经修饰的CEA核酸及表达载体转让专利
申请号 : CN03813265.6
文献号 : CN1658899B
文献日 : 2013-01-02
发明人 : M·帕林顿 , L·张 , B·罗维斯基 , L·R·格里茨 , T·格林哈尔希
申请人 : 安万特巴斯德有限公司 , 塞里奥生物制剂公司
摘要 :
本发明涉及编码多肽的核酸及所述核酸或多肽在预防和/或治疗癌中的用途。本发明涉及用于插入及表达编码肿瘤抗原的外源基因的经改进载体在免疫治疗性治疗癌中的用途。一种此类外源DNA序列为经修饰的CEA核酸。
权利要求 :
1.表达载体，其包含SEQ ID NO：6所示的核酸序列。
2.权利要求1的表达载体，其中载体为质粒或病毒载体。
3.权利要求2的表达载体，其中病毒载体选自痘病毒、腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒及腺伴随病毒。
4.权利要求3的表达载体，其中病毒载体为选自痘苗、NYVAC、ALVAC、禽痘及TROVAC的痘病毒。
5.权利要求4的表达载体，其中病毒载体为选自NYVAC和ALVAC的痘病毒。
6.权利要求5的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2。
7.权利要求4的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2，禽痘是鸟痘。
8.权利要求7的表达载体，其中鸟痘是金丝雀痘。
9.权利要求1的表达载体，其还包含至少一个额外的编码肿瘤相关抗原的核酸序列。
10.权利要求9的表达载体，其中载体为质粒或病毒载体。
11.权利要求10的表达载体，其中病毒载体选自痘病毒、腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒及腺伴随病毒。
12.权利要求11的表达载体，其中病毒载体为选自痘苗、NYVAC、ALVAC、禽痘及TROVAC的痘病毒。
13.权利要求12的表达载体，其中病毒载体为选自NYVAC和ALVAC的痘病毒。
14.权利要求13的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2。
15.权利要求12的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2，禽痘是鸟痘。
16.权利要求15的表达载体，其中鸟痘是金丝雀痘。
17.权利要求1的表达载体，其还包含至少一个编码血管发生相关抗原的核酸序列。
18.权利要求17的表达载体，其中载体为质粒或病毒载体。
19.权利要求18的表达载体，其中病毒载体选自痘病毒、腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒及腺相关病毒。
20.权利要求19的表达载体，其中病毒载体为选自痘苗、NYVAC、ALVAC、禽痘及TROVAC的痘病毒。
21.权利要求20的表达载体，其中病毒载体为选自NYVAC和ALVAC的痘病毒。
22.权利要求21的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2。
23.权利要求20的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2，禽痘是鸟痘。
24.权利要求23的表达载体，其中鸟痘是金丝雀痘。
25.权利要求9的表达载体，其还包含至少一个编码血管发生相关抗原的核酸序列。
26.权利要求25的表达载体，其中载体为质粒或病毒载体。
27.权利要求26的表达载体，其中病毒载体选自痘病毒、腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒及腺伴随病毒。
28.权利要求27的表达载体，其中病毒载体为选自痘苗、NYVAC、ALVAC、禽痘及TROVAC的痘病毒。
29.权利要求27的表达载体，其中病毒载体为选自NYVAC和ALVAC的痘病毒。
30.权利要求29的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2。
31.权利要求28的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2，禽痘是鸟痘。
32.权利要求31的表达载体，其中鸟痘是金丝雀痘。
33.权利要求1、9、17或25的表达载体，其还包含至少一个编码共刺激组分的核酸序列。
34.权利要求33的表达载体，其中载体为质粒或病毒载体。
35.权利要求34的表达载体，其中病毒载体选自痘病毒、腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒及腺伴随病毒。
36.权利要求35的表达载体，其中病毒载体为选自痘苗、NYVAC、ALVAC、禽痘及TROVAC的痘病毒。
37.权利要求36的表达载体，其中病毒载体为选自NYVAC和ALVAC的痘病毒。
38.权利要求37的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2。
39.权利要求36的表达载体，其中ALVAC是ALVAC-2，禽痘是鸟痘。
40.权利要求39的表达载体，其中鸟痘是金丝雀痘。
41.在可药用载体中包含表达载体的组合物，其中所述表达载体包含SEQ ID NO：6所示的核酸序列。
42.权利要求41的组合物，其中载体为质粒或病毒载体。
43.权利要求42的组合物，其中病毒载体选自痘病毒、腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒及腺伴随病毒。
44.权利要求43的组合物，其中病毒载体为选自痘苗、NYVAC、ALVAC、禽痘及TROVAC的痘病毒。
45.权利要求44的组合物，其中病毒载体为选自NYVAC和ALVAC的痘病毒。
46.权利要求45的组合物，其中ALVAC是ALVAC-2。
47.权利要求44的组合物，其中ALVAC是ALVAC-2，禽痘是鸟痘。
48.权利要求47的组合物，其中鸟痘是金丝雀痘。
49.包含SEQ ID NO：6的表达载体在制备预防或治疗癌的药物中的用途。
50.权利要求49的用途，其中载体为质粒或病毒载体。
51.权利要求50的用途，其中病毒载体选自痘病毒、腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒及腺伴随病毒。
52.权利要求51的用途，其中病毒载体为选自痘苗、NYVAC、ALVAC、禽痘及TROVAC的痘病毒。
53.权利要求52的用途，其中病毒载体为选自NYVAC和ALVAC的痘病毒。
54.权利要求53的用途，其中ALVAC是ALVAC-2。
55.权利要求52的用途，其中ALVAC是ALVAC-2，禽痘是鸟痘。
56.权利要求55的用途，其中鸟痘是金丝雀痘。
57.分离的DNA分子，其包含SEQ ID NO：6所示的CEA(6D)-1，2序列。
说明书 :
经修饰的CEA核酸及表达载体
[0001] 发明领域
[0002] 本发明涉及编码多肽的核酸及该核酸或多肽在预防和/或治疗癌中的用途。特别地，本发明涉及用于插入并表达编码肿瘤抗原的外源基因的经改进载体以用于免疫治疗性治疗癌。
[0003] 发明背景
[0004] 近几年，由于在几种技术如高密度微阵列、SEREX、免疫组织化学(ICH)、RT-PCR、原位杂交(ISH)及激光捕获显微术(Rosenberg，Immunity，1999；Sgroi等人，1999，Schena等人，1995，Offringa等人，2000)的帮助下，基于原发肿瘤和正常细胞表达模式在鉴定分子方面的巨大进展，极大增加了对具肿瘤相关抗原(TAAs)的癌疫苗的研发。TAAs为肿瘤细胞表达或过表达的抗原并可为一种或几种肿瘤特异，例如CEA抗原在结肠直肠癌、乳腺癌及肺癌中表达。Sgroi等人(1999)通过组合应用激光捕获微解剖及cDNA微阵列而鉴定了在侵袭性癌细胞和转移性癌细胞中差异表达的几个基因。可用几种递送系统如DNA或病毒进行人癌的治疗性疫苗接种(Bonnet等人，2000)并可引起免疫反应及也可破坏对TAAs的免疫耐受。肿瘤细胞可通过插入编码T细胞共刺激分子如B7.1或细胞因子IFNγ、IL2、GM-CSF等更具免疫原性。TAA及细胞因子或共刺激分子的共表达可用于研发有效的治疗性疫苗(Hodge等人，1995，Bronte等人，1995，Chamberlain等人，1996)。
[0005] 本领域需要用于刺激免疫反应以预防或治疗癌的试剂和方法。本发明提供了可克服其他人在试图治疗癌症如癌中遇到的许多困难的此类试剂和方法。特别地，本发明提供了CEA的新编码序列。该核苷酸序列 CEA(6D)-1，2，包括的序列修饰去除了表达载体对截短形式CEA的表达。此种经修饰的序列是本领域技术人员为改进CEA表达及免疫方案需要的。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明提供了用于向患者施用以预防和/或治疗癌的免疫原性靶。特别地，免疫原性靶为CEA肿瘤抗原(“TA”)和/或血管发生相关抗原(“AA”)。在一个实施方案中，免疫原性靶由在转染细胞中改进CEA表达的经修饰CEA核苷酸序列(CEA(6D)-1，2)编码。在某些实施方案中，TA和/或AA作为包含在质粒中的核酸或包含在其它递送载体如重组病毒中的核酸向患者施用。TA和/或AA也可与免疫刺激剂，如共刺激分子或佐剂组合施用。
[0008] 附图简述
[0009] 图1.A.图示了包含在部分H6启动子控制下具6D修饰的CEA编码序列的质粒p3′H6MCEA。B.图示了质粒pSE1544.9(pUC 18-mCEA重复序列1)。
[0010] 图2.图示了质粒pSE1616.44(pUC 18-mCEA-经修饰的重复序列1)。
[0011] 图3.图示质粒pSE1658.15(p3′H6MCEA-经修饰的重复序列1)。
[0012] 图4.图示质粒pBSmCEA。
[0013] 图5.图示质粒pSE1686.1(pUC 18mCEA经修饰的重复序列2)。
[0014] 图6.图示质粒pSE 1696.1(pUC 18mCEA经修饰的重复序列2)。
[0015] 图7.图示质粒p3′H6modMCEA-重复序列1和2。
[0016] 图8.图示质粒pNVQH6MCEA(6D lst&2nd)。
[0017] 图9A-D.CAP(6D)与CAP(6D)-1，2核苷酸序列的比较，序列之间的差异用下划线标出。
[0018] 图10.PCR分析以确定在NYVAC DNA中存在CAP(6D)-1，2。
[0019] 图11.图示在表达CAP(6D)-1，2的细胞中缺乏截短CEA的免疫印迹。 [0020] 发明详述
[0021] 本发明提供了用于治疗和/或预防癌的试剂和方法。本申请中引用的所有参考文献引用作为参考。
[0022] 在一个实施方案中，本发明涉及对一种或多种肿瘤抗原(“TA”)诱导或增强免疫反应以预防和/或治疗癌。在某些实施方案中，一种或多种TA可组合应用。在优选的实施方案中，例如施用包含编码肿瘤抗原的核酸载体后或施用肽或多肽形式的肿瘤抗原本身后，在宿主细胞中TA的表达导致免疫反应。
[0023] 如文中所用的，“抗原”为在施用该抗原的宿主中产生免疫反应的分子(如多肽)或其部分。免疫反应可包括产生结合至少一个抗原表位的抗体和/或对表达抗原表位的细胞产生细胞免疫反应。此反应通过例如引起抗体产生增强，产生对抗原有增强亲和力的抗体，或增强细胞反应(即增强的T细胞反应)而增强当前的免疫反应。产生免疫反应的抗原可备选地称为具免疫原性的或可作为免疫原。在描述本发明时，可将TA称为“免疫原性靶”。
[0024] 在癌细胞为抗原源时，TA包括肿瘤相关抗原(TAAs)及肿瘤特异抗原(TSAs)两者。TAA为在肿瘤细胞表面表达量比在正常细胞表面观察到的表达量高的抗原或为在胎儿发育期间正常细胞表达的抗原。TSA为只在肿瘤细胞表达而在正常细胞不表达的抗原。TA进一步包括TAAs或TSAs、其抗原性片段及保留它们抗原性的经修饰形式。
[0025] 根据它们的表达模式、功能或遗传起源，TA一般分为五类：睾丸癌(CT)抗原(即MAGE，NY-ESO-1)；黑素细胞分化抗原(即MelanA/MART-1，酪氨酸酶，gp100)；突变抗原(即MUC-1，p53，CDK-4)；过表达的“自身”抗原(即HER-2/neu，p53)及病毒抗原(即HPV，EBV)。为实施本发明，适当的TA为对施用该TA的宿主诱导或增强抗肿瘤免疫反应的任何TA。适当的TA包括，例如，gp100(Cox等人，Science，264：
716-719(1994))，MART-1/Melan A(Kawakami 等 人，J Exp.Med.，180：347-352(1994))，gp75(TRP-1)(Wang等 人，J.Exp.Med.，186：1131-1140(1996))，酪 氨 酸 酶(Wolfel 等人，Eur.J Immunol.，24：759-764(1994)； WO200175117；WO200175016；WO200175007)，NY-ESO-1(WO98/14464；WO99/18206)，黑素瘤蛋白聚糖(Hellstrom等人，J.Immunol.，
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92：7976-7980(1995))，细胞周期蛋白依赖性激酶-4(CDK4)(Wolfel等人，Science，
