一种直接的细胞能量递送系统

摘要

一种囊泡，其中包括ATP和一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂，囊泡的融合速率至少为20个囊泡融合/秒。

权利要求

1.一种融合囊泡，其包括：

ATP，其浓度为1mM到50mM，一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂，其中所述磷脂是磷脂酰胆碱，和至少一种不稳定的囊泡形成物，其中所述的不稳定的囊泡形成物是具有通式(I)的结构的极性脂质 X-L-Z2 (I)其中X是H或具有通式(II)的结构B是阳离子或烷基，

A是H或具有选自通式(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VII)的结构L是缺少两个氢原子的烷基，并且Z独立地是H、E或通式(XI)的结构其中E是烷基或烯基，并且当一个Z是H时，另外一个Z不是H，其中所述囊泡中稳定的囊泡形成物和不稳定的囊泡形成物之间的比例是1∶1到

500∶1，而且融合速率为至少20个囊泡融合/秒，并且所述囊泡是直径在5nm到500nm之间的单层囊泡。

3

2.权利要求1的囊泡，其中所述的融合速率为至少10 囊泡融合/秒。

3.一种囊泡，包括：

ATP，其浓度为1mM到50mM，DOPC，和

POPA，其中DOPC∶POPA的比例是1∶1到500∶1，其中所述囊泡是直径在5nm到500nm之间的单层囊泡。

4.权利要求3的囊泡，其中所述的DOPC∶POPA的比例是10∶1到100∶1。

说明书

一种直接的细胞能量递送系统

[0001] 相关申请

[0002] 本申 请要 求以 序号60/380,762 的美 国临 时申 请，FUSOGENICLIPIDVESICLES，为优先权。 该临时申请是William D.Ehringer和Sufan Chien在2002年5月
14日申请的，在此由于提及而全文引入。

背景技术

[0003] ATP是给所有细胞如动物、植物、细菌、真菌等细胞供能的燃料。 正如汽车没有汽油一样，人类和其它生物的空的ATP“储备”(tank)使之不能继续前进。 事实上，它们将会死亡。营养素分解产生的能量最终保存在高能磷酸键内。 当这些键断裂时，就给细胞、组织、器官和器官体系提供了可利用的能量。细胞不断地合成和代谢ATP。ATP要么以有氧代谢的方式通过氧化磷酸化产生以氧作为末端电子受体，并产生副产物二氧化碳(CO2)和水，要么在糖酵解过程中以无氧代谢的方式产生。 尽管糖酵解能给细胞提供能量，但所提供的能量有限，因为细胞环境变为酸性，对细胞有损伤并抑制ATP的产生。

[0004] 血管循环系统递送由氧和营养素产生的持续供应的能量。 在脉管系统中，内皮细胞屏障将被供能的细胞与脉管腔隔离。 为了到达个体的细胞，氧和营养素必须穿过内皮内层进入间质隙以输送氧和营养素。 这种氧供给会因为疾病或创伤被中断。 例如，心肌梗塞(心脏病发作)、中风、低血压和严重的创伤如车祸中颈动脉的断裂会导致氧丧失，导致内环境平衡的丧失并可能导致死亡。

[0005] 在局部缺血这一事件导致组织失去氧和营养素，之后重建血液供给时可能发生缺血再灌注损伤的现象。 如细胞试图合成ATP一样，再供氧后，当细胞试图再合成ATP时产生毒性代谢产物，如自由基。 局部缺血不仅是一种与损伤或疾病相关的现象，也可能由外科手术如主动脉旁路、开胸手术、主要组织再造、肿瘤切除、肠切除和器官移植的副作用引起。

[0006] 局部缺血给成功进行组织和器官移植提出了巨大的挑战。 在美国每年大约有14,000例肾移植和2500例心脏移植。 在切除后，器官在缺少氧和营养素的情况下只有有限的寿命。 心脏必须在获得后4到6小时内移植，而肾必须在72小时内移植。 因为接
受者通常远离捐赠者，这些很短的存活时间妨碍了移植。 血液可在4℃下大约只能储存
45天，然后就必须丢弃。更复杂的是在手术预处理中本体血的获得。患者通常只提供在这45天内的两个单位的血。 这些量并不够用，因为许多外科手术中用到3个、4个或更多单位的血。

