其是与E1A、特别是修饰的E1A的控制和表达分别有关的在本文中公开的那些。

[0084] 最后，在一个实施方案中，按照本发明使用的腺病毒是关于E1B、特别是E1B19kDa缺陷型的。如本文所用，术语缺陷型通常是指其中E1B不具有所有的野生型内在特性、但是缺乏这些特征中的至少一个的状况。

[0085] 在本文中公开的按照本发明使用的腺病毒基本上在本领域的一些实施方案中已知。按照本发明使用的腺病毒优选是重组腺病毒，特别还当与野生型相比按照本文提供的技术教导已经进行变化时。缺失或突变对于本发明不是关键性的那些腺病毒核酸序列也在本领域那些技术人员的范围内。如本文所述，这些缺失可以例如与编码E3和E4的核酸的一部分有关。如果这些缺失不延伸至蛋白质E4orf6，特别优选E4缺失，换句话说，按照本发明使用的腺病毒编码E4orf6。在优选实施方案中，这些腺病毒核酸可以还包装成病毒衣壳和可以因此形成感染性的颗粒。对按照本发明的核酸的应用同样如此。应当注意通常腺病毒系统可以缺失单个或数个表达产物。与此相关，应当考虑这可能是基于事实即编码该表达产物的核酸完全被突变或缺失或突变或缺失至基本上不再生产表达产物的程度，或者基于控制表达的启动子或转录因子的缺少，或者其分别在核酸水平上(缺少启动子；顺式-作用元件)或在翻译系统和转录系统水平上(反式-作用元件)以不同于野生型的方式有活性。特别是稍后方面可能依赖于细胞背景。

[0086] 除了使用已经已知的按照本发明的腺病毒以外，还可以以与对已经公开的本文所述其它腺病毒相同程度使用新的腺病毒。按照本发明的新的腺病毒产生于本文提供的技术教导。特别优选的代表是例如在图16和图17中描述的病毒Xvir03和Xvir03/01，其设计原理也进一步在实施例11和12中举例说明。

[0087] 在载体Xvir03的情形中，将CMV启动子克隆到E1区域中，该E1区域编码被IRES序列分开的E1B 55K和E4orf6的核酸。由于这两个基因和由其生产的基因产物的分别引入，产生复制缺陷型，其确实地相当于一种野生型病毒，其中细胞、特别是肿瘤细胞保持了复制的选择性，在具体地在YB-1核-阳性细胞和更具体地在YB-1被解除管制的细胞中发生复制的范围内。其中YB-1被解除管制的细胞优选与正常或非肿瘤细胞相比显示增加的YB-1表达，优选与隔室无关的那些。

[0088] 病毒Xvir03的另外发展是病毒Xvir03/01，其中在优选实施方案中治疗基因或转基因在特定启动子、尤其是肿瘤特异性或组织特异性启动子的控制下被克隆。还在该病毒范围内的是E4区域也是功能上无活性的，优选缺失。本文所述的转基因也可以克隆到E4区域中，其中这可以除了转基因克隆到E3区域中以外或作为其备选而发生。

[0089] 该治疗基因可以是前药基因，细胞因子的基因，诱导细胞调亡的基因，肿瘤抑制基因，金属蛋白酶抑制剂和/或血管生成抑制剂的基因。另外，siRNA，适体，反义和核酶可以过量表达，其直接针对癌症相关的靶分子。优选地，单个或多个靶分子选自包含抗性相关因子，抗细胞调亡因子，癌基因，血管生成因子，DNA合成酶，DNA修复酶，生长因子和它们的受体，转录因子，金属蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶和尿激酶类型的纤溶酶原激活物的组。其优选的实施方案已经在本文中公开。

[0090] 可以用于优选实施方案中的可能的前药基因是例如，胞嘧啶脱氨酶，胸苷激酶，羧肽酶，尿嘧啶磷酸核糖基转移酶；嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)；Kirn等，Trends in Molecular Medicine，卷8，No.4(增刊)，2002；WybranietzW.A.等，Gene Therapy，8，1654-1664，2001；Niculescu-Duvaz等，Curr.Opin.Mol.Therapy，1，480.486，1999；Koyama等，Cancer Gene Therapy，7，1015-1022，2000；Rogers等，Human Gene Therapy，7，2235-2245，1996；Lockett等，Clinical Cancer Res.，3，2075-2080，1997；Vijayakrishna等，J.Pharmacol.And Exp.Therapeutics，304，1280-1284，2003。

[0091] 可以用于优选实施方案中的可能的细胞因子是例如，GM-CSF，TNF-α，Il-12，I1-2，Il-6，CSF，干扰素-γ；Gene Therapy，Advances in Pharmacology，卷40，编辑：J.Thomas August，Academic Press；Zhang und Degroot，Endocrinology，144，1393-1398，
2003；Descamps等，J.Mol.Med.，74，183-189，1996；Majumdar等，Cancer Gene Therapy，7，
1086-1099，2000。

[0092] 可以用于优选实施方案中的可能的细胞调亡诱导基因是例如核心蛋白聚糖：Tralhao等，FASEB J，17，464-466，2003；成视网膜细胞瘤94：Zhang等，Cancer Res.，63，
760-765，2003；Bax和Bad：Zhang等，Hum.Gene Ther.，20，2051-2064，2002；细胞凋亡素(apoptin)：Noteborn 和 Pietersen，Adv.Exp.Med.Biol.，465，153-161，2000)；ADP：Toth等，Cancer Gene Therapy，10，193-200，2003；bcl-xs：Sumantran 等，Cancer Res，55，
2507-2512，1995；E4orf4：Braithwaite 和 Russell，Apoptosis，6，359-370，2001；FasL，Apo-1 和 Trail：Boehringer Manheim，Guide to Apoptotic Pathways，Arai 等，PNAC，
94，13862-13867，1997；Bims；Yamaguchi 等，Gene Therapy，10，375-385，2003；GNR163：
Oncology News，17Juni，2000。

[0093] 可以用于优选实施方案中的可能的肿瘤抑制基因是例如E1A，p53，p16，p21，p27，MDA-7。Opalka 等，Cell Tissues Organs，172，126-132，2002，Ji 等，Cancer Res.，59，3333-3339，1999，Su等，癌基因，22，1164-1180，2003。

[0094] 可以用于优选实施方案中的可能的血管生成抑制剂是例如血管内皮抑素(endostatin)，血管生长抑素(angiostatin)：Hajitou等，FASEB J.，16，1802-1804，2002，和针对VEGF的抗体(Ferrara，N.，Semin Oncol 2002Dec；29(6 Suppl 16)：10-4。

[0095] 可以用于优选实施方案中的可能的金属蛋白酶抑制剂是例如Timp-3，Ahonen等，Mol Therapy，5，705-715，2002；PAI-1；Soff 等，J.Clin.Invest.，96，2593-2600，1995；Timp-1，Brandt K.Curr.Gene Therapy，2，255-271，2002。

[0096] SiRNA(短干扰RNA)由2条、优选2条分开的RNA链组成，其由于碱基互补性而彼此杂交，即其基本上碱基配对和优选具有高达50个核苷酸，优选18-30个核苷酸，更优选少于25个核苷酸和最优选21，22或23个核苷酸的长度，其中这些数字是指siRNA的单链，特别是单链一段序列的长度，该单链分别与一条具体地与第二条单链杂交并与其碱基配对。SiRNA具体地诱导或介导mRNA的降解。siRNA和因此它的结合位点的序列提供其所需的特异性。待降解的靶序列基本上与siRNA形成链的第一或第二条链互补。尽管作用的确切方式还不清楚，推测siRNA代表细胞在发育期间抑制某些等位基因和保护其自身免于病毒的生物学策略。siRNA介导的RNA干扰用于通过引入基因特异的双链RNA来特异性抑制或甚至完全剔除蛋白质的表达。对于高等生物因此特别优选具有19-23个核苷酸长度的siRNA，因为它不导致非特异性防御反应，所谓白介素应答的激活。由21个在3’末端具有对称的2-nt长的突出端的核苷酸组成的双链RNA的瞬时转染能够介导哺乳动物细胞中的RNA干扰，并且与其它技术如核酶和反义分子相比高效(Elbashir，S.Harborth J.Lendeckel W.Yalvcin，A.Weber K Tuschl T：Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells.Nature 2001，411：494-498)。仅需要极少siRNA分子以抑制靶基因的表达。为了避免外源施用的siRNA的限制，该限制特别在于干扰现象和siRNA分子特异性传递的瞬时性质，现有技术使用允许内源性siRNA表达的载体。例如，提供具有64个核苷酸长度的寡核苷酸，其包含19个核苷酸长的靶序列，正义和反义方向，通过例如引入载体的9个核苷酸长的间隔序列分开。产生的转录物折叠成发卡结构，其例如具有19个碱基对的茎结构。环快速在细胞中降解以便产生功能siRNA(Brummelkamp等，Science，296，550-553，2002)。