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982-990(1995)，美国专利号5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；
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1807-1811(1994))；抗独特型表位或抗原，例如，免疫球蛋白独特型或T细胞受体独特型(Chen等人，J.Immunol.，153： 4775-4787(1994))；KSA(美国专利号5,348,887)，驱动蛋白2(Dietz等人，Biochem Biophys Res Commun 2000年9月7日；275(3)：731-8)，HIP55，TGFβ-1抗编程性细胞死亡因子(Toomey等人，Br J Biomed Sci2001；58(3)：177-83)，肿 瘤 蛋 白 D52(Bryne J.A. 等 人，Genomics，35：523-532(1996))，H1FT，NY-BR-1(WO
01/47959)，NY-BR-62，NY-BR-75，NY-BR-85，NY-BR-87，NY-BR-96(Scanlan，M.在 Cancer Vaccines 2000，癌研究所，纽约，NY一书中的鉴定人肿瘤抗原的血清学及生物信息学方法)，AAC2-1或AAC-2，包括“野生型”(即通常为基因组编码，天然存在的)、经修饰的及突变形式及其其它片段和衍生物。任何这些TA可单独应用或在共免疫方案中与另一其它TA组合应用。
716-719(1994))，MART-1/Melan A(Kawakami 等 人，J Exp.Med.，180：347-352(1994))，gp75(TRP-1)(Wang等 人，J.Exp.Med.，186：1131-1140(1996))，酪 氨 酸 酶(Wolfel 等人，Eur.J Immunol.，24：759-764(1994)； WO200175117；WO200175016；WO200175007)，NY-ESO-1(WO98/14464；WO99/18206)，黑素瘤蛋白聚糖(Hellstrom等人，J.Immunol.，
130：1467-1472(1983))，MAGE家族抗原(即MAGE-1，2，3，4，6，12，51；Van der Bruggen等人，Science，254：1643-1647(1991)；美国专利号6,235,525；CN1319611)，BAGE家族抗原(Boel等人，Immunity，2：167-175(1995))，GAGE家族抗原(即GAGE-1，2；Van den Eynde等人，J.Exp.Med.，182：689-698(1995)；美国专利号6,013,765)，RAGE家族抗原(即RAGE-1；Gaugler等人，Immunogenetics，44：323-330(1996)；美国专利号5,939,526)，N-乙酰 葡糖 氨基 转移酶 -V(Guilloux等人，J.Exp.Med.，183：1173-1183(1996))，p15(Robbins等人，J.Immunol.154：5944-5950(1995))，β-连环蛋白(Robbins等人，J.Exp.Med.，183：1185-1192(1996))，MUM-1(Coulie 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
92：7976-7980(1995))，细胞周期蛋白依赖性激酶-4(CDK4)(Wolfel等人，Science，
269：1281-1284(1995))，p21-ras(Fossum 等 人，Int.J.Cancer，56：40-45(1994))，BCR-abl(Bocchia等人，Blood，85：2680-2684(1995))，p53(Theobald等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11993-11997(1995))，p185HER2/neu(erb-B1；Fisk 等 人，J.Exp.Med.，181：2109-2117(1995))，表皮生长因子受体(EGFR)(Harris等人，Breast Cancer Res.Treat，29：1-2(1994))，癌 胚 抗原 (CEA)(Kwong等 人，J.Natl.Cancer Inst.，85：
982-990(1995)，美国专利号5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；
6,045,802；EP263933；EP346710及EP784483)；癌相关突变粘蛋白(即MUC-1基因产物；Jerome等 人，J.Immunol.，151：1654-1662(1993))；EBV的EBNA 基因 产 物( 即EBNA-1；Rickinson等人，CancerSurveys，13：53-80(1992))；人乳头状瘤病毒E7，E6蛋白(Ressing等人，J.Immunol，154：5934-5943(1995))；前列腺特异抗原(PSA；Xue等人，The Prostate，30：73-78(1997))；前列腺特异膜抗原(PSMA；Israeli等人，Cancer Res.，54：
1807-1811(1994))；抗独特型表位或抗原，例如，免疫球蛋白独特型或T细胞受体独特型(Chen等人，J.Immunol.，153： 4775-4787(1994))；KSA(美国专利号5,348,887)，驱动蛋白2(Dietz等人，Biochem Biophys Res Commun 2000年9月7日；275(3)：731-8)，HIP55，TGFβ-1抗编程性细胞死亡因子(Toomey等人，Br J Biomed Sci2001；58(3)：177-83)，肿 瘤 蛋 白 D52(Bryne J.A. 等 人，Genomics，35：523-532(1996))，H1FT，NY-BR-1(WO
01/47959)，NY-BR-62，NY-BR-75，NY-BR-85，NY-BR-87，NY-BR-96(Scanlan，M.在 Cancer Vaccines 2000，癌研究所，纽约，NY一书中的鉴定人肿瘤抗原的血清学及生物信息学方法)，AAC2-1或AAC-2，包括“野生型”(即通常为基因组编码，天然存在的)、经修饰的及突变形式及其其它片段和衍生物。任何这些TA可单独应用或在共免疫方案中与另一其它TA组合应用。
[0026] 在某些情况下，用TA与其它抗原，如血管发生相关抗原(“AA”)共免疫患者是有益的。AA为与参与血管诱导和/或血管继续发育的细胞相关的免疫原性分子(即肽、多肽)。例如AA可在血管的主要结构组分上皮细胞(“EC”)表达。当癌症为癌时，优选在供给肿瘤的血管内或血管附近发现AA。患者的抗AA免疫优选导致抗AA免疫反应，由此可预防和/或抑制在肿瘤附近或肿瘤内发生的血管发生过程。
[0027] 示例性的AA包括，例如血管内皮生长因子(即VEGF；Bernardini等人，J.Urol.，2001，166(4)：1275-9；Starnes 等 人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，2001，122(3)：
518-23)，VEGF受体(即VEGF-R，flk-1/KDR，Starnes等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，
2001，122(3)：518-23)，EPH受体(即EPHA2；Gerety等人，1999，Cell，4：403-414)，表皮生长因子受体(即EGFR；Ciardeillo等人，Clin.Cancer Res.，2001，7(10)：2958-70)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Davidson等人，Clin.Exp.Metastasis 2000，18(6)：501-7；
Poon等人，Am J.Surg.，2001，182(3)：298-304)，血小板源性细胞生长因子(即PDGF-B)，血小板源性上皮细胞生长因子(PD-ECGF；Hong等人，J.Mol.Med.，2001，8(2)：141-8)，转化生长因子(即TGF-α；Hong等人，J.Mol.Med.，2001，8(2)：141-8)，endoglin(Balza等人，Int.J.Cancer，2001，94：579-585)，Id蛋白(Benezra， R.Trends Cardiovasc.Med.，
2001，11(6)；237-41)，蛋白酶如uPA，uPAR及基质金属蛋白酶(MMP-2，MMP-9；Djonov等人，J.Pathol.，2001，195(2)：147-55)，一氧化氮合酶(Am.J.Ophthalmol.，2001，132(4)：
551-6)，氨肽酶(Rouslhati，E.Nature Cancer，2：84-90，2002)，血小板反应蛋白(即TSP-1，TSP-2；Alvarez 等 人，Gynecol.Oncol.，2001，82(2)：273-8；Seki 等 人，Int.J.Oncol.，2001，19(2)：305-10)，k-ras(Zhang等人，Cancer Res.，2001，61(16)：6050-4)，Wnt(Zhang等人，Cancer Res.，2001，61(16)：6050-4)，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs；
Drug Resist.Updat.2000，3(2)：83-88)，微管(Timar等人，2001.Path.Oncol.Res.，7(2)：
85-94)，热休克蛋白(即HSP90(Timar，同上))，肝素结合因子(即肝素酶；Gohji等人，Int.J.Cancer，2001，95(5)：295-301)，合酶(即ATP合酶，胸苷酸合酶)，胶原受体，整联蛋白(即ανβ3，ανβ5，α1β1，α2β1，α5β1)，表面蛋白聚糖NG2，AAC2-1或AAC2-2等等，包括“野生型”(即通常由基因组编码，天然存在的)、经修饰的及突变形式及其其它片段和衍生物。任何这些靶可在实践本发明中适用，无论单一应用或与其它AA或与另外其它药剂组合应用。
518-23)，VEGF受体(即VEGF-R，flk-1/KDR，Starnes等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，
2001，122(3)：518-23)，EPH受体(即EPHA2；Gerety等人，1999，Cell，4：403-414)，表皮生长因子受体(即EGFR；Ciardeillo等人，Clin.Cancer Res.，2001，7(10)：2958-70)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Davidson等人，Clin.Exp.Metastasis 2000，18(6)：501-7；
Poon等人，Am J.Surg.，2001，182(3)：298-304)，血小板源性细胞生长因子(即PDGF-B)，血小板源性上皮细胞生长因子(PD-ECGF；Hong等人，J.Mol.Med.，2001，8(2)：141-8)，转化生长因子(即TGF-α；Hong等人，J.Mol.Med.，2001，8(2)：141-8)，endoglin(Balza等人，Int.J.Cancer，2001，94：579-585)，Id蛋白(Benezra， R.Trends Cardiovasc.Med.，
2001，11(6)；237-41)，蛋白酶如uPA，uPAR及基质金属蛋白酶(MMP-2，MMP-9；Djonov等人，J.Pathol.，2001，195(2)：147-55)，一氧化氮合酶(Am.J.Ophthalmol.，2001，132(4)：
551-6)，氨肽酶(Rouslhati，E.Nature Cancer，2：84-90，2002)，血小板反应蛋白(即TSP-1，TSP-2；Alvarez 等 人，Gynecol.Oncol.，2001，82(2)：273-8；Seki 等 人，Int.J.Oncol.，2001，19(2)：305-10)，k-ras(Zhang等人，Cancer Res.，2001，61(16)：6050-4)，Wnt(Zhang等人，Cancer Res.，2001，61(16)：6050-4)，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs；
Drug Resist.Updat.2000，3(2)：83-88)，微管(Timar等人，2001.Path.Oncol.Res.，7(2)：
85-94)，热休克蛋白(即HSP90(Timar，同上))，肝素结合因子(即肝素酶；Gohji等人，Int.J.Cancer，2001，95(5)：295-301)，合酶(即ATP合酶，胸苷酸合酶)，胶原受体，整联蛋白(即ανβ3，ανβ5，α1β1，α2β1，α5β1)，表面蛋白聚糖NG2，AAC2-1或AAC2-2等等，包括“野生型”(即通常由基因组编码，天然存在的)、经修饰的及突变形式及其其它片段和衍生物。任何这些靶可在实践本发明中适用，无论单一应用或与其它AA或与另外其它药剂组合应用。