[0007] 已进行多种尝试来克服或抑制低氧供给的有害影响。 这些方法包括：(1)提供糖酵解中间体以增加无氧的ATP产出；(2)减少代谢需求，如在4℃下贮藏细胞、组织和器官；和(3)直接把ATP加入细胞、组织或器官。 给细胞供应能量优选通过直接供给ATP实现；但是，细胞摄取外源性ATP的能力差，因为缺少ATP受体或通道。而且，细
胞浆膜是疏水性的，而ATP是亲水性的，因而阻止了ATP的通过。 将ATP引入血流是
无效的，因为ATP不能穿过内皮屏障且ATP容易水解。 尝试使用脂质体输送ATP大多
是不成功和无效的(ARAkawa等，1998，Puisieux等，1994)。 例如，Puisieux等构建了包封有ATP的磷脂酰胆碱、胆固醇和磷脂酰丝氨酸脂质囊泡，然后与精细胞、肝和脑组织一起孵化。尽管观察到一些摄取，不能取得满足代谢对ATP的要求的受控递送。当在血流中给药时，脂质体通常不能突破内皮细胞屏障；此外，它们通常不具有与细胞膜的高融合率，这是囊泡将其载运的ATP递送到细胞的必要条件。

[0008] 动物细胞浆膜含有四种主要的占脂质总量一半以上的磷脂：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。 磷脂酰胆碱和鞘磷脂大多存在于外层小叶中，而磷脂酰胆胺和磷脂酰丝氨酸主要存在于内层小叶中。 在外层小叶中负电荷的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇占优势导致在细胞表面带净负电荷。 浆细胞膜有助于维持细胞的完整性和可被选择性的渗透。 一些分子能扩散穿过细胞膜，而大多分子包括ATP需要以其它方式进入，如转运蛋白或通道。

[0009] 概述

[0010] 一方面，本发明涉及一种囊泡，该囊泡包括ATP和一种作为稳定的囊泡形成物(former)的磷脂。 所述囊泡具有至少20个囊泡融合/每秒的融合速率。

[0011] 第二方面，本发明涉及一种囊泡，该囊泡包括一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂和另一种极性脂质和/或PEG。 囊泡具有至少20个囊泡融合/每秒的融合速率。

[0012] 第三方面，本发明涉及一种囊泡，该囊泡包括ATP和一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂。 磷脂具有式(I’)的结构

[0013] X’-L’-Z’2(I’)

[0014] 其中X’具有式(II’)的结构

[0015]

[0016] B’是阳离子或烷基，

[0017] A’是烷基，

[0018] L’是缺少两个氢原子的烷基，并且

[0019] 一个Z’是E”，或是式(XI”)的结构

[0020]

[0021] 其中E”是烷基或烯基，并且

[0022] 另一个Z’是E’，或是式(XI’)的结构

[0023]

[0024] 其中E’是烯基。

[0025] 第四方面，本发明涉及一种囊泡，该囊泡包括一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂和一种不是作为稳定的囊泡形成物的极性脂质和/或PEG。 作为稳定的囊泡形成物的磷脂具有式(I)的结构

[0026] X-L-Z2(I)

[0027] 其中X是氢或具有式(II)的结构

[0028]

[0029] B是阳离子或烷基，

[0030] A是H或烷基，

[0031] L是缺少两个氢原子的烷基，并且

[0032] 每一个Z独立地为H、E，或是式(XI)的结构，

[0033]

[0034] 其中E是烷基或烯基，并且当一个Z是H时，另一个Z不是H。

[0035] 第五方面，本发明涉及一种将ATP递送到细胞的方法，包括使将细胞与囊泡相接触。 囊泡包括一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂，和ATP。 递送到细胞的ATP的量足以满足细胞的代谢需要。

[0036] 第六方面，本发明涉及一种处理创伤的方法，包括将创伤与含有囊泡的组合物相接触。 囊泡包括一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂和ATP。

[0037] 第七方面，本发明涉及一种包括囊泡和贝卡普勒明(becaplermin)的组合物。 囊泡包括一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂和ATP。

[0038] 第八方面，本发明涉及一种提高具有至少一个细胞的生物反应器的产率的方法，包括将细胞与囊泡相接触。 囊泡包括一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂和ATP。