[0097] pRb和E2F的活性分别通过磷酸化调节。pRb的低磷酸化形式主要存在于G1和M期。相反，pRb的超磷酸化形式存在于S和G2期。通过pRb的磷酸化从由E2F和低磷酸化的pRb组成的复合体中释放E2F。E2F从由E2F和低磷酸化的pRb组成的复合体中的释放导致E2F依赖性基因的转录。E1A蛋白不仅结合低磷酸化形式的pRb，其中E1A与pRb的结合大部分通过E1A蛋白的CR2区域发生。另外，它还与CR1区域结合，尽管亲和力较低(Ben-Israel 和 Kleiberger，Frontiers in Bioscience，7，1369-1395，2002；Helt 和Galloway，Carcinogenesis，24，159-169，2003)。

[0098] 在按照本发明使用的腺病毒的一个实施方案中，编码YB-1的核酸是腺病毒的一部分，也可以包含介导YB-1转运至核内的核酸序列。按照本发明的核酸，腺病毒和腺病毒系统以及现有技术已知的腺病毒如例如Onyx-015，AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB016，dl520和在专利EP 0 931830中描述的腺病毒可以照这样使用或与按照本发明与其结合的这些核酸结合作为腺病毒和腺病毒系统和因此作为相应的核酸使用。介导核转运的适当的核酸序列为本领域技术人员所已知，例如在(Whittaker，G.R.等，Virology，246，1-23，1998；Friedberg，E.C.，TIBS 17，347，1992；Jans，D.A. 等，Bioessays 2000Jun；22(6)：
532-44；Yoneda，Y.，J.Biocehm.(Tokyo)1997May；121(5)：811-7；Boulikas，T.，Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.1993；3(3)：193-227；Lyons RH，Mol.Cell Biol.，7，2451-2456，
1987)中描述。与介导核转运的核酸序列相关，可以使用不同的原理。一种这样的原理可以例如是YB-1与信号肽一起形成融合蛋白，导入核内，按照本发明的腺病毒的复制于是发生。

[0099] 可以在按照本发明使用的腺病毒的设计中实现的另一原理是可以提供YB-1转运蛋白序列，其优选从细胞质中的合成开始，将YB-1导入细胞核内或者将YB-1转移至细胞核内，并促进那的病毒复制。介导核转运具体有效的核酸序列的实例是HIV的TAT序列，其尤其适合在Efthymiadis，A.，Briggs，LJ，Jans，DA.，JBC 275，1623-1628，1998中描述的那种类型的核酸序列。属于本发明范围内的是，按照本发明使用的腺病毒包含编码肽的核酸序列，该肽编码核转运。

[0100] 属于本发明范围内的是，YB-1以全长，特别是以对应于野生型YB-1的形式存在。属于本发明范围内的是，YB-1作为衍生物，如例如缩短或截短形式使用或存在。在本发明内使用或存在的YB-1衍生物是能够结合E2-晚期启动子和因此激活腺病毒E2区域基因表达的YB-1。该衍生物特别包含本文公开的YB-1衍生物。通过在N-末端、在C-末端或在氨基酸序列内缺失单个或数个氨基酸可以产生另外的衍生物。

[0101] 关于前述各种另外表达的由腺病毒编码的基因和基因产物，还可能这些分别以任何组合编码和以任何组合表达。

[0102] 术语腺病毒和腺病毒系统在本发明中应当具有基本上相同的含义。腺病毒应当特别是指包含衣壳和核酸的完整病毒颗粒。术语腺病毒系统特别集中于事实即与野生型相比应当改变核酸。优选这些变化包含腺病毒基因组结构的变化，如由缺失和/或增加和/或突变启动子、调节序列和/或编码序列如可读框产生。另外，术语腺病毒系统优选与例如用于基因治疗的载体结合使用。

[0103] 前面提供的说明，分别包括腺病毒和腺病毒系统的任何应用以及设计，也适用于编码的核酸，反之亦然。

[0104] 按照本发明可能的是，按照本发明使用的腺病毒和编码其的核酸分别可以是任何各自的腺病毒核酸，该腺病毒核酸照这样或与另外的核酸序列结合导致复制事件。如本文所释，可能通过辅助病毒提供复制所需的序列和/或基因产物。在提及编码核酸序列方面和在该核酸序列已知方面，在本发明范围内的是不仅使用相同的序列，而且使用其衍生的序列。术语衍生序列在本文中应当特别是指仍产生基因产物(核酸或多肽)的序列，其显示对应于非衍生序列的一种功能。这可以通过本领域技术人员已知的简单常规试验确定。该衍生的核酸序列的实例是编码相同基因产物，特别是相同氨基酸序列的那些核酸序列，然而，由于遗传密码的简并性具有偏离的碱基序列。

[0105] 在优选实施方案中，关于分别按照本发明的腺病毒和按照本发明的腺病毒复制系统和按照本发明它们的应用，腺病毒核酸缺乏癌基因蛋白质、特别是E1A蛋白的表达，这意味着它或者不编码12S E1A蛋白或13S E1A蛋白，或者它即不编码12S E1A蛋白又不编码13S E1A蛋白，或被修饰，如本文所定义，腺病毒复制系统另外包含辅助病毒的核酸，其中辅助病毒的核酸包含编码癌基因蛋白质的、特别是E1A蛋白的核酸序列，其具有下列特性和分别赋予腺病毒下列特性，即它优选不在YB-1核-阴性细胞中复制而在独立于细胞周期的YB-1核-阳性细胞中复制，在YB-1核-阳性细胞中反式激活至少一个病毒基因，特别是E1B55kDa，E4orf6，E4orf3和/或E3ADP，和/或不将细胞YB-1转移至核内。在本发明范围内的是，本文所述转基因由辅助病毒单独或一起编码和/或由其表达。

[0106] 在按照本发明的这种腺病毒复制系统的一个实施方案中，腺病毒核酸和/或辅助病毒的核酸另外作为能够复制的载体存在。

[0107] 属于本发明范围内的是，编码按照本发明使用的腺病毒的编码核酸存在载体中，优选表达载体中，该表达载体按照本发明使用。

[0108] 在另一方面，本发明还涉及包含至少两个载体的载体组，其中载体组包含如本文所述的完全的腺病毒复制系统，按照本发明使用载体组。意欲腺病毒复制系统的每种元件排列在单个载体、优选表达载体上。

[0109] 另外，本发明另一方面涉及为了本文所述相同目的的细胞对腺病毒的应用，其中细胞包含一个或数个核酸和/或各自的腺病毒复制系统和/或各自的载体和/或按照本发明的载体组，所述核酸编码本文所述的按照本发明使用的腺病毒。

[0110] 前述腺病毒构建体和特别是它们的核酸和编码其的核酸，可以分份导入细胞，特别是肿瘤细胞中，于是由于各种单独元件的存在，它们可以这样一起作用，好像单个元件分别来源于单个核酸和单个或数个腺病毒。

[0111] 按照本发明使用的编码腺病毒、腺病毒系统或其部分的核酸可以作为载体存在。优选地，它们可以作为病毒载体存在。在包含腺病毒核酸的核酸的情形中，病毒颗粒优选为载体。然而，也在本发明范围内的是，所述核酸以质粒载体存在。在任何情形中载体包含分别提供插入核酸增殖(即复制)和插入核酸任选表达和控制它们的元件。适当的载体，特别是表达载体和对应的元件是本领域技术人员已知的，例如在Grunhaus，A.，Horwitz，M.S.，
1994，Adenoviruses as cloning vectors.In Rice，C.，edit.，Seminars inVirology，London：Saunders Scientific Publications中描述。

[0112] 本发明涉及载体组的方面说明前述实施方案，核酸的各种元件不一定仅包含在一个载体上。因此，载体组包含至少两个载体。另外，关于载体所述的也分别适用于载体和载体组。

[0113] 按照本发明使用的腺病毒其特征分别在于本文公开的各种核酸和基因产物，并可以另外包含所有那些本领域技术人员已知的元件，如对于野生型腺病毒同样如此(Shenk，T.：Adenoviridae：The virus and their replication.Fields Virology，第三版，edit.Fields，B.N.，Knipe，D.M.，Howley，P.M.等，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996，第67章)。

[0114] 腺病毒的复制是非常复杂的过程，通常利用人转录因子E2F。首先在病毒复制期间，表达“早期基因”E1，E2，E3和E4。“晚期基因”组负责病毒结构蛋白的合成。对于早期以及晚期基因的激活，由编码不同的E1A和E1B蛋白的两个转录单元E1A和E1B组成的E1区域是关键的，因为E2，E3和E4的转录由它们诱导(Nevins，J.R.，Cell 26，213-220，1981)。另外，E1A蛋白可以诱导剩余细胞中的DNA合成，和因此开始进入S期(c.f.Boulanger和Blair，1991)。另外，它们与Rb类的肿瘤抑制剂相互作用(Whyte，P.等，Nature 334，
124-127，1988)。在这种情况下，释放细胞转录因子E2F。E2F因子可以随后结合细胞以及病毒基因的相应的启动子区域(特别是腺病毒E2早期启动子)和其中引发转录和复制(Nevins，J.R.，Science258，424-429，1992)。