[0028] 在某些实施方案中，应用编码免疫原性靶的核酸分子。核酸分子可包含或由编码一种或多种免疫原性靶的核苷酸序列或其片段或衍生物组成，例如ATCC保藏中心的DNA插入物中包含的核酸分子。术语“核酸序列”或“核酸分子”是指DNA或RNA序列。该术语包含自任何已知DNA与RNA碱基同系物形成的分子，诸如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基-胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶、双氢尿嘧啶、次黄苷、N6-异-戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫脲嘧啶、 β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶及2，6-二氨基嘌呤等等。
[0029] 经分离的核酸分子为：(1)当总核酸分离自来源细胞时，所述经分离核酸分子与至少50％天然存在的蛋白质、脂类、糖类或其它矿物质分开；(2)与所述核酸分子天然连接的全部或部分多核苷酸不相连接；(3)与非天然连接的多核苷酸可以可操作地连接；和/或，(4)本身不作为更大多核苷酸序列的部分。优选地，本发明经分离的核酸分子基本上不含任何其它污染的核酸分子或其它自然环境中发现的可干扰多肽产生用途或它在治疗、诊断、预防或研究用途的其它污染物。如文中应用的，与生物学材料如核酸分子、多肽、宿主细胞等一起应用的术语“天然存在”或“天然”或“天然发现”是指在自然中发现的但不通过人进行操作的材料。同样，文中应用的“非天然存在”或“非天然”是指在自然中没有发现或经过人进行结构修饰或合成的材料。
[0030] 两个或多个核酸或多肽分子的同一性通过比较序列进行确定。如本领域已知的，“同一性”表示由组成分子的单位(即核苷酸或氨基酸残基)之间的匹配来确定核酸分子或多肽间的序列相关性程度。同一性通过特定的数学模型或计算机程序(即运算法则)测定两个或多个具有缺口比对(gapalignments)(如果存在的话)的较小序列之间同一性匹配的百分率。核酸序列之间的同一性也可通过相关序列与核酸序列或经分离的核酸分子杂交的能力进行确定。在确定此类序列时，术语“高度严格条件”及“中度严格条件”是指允许序列互补的核酸链杂交，并排除明显不匹配核酸杂交的过程。杂交及洗涤的“高度严格条件”的实例为0.015M氯化钠，0.0015M柠檬酸钠于65-68℃或0.015M氯化钠，0.0015M柠檬酸钠及50％甲酰胺于42℃进行杂交及洗涤(参见，例如Sambrook，Fritsch & Maniatis， Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor实验室，1989)；Anderson等人，Nucleic Acid Hybridisation：A PracticalApproach第4章(IRL有限出版社))。术语“中度严格条件”是指在该条件下，DNA双链体比“高度严格条件”下可形成的错配有更大程度的碱基对错配。示例性的中度严格条件为0.015M氯化钠，0.0015M柠檬酸钠于50-65℃或0.015M氯化钠，0.0015M柠檬酸钠及20％甲酰胺于37-50℃进行杂交及洗涤。以举例的方式，在0.015M钠离子中于50℃进行杂交及洗涤的中度严格条件有约21％的错配。在杂交期间，杂交和洗涤缓冲液中可包括其它试剂以降低非特异和/或背景杂交。实例为0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％焦磷酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，NaDodSO4，(SDS)，菲可(ficoll)，Denhardt′s溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(或其它非互补DNA)及硫酸葡聚糖，但也可用其它适当试剂。在基本上不影响杂交条件的严格性时，这些添加剂的浓度及类型可进行改变。杂交实验通常在pH 6.8-7.4进行；然而，在一般离子强度条件下，杂交速率几乎不依赖pH。
[0031] 在本发明优选的实施方案中，用载体将编码多肽的核酸序列转移到细胞中。载体为用于向宿主细胞转移核酸序列的任何分子。在某些情况下，应用表达载体。表达载体为这样的核酸分子，其适于向宿主细胞转化并包含指导和/或调控所转移核酸序列表达的核酸序列。表达包括但不限于如转录、翻译及剪接(如果存在内含子的话)的过程。表达载体一般包含与编码多肽的外源核酸序列可操作地连接的一个或多个侧翼序列。侧翼序列可例如为同源(即与宿主细胞来自同一物种和/或品系)，外源(即除宿主细胞物种或品系外的物种)，杂交体(即，一个以上来源侧翼序列的组合)或合成的。
[0032] 侧翼序列优选能影响编码序列的复制、转录和/或翻译并与编码序列可操作地连接。如文中应用的，术语可操作地连接是指多核苷酸元件功能相关地进行连接。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接。然而，侧翼序列不必与编码序列邻 近，只要它正确发挥功能。因此，例如在启动子序列和编码序列之间可存在间插的非翻译但转录的序列并且又仍可认为启动子序列是与编码序列是可操作地连接的。同样，增强子序列可位于编码序列的上游或下游并影响该序列的转录。 [0033] 在某些实施方案中，优选侧翼序列为在靶细胞中引起高水平表达的转录调节区。转录调节区可包含，例如启动子、增强子、沉默子、抑制元件或其组合。转录调节区可分为组成型、组织特异型、细胞特异型(即与其它组织或细胞类型相比该区引起一种组织或细胞的较高水平转录)或可调节型(即对化合物如四环素的相互作用作出反应)。转录调节区的来源可为任何原核生物或真核生物，任何脊椎或无脊椎生物或任何植物，条件是侧翼序列在细胞内通过在该细胞内引起核酸转录行使功能。在实践本发明时，可应用多种转录调节区。
[0034] 适当的转录调节区包括CMV启动子(即CMV立即早期启动子)；来自真核基因的启动子(即雌激素可诱导的鸡卵清蛋白基因、干扰素基因、糖皮质激素可诱导的酪氨酸氨基转移酶基因及胸苷激酶基因)和主要早期及晚期腺病毒基因启动子；SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-10)；包含劳斯肉瘤病毒(RSV)3’长末端重复(LTR)的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell 22：787-97)；单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-45)；金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，1982，Nature296：39-42)；原核表达载体如β内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：
3727-31)或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：21-25)。组织和/或细胞特异的转录控制区包括，例如胰腺腺泡细胞中活跃的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，1984，Cell 38：639-46；Ornitz等人，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；胰腺β细胞中活跃的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature315：115-22)；淋巴样细胞中活跃的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl 等人，1984，Cell 38：647-58；Adames等人，1985，Nature 318：533-38；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.，7：1436-44)；睾丸、乳腺、淋巴样细胞及肥大细胞中的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人，1986，Cell45：485-95)；
肝中的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，Genes andDevel.1：268-76)；肝中的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.，5：1639-48；Hammer等人，1987，Science 235：53-58)；肝中的α1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1：161-71)；骨髓细胞中的β球蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，Nature315：
338-40；Kollias等人，1986，Cell 46：89-94)；脑少突胶质细胞中髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，Cell 48：703-12)；骨骼肌中肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani，
1985，Nature 314：283-86)；下丘脑的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，1986，Science 234：1372-78)及黑素瘤细胞中的酪氨酸酶启动子(Hart，I.Semin Oncol 1996年
2月；23(1)：154-8；Siders等人，Cancer Gene Ther 1998年9月-10月；5(5)：281-91)，等等。其它适当启动子是本领域已知的。
3727-31)或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：21-25)。组织和/或细胞特异的转录控制区包括，例如胰腺腺泡细胞中活跃的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，1984，Cell 38：639-46；Ornitz等人，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；胰腺β细胞中活跃的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature315：115-22)；淋巴样细胞中活跃的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl 等人，1984，Cell 38：647-58；Adames等人，1985，Nature 318：533-38；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.，7：1436-44)；睾丸、乳腺、淋巴样细胞及肥大细胞中的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人，1986，Cell45：485-95)；
肝中的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，Genes andDevel.1：268-76)；肝中的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.，5：1639-48；Hammer等人，1987，Science 235：53-58)；肝中的α1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1：161-71)；骨髓细胞中的β球蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，Nature315：
338-40；Kollias等人，1986，Cell 46：89-94)；脑少突胶质细胞中髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，Cell 48：703-12)；骨骼肌中肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani，
1985，Nature 314：283-86)；下丘脑的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，1986，Science 234：1372-78)及黑素瘤细胞中的酪氨酸酶启动子(Hart，I.Semin Oncol 1996年
2月；23(1)：154-8；Siders等人，Cancer Gene Ther 1998年9月-10月；5(5)：281-91)，等等。其它适当启动子是本领域已知的。
[0035] 如上所述，增强子也可为适当的侧翼序列。增强子为DNA的顺式作用元件，通常长约10-300bp，作用于启动子以增强转录。增强子一般是不依赖方向和位置的，已确定可位于受控编码序列的5’和3’。已知可获得几种来自哺乳动物基因的增强子序列(即球蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白和胰岛素)。同样，SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，多瘤病毒增强子及腺病毒增强子可与真核启动子序列应用。虽然增强子可在核酸编码序列的5’或3’位剪接入载体内，但它一般位于启动子的5’位。其它适当增强子是本领域已知的，并可适用于本发明。