[0039] 定义

[0040] “烷基”(或烷基-或烷-)指的是取代或非取代的、直链、支链或环状烃链，优选含有1到20个碳原子的烃链。 合适的非取代烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、环丁基、戊基、环戊基、己基、环己基和类似基团。 “烷芳基”和“烷杂环基”是各自通过共价键与芳环或杂环相连的烷基。

[0041] “烯基”指的是取代或非取代的、直链、支链或环状、不饱和烃链，其中包括至少一个双键，优选2到20个碳原子的烃链。 例如不饱和的烯基包括乙烯基(ethenyl)或vinyl)，1-丙烯基，2-丙烯基(或烯丙基)、1，3-丁间二烯基、己烯基、戊烯基、1，3，5-己三烯基和类似基团。 优选含5到8个碳原子和至少一个双键的环烯基。 例如环烯基包括环己二烯、环己烯、环戊烯基、环庚烯基、环辛烯基、环己二烯、环庚二烯、环辛三烯等。

[0042] “烷氧基”指的是取代或非取代的、-O-烷基。 例如烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基、正-丁氧基，叔-丁氧基等。

[0043] “芳基”指的是任何单价芳香碳环或芳香杂环，优选3到10个碳原子的基团。芳基可以是二环(即苯基(或Ph))或多环(即萘基)，并且可以是未取代的和取代的。
优选的芳基基团包括苯基、萘基、呋喃基、吡啶基、吲哚基、喹啉基或异喹啉基。

[0044] “氨基”指的是非取代或取代的-NRR’基团。 胺可以是伯胺(-NH2)、仲胺(-NHR)或叔胺(-NRR’)，这取决于取代基(R或R’)的数量。 例如取代的氨基基
团包括甲氨基、二甲氨基、乙氨基、二乙氨基、2-丙胺基、1-丙胺基、双(n-丙基)氨
基、双(异-丙基)氨基、甲基-n-丙氨基、t-丁氨基、苯氨基等。

[0045] “杂环基”指的是稳定、饱和、部分不饱和，或芳香的环、优选含5到10个碳原子，更优选含5到6个碳原子的基团。 环可以被取代基1次或多次取代(优选1、2、3、4或5次)。 环可以是单环、双环或多环。 杂环由碳原子和1个到3个独立地选自
氮、氧和硫的杂原子组成。杂原子可以是保护的或非保护的。例如可用的杂环包括取代或非取代、保护或非保护的吖啶、苯并噻啉、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噻唑、苯并苯硫基、咔唑、噌啉、呋喃、咪唑，1H-吲唑、吲哚、异吲哚、异喹啉、异噻唑、吗啉、噁唑(也即1，2，3-噁二唑)、吩嗪、吩噻嗪、吩卓嗪、呔嗪、哌嗪、蝶啶、嘌呤、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、喹唑啉、喹啉、喹喔啉、噻唑、1，3，
4-噻二唑、噻吩、1，3，5-三嗪、三唑(即1，2，3-三唑)等。

[0046] “取代”指的是基团含有至少一个，优选1到3个取代基。 合适的取代基包括氢(H)和羟基(-OH)、氨基(-NH2)、氧基(-O-)、羰基(-CO-)、硫醇、烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤素、腈、硝基、芳基和杂环。 这些取代基可任选地被1-3个取代基进一步取代。例如被取代的取代基包括氨甲酰(carboxamide)、烷巯基、烷磺基、烷氨基、二烷氨基、羧酸盐、烷氧羰基、烷芳基、芳烷基、烷杂环等。

附图说明

[0047] 图1表示一小时后，ATP在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内的分配系数。

[0048] 图2表示本发明组合物治愈裸鼠创伤的效果。

[0049] 图3表示大鼠断肢的成功再植入。 重新接上后肢体功能完全正常。

[0050] 详细描述

[0051] 本发明利用下述发现完成，小的脂质囊泡与细胞脂双层膜之间具有可融合性，能包封ATP并将把ATP直接递送到细胞。通过改变脂质囊泡组合物或通过其它方式获得不同的融合速度很容易控制递送ATP的速度。 此外，囊泡组合物可以调整以适应不同的给药模式。 例如通过注射进入循环系统时可制成小的脂质囊泡，囊泡与内皮细胞融合，使间隙打开，因而能有效与靶细胞融合。 为了更好地实现靶向融合，可在囊泡中加入其它成分，例如某些多肽。 通过载入脂质囊泡，ATP变得稳定不易水解。