[0115] 复制的引发和完成分别特别需要E2区域的基因产物，因为它们编码三个关键蛋白。E2蛋白的转录受两个启动子控制，“E2-早期E2F-依赖型”启动子，其在本文中也称为E2-早期启动子或早期E2启动子，和“E2-晚期”启动子(Swaminathan和Thimmapaya，The Molecular Repertoire ofAdenoviruses III：Current Topics in Microbiology and Immunology，卷199，177-194，Springer Verlag 1995)。另外，E4区域的产物与E1A和E1B-55kDa蛋白一起分别对E2F的活性和p53的稳定性起重要作用。例如，通过由E4区域编码的E4orf6/7与由E2F和DP1组成的杂二聚体直接相互作用更加激活启动子(Swaminathan和Thimmapaya，JBC 258，736-746，1996)。另外，由E1B-55kDa和E4orf6组成的复合体使p53失活(Steegenga，W.T.等，Oncogene 16，349-357，1998)，以便成功完成裂解性感染周期。另外，E1B-55kDa蛋白显示另一重要功能，即它通过与E4orf6蛋白相互作用促进病毒RNA从核中输出，其中细胞所有的RNA保持在核内(Bridge和Ketner，Virology 174，345-353，1990)。另一个重要发现是，由E1B-55kDa/E4orf6组成的蛋白质复合体定位于所谓的“病毒内含体”。推测这些结构是复制和转录的位点(Ornelles和Shenk，J.Virology 65，424-429，1991)。

[0116] 对于复制和特别是对于腺病毒释放重要的另一区域是E3区域。E3区域更具体地包含多种较小蛋白的遗传信息，该较小蛋白不是腺病毒体外感染周期所必需的，即在细胞培养中不是必需的。然而，它们对于体内急性和/或潜伏侵染期间病毒的存活起重要作用，因为它们尤其具有免疫调节和细胞调亡功能(Marshall S.Horwitz，Virololgie，279，1-8，2001；Russell，上文)。可以表明具有约11.6kDa的蛋白质诱导细胞死亡。由于其功能，该蛋白质称为ADP-英文术语腺病毒死亡蛋白-(Tollefson，J.Virology，70，2296-2306，1996)。
该蛋白质主要在感染周期的晚期形成。另外，蛋白质的过量表达导致感染细胞的更好裂解(Doronin等，J.Virology，74，6147-6155，2000)。

[0117] 另外，本发明人已知E1A缺失病毒，即具体地不含有12S E1A蛋白质和也不表达13S E1A蛋白质的病毒可以在较高MOI下非常高效的复制(Nevins J.R.，Cell 26，213-220，1981)，其然而不能在任何临床应用中实现。该现象在文献中称为“类E1A活性”。
还已知从E1A编码的5个蛋白中，两个蛋白，即12S和13S蛋白，分别控制和诱导其它腺病毒基因的表达(Nevins，J.R.，Cell 26，213-220，1981；Boulanger，P.und Blair，E.；
Biochem.J.275，281-299，1991)。与其相关，显示反式激活功能主要由13S蛋白的CR3区域提供(Wong HK und ZiffEB.，J Virol.，58，4910-20，1994)。在13S蛋白的CR1和/或CR2区域和/或CR3区域具有特定缺失的腺病毒大部分是复制缺陷型，然而，在一些细胞系中特别是E2区域中病毒基因和启动子仍分别被反式激活(Wong HK，Ziff EB.，J Virol.68，
4910-20，1994；Mymryk，J.S.and Bayley，S.T.，Virus Research 33，89-97，1994)。

[0118] 在使用野生型腺病毒感染细胞、典型地肿瘤细胞以后，由E1A，E1B-55K和E4orf6介导将YB-1导入核内，与E1B-55K共定位于病毒内含体的核内，这允许病毒在体外和体内在细胞核内有效复制。与其相关，先前已经发现E4orf6结合E1B-55K(Weigel，S. 和 Dobbelstein，M.J.Virology，74，764-772，2000；Keith N.Leppard，Seminars in Virology，8，301-307，1998)，和因此分别介导E1B-55K转运和分配到核内，其分别提供最佳病毒生产和腺病毒复制。由于E1A，E1B-55K和YB-1的相互作用，通过分别由E1B-55K/E4orf6和YB-1组成的复合体，YB-1和E1B-55K在核内在所谓的病毒内含体中的共定位，按照本发明的病毒的有效复制是可能的，和因此本文所述病毒用于YB-1核-阳性细胞的复制和用于制备治疗疾病的药物，其中涉及YB-1核-阳性细胞。该细胞背景这种可能的复制导致细胞的裂解，病毒的释放和相邻细胞的感染和裂解，因此在分别感染肿瘤细胞和肿瘤的情形中，肿瘤的最终裂解，即溶癌作用发生。

[0119] YB-1属于高度保守因子的类别，其与反向CAAT序列，所谓的Y-盒结合。它们可以以调节的方式在转录以及翻译水平上有活性(Wolffe，A.P.Trends in Cell Biology 8，318-323，1998)。增长数量的Y-盒依赖性调节途径在生长和细胞调亡相关基因的激活和抑制中发现(Swamynathan，S.K.等，FASEB J.12，515-522，1998)。因此，YB-1直接与p53相互作用(Okamoto，T.et al.，Oncogene 19，6194-6202，2000)，在Fas基因表达(Lasham，A.等，Gene252，1-13，2000)，MDR和MRP基因表 达(Stein，U.等，JBC 276，28562-69，
2001；Bargou，R.C.等，Nature Medicine 3，447-450，1997)和拓扑异构酶和金属蛋白酶的激活(Mertens.P.R.等，JBC 272，22905-22912，1997；Shibao，K.等，Int.J.Cancer 83，
732-737，1999)中起重要作用。另外，YB-1涉及mRNA稳定性(Chen，C-Y.等，Genes & Development 14，1236-1248，2000)和修复过程(Ohga，T.等，Cancer Res.56，4224-4228，
1996)的调节。

[0120] YB-1在肿瘤细胞中的核定位导致独立于E1A的病毒复制，其中具体地12S E1A蛋白或13S E1A蛋白分别都不以表达形式存在和使用(Holm，P.S.等JBC 277，10427-10434，2002)，和在蛋白质YB-1过量表达的情形中多药耐药性(多重抗性)。另外，已知腺病毒蛋白质如例如E4orf6和E1B-55K对病毒复制具有正效果(Goodrum，F.D.和Ornelles，D.A，J.Virology 73，7474-7488，1999)，其中功能E1A蛋白负责开启其它病毒基因产物(如E4orf6，E3ADP和E1B-55K)(Nevins J.R.，Cell 26，213-220，1981)。这然而用现有技术的E1A-minus腺病毒不发生，在该腺病毒中不存在13S E1A蛋白。YB-1在核内含有YB-1的多药耐药性细胞中的核定位分别提供该E1A-minus病毒的复制和颗粒信息。然而在该情形中，与野生型Ad5相比，病毒复制和颗粒形成的效率减少数倍。YB-1的组合已经意外地发现是通过YB-1介导极有效的病毒复制和颗粒形成的系统和因此提供溶癌作用，该YB-1或者已经存在于肿瘤细胞的核内，或者通过外部因素(例如施用细胞生长抑制剂或照射或过热)引入肿瘤细胞，即促进存在于核内，特别是独立于细胞周期，或者作为转基因通过载体用系统、优选腺病毒系统导入，该腺病毒系统开启腺病毒基因但不允许病毒复制。适当的细胞生长抑制剂尤其是属于下列各组的那些：蒽环霉素，如道诺霉素和阿霉素；烷化剂，如环磷酰胺；生物碱类，如依托泊苷；vin-生物碱类，如长春新碱和长春碱；抗代谢药如5-氟尿嘧啶和methrotrexate；铂衍生物，如例如顺铂；拓扑异构酶抑制剂，如camphothecine；和紫杉烷类，如例如紫杉醇(taxole)。本文公开的腺病毒，特别是重组腺病毒，仅能够在YB-1核-阳性细胞中复制，与野生型腺病毒、特别是野生型Ad5相应的反式激活能力相比，在它们反式激活病毒基因E1B-55K，E4orf6，E4orf3和E3ADP的能力方面有限。本发明人现在意外地发现这些有限的反式激活能力可以通过相应的基因特别是通过E1B-55K和E4orf6的表达结合YB-1的核定位来补偿。如本文实施例所示，在该条件下病毒复制和颗粒形成分别增加至比得上野生型腺病毒复制和颗粒形成行为的水平。

[0121] 意欲与其相关或用于制备的药物通常系统施用，尽管局部施用或传递该药物也在本发明范围内，在该药物中按照本发明使用本文所述的腺病毒。完成该施用意欲特别是用腺病毒感染那些细胞和特别是在这些细胞中复制发生，其优选以因果的方式在病症，典型地疾病的形成中涉及，为了诊断和/或预防和/或治疗该疾病使用按照本发明的药物。

[0122] 这种药物优选用于治疗肿瘤疾病。在肿瘤疾病中，特别优选其中由于构成肿瘤疾病的机制、特别是构成基础的病理学机制导致YB-1已经定位于核内的那些，或者其中由于外源措施导致YB-1存在于核内的那些，其中该措施适合将YB-1转移至核内，在那诱导YB-1或在那表达YB-1。本文所用的术语肿瘤或肿瘤疾病应当包含恶性以及良性肿瘤和各种疾病。可以预期药物包含至少一种另外的药物活性化合物。这种另外的药物活性化合物的种类和数量将取决于药物使用的适应症。在药物用于治疗和/或预防肿瘤疾病的情形中，典型地使用细胞生长抑制剂，如例如顺铂和紫杉醇，道诺红菌素，正定霉素，阿霉素和/或米托蒽醌或本文所述的其它细胞生长抑制剂或细胞生长抑制剂组。