[0036] 在准备本发明的试剂时，可需要将细胞进行转染或转化。转染是指细胞将外来或外源DNA摄入，并且外源DNA导入到细胞膜内时已将细胞进行了转染。许多转染技术是本领域公知的(即Graham等人，1973，Virology52：456；Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratories，1989)；Davis 等 人，Basic Methods in Molecular Biology(Elsevier，1986)及Chu等人，1981，Gene 13：197)。此类技术可用于将一个或多个外源DNA导入到适当的宿主细胞中。
[0037] 在某些实施方案中，优选转染细胞导致所述细胞的转化。当细胞特性发生变化时已将细胞进行了转化，当进行修饰以包含新核酸时正在将细胞进行转化。转染后，经转染的核酸可通过物理整合到细胞的染色体中与细胞的核酸重组，可作为不能进行复制的附加元件暂时存在，或可作为质粒自主复制。当核酸随细胞的分裂进行复制时，细胞发生了稳定转化。
[0038] 本发明进一步提供了多肽形式的经分离免疫原性靶。可认为多肽是已分离的，条件是(1)当分离自源细胞时，所述多肽与至少约50％天然存在的多核苷酸、脂质、糖类，或其它矿物质分开；(2)与所有或部分与该经分离多肽天然连接的多肽不再连接(通过共价或非共价相互作用)；(3)与非天然连接的多肽可操作地连接(通过共价或非共价相互作用)；或(4)天然不存在。优选地，经分离的多肽基本上不含任何其它污染多肽或其它在自然环境中发现的可干扰它在治疗、诊断、预防或研究用途的污染物。
[0039] 根据对它们进行制备的方法，免疫原性靶多肽可为成熟多肽，如本文中定义的，并可含有或不含有氨基末端甲硫氨酸残基。也考虑相关多肽如具有免疫原性靶的至少一个特性或活性(即活性，抗原性)的片段、变体(即等位基因变体，剪接变体)，直向同源物，同系物及衍生物。也涉及这样的肽，所述肽是指有与来自其序列来源的多肽中至少一部分对应序列的一系列连续的氨基酸残基。在优选的实施方案中，肽包含约5-10个氨基酸，10-15个氨基酸，15-20个氨基酸，20-30个氨基酸，或30-50个氨基酸。在一个更优选的实施方案中，肽包含9-12个氨基酸，例如适于向MHC I类分子递呈。
[0040] 核酸或多肽片段包含在氨基末端(有或无前导序列)和/或羧基末端截短的序列(即核酸或多肽)。片段也可包括变体(即等位基因变体，剪接变体)，直向同源物，同系物及与亲本序列相比，有一个或多个氨基酸添加或替代或内部缺失的其它变体。在优选的实施方案中，截短和/或缺失包含约10个氨基酸，20个氨基酸，30个氨基酸，40个氨基酸，50个氨基酸或更 多。如此产生的多肽片段可包含约10个氨基酸，25个氨基酸，30个氨基酸，40个氨基酸，50个氨基酸，60个氨基酸，70个氨基酸或更多。这些多肽片段可任选地包含一个氨基末端甲硫氨酸残基。应当理解这些片段可用于，例如产生针对免疫原性靶多肽的抗体或细胞免疫反应。
[0041] 变体为与目标序列相比有一个或多个序列替代、缺失和/或添加的序列。变体可为天然存在或人工构建的。此类变体可从对应的核酸分子进行制备。在优选的实施方案中，变体有从1至3，或从1至5，或从1至10，或从1至15，或从1至20，或从1至25，或从1至30，或从1至40，或从1至50，或多于50个氨基酸替代、插入、添加和/或缺失。 [0042] 等位基因变体为在占据一个生物体或一群生物体的染色体的给定基因座处的基因的几个可能的天然存在备选形式之一。剪接变体为产生自初期转录体剪接导致的几个RNA转录体之一的多肽。直向同源物为与其它物种相似的核酸或多肽序列。例如免疫原性靶多肽的小鼠和人形式可认为是相互的直向同源物。序列的衍生物为来源于有替代、添加、缺失或经化学修饰变体的亲本序列衍生的。变体也可包括融合蛋白，所述融合蛋白是指一种或多种第一序列(如肽)在至少一个其它序列的氨基或羧基末端(异源肽)的融合。 [0043] “相似性”是与同一性相关的概念，除了相似性包括对同一性匹配及保守替代匹配这两者进行相关性测定这一点不同之外。如果两个多肽序列有例如，10/20相同氨基酸，并且其余全为非保守替代，那么同一性及相似性的百分率均为50％。如果在同一实例中，有五个以上位置为保守性替代，那么同一性百分率为50％，但相似性百分率为75％(15/20)。因此，在有保守性替代情况下，两个多肽的相似性百分率比两个多肽之间的同一性百分率高。 [0044] 替代可为保守性，或非保守性，或其任何组合。多肽序列的保守性氨基酸修饰(及对应的编码核苷酸修饰)可产生与亲本多肽相似的功能及化学特征的多肽。例如，“保守氨基酸替代”可包括用非天然残基替代天然氨基酸残基，由此对所述位点的氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性 或亲水性有很小或没有影响，并且特别地，不会导致免疫原性降低。
在表1中显示了适当的保守性氨基酸替代。
在表1中显示了适当的保守性氨基酸替代。
[0045] 表1
[0046]最初残基 示例性替代 优选替代
丙氨酸 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸 缬氨酸
精氨酸 赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺 赖氨酸
天冬酰胺 谷氨酰胺 谷氨酰胺
天冬氨酸 谷氨酸 谷氨酸
半胱氨酸 丝氨酸、丙氨酸 丝氨酸
谷氨酰胺 天冬酰胺 天门冬酰胺
谷氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸
甘氨酸 脯氨酸、丙氨酸 丙氨酸
组氨酸 天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸 精氨酸
异亮氨酸 亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨 酸、正亮氨酸 亮氨酸
亮氨酸 正亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙 氨酸、苯丙氨酸 异亮氨酸
赖氨酸 精氨酸、1，4-二氨基丁酸、谷氨酰胺、天冬酰 胺 精氨酸
甲硫氨酸 亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸 亮氨酸
苯丙氨酸 亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、色氨酸 亮氨酸
脯氨酸 丙氨酸 甘氨酸
丝氨酸 苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸 苏氨酸
苏氨酸 丝氨酸 丝氨酸
色氨酸 酪氨酸、苯丙氨酸 酪氨酸
酪氨酸 色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸 苯丙氨酸
缬氨酸 异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙 氨酸、正亮氨酸 亮氨酸[0047] 熟练技术人员能用公知的技术确定适当的多肽变体。为鉴定可发生变化而不破坏生物学活性的分子的适当区域(即MHC结合活性，免疫原性)， 本领域技术人员可靶向认为对所述活性不重要的区域。例如，当来自同一物种或来自其它物种的有相似活性的相似多肽是已知时，本领域技术人员可与该相似多肽比较所述多肽的氨基酸序列。通过进行这些分析，可鉴定在相似多肽中保守的残基及分子部分。应当理解相对于此类相似多肽，在分子的不保守区进行变化对多肽的生物学活性和/或结构较不可能有不利影响。同样，需要与MHC结合的残基是已知的，并可进行修饰以改进结合。然而，在大多数情况下，导致与MHC结合降低的修饰是不适当的。本领域技术人员也知道，甚至在相对保守区，可用化学相似的氨基酸替代天然存在的残基而保留活性。因此，甚至对生物学活性或结构重要的区域也可进行保守性氨基酸替代而不破坏生物学活性或对多肽结构不造成不利影响。
丙氨酸 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸 缬氨酸
精氨酸 赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺 赖氨酸
天冬酰胺 谷氨酰胺 谷氨酰胺
天冬氨酸 谷氨酸 谷氨酸
半胱氨酸 丝氨酸、丙氨酸 丝氨酸
谷氨酰胺 天冬酰胺 天门冬酰胺
谷氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸
甘氨酸 脯氨酸、丙氨酸 丙氨酸
组氨酸 天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸 精氨酸
异亮氨酸 亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨 酸、正亮氨酸 亮氨酸
亮氨酸 正亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙 氨酸、苯丙氨酸 异亮氨酸
赖氨酸 精氨酸、1，4-二氨基丁酸、谷氨酰胺、天冬酰 胺 精氨酸
甲硫氨酸 亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸 亮氨酸
苯丙氨酸 亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、色氨酸 亮氨酸
脯氨酸 丙氨酸 甘氨酸
丝氨酸 苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸 苏氨酸
苏氨酸 丝氨酸 丝氨酸
色氨酸 酪氨酸、苯丙氨酸 酪氨酸
酪氨酸 色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸 苯丙氨酸
缬氨酸 异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙 氨酸、正亮氨酸 亮氨酸[0047] 熟练技术人员能用公知的技术确定适当的多肽变体。为鉴定可发生变化而不破坏生物学活性的分子的适当区域(即MHC结合活性，免疫原性)， 本领域技术人员可靶向认为对所述活性不重要的区域。例如，当来自同一物种或来自其它物种的有相似活性的相似多肽是已知时，本领域技术人员可与该相似多肽比较所述多肽的氨基酸序列。通过进行这些分析，可鉴定在相似多肽中保守的残基及分子部分。应当理解相对于此类相似多肽，在分子的不保守区进行变化对多肽的生物学活性和/或结构较不可能有不利影响。同样，需要与MHC结合的残基是已知的，并可进行修饰以改进结合。然而，在大多数情况下，导致与MHC结合降低的修饰是不适当的。本领域技术人员也知道，甚至在相对保守区，可用化学相似的氨基酸替代天然存在的残基而保留活性。因此，甚至对生物学活性或结构重要的区域也可进行保守性氨基酸替代而不破坏生物学活性或对多肽结构不造成不利影响。
[0048] 其它优选的多肽变体包括糖基化变体其中糖基化位点的数量和/或类型与目标氨基酸序列相比已发生改变。在一个实施方案中，多肽变体比目标氨基酸序列包含更多或更少数量的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点以天冬酰胺-X-丝氨酸(Asn-X-Ser)或天冬酰胺-X-苏氨酸(Asn-X-Thr)序列为特征，其中称为X的氨基酸残基可为除脯氨酸外的任何氨基酸残基。以产生该序列而进行氨基酸残基的替代为添加N连接的糖链提供了一个潜在的新位点。备选地，去除该序列的替代可去除现存的N连接的糖链。也提供了N连接的糖链重排，其中将一个或多个N连接的糖基化位点(一般为天然存在)去除并将一个或多个新的N连接位点产生。为影响多肽的O-连接糖基化，可修饰丝氨酸和/或苏氨酸残基。
[0049] 其它优选的变体包括半胱氨酸变体，其中与目标氨基酸序列组相比，将一个或多个半胱氨酸残基去除或用其它氨基酸(如丝氨酸)替代。半胱氨酸变体用于当多肽必需进行重新折叠成生物学活性构象(如在分离不可溶的包涵体后)。半胱氨酸变体一般比天然蛋白质的半胱氨酸残基少，并且一般具有偶数数量以使不配对半胱氨酸导致的相互作用降到最低。
[0050] 在其它实施方案中，本发明的经分离多肽包括有助于多肽纯化的融合多肽片段。融合可在目标多肽变体的氨基末端或羧基末端进行。融合可直 接在没有接头或衔接分子情况下进行或可通过接头或衔接分子进行。接头或衔接分子可为一个或多个氨基酸残基，一般从约20个至约50个氨基酸残基。也可将接头或衔接分子设计为具有DNA限制性内切酶或蛋白酶的切割位点以允许融合部分的分离。应当理解融合多肽一旦构建成，就可根据文中描述的方法进行衍生。适当的融合片段包括金属结合结构域(例如多聚组氨酸片段)，免疫球蛋白结合结构域(即A蛋白、G蛋白、T细胞、B细胞、Fc受体或补体蛋白抗体结合结构域)，糖结合结构域(例如，麦芽糖结合结构域和/或“标记”区(即α-半乳糖苷酶的至少一部分，strep-tag肽、T7标记肽、FLAG肽或其它可用与结构域结合的化合物例如单克隆抗体进行纯化的结构域)等等。该标记一般在多肽表达时与多肽融合，并可作为从宿主细胞亲和纯化目的多肽序列的方法。亲和纯化可例如，通过用针对标记的抗体作为亲和基质的柱层析实现。任选地，标记可随后通过各种方法如用用于切割的某些肽酶从纯化的目的多肽序列中去除。如下面描述的，例如融合可在TA及共刺激组分如趋化因子CXC10(IP-10)，CCL7((MCP-3)，或CCL5(RANTES)之间进行。