[0052] 本发明的组合物和方法满足了有效地把ATP递送到细胞的要求。 为了把ATP递送到细胞有四个必要的要求：第一，ATP必须通过细胞膜；第二，递送ATP的量必须
达到一定的速度以满足基础代谢的需要；第三，含有ATP的组合物必须与给药途径相适应。 最后，为了起效，ATP必须在水解前进入细胞。

[0053] 脂质囊泡膜类似于浆细胞膜；此外也易于制备。 因为它们有一个水溶性部分，脂质囊泡可以包封多种的溶液，包括含有ATP的溶液。 制得的脂质囊泡与细胞膜融合，实现脂质囊泡内容物的递送。

[0054] 本发明的方法和组合物具有广泛的用途，包括出血性休克、心脏病中风、冠心病、中风、低血压、严重创伤、伤口愈合、组织和器官贮藏、肺心病复苏术和移植。 在严重创伤的情况下，本发明的组合物在伤区给药使伤害最小化直至获得医疗帮助。 本发明的方法和组合物可用于延长血液和血小板的贮存。

[0055] 下述内容不是限定本发明，介绍这些内容是为了帮助专业人员，尽管还可使用其它方法、技术、细胞、试剂和方法。

[0056] 可融合性(fusogenic)脂质囊泡

[0057] 脂质囊泡与浆细胞膜相似，可制备与细胞膜融合的脂质囊泡。 先前的脂质体研究表明已观察到脂质体和细胞膜之间存在四种主要的相互作用：细胞表面吸收作用；内吞作用(吞噬细胞主动摄入脂质体)；脂质交换(涉及单个脂分子在脂质体和浆细胞膜之间的迁移)；和融合(其中脂质体膜与浆细胞膜联合)。脂质囊泡与细胞膜之间的相互作用可能类似于脂质体和细胞膜之间的情况。 融合是一种最吸引人的机制，因为它使囊泡内容物直接导入细胞中。 吸收和脂交换可在囊泡不易融合和不能递送囊泡的水溶性内容物的情况下发生。 内吞作用也只发生于某些类型的细胞，如白细胞。

[0058] 然而，大多数脂质体和多层囊泡不易融合，主要因为囊泡弯曲半径内储存的能量极少。但本发明的小的单层囊泡具有非常紧密的弯曲半径，易于融合。 一般而言小的单层囊泡(SUV)的平均直径在5nm到500nm之间；优选10nm到100nm之间，更优选20nm到60nm，包括40nm。 该尺寸使囊泡可以通过内皮细胞的间隙。 所用囊泡可在大
小上有很大变化，根据具体应用进行选择。

[0059] 本发明用于制备囊泡的组合物含有一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂，优选同时含有另一种极性脂质，和任意的一种或多种附加的极性脂质和/或筏形成物。

[0060] 极性脂质是同时具有疏水性末端和亲水性末端的有机分子，含有至少6个碳原子；它们具有式(I)所示的结构，其中X是头基团(headgroup)，L是主链基团，每个Z都是脂肪基。两个Z基团可以相同或不同。磷脂是具有式(II)头基团的极性脂质，其中A和B是头基团的取代基。

[0061] 头基团X可以是任何极性基团，优选阳离子、阴离子或两性离子基团，或H。更优选X是结构式(II)所示的基团。 优选地，B是阳离子，如Na+，K+，或四甲铵离
子；或烷基。 优选地，A是H，或烷基；更优选地A是氨基取代的烷基；最优选A是
式(III)、(IV)、(V)、(V)或(VII)的基团。 应当注意，在整个说明书中，结构式可能显示的是质子化形式的结构，但它们也包括非质子化形式(反之亦然)；其在任一组合物中出现的形式取决于组合物确切的pH值，以及水和/或适当抗衡离子的存在。