[0123] 按照本发明的药物可以以各种制剂存在，优选液体形式。另外，药物将包含稳定剂，缓冲剂，防腐剂和药物制剂领域技术人员已知的这种试剂。

[0124] 本发明人已经意外地发现本文所述病毒按照本发明的应用可以以非常高的成功率应用于肿瘤，其在核内独立于细胞周期含有YB-1。通常，YB-1位于细胞质中，特别是还在核周胞质中。在细胞周期的S-期期间，在正常细胞以及肿瘤细胞的细胞核中可以发现YB-1。然而使用这样修饰的腺病毒，这不足以提供病毒的溶癌作用。现有技术中所述的这种减毒腺病毒的较小功效是最终基于它们的错误应用。换句话说，当施用如本文所述减毒或修饰的病毒时，特别是也以增加的功效可以使用这些腺病毒系统，其中提供病毒溶癌作用的分子生物学先决条件。在如本文所述按照本发明使用的所述腺病毒，如AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB016，dl520和在欧洲专利EP 0 931 830中描述的重组腺病毒的情形中，在肿瘤疾病的情形中提供先决条件，在肿瘤疾病中其细胞显示独立于细胞周期的YB-1的核定位。这种形式的核定位可以是由肿瘤自身种类导致或可以是由本文公开的按照本发明的措施或试剂导致。本发明因此分别定义一组新肿瘤和肿瘤疾病，和因此患者，其也可以按照本发明用病毒、特别是也用现有技术中已经描述的减毒或修饰的腺病毒成功治疗。

[0125] 另一组患者是确保通过施加或实现不同条件YB-1迁移到核内或引入那或转移其中的那些患者，其可以按照本发明使用腺病毒治疗，这些腺病毒中的一些已知并可以按照本发明使用，或者使用在本文中第一次描述的腺病毒治疗，特别是使用分别在E1A蛋白中具有突变和缺失的这些腺病毒，其不干扰Rb/E2f的结合但不在YB-1核-阴性细胞中复制或者分别具有或显示强烈减少的如本文定义的复制，和/或缺失的癌蛋白质，特别是E1A，如例如病毒AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB106和在欧洲专利EP0 931 830中描述的腺病毒。与这组患者相关的这些腺病毒的应用是基于发现即，病毒复制的诱导是基于YB-1的核定位，YB-1随后与E2-晚期启动子结合。由于本文公开的发现，腺病毒如AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB106和/或欧洲专利EP 0 931 830描述的腺病毒也可以在YB-1核-阳性的细胞中和/或在其中如本发明所定义YB-1被解除管制的细胞中复制。因此，按照本发明这些腺病毒可以分别用于治疗疾病和各类患者，其包含具有这些特性的细胞，特别是当这些细胞涉及待治疗的各种疾病的形成时。这是AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB016和在专利EP 0 931 830中描述的腺病毒按照本发明治疗这些肿瘤的成功基础，这些肿瘤独立于细胞周期在核内含有YB-1或者其中YB-1在本公开内容的意义上被解除管制。可以按照本发明使用本文描述的可按本发明使用的腺病毒和使用那些病毒，特别是在本文中第一次描述的腺病毒治疗的另一组患者是YB-1核-阳性和/或因为下列所述治疗导致YB-1核-阳性的那些和/或已经与给药各种病毒相伴进行该治疗的那些患者，其中该治疗优选为药物治疗。在本发明范围内的是，YB-1核-阳性患者是独立于细胞周期在多个形成肿瘤的细胞内在核内含有YB-1的患者。在这些中治疗是完全给药如本文所述的细胞生长抑制剂和/或如肿瘤治疗所用。另外，辐射，优选如肿瘤治疗中所用的辐射，属于这类治疗。
辐射特别是指使用高能辐射的辐射，优选放射性辐射，优选如肿瘤治疗中所用。过热和应用过热，优选在肿瘤治疗中使用的过热，是另外的治疗。在特别优选的实施方案中，局部施加过热。最后，激素治疗，特别是如肿瘤治疗中使用的激素治疗，是另外的治疗。与该激素治疗相关使用抗雌激素和/或抗雄激素。抗雌激素如他莫昔芬，特别是在乳腺癌的治疗中，和抗雄激素如例如氟他胺或醋酸环丙孕酮，用于前列腺癌的治疗中。

[0126] 在本发明范围内的是，一些形成肿瘤的细胞包含YB-1或包含本公开内容意义上解除管制的YB-1，该YB-1分别是内在的或在诱导和活性导入核内以后包含的。优选地，约5％或以上任何百分比，即6％，7％，8％等的肿瘤形成细胞是这种YB-1核-阳性细胞或其中YB-1以解除管制方式存在的细胞。分别通过外界施加的胁迫和通过局部外加胁迫可以诱导YB-1的核定位。这种诱导可以例如通过辐射、特别是UV辐射，施用如尤其已经在本文中公开的细胞生长抑制剂，和过热来发生。关于过热，关键的是现在可以以非常特定的方式，更具体以局部非常特定的方式实现，因此也可以提供YB-1在细胞核内特定的核定位，因此，提供腺病毒复制和因此细胞和肿瘤裂解的先决条件，其优选局部限制(Stein U，Jurchott K，WaltherW，Bergmann S，Schlag PM，Royer HD.J Biol Chem.2001，276(30)：28562-9；Hu Z，Jin S，Scotto K W.J Biol Chem.2000Jan 28；275(4)：2979-85；Ohga T，Uchiumi T，Makino Y，Koike K，Wada M，Kuwano M，Kohno K.J Biol Chem.1998，273(11)：5997-6000)。

[0127] 按照本发明的药物因此也可以施用于患者和患者组，或可以期望他们，其中通过适当预治疗或伴随处理实现YB-1的转运，优选在各种肿瘤细胞中。

[0128] 基于该技术教导，本领域技术人员在其技术范围内进行适当的改进，特别是对E1A，其例如可以包含缺失或点突变以便因此产生腺病毒的各种实施方案，其可以结合按照本发明的应用来使用。

[0129] 如以上已经解释，按照本发明使用的腺病毒能够分别在核中含有YB-1的这些细胞和细胞系统中复制。为了回答按照本发明使用的腺病毒是否能够复制和因此能够裂解肿瘤的问题，关于Rb，即成视网膜细胞瘤肿瘤抑制产物存在或不存在的细胞状态是不相关的。另外，关于所述腺病毒按照本发明的应用，不需要考虑感染细胞、待感染细胞或待治疗细胞的p53的状态，因为通过使用本文公开的腺病毒系统，关于YB-1核-阳性细胞，即独立于细胞周期在核内含有YB-1的细胞，该p53状态以及Rb状态对本文公开的技术教导的完成无影响。

[0130] 分别地癌基因和癌基因蛋白质，特别是E1A，可以在所有天然腺病毒启动子的控制下和/或通过肿瘤或组织特异性启动子控制。适当的非腺病毒启动子可以选自包含巨细胞病毒启动子，RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子，基于腺病毒的启动子Va I和非病毒YB-1启动子(Makino Y.等，NucleicAcids Res.1996，15，1873-1878)。可以连同本文公开的本发明各个和任何方面使用的另外的启动子包含端粒酶启动子，甲胎蛋白(AFP)启动子，caecinoembryonic抗原启动子(CEA)(Cao，G.，Kuriyama，S.，Gao，J.，Mitoro，A.，Cui，L.，Nakatani，T.，Zhang，X.，Kikukawa，M.，Pan，X.，Fukui，H.，Qi，Z.Int.J.Cancer，78，242-247，1998)，L-丝束蛋白启动子(Chung，I.，Schwartz，PE.，Crystal，RC.，Pizzorno，G，Leavitt，J.，Deisseroth，AB.Cancer GeneTherapy，6，99-106，1999)，精氨酸血管升压素启动子(Coulson，JM，Staley，J.，Woll，PJ.British J.Cancer，80，1935-1944，1999)，E2f启动子(Tsukada等Cancer Res.，62，3428-3477)，uroplakine II启动子(Zhang等，Cancer Res.，62，3743-3750，2002)和PSA启动子(Hallenbeck PL，Chang，YN，Hay，C，Golightly，D.，Stewart，D.，Lin，J.，Phipps，S.，Chiang，YL.Human GeneTherapy，10，1721-1733，
1999)。另外，如德国专利申请DE 101 50 984.7所述的腺病毒的YB-1依赖性E2-晚期启动子是可以用于本发明的启动子。