[0051] 融合基序可增强免疫原性靶向MHC加工区室如内质网的转运。这些序列称为转导或胞吞序列，包括来自HIV tat(参见Kim等人，1997J.Immunol.159：1666)，果蝇(Drosophila antennapedia)(参见Schutze-Redelmeier等人，1996J.Immunol.157：650)或人1期蛋白质(hPERI；特别是，SRRHHCRSKAKRSRHH)的序列。
[0052] 此外，多肽或其变体可与同源多肽融合形成同源二聚体或与异源多肽融合形成异源二聚体。异源肽和异源多肽包括，但不限于：允许检测和/或分离融合多肽的表位；跨膜受体蛋白或其部分，如胞外结构域或跨膜结构域及胞内结构域；与跨膜受体蛋白结合的配体或其部分；有催化活性的酶或其部分；促进寡聚化的多肽或肽，如亮氨酸拉链结构域；增加稳定性的多肽或肽，如免疫球蛋白恒定区及与多肽或其变体不同的有治疗活性的多肽。 [0053] 在某些实施方案中，在本发明的组合物中将编码免疫原性靶、多肽或 其衍生物的核酸序列与一个或多个共刺激组分如细胞表面蛋白、细胞因子或趋化因子的核酸序列组合是有益的。共刺激组分可包括组合物中例如作为多肽或作为编码多肽的核酸。适当的共刺激分子包括，例如，与CD28家族成员结合的多肽(即CD28，ICOS；Hutloff等人，Nature 1999，397：263-265；Peach等人，J Exp Med 1994，180：2049-2058)如CD28结合多肽B7.1(CD80；Schwartz，1992；Chen等人，1992；Ellis等人，J.Immunol.，156(8)：2700-9)及B7.2(CD86；Ellis等人，J.Immunol.；156(8)：2700-9)；与整联蛋白家族成员结合的多肽(即LFA-1(CD11a/CD18)；Sedwick等人，J Immunol 1999，162：1367-1375； 等人，Science1998，282：2266-2269；Lub等人，Immunol Today 1995，16：479-483)包括ICAM家族成员(即ICAM-1，-2或-3)；与CD2家族成员结合的多肽(即CD2，信号传导淋巴细胞活化分子(CDw150或“SLAM”；Aversa等人，J Immunol 1997，158：4036-4044))如CD58(LFA-3；CD2配体；Davis等人，Immunol Today 1996，17：177-187)或SLAM配体(Sayos等人，Nature 1998，395：462-469)；与热稳定抗原结合的多肽(HSA或CD24；Zhou等人，Eur J Immunol 1997，27：2524-2528)；与TNF受体(TNFR)家族成员结合的多肽(即4-1BB(CD137；Vinay 等 人，SeminImmunol 1998，10：481-489)，OX40(CD134；Weinberg 等人，SeminImmunol 1998，10：471-480；Higgins等人，J Immunol 1999，162：486-493)及CD27(Lens等人，Semin Immunol 1998，10：491-499))如4-1BBL(4-1BB配体；Vinay等人，Semin Immunol 1998，10：481-48；DeBenedette等 人，J Immunol 1997，158：551-559)，TNFR相关因子1(TRAF-1；4-1BB配体；Saoulli等人，J Exp Med 1998，187：1849-1862，Arch等人，Mol CellBiol 1998，18：558-565)，TRAF-2(4-1BB及OX40配体；Saoulli等人，J Exp Med 1998，187：1849-1862；Oshima等人，Int Immunol 1998，10：517-526，Kawamata等人，J Biol Chem 1998，273：5808-5814)，TRAF-3(4-1BB及OX40配体；Arch等人，Mol Cell Biol 1998，18：558-565；Jang等人，Biochem Biophys Res Commun 1998，242：613-620；
Kawamata S 等人，J Biol Chem 1998，273：5808-5814)，OX40L(OX40配体；Gramaglia等人，J Immunol 1998，161：6510-6517)，TRAF-5(OX40配体；Arch等人，Mol Cell Biol 1998，18：
558-565；Kawamata等人，J Biol Chem 1998，273：5808-5814)及CD70(CD27配体；Couderc等人，Cancer Gene Ther.，5(3)：163-75)，CD154(CD40配体或“CD40L”；Gurunathan等人，J.Immunol.，1998，161：4563-4571；Sine等人，Hum.Gene Ther.，2001，12：1091-1102)也可适用。
Kawamata S 等人，J Biol Chem 1998，273：5808-5814)，OX40L(OX40配体；Gramaglia等人，J Immunol 1998，161：6510-6517)，TRAF-5(OX40配体；Arch等人，Mol Cell Biol 1998，18：
558-565；Kawamata等人，J Biol Chem 1998，273：5808-5814)及CD70(CD27配体；Couderc等人，Cancer Gene Ther.，5(3)：163-75)，CD154(CD40配体或“CD40L”；Gurunathan等人，J.Immunol.，1998，161：4563-4571；Sine等人，Hum.Gene Ther.，2001，12：1091-1102)也可适用。
[0054] 一种或多种细胞因子也可为适当的共刺激组分或“佐剂”，既可作为本发明组合物中包含的多肽又可由核酸编码(Parmiani等人，Immunol Lett2000年9月15日；74(1)：41-4；Berzofsky等人，Nature Immunol.1：209-219)。适当的细胞因子包括，例如白细胞介素-2(IL-2)(Rosenberg等人，Nature Med.4：321-327(1998))，IL-4，IL-7，IL-12(Pardoll综述，1992；Harries等人，J.Gene Med.2000年7月-8月；2(4)：243-9；Rao等人，J.Immunol.156：3357-3365(1996))，IL-15(Xin等人，Vaccine，17：858-866，1999)，IL-16(Cruikshank等人，J.Leuk Biol.67(6)：757-66，2000)，IL-18(J.Cancer Res.Clin.Oncol.2001.127(12)：718-726)，GM-CSF(CSF(Disis等人，Blood，88：202-210(1996))，肿瘤坏死因子α(TNF-α)或γ干扰素(INF-γ)。如本领域公知的，其它细胞因子也适用于实行本发明。
[0055] 也可应用趋化因子。例如包含CXCL10(IP-10)及CCL7(MCP-3)与肿瘤自身抗原融合的融合蛋白已显示诱导抗肿瘤免疫(Biragyn等人，Nature Biotech.1999，17：253-258)。趋化因子CCL3(MIP-1α)及CCL5(RANTES)(Boyer等人，Vaccine，1999，
17(Supp.2)：S53-S64)在实行本发明中也可应用。其它适当的趋化因子是本领域已知的。 [0056] 可对抑制性或负调节免疫机制进行阻断，以导致增强的免疫反应也是本领域已知的。例如，用抗CTLA-4(Shrikant等人，Immunity，1996，14：145-155；Sutmuller等人，J.Exp.Med.，2001，194：823-832)，抗CD25(Sutmuller，同上)，抗CD4(Matsui等人，J.Immunol.，1999，163： 184-193)，IL13Ra2-Fc融合蛋白(Terabe等人，Nature Immunol.，
2000，1：515-520)及其组合物治疗(即抗CTLA-4及抗CD25，Sutmuller，同上)已显示上调抗肿瘤免疫反应并适用于实行本发明。
17(Supp.2)：S53-S64)在实行本发明中也可应用。其它适当的趋化因子是本领域已知的。 [0056] 可对抑制性或负调节免疫机制进行阻断，以导致增强的免疫反应也是本领域已知的。例如，用抗CTLA-4(Shrikant等人，Immunity，1996，14：145-155；Sutmuller等人，J.Exp.Med.，2001，194：823-832)，抗CD25(Sutmuller，同上)，抗CD4(Matsui等人，J.Immunol.，1999，163： 184-193)，IL13Ra2-Fc融合蛋白(Terabe等人，Nature Immunol.，
2000，1：515-520)及其组合物治疗(即抗CTLA-4及抗CD25，Sutmuller，同上)已显示上调抗肿瘤免疫反应并适用于实行本发明。
[0057] 任何这些组分可单独应用或与其它试剂组合应用。例如，已显示CD80、ICAM-1及LFA-3(“TRICOM”)的组合可加强抗癌免疫反 应(Hodge等人，Cancer Res.59：5800-5807(1999))。其它有效组合包括，例如IL-12+GM-CSF(Ahlers等人，J.Immunol.，158：3947-3958(1997)；Iwasaki 等 人，J.Immunol.158：4591-4601(1997))，IL-12+GM-CSF+TNF-α(Ahlers 等 人，Int.Immunol.13：897-908(2001))，CD80+IL-12(Fruend 等 人，Int.J.Cancer，85：508-517(2000)；Rao 等 人，同 上 ) 及CD86+GM-CSF+IL-12(Iwasaki，同上)。本领域技术人员应当知道用于实行本发明的另外组合。此外，熟练技术人员应当知道用于调整此种机制的另外试剂或方法。这些试剂与方法，以及其它为本领域技术人员已知试剂和方法，可用于实行本发明。
[0058] 也可应用改进基于核酸免疫功效的另外策略包括，例如应用自主复制病毒复制子(Caley等人，1999，vaccine，17：3124-3135；Dubensky等人，2000.Mol.Med.6：723-732；Leitner等人，2000.Cancer Res.60：51-55)，密码子最佳化(Liu等人，2000.Mol.Ther.，1：
497-500；Dubensky，同上；Huang等人，2001.J.Virol.75：4947-4951)，体内电穿孔(Widera等人，2000.J.Immunol.164：4635-3640)，掺入CpG刺激基序(Gurunathan等人，Ann.Rev.Immunol.，2000，18：927-974；Leitner，同上)，用于靶向胞吞或遍在蛋白加工途径的序列 (Thomson等 人，1998.J.Virol.72：2246-2252；Velders 等 人，2001.J.Immunol.166：
5366-5373)，初次免疫加强方案(Gurunathan，同上；Sullivan等人，2000.Nature，408：
605-609；Hanke等人，1998.Vaccine，16：439-445；Amara等人，2001.Science 292：69-74)及应用粘膜递送载体如沙门氏菌(Darji等人，1997.Cell，91：765-775；Woo等人，2001.Vaccine，19：2945-2954)。其它方法是本领域已知的，其中一些在下面描述。 [0059] 也可将化学治疗剂、放射线、抗血管发生化合物或其它药剂应用于用免疫原性靶治疗和/或预防癌(Sebti等人，Oncogene 2000年12月27日；19(56)：6566-73)。例如，在治疗转移性乳腺癌中，有用的化学治疗剂包括环磷酰胺、阿霉素、紫杉醇、多西紫杉、诺维本、卡培他滨及丝裂霉素C等等。也已经证实有效的组合化学治疗方案包括例如，环磷酰胺+甲氨蝶呤+5-氟尿嘧啶；环磷酰胺+阿霉素+5-氟尿嘧啶或环磷酰胺+阿霉素。其它化合物如泼尼松、紫杉烷、诺维本、丝裂霉素C或长春碱已经用于各种用途。大多数乳腺癌患者有雌激素受体阳性(ER+)肿瘤并且在这些患者中，内分泌治疗(即他莫昔芬)优于化学治疗。对于这些患者，他莫昔芬或作为第二线治疗，优选黄体酮(醋酸甲羟孕酮或醋酸甲地孕酮)。芳香酶抑制剂(即氨鲁米特及其同系物如来曲唑)降低维持肿瘤生长需要的雌激素利用度并可在特定患者中用于第二或第三线内分泌治疗。
497-500；Dubensky，同上；Huang等人，2001.J.Virol.75：4947-4951)，体内电穿孔(Widera等人，2000.J.Immunol.164：4635-3640)，掺入CpG刺激基序(Gurunathan等人，Ann.Rev.Immunol.，2000，18：927-974；Leitner，同上)，用于靶向胞吞或遍在蛋白加工途径的序列 (Thomson等 人，1998.J.Virol.72：2246-2252；Velders 等 人，2001.J.Immunol.166：