[0131] 已知端粒酶启动子在人类细胞中极其重要。因此，端粒酶活性通过端粒酶逆转录酶基因(hTERT)的转录控制调节，其是酶的催化亚基。端粒酶的表达在85％的人类肿瘤细胞中有活性。与其相反，它在大多数正常细胞中无活性。免于其的是生殖细胞和胚胎组织(Braunstein，I.等，CancerResearch，61，5529-5536，2001；Majumdar，A.S.等，Gene Therapy 8，568-578，2001)。对hTERT启动子更详细的研究已显示远离起始密码子的启动子283bp和82bp的片段分别足以在肿瘤细胞中特异性表达(Braunstein I.等；Majumdar AS et al.，上文)。因此，该启动子和特定片段分别适合提供基因和特别是转基因、优选本文公开的转基因之一仅在肿瘤细胞中的特异性表达。启动子应当允许修饰的癌基因、优选E1A癌基因蛋白质仅在肿瘤细胞中表达。此外，在优选实施方案中，转基因在该腺病毒载体中的表达在这些启动子中任何一个的控制下，所述转基因特别是选自包含E4orf6，E1B55kD，ADP和YB-1的组。还属于本发明范围内的是，反式激活癌基因蛋白质，特别是E1A蛋白的可读框在一个或数个腺病毒系统的基因产物的框架内。然而，反式激活E1A蛋白的可读框也可以是相对于其独立。

[0132] 期望关于用于裂解的细胞的特性，在一个实施方案中这些有抗性，优选具有多药耐药性或多重抗性，在所述裂解中按照本发明使用本文所述的腺病毒。本文所述的抗性，优选是指对本文所述的细胞生长抑制剂的抗性。该多药耐药性抗性优选与膜结合转运蛋白P-糖蛋白的表达，优选过量表达有关，该P-糖蛋白可以用作确定各种细胞的标记和因此还可以用于具有该多药耐药性的肿瘤和各类患者。本文所用的术语抗性包含P-糖蛋白介导的抗性，其也称为常规抗性，以及非典型抗性，其包含通过MRP介导的抗性或其它非-P-糖蛋白介导的抗性。另一个与YB-1表达相关的标记是拓扑异构酶IIα。因此，在筛选确定患者是否可以使用按照本发明的腺病毒治疗而期望成功中，可以使用拓扑异构酶IIα的表达代替或加上YB-1在核内的确定。另一可以基本上以类似于P-糖蛋白的方式使用的标记是MRP。至少就结直肠癌细胞或患结直肠癌的患者而言，另一个标记是PCNA(engl.proliferating cell nuclear antigen)(Hasan S.等，Nature，15，387-391，2001)，如例如Shibao K.等所述(Shibao K等，Int.Cancer，83，732-737，1999)。最后，MDR(multiple drug resistance)的表达是在上述意义上的标记(Oda Y等，Clin.Cancer Res.，4，2273-2277，1998)，至少对于乳腺癌细胞和骨肉瘤细胞而言。可以按照本发明使用的另一个可能的标记 是 p73(Kamiya，M.，Nakazatp，Y.，J Neurooncology 59，143-149(2002)；Stiewe 等，J.Biol.Chem.，278，14230-14236，2003)。

[0133] 因此本发明的一个特殊优势是如本文所述按照本发明使用腺病毒也可以治疗患者，这些患者否则被认为是在临床意义上不再可治疗和当另外的按照现有技术方法的肿瘤疾病治疗不再可能期望获得成功时，特别是当细胞生长抑制剂的使用不再合理可能和不再可以在影响或减少肿瘤的意义上成功进行时。术语肿瘤在本文通常是指各种和任何肿瘤或癌症疾病，其固有地在核内包含YB-1或由于实现本文所述的外加措施导致优选独立于细胞周期在核内包含YB-1。

[0134] 另外，本文所述的病毒通常可以用于治疗肿瘤。优选地，这些肿瘤选自包含乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，骨肉瘤，成胶质细胞瘤，黑素瘤，小细胞肺癌和结直肠癌的组。另外的肿瘤是如本文所述有抗性的那些，优选具有多重抗性的那些，还特别优选上述组的那些肿瘤。

[0135] 另一方面本发明涉及筛选患者的方法，该患者可以使用一种修饰的腺病毒，即按照本发明使用的腺病毒如例如AdΔ24，dl922-947，E1Ad/01/07，CB016或欧洲专利EP 0931 830中描述的病毒治疗，其中该方法包含下列步骤：

[0136] -检查肿瘤组织的样品和

[0137] -确定YB-1是否独立于细胞周期定位于核内。

[0138] 可以检测上述标记的存在以代替或加上YB-1。

[0139] 在肿瘤组织或其部分特别是独立于细胞周期在核内包含YB-1的情形中，可以按照本发明的实施使用本文公开的腺病毒。

[0140] 在按照本发明方法的一个实施方案中，通过使用试剂完成肿瘤组织的检查，该试剂选自包含针对YB-1的抗体，针对YB-1的适体，和针对YB-1的spiegelmer以及针对YB-1的抗促成素的组。基本上，对于相应的标记可以产生相同的方法和相应地使用。抗体，特别是单克隆抗体的制备是本领域技术人员已知的。特异性检测YB-1或标记的另一种方法是与靶结构以高亲和力结合的肽，在本发明情形中靶结构为YB-1或所述标记。在现有技术中已知方法如噬菌体-展示以便产生这些肽。典型地，将肽库当作起始点，其中单个肽具有2 18 8 15
8-20个氨基酸的长度，库的大小约为10-10 ，优选10-10 种不同的肽。一种特殊形式的靶分子结合多肽是所谓的抗促成素，其例如在德国专利申请DE 197 42 706中描述。

[0141] 特异性结合YB-1或本文公开的相应的标记和因此检测独立于细胞周期的YB-1在细胞核内的定位的另一种方法是所谓的适体，即D-核酸，其作为RNA或DNA，作为单链或双链存在并特异性地与靶分子结合。适体的产生例如在欧洲专利EP 0 533 838中描述。一种具体形式的适体是所谓的aptazyme，其例如在Piganeau，N.等(2000)，Angew.Chem.Int.Ed.，39，no.29，第4369-4373页中描述。这些是适体的具体实施方案，因为它们除了适体部分包含核酶部分，并且在结合或释放结合适体部分的靶分子以后获得催化活性和切割核酸底物，其伴随着信号的产生。

[0142] 另一种形式的适体是所谓的spiegelmer，即由L-核酸制成的靶分子结合核酸。制备该spiegelmer的方法例如在WO 98/08856中描述。

[0143] 通过穿刺或通过外科手术可以获得肿瘤组织的样品。评估YB-1是否独立于细胞周期而定位于核内经常通过使用显微镜技术和/或免疫组织学分析，优选使用抗体或其它任何前述方法来完成。本领域技术人员已知另外的检测YB-1在核内和特别是检测YB-1独立于细胞周期定位在那的方法。例如，当筛选它们时在染色的组织切片中可以容易地检测YB-1的定位。YB-1在核内的存在频率已经显示定位独立于细胞周期。独立于细胞周期检测核内的YB-1的另一选择在于对YB-1染色和检测YB-1是否定位于核内和确定细胞的阶段。这以及YB-1的检测也可以通过使用前述针对YB-1的方法实现。通过本领域技术人员已知的方法完成方法的检测。通过与YB-1和不与待分析的样品中其它任何结构特异性结合的所述试剂，具体地细胞，它们的定位和因为它们特异性结合YB-1和YB-1的定位也可以通过适当的标记方法检测和确定。所述方法的标记方法对本领域技术人员是已知的。

[0144] 下面，通过参考附图和实施例将进一步举例说明本发明，从中将获得新特征，实施方案和优势。

[0145] 图1显示腺病毒载体的结构设计，该载体在本文中称为AdE1/E3-负型(minus)，为野生型腺病毒和腺病毒dl520的E1/E3-缺失的腺病毒。

[0146] 图2显示E1A蛋白关于结合p300，p107和p105的结合区域。

[0147] 图3显示在用E1/E3-缺失的腺病毒Ad5(称为E1/E3-负型Ad5)和dl520感染后在核内不含有YB-1的U2OS细胞。

[0148] 图4显示在用E1/E3-缺失的腺病毒Ad5(称为E1/E3-负型Ad5)和腺病毒dl520感染后在核内含有YB-1的257RDB细胞。

[0149] 图5显示在用腺病毒dl1119/1131感染后的257RDB细胞和U2OS细胞。

[0150] 图6显示EMSA分析的结果，其证实YB-1分别存在于多药耐药性细胞和细胞系257RDB，181RDB，MCF-7Ad中，而YB-1不存在于U2OS和HeLa细胞的核内。

[0151] 图7显示野生型腺病毒，腺病毒dl520和腺病毒dl1119/1131的E1A蛋白的结构设计。

[0152] 图8是显示在另外表达的病毒蛋白质的存在下腺病毒复制效率的直方图，为绝对数值。

[0153] 图9是显示在另外表达的病毒蛋白质的存在下腺病毒复制效率增加的直方图。

[0154] 图10显示在结晶紫染色和分别用10和30pfu/细胞的dl520感染后U2OS细胞生长良好，对照(K)分别未施用道诺红菌素(daunorubicine)和施用40ng道诺红菌素/ml。

[0155] 图11显示在结晶紫染色和分别用10和30pfu/细胞的dl520感染后HeLa细胞生长良好，对照(K)分别未施用道诺红菌素和施用40ng道诺红菌素/ml。

[0156] 图12是具有不同来源(RDB257和HeLa)的肿瘤的肿瘤体积的图表，其分别为在用PBS和dl520处理以后的时间的函数。

[0157] 图13显示杀死的小鼠的照片，在分别用PBS和5×108pfu dl520处理后该小鼠发展基于RDB257细胞的肿瘤。

[0158] 图14是在感染dl520以后RDB257细胞和HeLa细胞的(皮下生长肿瘤)细胞提取物的DNA杂交印迹分析的结果。

[0159] 图15是分别显示YB-1核-阳性肿瘤细胞(257RDB和181RDB)和YB-1核-阴性肿瘤细胞(HeLa，U2OS)中dl520和野生型腺病毒的复制效率和颗粒形成的直方图。

[0160] 图16显示野生型腺病毒和腺病毒载体AdXvir03的结构设计。

[0161] 图17显示腺病毒载体AdXvir03/01的结构设计。

[0162] 图18A/B显示在结晶紫染色和用Ad312(20pfu/细胞)，Xvir03(5pfu/细胞)感染以后181RDB细胞(图18A)和272RDB细胞(图18B)生长良好和对照(未感染)，其中在感染后5天进行结晶紫染色。

[0163] 实施例1：按照本发明使用的腺病毒可以包含的E1A修饰的类型

[0164] 图1显示腺病毒载体AdE1/E3-minus，即E1/E3-缺失的腺病毒，野生型腺病毒和腺病毒dl520的结构设计。

[0165] 腺病毒AdE1/E3-minus不含有编码功能E1A或功能E1B或E3的区域，用在本实验中作为毒性对照。

[0166] 野生型E1A基因编码总共5个蛋白质，其是通过E1A RNA的可变剪接产生的。其中，产生2个不同的蛋白质，即289个氨基酸的蛋白质和243个氨基酸的蛋白质。dl520不编码289个氨基酸的蛋白质，因为它在E1A基因的CR3序列中存在缺失，导致缺乏13S的基因产物。按照本发明可以使用的腺病毒dl520被本领域那些技术人员称为12S-E1A病毒。现有技术中已知的腺病毒dl347(Wong und Ziff，J.Virol.，68，4910-4920，1994)也是按照本发明可以使用的12S-E1A病毒。

[0167] 在由13S-E1A mRNA编码的289个氨基酸的蛋白质中，存在在各种腺病毒亚类之间保守的3个区域。这些称为CR1，CR2和CR3。尽管CR1和CR2存在两种E1A蛋白质(E1A12S和E1A 13S)中，即在289个氨基酸和243个氨基酸的蛋白质中，CR3区域仅存在于两个前述蛋白中较大的一个中。

[0168] 病毒基因特别是E1B，E2，E3和E4的激活需要CR3区域。仅含有较小的，即243个氨基酸的蛋白质的病毒仅极弱地反式激活病毒基因和在核内不含有YB-1的那些细胞中不促进腺病毒复制。因为YB-1仅存在于肿瘤细胞的核内和仅可以在那检测到，该载体适合诱导肿瘤特异性的复制。

[0169] 由于dl520中CR3的缺失，该腺病毒不能将细胞YB-1转移至细胞的核内，其在本文中也称为转运，因此不能够在YB-1核-阴性的细胞中复制的位置，因此是可以按照本发明使用的病毒，其中该病毒包含按照本发明所需的反式激活。

[0170] 实施例2：腺病毒的作用方式依赖于细胞的Rb状态

[0171] 图2显示E1A蛋白关于结合p300，p107和p105的结合区域。P300以及p107，是细胞结合蛋白质。成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)，一种肿瘤抑制蛋白质，其结合是通过CR1和CR2介导的。研究已经表明pRb和p107/p300结合在调节转录中有效的细胞转录因子E2F。野生型E1A蛋白干扰E2F与Rb的结合。如此释放的E2F结合E2早期启动子和其中诱导腺病毒复制。

[0172] 从现有技术中已知E1A癌蛋白质中的某些缺失可能导致重组腺病毒载体如下面提及的那些，其能够主要在Rb-阴性细胞中复制和可以按照本发明使用。例如，腺病毒载体dl922-947包含CR2区域中(氨基酸位点122-129)的缺失，载体CB016在CR1区域(氨基酸位点27-80)和CR2区域(氨基酸位点122-129)中具有缺失。载体E1Adl01/07在CR2区域(氨基酸位点111-123)中含有缺失。另外，因为在N-末端(氨基酸位点4-25)处另外的缺失，另外，不与蛋白质p300结合。腺病毒载体AdΔ24在CR2区域中(氨基酸位点120-127)含有缺失。在专利EP 0 931 830中描述的腺病毒载体在CR1区域和CR2区域含有缺失。

[0173] E2F/RB的结合机制和E1A介导的E2F的释放机制根本不同于构成本发明基础的机制。不同于现有技术中假设的，它不是E2F从Rb蛋白中的释放，Rb蛋白即使不说对于病毒复制是关键性的也是必要的，然而它是人转录因子YB-1的核定位。该转录因子在正常细胞中在大多数细胞周期中仅存在于细胞质中。在用腺病毒感染以后，在某些情形下它被诱导入核内或者在不同的细胞系统中已经存在核内，如不同的肿瘤疾病，其包括例如但不限于乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，骨肉瘤癌，成胶质细胞瘤，黑素瘤，小细胞肺癌和结直肠癌。

[0174] 实施例3：U2OS细胞的感染

[0175] 每孔平铺100,000个U2OS细胞。次日用如图3所示的不同腺病毒感染细胞。在500μl无血清的DMEM培养基中在37℃下1小时来进行感染。随后，去除感染培养基并用
2ml完全培养基(10％FCS/DMEM)替换。在3天后使用结晶紫染色进行分析。

[0176] 如从图3中可以获得，在核内不含有YB-1的U2OS细胞在用两种不同腺病毒感染以后未显示裂解，如结晶紫染色所示，所述腺病毒即称为E1/E3-minus的E1/E3-缺失的腺病毒，和腺病毒dl520，其可以按照本发明使用。与其相关，首先去除培养基。随后，用结晶紫(50％ETOH，3％甲醛，5％乙酸，1％结晶紫)覆盖细胞和在室温下温育5-10min。随后，用水充分漂洗具有6个孔的平板，室温干燥。

[0177] 这证实构成本发明基础的发现，即需要YB-1的存在以便诱导按照本发明使用的病毒来裂解感染的细胞。

[0178] 实施例4：257RDB细胞的感染

[0179] 每孔平铺100,000个257RDB细胞。次日用如图4所示的不同腺病毒感染细胞。在500μl无血清的DMEM培养基中在37℃下1小时来进行感染。随后，去除感染培养基并用
2ml完全培养基(10％FCS/DMEM)替换。在3天后使用结晶紫染色进行分析。

[0180] 本实验的结果在图4中描述。经感染核内含有YB-1的257RDB细胞以后，称为E1/E3-minus Ad5的、E1/E3-缺失的腺病毒在低MOI(pfu/细胞)下未显示任何裂解。与此对比，如实施例3所示的dl520，在YB-1核-阴性细胞中不复制和同时编码按照本发明用于反式激活癌基因蛋白质的E1A，在40pfu/细胞的MOI(感染复数)下导致实际上完全的裂解，和在10pfu/细胞的MOI下仍导致主要裂解。可以从中得出结论，dl520和类似的病毒如本文中通过dl1119/1131或AdXvir 03所述，需要与E1-缺失或E1/E3-缺失的腺病毒相比减小约1个数量级(十倍)的MOI，这证明了它们的临床应用。

[0181] 如图7所示，dl520的蛋白质E1A其特征在于其CR3区域缺失，导致按照本发明应用所需的反式激活和YB-1核-阳性细胞中的复制。

[0182] 实施例5：用dl1119/1131感染257RDB和U2OS细胞

[0183] 如图5所示，在用腺病毒dl1119/1131感染YB-1核-阴性U2OS细胞以后在20pfu/细胞的MOI下没有裂解，腺病毒dl1119/1131显示缺失E1A蛋白的氨基酸4-138和编码其的核酸，和在氨基酸218后另外包含终止密码子，其中表达的截短E1A蛋白包含完整E1A蛋白的CR3区域。作为阴性对照使用未感染的细胞层。

[0184] 与其相反，在细胞系统如核内含有YB-1，即YB-1核-阳性的257RDB中，在腺病毒dl1119/1131的影响下，在20pfu/细胞的MOI下实际上细胞层完全裂解。因此该实施例是另一证据，其证明如图7所示的修饰的E1A癌基因蛋白质仅包含例如CR3区域和缺少CR1区域和CR2区域，在YB-1核-阳性细胞中提供所需的反式激活，这按照本发明是腺病毒复制所需，导致病毒复制。腺病毒dl1119/1131因此是按照本发明可以使用的另一种腺病毒。属于本发明范围内的是，也可以使用关于CR3区域类似于dl1119/1131设计但与其相反具有CR1区域和/或CR2区域的病毒。

[0185] 实施例6：检测多药耐药性细胞中的核YB-1

[0186] 本实施例是基于以下考虑，即核YB-1应当作为转录因子结合mdrl启动子(engl.multiple drug resistance promoter)内的Y-盒(CAAT序列)。为了检测这个，进行所谓的EMSA分析(电泳迁移率变动分析)。与其相关，分离核蛋白质，随后将1-10μg蛋白质与短DNA片段(寡)一起在37℃下温育。为了测定核YB-1，使用下列寡核苷酸：与U2O3相对的mdrl启动子(位点-86至-67)：TGAGGCTGATTGGCTGGGCA(X-盒加下划线)。