5366-5373)，初次免疫加强方案(Gurunathan，同上；Sullivan等人，2000.Nature，408：
605-609；Hanke等人，1998.Vaccine，16：439-445；Amara等人，2001.Science 292：69-74)及应用粘膜递送载体如沙门氏菌(Darji等人，1997.Cell，91：765-775；Woo等人，2001.Vaccine，19：2945-2954)。其它方法是本领域已知的，其中一些在下面描述。 [0059] 也可将化学治疗剂、放射线、抗血管发生化合物或其它药剂应用于用免疫原性靶治疗和/或预防癌(Sebti等人，Oncogene 2000年12月27日；19(56)：6566-73)。例如，在治疗转移性乳腺癌中，有用的化学治疗剂包括环磷酰胺、阿霉素、紫杉醇、多西紫杉、诺维本、卡培他滨及丝裂霉素C等等。也已经证实有效的组合化学治疗方案包括例如，环磷酰胺+甲氨蝶呤+5-氟尿嘧啶；环磷酰胺+阿霉素+5-氟尿嘧啶或环磷酰胺+阿霉素。其它化合物如泼尼松、紫杉烷、诺维本、丝裂霉素C或长春碱已经用于各种用途。大多数乳腺癌患者有雌激素受体阳性(ER+)肿瘤并且在这些患者中，内分泌治疗(即他莫昔芬)优于化学治疗。对于这些患者，他莫昔芬或作为第二线治疗，优选黄体酮(醋酸甲羟孕酮或醋酸甲地孕酮)。芳香酶抑制剂(即氨鲁米特及其同系物如来曲唑)降低维持肿瘤生长需要的雌激素利用度并可在特定患者中用于第二或第三线内分泌治疗。
[0060] 其它癌可需要不同的化学治疗方案。例如转移性结肠直肠癌一般单独用依立替康(依立替康或CPT-11)、5-氟尿嘧啶或亚叶酸进行治疗或它们互相组合应用进行治疗。蛋白酶及整联蛋白抑制剂如MMP抑制剂马马司他(marimastate)(British Biotech)、COL-3(Collagenex)、新 伐 司 他 (Aetema)、AG3340(Agouron)、BMS-275291(Bristol Myers Squibb)、CGS 27023A(Novartis)或整联蛋白抑制剂Vitaxin(Medimmune)或MED1522(Merck KgaA)也可适用。如此，免疫学靶向与结肠直肠癌相关的免疫原性靶可与使用那些化学治疗剂的治疗组合进行。同样，用于治疗其它类型癌的化学治疗剂是本领域公知的并可与本文中描述的免疫原性靶组合。
[0061] 许多抗血管发生药剂是本领域公知的并适于与免疫原性靶疫苗共施用(参见，例如Timar等人，2001.Pathology Oncol.Res.，7(2)：85-94)。此类药剂包括，例如生理学药剂如生长因子(即ANG-2、NK1，2，4(HGF)，转化生长因子β(TGF-β))，细胞因子(即干扰素IFN-α，-β，-γ，血小板因子4(PF-4)、PR-39)，蛋白酶(即经切割的AT-III，胶原XVIII片段(内皮他汀(Endostatin))，HmwKallikrein-d5纤溶酶片段(血管他汀 (Angiostatin))，凝血酶原-F1-2，TSP-1)，蛋白酶抑制剂(即组织金属蛋白酶抑制剂如TIMP-1，-2，或-3；maspin；纤溶酶原激活剂抑制剂如PAI-1；色素上皮衍生因子(PEDF))，Tumstatin(通过ILEX有限公司获得)，抗体产物(即胶原结合抗体HUTV26，HUI77，XL313；抗VEGF；抗整联蛋白(即Vitaxin，(Lxsys)))及糖苷酶(即肝素酶-I，III)。已知的或相信有抗血管发生潜力的“化学”或经修饰生理学药剂包括，例如长春碱，紫杉醇(taxol)，酮康唑，反应停，dolestatin，考布他汀A，雷帕霉素(Guba等人，2002，Nature Med.，8：128-135)，CEP-7055(从Cephalon公司获得)，黄酮醋酸、Bay 12-9566(Bayer公司)，AG3340(Agouron公司)，CGS27023A(Novartis)，四环素衍生物(即COL-3(Collagenix公司))，新伐司他(Aeterna)，BMS-275291(Bristol-Myers Squibb)，低剂量5-FU，低剂量氨甲蝶呤，伊索格拉定，根赤壳菌素，环孢菌素，卡托普利，塞来昔布，D45152-硫酸多糖，阳离子蛋白(Protamine)，阳离子肽-VEGF，苏拉明(聚磺酰萘尿素)，干扰VEGF功能或产生的化合物(即SU5416或SU6668(Sugen)，PTK787/ZE22584(Novartis))，偏端霉素A，Angiozyme(核酶)，异黄酮，星形孢菌素衍生物，金雀异黄素，EMD121974(MerckKcgaA)，tyrphostins，异喹诺酮，维甲酸，羧基氨基三唑，TNP-470，善得定，2-甲氧雌二醇，氨基固醇(即角鲨胺)，谷胱甘肽同系物(即N-乙酰基-L-半胱氨酸)，考布他汀A-4(Oxigene)，Eph受体阻断剂(Nature，414：933-938，2001)，Rh-血管他汀，Rh-内皮他汀(WO01/93897)，环-RGD肽，accutin-disintegrin，苯二氮卓类，人源化抗avb3Ab，Rh-PAI-2，阿米洛利，对氨基苯甲脒，抗-uPAab，抗-uPARAb，L-苯丙氨酸-N-甲酰胺(即巴马司他，马马司他)，AG3340及二甲胺四环素。许多其它适当药剂是本领域已知的并足可实行本发明。
[0062] 本发明也可与治疗癌的“非传统”方法组合应用。例如，最近证实施用某种厌氧菌可有助于减缓肿瘤生长。在一项研究中，将梭状芽孢杆菌(Clostridium novyi)进行修饰以去除噬菌体游离体携带的毒素基因并向有结肠直肠癌的小鼠施用(Dang等人，P.N.A.S.USA，98(26)： 15155-15160，2001)。与化学治疗组合，该治疗显示引起动物的肿瘤坏死。本申请中描述的试剂与方法可与此种治疗方法组合。
[0063] 编码免疫原性靶的核酸可通过任何几种可获得技术向患者施用。已成功用于向宿主导入核酸的各种病毒载体包括反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒及痘病毒等等。在本领域中应当理解许多此类病毒载体是本领域可获得的。本发明的载体可用本领域技术人员可广泛获得的标准重组技术进行构建。此类技术可在普通分子生物学参考文献如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook等人，1989，ColdSpring Harbor实验室出版社)，Gene Expression Technology(D.Goeddel编辑的Methods in Enzymology，第185卷，1991.Academic出版社，SanDiego，CA)及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis等人，1990.Academic出版社，San Diego，CA)中找到。
[0064] 优选的反转录病毒载体为慢病毒衍生物及小鼠或禽反转录病毒衍生物。适当的反转录病毒载体的实例包括，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)，哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)，SIV，BIV，HIV及劳斯肉瘤病毒(RSV)。许多反转录病毒载体可掺入多个外源性核酸序列。由于重组反转录病毒是有缺陷的，它们需要辅助以产生感染性载体颗粒。该辅助作用可通过，例如编码反转录病毒结构基因的辅助细胞系进行提供。适当的辅助细胞系包括ψ2、PA317及PA12等等。然后可用此类细胞系产生的载体病毒体感染组织细胞系如NIH 3T3细胞，以产生大量的嵌合反转录病毒体。反转录病毒载体可通过传统方法(即注射)或通过植入与靶细胞群相邻的“生产细胞系”进行施用(Culver，K.等人，1994，Hum.Gene Ther.，5(3)：343-79；Culver，K.等人，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，59：685-90)；Oldfield，E.，1993，Hum.Gene Ther.，4(1)：39-69)。将生产细胞系进行改造以产生病毒载体并在靶细胞附近释放病毒颗粒。所释放病毒颗粒的一部分与靶细胞接触并感染这些细胞，因此将本发明的核酸递送到靶细胞。感染靶细胞后，出现载体核酸的表达。
[0065] 腺病毒载体是经证实特别有用的向真核细胞进行基因转移(Rosenfeld， M.等人，1991，Science，252(5004)：431-4；Crystal，R. 等 人，1994，Nat.Genet.，8(1)：42-51)，可用于真核基因表达的研究(Levrero，M.等人，1991，Gene，101(2)：195-202)，疫苗研发(Graham，F.和Prevec，L.，1992，Biotechnology，20：363-90)及动物模型(Stratford-Perricaudet，L.等人，1992，Bone Marrow Transplant.，9(Suppl.1)：151-2；
Rich，D.等人，1993，Hum.Gene Ther.，4(4)：461-76)。向体内不同组织施用重组Ad的实验途径包括气管内滴注(Rosenfeld，M.等人，1992，Cell，68(1)：143-55)，注射入肌肉(Quantin，B.等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7)：2581-4)，外周静脉注射(Herz，J.和Gerard，R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(7)：2812-6)及脑立体定位接种(Le Gal La Salle，G.等人，1993，Science，259(5097)：988-90)等等。 [0066] 腺伴随病毒(AAV)证实有高水平的感染性、广泛的宿主范围及在整合入宿主基因组中的特异性(Hermonat，P.等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(20)：6466-70)。
而单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是另一个吸引人的载体系统，由于它的嗜神经特性，特别用于神经系统(Geller，A.等人，1991，Trends Neurosci.，14(10)：428-32；Glorioso等人，
1995，Mol.Biotechnol.，4(1)：87-99；Glorioso 等 人，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49：
675-710)。
Rich，D.等人，1993，Hum.Gene Ther.，4(4)：461-76)。向体内不同组织施用重组Ad的实验途径包括气管内滴注(Rosenfeld，M.等人，1992，Cell，68(1)：143-55)，注射入肌肉(Quantin，B.等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7)：2581-4)，外周静脉注射(Herz，J.和Gerard，R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(7)：2812-6)及脑立体定位接种(Le Gal La Salle，G.等人，1993，Science，259(5097)：988-90)等等。 [0066] 腺伴随病毒(AAV)证实有高水平的感染性、广泛的宿主范围及在整合入宿主基因组中的特异性(Hermonat，P.等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(20)：6466-70)。
而单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是另一个吸引人的载体系统，由于它的嗜神经特性，特别用于神经系统(Geller，A.等人，1991，Trends Neurosci.，14(10)：428-32；Glorioso等人，
1995，Mol.Biotechnol.，4(1)：87-99；Glorioso 等 人，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49：
675-710)。
[0067] 痘病毒是另一个有用的表达载体(Smith等人，1983，Gene，25(1)：21-8；Moss等人，1992，Biotechnology，20：345-62；Moss等 人，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：25-38；Moss等人，1991.Science，252：1662-1667)。显示是有用的痘病毒包括痘苗、NYVAC、鸟痘、禽痘、金丝雀痘、ALVAC及ALVAC(2)等等。
[0068] NYVAC(vP866)衍生自痘苗病毒哥本哈根(Copenhagen)疫苗株，通过缺失基因组中编码已知或潜在毒力因子的六个非必需区而获得(参见，例如美国专利号5,364,773及5,494,807)。缺失基因座也可设计为插入外源基因的接受基因座。缺失区为胸苷激酶基因(TK；J2R)；出血区(u；B13R+B14R)；A型包涵体区(ATI；A26L)；血凝素基因(HA；A56R)； 宿主范围基因区(C7L-K1L)及核苷酸还原酶大亚单位(I4L)。NYVAC是基因改造的痘苗病毒株，所述基因改造的痘苗病毒株是通过特异缺失编码与毒力及宿主范围相关基因产物的十八个可读框而产生的。已显示NYVAC用于表达TAs(参见，例如美国专利号6,265,189)。
NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse，pMPC6H6K3E3及pC3H6FHVB也根据布达佩斯条约保藏在ATCC，保藏号分别为VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912及ATCC-97914。
NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse，pMPC6H6K3E3及pC3H6FHVB也根据布达佩斯条约保藏在ATCC，保藏号分别为VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912及ATCC-97914。
[0069] 基于ALVAC的重组病毒(即ALVAC-1和ALVAC-2)也适用于实行本发明(参见，例如美国专利号5,756,103)。ALVAC(2)与ALVAC(1)相同，除了ALVAC(2)基因组包含在痘苗启动子控制下的痘苗病毒E3L与K3L基因(美国专利号6,130,066；Beattie等人，1995a，1995b，1991；Chang等人，1992；Davies等人，1993)。ALVAC(1)与ALVAC(2)均证实用于表达外源DNA序列，如TAs(Tartaglia等人，1993a，b；美国专利号5,833,975)。根据布达佩斯条约ALVAC保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 Boulevard大学，马纳萨斯，Va.20110-2209，美国，ATCC保藏号VR-2547。
[0070] 另一个有用的痘病毒载体为TROVAC。TROVAC是指减毒禽痘，所述减毒禽痘衍生自得到批准用于接种1日龄鸡的禽痘病毒FP-1疫苗株的空斑克隆分离株。TROVAC同样根据布达佩斯条约保藏在ATCC，保藏号为2553。
[0071] “非病毒”质粒载体也可适用于实施本发明。优选的质粒载体与细菌、昆虫和/或哺乳动物宿主细胞相容。此类载体包括，例如PCR-II、pCR3及pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)，pBSII(Stratagene，La Jolla，CA)，pET15(Novagen，Madison，WI)，pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)，pETL(BlueBacII，Invitrogen)，pDSR-α(PCT 公 开 号 WO90/14363) 及pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island，NY)以及Bluescript 质粒衍生物(基于 COLE1的高拷贝数噬菌粒，Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)，设计用于克隆Taq扩增TMPCR产物的PCR质粒(例如，TOPO TA克隆 试剂盒，PCR2.1 质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)。细菌载体也可用于本发明。这些载体包括，例如志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、乳酸杆菌、卡介苗(BCG)及链球菌(参见例如，WO88/6626；WO90/0594；WO91/13157；
WO92/1796及WO92/21376)。许多其它非病毒质粒表达载体和系统是本领域已知的并可用于本发明。
WO92/1796及WO92/21376)。许多其它非病毒质粒表达载体和系统是本领域已知的并可用于本发明。
[0072] 适当的核酸递送技术包括DNA-配体复合体，腺病毒-配体-DNA复合体，直接注射DNA，CaPO4沉淀，基因枪技术，电穿孔及胶体分散系统，等等。胶体分散系统包括大分子复合物、毫微胶囊、微球、珠及基于脂类系统包括水包油乳剂、胶粒、混合胶粒及脂质体。本发明优选的胶体系统为脂质体，所述脂质体为用作体外及体内递送工具的人工膜囊泡。RNA、DNA及完整病毒粒子可包封在水相内部并以生物活性形式递送到细胞(Fraley，R.等人，1981，Treads Biochem.Sci.，6：77)。脂质体组合物通常为磷脂组合物，特别是高相转换温度磷脂，通常与类固醇，特别是胆固醇组合。也可用其它磷脂或其它脂类。脂质体的物理特性依赖于pH、离子强度及二价阳离子的存在。用于脂质体产生的脂类实例包括磷脂酰基化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂及神经节苷脂。特别有用的是二酰磷脂酰甘油，它的脂类部分包含14-18个碳原子，特别是16-18个碳原子并为饱和的。用作例子的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱及二硬脂酰磷脂酰胆碱。
[0073] 免疫原性靶也可与一种或多种佐剂组合施用以增强免疫反应。典型的佐剂在以下表I中进行显示：
[0074] 表I
[0075] 免疫原性佐剂的类型
[0076]
[0077] 本发明的免疫原性靶也可用于产生抗体以在筛选测定法或免疫治疗中 应用。其它用途对本领域技术人员是显然的。术语“抗体”包括抗体片段，如本领域已知的，包括Fab、Fab2、单链抗体(例如Fv)、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体，它们是通过本领域已知的几种方法产生的。制备和应用各种类型抗体的方法是本领域技术人员公知的并适用于实行本发明(参见，例如，Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Labortory，1988；Harlow 等 人，Using Antibodies：A LaboratoryMannuals，Portable protocol.No.1，1998；Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975))；Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann 等 人，Nature，332：323-329(1988)；Presta(Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)；Verhoeyen等人，(Science，239：1534-1536(1988)；
Hoogenboom 等 人，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks 等 人，J.Mol.Biol.，222：
581(1991)；Cole 等 人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，第 77 页 (1985)；Boerner 等 人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；Marks 等 人，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg 等 人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等 人，Nature Bioteclmology 14，845-51(1996)；
Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg 和 Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)以及美国专利号4,816,567；5,545,807；5,545,806；5,569,825；
5,625,126；5,633,425及5,661,016)。抗体或其衍生物也可与治疗部分如细胞毒性药物或毒素或其活性片段如白喉毒素A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、酚霉素、伊诺霉素等等连接。细胞毒性剂也可包括放射化学剂。抗体及它们的衍生物可掺入到本发明组合物中用于体外或体内应用。
Hoogenboom 等 人，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks 等 人，J.Mol.Biol.，222：
581(1991)；Cole 等 人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，第 77 页 (1985)；Boerner 等 人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；Marks 等 人，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg 等 人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等 人，Nature Bioteclmology 14，845-51(1996)；
Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg 和 Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)以及美国专利号4,816,567；5,545,807；5,545,806；5,569,825；
5,625,126；5,633,425及5,661,016)。抗体或其衍生物也可与治疗部分如细胞毒性药物或毒素或其活性片段如白喉毒素A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、酚霉素、伊诺霉素等等连接。细胞毒性剂也可包括放射化学剂。抗体及它们的衍生物可掺入到本发明组合物中用于体外或体内应用。
[0078] 代表免疫原性靶的核酸、蛋白质或其衍生物可用于确定患者疾病状况存在、预测预后状况或确定化学治疗性或其它治疗方案有效性的测定法。按本领域已知完成的表达谱可用于确定免疫原性靶表达的相对水平。然后，表达水平可与基础水平相关联以确定患者中是否存在特定疾病，患者的预 后状况或特定治疗方案是否有效，例如，如果患者用特定化学治疗方案进行治疗，免疫原性靶在患者组织(即外周血)中表达水平的降低可表明该方案可降低该宿主的荷瘤程度。同样，如果表达水平升高，则需要应用另外的治疗方式。在一个实施方案中，与编码免疫原性靶的核酸对应的核酸探针可固定至生物芯片，如本领域已知的，用于宿主中表达的检测及定量。
[0079] 在药物筛选测定中，也可用核酸、蛋白质、其衍生物或其抗体作为试剂。所述试剂可用于确定药物候选物对细胞系或患者的细胞或组织中免疫原性靶表达的作用。表达谱技术可与高通量筛选技术组合以能快速鉴定有用的化合物及监测用药物候选物治疗的功效(参见，例如Zlokarnik等人，Science 279，84-8(1998))。药物候选物可为天然存在或人工衍生的化学化合物、核酸、蛋白质、抗体或其衍生物。如此鉴定的药物候选物可作为药物组合物用于向患者施用或用于进一步筛选测定，以及用于其它用途。
[0080] 向宿主施用本发明组合物可用本领域技术人员已知的任何各种技术完成。组合物可根据药学常规方法进行加工以产生药剂用于向患者包括人及其它哺乳动物施用(即“药物组合物”)。药物组合物优选制剂成例如包含给定量DNA、病毒载体粒子、多肽或肽的剂量单位形式。取决于患者的疾病和其它因素，人或其它哺乳动物适当的每日剂量可有很大变化，但再一次说明的是，可用常规方法确定。
[0081] 药物组合物可以包含常规可药用载体、佐剂及运载工具的剂量单位剂型，经口、肠胃外、吸入喷雾、经直肠、结节内或局部施用。本文中应用的术语“可药用载体”或“生理学可接受载体”是指适用于完成或增强作为药物组合物的核酸、多肽或肽递送的一种或多种制剂材料。“药物组合物”为包含治疗有效量核酸或多肽的组合物。术语“有效量”及“治疗有效量”每个是指用于诱导或增强有效免疫反应的核酸或多肽的量。优选本发明的组合物提供在宿主中诱导或增强抗肿瘤免疫反应，所述抗肿瘤免疫反应保护宿主免受肿瘤发展和/或使宿主从身体去除存在的肿瘤。
[0082] 对于经口施用，药物组合物可为包括，例如胶囊剂、片剂、悬液或液体等几种形式中的任一形式。液体可作为具适当载体包括盐水、葡萄糖或 水的组合物通过注射进行施用。本文应用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、胸骨内注射、灌输或腹膜内施用。用于直肠施用药的栓剂可通过将药与适当的非刺激性赋形剂如在常温下为固体但在直肠温度下为液体的可可脂及聚乙二醇混合进行制备。
[0083] 用本发明的组合物免疫宿主或治疗疾患或疾病的剂量方案以多种因素为基础，所述多种因素包括患者的疾病类型、年龄、体重、性别、医学状况、疾病的严重性、施用途径及6
所用的特定化合物。例如，痘病毒载体可作为每个剂量包含1×10 感染颗粒的组合物进行施用。因此，剂量方案可有很大变化，但可用标准方法进行常规确定。
所用的特定化合物。例如，痘病毒载体可作为每个剂量包含1×10 感染颗粒的组合物进行施用。因此，剂量方案可有很大变化，但可用标准方法进行常规确定。