[0187] 在这之前将该DNA片段在5’末端用32P放射性标记。随后，在天然聚丙烯酰胺凝胶中进行分离。在蛋白质YB-1结合寡核苷酸序列的情形中，可以检测它，因为任何未结合的寡核苷酸在凝胶中迁移比结合的寡核苷酸快(Holm，P.S.等，JBC 277，10427-10434，2002；Bargou，R.C.等，NatureMedicine 3，447-450，1997)。

[0188] 如图6所示，用EMSA分析可以显示，与细胞系U2OS和HeLa细胞形成对比，YB-1存在多药耐药性细胞257RDB，181RDB和MCF-7Ad细胞的核中。

[0189] 实施例4和5的结果证实，与U205形成对比，腺病毒dl520和dl1119/1131在YB-1核-阳性细胞如例如257RDB中复制，并诱导其裂解。这证实关于按照本发明的腺病毒的应用的发现。另外，结果已经证实，与野生型腺病毒相比，在YB-1核-阳性细胞中通过修饰或缺失的E1A基因产物来弱反式激活病毒基因，在核内YB-1存在下导致成功的复制和这些细胞的裂解，这些细胞包括例如多药耐药性细胞，本文所述的腺病毒可以因此用于裂解这些肿瘤。

[0190] 实施例7：提高E1-minus腺病毒的复制效率

[0191] 本实施例显示早期病毒基因E1B-55K和E4orf6可以通过用质粒pE4orf6转染和E1/E3-缺失的腺病毒Ad-55K感染来替代。Ad-55K是E1/E3缺失病毒，其中将E1B-55K克隆到E1中并在CMV的控制下。根据以下事实该替代是需要的，即AdYB-1(表达YB-1的腺病毒)不表达这些早期基因，本发明人已经认识到核内含有YB-1的复制系统中这些早期基因的替代能够分别提高复制效率和颗粒形成效率，其程度比得上类型Ad5的野生型腺病毒。

[0192] 进行以下各项：

[0193] 使用脂转染胺用质粒pE4orf6转染各个105U2OS细胞。质粒pE4orf6携带在CMV控制下的编码早期病毒基因E4orf6的DNA序列。

[0194] 用质粒pE4orf6转染24h后，用表达YB-1的E1/E3-缺失腺病毒AdYB-1(50pfu/细胞)和E1/E3-缺失的E1B-55K腺病毒Ad-55K(50pfu/细胞)感染细胞。Ad-55K是E1/E3-缺失的病毒，其携带在CMV控制下的作为转基因的病毒基因E1B-55K。

[0195] 随后，在感染5天后(＝感染后)从培养基(2ml)中去除细胞。通过交替冷冻和解冻3次(融/冻)完成从分离的细胞中释放病毒颗粒。随后，对293个细胞进行噬菌斑测定，以测定产生的感染性颗粒(蚀斑形成单位/ml(pfu/ml))。结果在图8和9中表示。图8显示噬菌斑测定的结果，以绝对数值表示。通过用质粒pE4orf6转染和用两种病毒AdYB-1和Ad-55K共感染来显示与仅用AdYB-1感染相比的最显著的差别。图9显示图8的结果，其中复制效率的提高表示为对AdYB-1测定的复制倍数。用质粒pE4orf6和随后用AdYB-1和E1B-55K(Ad-55K)感染的细胞产生高达25倍多的pfu/ml。

[0196] 基于这些结果可以得出结论，E1B-55K和E4orf6的替代提高用E1/E3-缺失的腺病毒AdYB-1感染后形成的病毒数量(pfu/ml)达25倍。与两种基因产物各自的效果相比，E1B-55K和E4orf6对蚀斑形成单位(pfu)产量的相加作用显著更高。

[0197] 使用表达EGFP的一个质粒的对照实验清楚地显示，在所选实验方法中仅10％的细胞成功地被质粒pE4orf6转染。表达E1B-55K和E4orf6的细胞中形成的颗粒数量比得上一种类型5的人腺病毒(野生型)。这证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6和E1B-55K的表达结合YB-1的核定位，能够提供腺病毒复制和颗粒形成，特别是E1A-缺失的腺病毒，其比得上一种野生型Ad5。

[0198] 实施例8：在YB-1核-阳性细胞中经施用细胞生长抑制剂后提高的腺病毒复制，该腺病毒在YB-1核阴性细胞中不复制

[0199] 现有技术中已知加入不同细胞生长抑制剂诱导人转录因子YB-1的核定位。如本发明人已经发现，定位在核内的YB-1通过激活腺病毒E2-晚期启动子来控制腺病毒复制。两种作用的结合可以用于提供特异性的肿瘤裂解。

[0200] 在肿瘤消解测定的实施中，依照下列步骤：将200,000个细胞(分别为HeLa和U2OS)平板接种到6孔板的每孔中。次日，加入40ng/ml(终浓度)的道诺红菌素。在3小时温育后，分别用10和30pfu dl520/细胞感染细胞。随后，将细胞在无细胞生长抑制剂的培养基中温育。在3-5天后使用结晶紫将细胞染色。

[0201] 如从图10和11中可以获得，加入道诺红菌素通过YB-1的核定位诱导dl520的复制。因此，与仅道诺红菌素相比，dl520与细胞生长抑制剂道诺红菌素结合产生更大的肿瘤裂解效果。

[0202] 实施例9：dl520的体内肿瘤裂解

[0203] 在无菌细胞培养条件下扩展用于本体内研究的HeLa(YB-1核-阴性)和257RDB(YB-1核阳性)细胞。在将细胞注射到小鼠(CD1NuNu品系)中之前以便产生皮下肿瘤，通过胰蛋白酶化收集细胞，放入DMEM培养基(10％FCS)中，计数并用PBS洗涤一次。
随后，将细胞离心，吸出PBS，以期望细胞数将细胞在新鲜PBS中分份。在本研究中皮下注射
6
的细胞数是两个细胞系每个5×10 个细胞。进行皮下注射至动物的一侧，其中将HeLa细胞注射到右侧和将257RDB细胞注射到左侧以更好的区分。1周2次控制肿瘤的生长，其中使用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度。基于此，基于下列数学公式计算肿瘤体积：

[0204] 3/4π*a/2*(b/2)2a＝长度，b＝宽度

[0205] 一旦肿瘤已经达到200-520mm3的体积，分别在肿瘤内施用病毒和作为阴性对照的8
PBS。注射的体积相等和为每次50μl。连续3天重复注射。施用病毒的总剂量为5×10pfu。
随后，继续1周2次记录肿瘤生长，计算体积。在研究结束时杀死小鼠，去除肿瘤以进一步分析。

[0206] 结果在图12和13中表示。

[0207] 图12显示表示作为时间函数的肿瘤体积和不同治疗方案的图表。在通过RDB2573 3
形成肿瘤的情形中，在注射PBS以后肿瘤显著生长约438mm-1466mm。在按照本发明使用
3
的载体dl520的影响下，肿瘤生长可以显著减小。从344mm 的平均肿瘤大小开始，肿瘤大
3
小仅增加21％至总共543mm。

[0208] 在本实施例中，将由HeLa细胞组成的肿瘤用作对照，其在施用PBS以后的行为类似于在施用PBS以后的基于RDB257的肿瘤。然而，基于HeLa细胞和用dl520处理的肿瘤3 3
仍显示肿瘤生长显著增加，从311mm 开始增加至1954mm。

[0209] 图13显示杀死的使用RDB257长有肿瘤的裸鼠照片。可以清楚的看见，在按照本发明施用腺病毒dl520以后，出现肿瘤显著减少。在本情形中甚至还有肿瘤体积的减小(施3 3
用病毒dl520后第1天：515mm ；在施用病毒dl520后第30天：350mm)。

[0210] 实施例10：肿瘤DNA的DNA印迹杂交

[0211] 从肿瘤样品中提取DNA，该肿瘤样品取自实施例9中发展的肿瘤中间。为了分离使用Qiagen的Dneasy Tissue Kit。按照制造商的使用说明完成DNA分离。按照其，通过碱裂解从细胞中释放DNA。随后，用柱纯化分离的DNA。随后，通过光度测定法在260nm测定分离的DNA的浓度。使用2μg DNA样品进行分析，该DNA样品用10个单位的限制酶KpnI消化。随后，在0.8％的琼脂糖凝胶中进行样品的电泳分离。随后，将DNA印迹在尼龙膜上(按照Schleicher & Schuell系统进行)。将印迹在膜上的DNA对特异的1501bp DNA探针杂交。1501bp DNA探针特异性地结合编码E2A的Ad5序列内的3369bp Kpn I片段。通过PCR(引物：5‘-GTCGGA GAT CAG ATC CGC GT，5‘-GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT)制备32
探针并使用 P放射性标记。随后，洗涤膜并曝光胶片。

[0212] 肿瘤DNA的DNA印迹结果在图14中表示。分析证实仅dl520在抗性细胞RDB257中体外复制，如泳道3，4和5所示。泳道1表示阳性对照Ad-5d，泳道6，7和8表示来自感染dl520的HeLa细胞的DNA。因为HeLa细胞不是YB-1核阳性，病毒dl520不复制，因此按照这个不可以检测E2A序列。

[0213] 使用dl520的另外的结果在图15中表示。基于噬菌斑测定，在用dl520和野生型腺病毒感染以后研究颗粒形成(pfu/ml)。用dl520和野生型腺病毒感染各种YB-1核-阳性(257RDB和181RDB)肿瘤细胞和YB-1核-阴性肿瘤细胞。

[0214] 实施下列步骤：

[0215] 将100,000-200,000个细胞各自平板接种在所谓的具有6个孔的平板(即6孔平板)上含有10％FCS的L15培养基(抗性细胞)和DMEM(非抗性细胞)中。在24小时后进行用dl520和野生型腺病毒感染(10pfu/细胞)。感染后(感染之后)3天，通过交替冷冻和解冻3次从细胞悬浮液(3ml)中释放病毒颗粒。随后，对293个细胞进行噬菌斑测定以测定形成的感染性颗粒(蚀斑形成单位/ml(pfu/ml))。结果在图15中显示。噬菌斑测定的结果显示，类似于野生型腺病毒，dl520在YB-1核-阳性细胞(257RDB和181RDB)中复制。因此，当按照本发明使用本文所述的腺病毒时，可以观察到类似于一种野生型腺病毒的复制效率。

[0216] 实施例11：腺病毒载体Xvir03的结构设计

[0217] 图16显示腺病毒载体Xvir03的结构设计。腺病毒Xvir03是一种所谓的E1/E3-缺失腺病毒。这意味着不制备在腺病毒复制中起作用的E1A，E1B和E3蛋白。E1区域的缺失从342扩展至3528；氨基酸位点27865-30995的E3区域缺失。如本文所示，术语“E1-缺失的病毒”是指E1不再有功能活性的病毒。这可以通过失活另外大部分完整的核酸和氨基酸序列而实现，然而这也可以意指具有不同大小的编码E1区域蛋白质的缺失。因为缺乏E1A和E1B蛋白和编码其的核酸，E4区域，如E4orf6仅微弱表达(与野生型腺病毒相比约1-5％)或根本不表达。病毒基因E1B55k和E4orf6通过引入Xvir03的异源CMV启动子(Clontech：Plasmid pShuttle)在E1区域中表达。代替CMV启动子，可以使用与E1A表达相关的本文公开的各种和任何启动子。两个基因的可读框通过所谓的IRES序列(engl.internalribosomal entry site)(Pelletier，J. 和 Sonenberg，N.Nature，1988，334，320-325)彼此连接。该元件(Novagen：pCITE)提供来自1个mRNA的2个蛋白质的表达。

[0218] 如下制备载体：

[0219] 通过将来自M.Dobelstein(University of Marburg)的pCGNE1B的E1B55k可读框用XbaI和BfrI克隆到Clontech的pShuttle载体中来产生质粒E1B55k-pShuttle。随后，用ApaI将pShuttle中的E1B55k线性化，末端补平并用NheI切割。

[0220] 在第二个载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中，彼此连续，使用Novagen公司的pCITE-4a(+)作为模板通过TA克隆将IRES元件作为PCR产物克隆到EcoRV切割位点，借助BamHI克隆来自质粒pCMV-E4orf6(M.Dobelstein，University of Marburg)的E4orf6＝IRES-E4orf6-pcDNA3.1(+)。用NotI线性化pcDNA3.1(+)中的IRES-E4orf6，末端补平，随后用NheI切掉片段IRES-E4orf6。用断开的载体E1B55k-pShuttle(平端，NheI)连接片段IRES-E4orf6。随后用I-Ceu I和PI-SceI从E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttle和CMV启动子以及牛生长激素(BGH)-PolyA中将盒克隆到ΔE1，ΔE3Adeno-X-质粒(Clontech)中，其称为AdcmvE1B/IRES/E4orf6。随后，按照制造商的使用说明(Clontech)制备腺病毒。将用PacI线性化的含有表达元件CMV-E1B55k-IRES-E4orf6-BGH polyA的adeno质粒转染至HEK293细胞中，转染后11天与培养基一起去除脱离的细胞以便通过反复冻融循环释放腺病毒。

[0221] 上述载体原则上适合本文所述按照本发明使用的其它病毒。特别是上述载体适合在细胞中复制和引发裂解，所述细胞分别为YB-1核-阳性细胞以及其中YB-1被解除管制(即与正常细胞和非肿瘤细胞相比过量表达)的细胞。该载体的使用特别适用于那些疾病和患者组和患者集体，其与在本文中描述按照本发明使用的其它腺病毒和本发明公开的其它腺病毒结合一起公开。

[0222] 实施例12：腺病毒载体Xvir03/01的结构设计

[0223] 如从图17中可以获得，Xvir03/01是Xvir03进一步的发展。治疗基因如例如本文所述的基因和转基因可以克隆到E3区域。另外，将缺失引入E4区域以便避免与来自Xvir03表达盒的E4orf6同源重组。这允许较大的转基因可以克隆到该构建体中。缺失的E3区域包含用于引入盒的SacI，NdeI和NheI限制位点，其中例如可以克隆治疗的转基因。

[0224] 将治疗基因克隆到E3区域中以及在E4区域中进行缺失的质粒的制备：

[0225] Clontech的pAdenoX-Plasmid在野生型腺病毒中缺乏的3’ITR区之后具有针对SfuI的限制位点。使用SpeI(位点23644)和SfuI从pAdenoX(Clontech)中获得E3-E4区域，并转移至pcDNA3.1(+)(Invitrogen)＝pcDNA3.1-E3Δ27865-30995-E4。通过PstI去除E4ORF6的大部分，即33241-33875＝pcDNA3.1-E3Δ27865-30995，E4Δ33241-33875。为了进一步发展Xvir03，用SfuI和SpeI从pcDNA3.1-E3Δ27865-30995，E4Δ33241-33875中将缺失的E3/E4区域克隆到质粒pAdenoX中＝pAdenoXE3Δ27865-30995，E4Δ33241-33875。

[0226] 如 关 于 Xvir03 所 述， 随 后 用 I-Ceu I 和 PI-SceI 从E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttle中将表达盒连同CMV启动子和牛生长激素(BGH)-PolyA克 隆 到pAdenoX E3Δ27865-30995，E4Δ33241-33875 中，其 称 为 AdcmvE1B/IRES/E4orf6-ΔE4。随后，按照制造商的使用说明(Clontech)制备腺病毒。

[0227] 上述载体原则上适合本文所述按照本发明使用的其它病毒。特别是上述载体适合在细胞中复制和导致裂解，所述细胞为YB-1核-阳性细胞以及其中YB-1被解除管制(即与正常细胞和非肿瘤细胞相比过量表达)的细胞。该载体可以用于那些疾病和患者组和患者集体，其关于按照本发明使用的其它腺病毒和按照本发明的腺病毒在本文中公开。

[0228] 实施例13：257RDB和181RDB细胞中Xvir 03的肿瘤消解作用

[0229] 在具有6个孔的平板(6孔平板)的每孔中平板接种100,000个细胞(257RDB和181RDB)。次日，如图18所示，用Ad312(20pfu/细胞)和Xvir03(5pfu/细胞)感染细胞。
在500μl无血清DMEM培养基中在37℃下1小时进行感染。随后，去除感染培养基并用2ml完全培养基(10％FCS/DMEM)替代。通过5天后结晶紫染色完成分析。结果在图18A和18B中表示。

[0230] 如可以从图18A和18B中获得，在感染Ad312和Xvir03以后仅在Xvir03的情形中在核内含有YB-1的多药耐药性细胞显示裂解，如细胞的结晶紫染色所示。与其相关，首先去除培养基。随后，用结晶紫(50％ETOH，3％甲醛，5％乙酸，1％结晶紫)覆盖细胞，在室温下温育5-10分钟。随后，用水充分漂洗6孔平板并在室温下干燥。

[0231] 本发明人已知E1A-缺失的病毒(例如Ad312)，然而其在本发明的意义上不是反式激活腺病毒，可能在高MOI下非常有效地复制(Nevins J.R.，Cell 26，213-220，1981)，但是不能在临床应用中实现。该现象在文献中称为“类E1A活性”。本文所用的腺病毒Ad312是E1A-缺失的病毒。在所用效价(20pfu/细胞)下，该效价仍高于临床理想效价，早期腺病毒基因如E1B55k和E4orf6不表达或仅极少量地表达(Nevins J.R.，Cell 26，213-220，1981)。如本文已经描述，这些基因和蛋白质在病毒复制中起重要作用。与其对比，这些基因和蛋白质分别由腺病毒Xvir03表达(图16)。如从图18A和18B中可以获得，在伴随所需的较低的感染效价下(表达为pfu/细胞)基因E1B55k和E4orf6的表达将导致有效的病毒复制和细胞裂解。这证实了构成本发明基础的发现，即E4orf6和E1B-55K(缺少E1A)的表达结合YB-1的核定位能够诱导非常有效的腺病毒复制。其所需仅1-5pfu/细胞的效价现在允许临床应用。

[0232] 这证实了构成本发明基础的发现，即为了使按照本发明使用的病毒裂解感染的细胞，YB-1在核内的存在，特别是独立于细胞周期的存在，是必需的。

[0233] 前述说明书公开的本发明的特征，权利要求以及附图可以单独以及任意组合，对于本发明其各种实施方案的实现是重要的。