[0084] 也可应用初次免疫-加强免疫方案(WO01/30382A1)，其中靶向免疫原在初次免疫步骤中以一种形式进行最初施用接着在加强免疫步骤中靶向免疫原以另外的形式进行施用。在初次免疫步骤和加强免疫步骤中靶向免疫原的形式是不同的。例如，如果初次免疫步骤应用核酸，加强免疫步骤可用肽进行施用。同样，当在初次免疫步骤中应用一类重组病毒(即ALVAC)时，加强免疫步骤可应用另外一类病毒(即NYVAC)施用。初次免疫-加强免疫方法已显示可诱导强的免疫反应。
[0085] 虽然本发明的组合物可作为唯一的活性药剂进行施用，它们也可与一种或多种其它组合物或药剂(即其它免疫原性靶、共刺激分子、佐剂)组合应用。当作为组合物施用时，单个组分可作为同一时间或不同时间施用的单独组合物进行制剂，或各组分可组合为单一组合物。
[0086] 可注射制剂，如无菌可注射的水或油悬液，可根据已知的方法用适当的分散剂或湿润剂及悬浮剂进行配制。可注射制剂也可为无毒性肠胃外可用的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液。可用的适当载体及溶剂为水，林格液及等渗氯化钠溶液等等。例如，病毒载体如痘病毒可用0.4％NaCl进行制备。此外，无菌不挥发性油常规用作溶剂或悬浮基质。为此目的，可用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用在可注射制剂的制备中。
[0087] 对于局部施用，组合物的适当局部剂量可为每天施用一至四次，并优 选二至三次。剂量也可隔天施用，其间不应用剂量。适当的组合物可包含占制剂0.001％至10％w/w的重量，例如，占1％至2％的重量，虽然它可包含达10％w/w，但优选不多于5％w/w，并且更优选占制剂的0.1％至1％重量。适于局部施用的制剂包括适于穿透皮肤的流体或半流体制剂(即搽剂、洗涤剂、软膏、乳剂或糊剂)及适于施用于眼、耳或鼻的滴剂。 [0088] 药物组合物也可以固体形式进行制备(包括颗粒剂、粉剂或栓剂)。药物组合物可进行常规药学操作如灭菌和/或可包含常规佐剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂等。用于经口施用的固体剂型可包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂及颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉进行混合。如在常规实践中，此种剂型也可包含除惰性稀释剂之外的额外物质，例如，润滑剂如硬脂酸镁。对于胶囊剂、片剂及丸剂，剂型也可包含缓冲剂。片剂及丸剂又可用肠包衣进行制备。用于经口施用的流体剂型可包括含有本领域常用惰性稀释剂如水的可药用乳剂、溶液、悬液、糖浆剂及酏剂。此类组合物也可包含佐剂，如湿润剂、甜味剂、调味剂及芳香剂。
[0089] 包含本发明核酸或多肽的药物组合物可采用几种形式中的任一种形式并可通过几种途径的任一途径进行施用。在优选的实施方案中，组合物通过肠胃外途径施用(皮内、肌内或皮下)以在宿主中诱导免疫反应。备选地，组合物可直接施用于淋巴结(结节内)或肿瘤块(即肿瘤内施用)。例如，剂量可在第0、7及14天进行皮下施用。用包含TAs的组合物免疫的适当方法是本领域已知的，如使用p53(Hollstein等人，1991)，p21-ras(Almoguera等人，1988)，HER-2(Fendly等人，1990)，黑素瘤相关抗原(MAGE-1；MAGE-2)(van der Bruggen等人，1991)，p97(Hu等人，1988)及癌胚抗原(CEA)(Kantor等人，1993；Fishbein等人，1992；Kaufman等人，1991)等等免疫时显示的适当方法。
[0090] 可施用组合物优选的实施方案包括，例如，液体制剂如悬液、糖浆剂或酏剂形式的核酸或多肽。优选的可注射制剂包括，例如适于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用如无菌悬液或乳剂的核酸或多肽。例如，重 组痘病毒可与适当的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等进行混合。组合物也可以冷冻干燥形式进行提供，用于用例如等渗水、盐缓冲液重新溶解。此外，组合物可与其它抗瘤剂、抗肿瘤或抗癌剂和/或可降低或减轻抗瘤剂、抗肿瘤或抗癌剂副作用的药剂共同施用或依次施用。
[0091] 也提供了包含本发明组合物的试剂盒。该试剂盒可包括含有适当载体、稀释剂或赋形剂的单独容器。该试剂盒也可包括用于共同施用或依次施用的额外抗癌、抗肿瘤或抗瘤剂和/或可降低或减轻抗瘤剂、抗肿瘤或抗癌剂副作用的药剂。此外，该试剂盒可包括用于混合或组合各组分和/或施用方法的说明书。
[0092] 从下面以说明方式给出的实施例中，可更好地理解本发明及其许多优点。 [0093] 实施例
[0094] 实施例1
[0095] A.mCEA(6D)重复序列1的修饰
[0096] 已记录了重组CEA表达后细胞中截短形式CEA的存在。本研究产生了细胞中表达后不会导致截短CEA表达的CEA编码核酸序列。新CEA编码核酸序列CAP(6D)-1，2的产生和表达在以下进行了描述。
[0097] 质粒p3’H6MCEA获自Virogenetics公司。该质粒包含在部分H6启动子控制下有6D修饰的MCEA基因(图1A)。将来自p3’H6MCEA 912bp的NruI-BamHI片段克隆到pUC18中以形成质粒pSE1544.9(pUC18-mCEA重复序列1；图1B)。
[0098] 经OPC纯化 的寡核 苷酸7524-7526，7528-7533，7535-7537及7567-7568 进行激酶化并进行退火以产生两个片段，将该两个片段连接得到侧翼为AccI及BamHI位点的464bp人工修饰的mCEA重复序列1。将此人工修饰的重复序列1片段克隆到pSE1544.9的AccI-BamHI以产生pSE1616.44(pUC18-mCEA-经修饰的重复序列1；图2)。pSE1616.44的904bp EcoRV-BamHI片段克隆回p3’H6MCEA EcoRV-BamHI以形成pSE1658.15(p3’H6MCEA-经修饰的重复序列1；图3)。
[0099] B.mCEA(6D)重复序列2的修饰
[0100] 通过用称为重叠延伸基因剪接(SOE)的方法产生人工修饰的重复序列2片段并克隆到pBluescript-SK+中，产生pBSmCEA(图4)。以下显示了用于重复序列2修饰的寡核苷酸(第IV节，B)。两个不同的克隆(pBS-mCEA-3及pBS-mCEA-8)包含不同的点突变。 [0101] 将pBS-mCEA-3697bp的BamHI-EcoRI片段克隆到pUC18的BamHI-EcoRI中产生pSE1671.8。将pBS mCEA-8591bp的SpeI-Bsu36I片段克隆到pSE1671.8的SpeI-Bsu36I中，产生命名为pSE1681.1的质粒。用来自Stratagene的快速改变定点诱变试剂盒及寡核苷酸7751(GGACGGTAGTAGGTGTATGATGGAGATATAGTTGGGTCGTCTGGGCC)及7760(CAGAATGAATTATCCGTTGATCACTCC)进行两个位点的PCR诱变，以校正pSE1681.1中存在的两个点突变。将经校正的克隆命名为pSE1686.1(pUC18mCEA经修饰的重复序列2；图5)。
[0102] 如最近提到的，丙氨酸密码子在包含CEA的质粒p3’H6MCEA第二重复的5’末端不存在。为了保留CEA氨基酸序列的一致性，将包含CEA经修饰第二重复的质粒pSE1686.1中存在的丙氨酸密码子进行敲除。这是用寡核苷酸7802(CGTGACGACGATTACCGTGTATGAGCCACCAAAACCATTCATAAC)及7803(GTTATGAATGGTTTTGGTGGCTCATACACGGTAATCGTCGTCACG)和来自Stratagene的快速改变定点诱变试剂盒完成的。得到的质粒pSE1696.1(pUCl8mCEA经修饰的重复序列2；图6)通过测序进行证实。
[0103] 将 来 自 pSE1696.1694bp 的 Bsu36I-BamHI 片 段 克 隆 到 Pse 1658.15 的Bsu36I-BamHI位点以组合经修饰的重复序列1和2。将产生的质粒命名为p3’H6modMCEA-重复序列1和2(图7)。
[0104] C.ALVAC供体质粒pNVQH6MCEA(6Dlst & 2nd)的构建
[0105] 将 来 自p3’H6modMCEA-lst&2nd 重 复 的2.2kb NruI/XhoI片 段 克 隆 到pNVQH6LSP-18的NruI/XhoI位点，产生pNVQH6MCEA(6Dlst&2nd)；图8)。图9中显示了pNVQH6MCEA内包含的经修饰CEA序列(“CAP(6D)-1，2”)。
[0106] D.经修饰CEA的表达
[0107] 为检测CAP(6D)-1，2序列在细胞中表达后的稳定性，将该基因与侧翼H6启动子一起用pNVQH6MCEA(6D1st&2nd)作为模板及寡核苷酸(8034LZ：CTGGCGCGCCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG；及8035LZ：CTGGTACCAGAAAAACTATATCAGAGCAACCCCAAC)进行PCR扩增。然后将PCR产物克隆到包含LacZ及K1L标记基因的命名为pLZTK1的NYVAC TK供体质粒中。该载体特别有助于通过用蓝/白斑筛选方法在NYVAC中产生重组病毒。在供体质粒pLZTKlmCEA(6Dlst&2nd)及NYVAC之间进行体外重组后，将外源CAP(6D)-1，2序列及标记基因整合到NYVAC基因组中。包含LacZ及mCEA这两者的重组NYVAC中间体的空斑出现蓝色。然后进行几轮空斑纯化。第二次重组事件将标记基因敲除导致只包含有CAP(6D)-1，2序列但没有标记基因的重组体的最终白色空斑(图10)。
[0108] 将重组白色空斑及蓝色空斑进行挑选以证实CAP(6D)-1，2序列的表达。用来自各个空斑的病毒进行感染并在感染三天后收获细胞以制备细胞DNA或细胞裂解物。为分离重组的NYVAC DNA，应用DNAzol 试剂(GibcoBRL)。进行PCR(PCR条件：95℃(5分钟)→[95℃(30秒)→49℃(30秒)→72℃(1分钟)]30个循环→72℃(7分钟)→4℃)以确定在重组NYVAC基因组中CAP(6D)-1，2序列的存在。应用的引物为可扩增全长2106bp CAP(6D)-1，2的7569LZ(5’ttggatccatggagtctccctcggcc 3’正向引物)及7570LZ(5’ttggatccctatatcagagcaacccc 3’反向引物)。
[0109] 最终重组白色空斑PRBC-III-2，3，6，8，9，10在PCR中均证实有2.1kbCAP(6D)-1，2序列条带。PRBC-III-N1为病毒基因组中具有标记基因及CAP(6D)-1，2序列的蓝色空斑并且CAP(6D)-1，2序列条带也在PCR中被扩增。从vCP 307DNA(包含整合到ALVAC基因组的天然CEA)扩增的主 要PCR条带为截短CEA，在1.2kb有非常微弱的全长CEA条带。在PCR反应中，用只有细胞的样本(没有病毒感染)用作阴性对照并用质粒pLZTK1MCEA(6D1ST&2ND)作为阳性对照。PCR结果清楚显示在重组病毒基因组中的全长CAP(6D)-1，2，未见其它截短形式的CEA。此结果表明相对于ALVAC基因组中的天然CEA，CAP(6D)-1，2具有增强的稳定性。
[0110] 也通过免疫印迹进行蛋白质表达测定以确定在表达CAP(6D)-1，2D的细胞中不存在经截短的CEA蛋白(图11)。对于细胞裂解物的分离，细胞首先用PBS洗涤，接着加入裂解缓冲液(报道基因测定法；BoehringerMannheim)并振荡15分钟。将细胞裂解液于13,000转/分钟离心并收集上清液用于Western印迹分析。将样本上样于10％聚丙烯酰胺凝胶并125伏特进行电泳。然后将蛋白质转移到PVDF滤膜(Immobilon-P，Millipore)。用HRP-连TM
接的小鼠CEA单克隆抗体(1∶1000；Fitzgerald)与来自化学发光试剂(DNA Thunder ；
TM
NEN Life Science Products)的增强作用检测mCEA的表达。
接的小鼠CEA单克隆抗体(1∶1000；Fitzgerald)与来自化学发光试剂(DNA Thunder ；
TM
NEN Life Science Products)的增强作用检测mCEA的表达。
[0111] 所有六个最终CAP(6D)-1，2重组白色空斑(PRBC-III-2，3，6，8，9，10)及一个中间白色空斑(pRBC-III-Nl)显示只有一条CEA条带，没有其它截短形式(图11)。相反，来自vCP307空斑的蛋白质(表达天然CEA的重组ALVAC)显示除全长CEA外，在～60kDa有清楚的经截短CEA产物。将胶片爆光时间延长证实在CAP(6D)-1，2重组体中不存在任何经截短的CEA多肽。CEF用作阴性对照。
[0112] 总之，用mCEA代替天然CEA产生CAP(6D)-1，2重组体以防止多种形式CEA的表达。通过PCR及Western印迹证实来自重组NYVAC表达的CAP(6D)-1，2在去除截短形式的CEA中是有效的。
[0113] 本发明以优选实施方案的形式进行了描述，应当理解对本领域技术人员可发生变化及改变。因此，认为后附的权利要求书覆盖了在本发明要求保护的范围内出现的所有此类同等变化。