[0062] 主链基团L是缺少两个氢原子的烷基(以提供总共三个开放连接点)，优选烷氧基，或氨基取代的烷基。 最优选L是式(VIII)(IX)或(X)的基团。

[0063] 脂肪基Z可以相同或不同，是氢或E基团，或是式(XI)所示的基团，其中E是烷基或烯基。优选地，E是未取代的直链烷基或烯基，有6-26个碳原子；更优选E是式
(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)或(XVI)的基团。 如果一个脂基团是H，另一个必须不
同。 如果出现双键，优选顺式构型。

[0064]

[0065]

[0066] 一种作为稳定的囊泡形成物的磷脂(或极性脂质)是形成囊泡的磷脂(或极性脂质)，在按下述方法制成后其中至少50％能维持至少一个小时：磷脂溶于氯仿并置于玻璃试管内。在稳定的氮气流下蒸馏除去溶剂，然后将样品置于真空器1 2小时除气。然后将干燥后的脂质在10mMNa2HPO4中再次水合，时间60分钟，温度高于脂相转变温度；所需的最终浓度为25mg/ml。 脂质混合物用超声搅拌，所用微末端(microtip)450瓦超声器，在40％负载循环下工作。

[0067] 优选地，除了作为稳定的囊泡形成物的磷脂外组合物还包括至少一种其它的磷脂，更优选，包括一种或多种作为不稳定的囊泡形成物的极性脂质。

[0068] 当囊泡在水溶液中，筏(raft)形成物是一种位于囊泡脂层内的化合物，会形成或导致形成在囊泡壁内的分散区域(也称作筏)。这些分散的区域容易使囊泡去稳定化，提升了融合能力。 例如，筏形成物是具有膜结合性的胆固醇(结构式XXIV)、鞘磷脂和蛋白质和多肽。 通过选择极性脂质融合能力得到加强，这使得囊泡产生表面电荷，与靶细胞Gouey-Chapman层的电荷相反(典型的Gouey-Chapman层带正电荷)。

[0069] 用于本发明的极性脂类的例子包括1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)(结构式XVII；一种稳定的囊泡形成物)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸(POPA)
(见结构式X VIII的单钠盐)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOPC-e)(见
结构式X IX的盐酸盐)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆胺(DOPE)(结构式X X)、
1，2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-1-丝氨酸](DOPS)(见结构式X X I的钠盐)、1-棕
榈酰-2-廿二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(结构式X X II；一种稳定的囊泡成形
器)、一种典型的鞘磷脂(结构式X X III；胆固醇加入到由鞘磷脂和DOPC混合物形成
的囊泡时形成筏，)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油(结构式X X V)和1-棕榈酰-2-羟
基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(X X VI)。 其它可用于本发明的极性脂类包括磷脂酰丝氨酸
(PS)、磷脂酰甘油(PG)、混合链磷脂酰胆碱(MPC)、磷脂酰乙醇(PE)和含有廿二碳
六烯酸的磷脂。 Cit-DOPC和cit-DOPC-e尤其适用。 也可用磷脂酰胆碱，包括在sn-1
和sn-2位置具有廿二碳六烯酸的磷脂酰胆碱(DHPC)。 其它二不饱和脂类，如二花生
四烯酸磷脂酰胆碱(例如20∶4DOPC∶DArPC)也适用。 二亚麻酸磷脂酰胆碱(例如
18∶3DOPC∶DLnPC)也适用。例如，在制备SUV时，DOPC中可与增长量的DLnPC、
DArPC和DHPC混合。适用的比例包括(DOPC∶DLnPC、DArPC或DHPC)1-1000∶1，
如25-500∶1，包括1∶1、25∶1、50∶1、100∶1、500∶1和1000∶1。 也可用
具有大均值分子域的磷脂的组合，如DOPC∶DLnPC∶DHPC。 也可将二酰甘油(一
种非层状脂质)与DOPC混合。 此外，可使用分子量为20到4000重复单元聚乙二醇
(PEG)。

[0070] 优选地，作为稳定的囊泡形成物的磷脂与作为不稳定的囊泡形成物的极性脂质的比例在1∶1到500∶1之间，更优选在10∶1到100∶1之间(例如50∶1)。 例如包括：DOPC/COPC-e(1∶1)；DOPC/POPA(50∶1)和DOPC/POPA(1∶1)。

[0071]

[0072]

[0073]

[0074] 脂质囊泡的构造

[0075] 为了构建脂类囊泡，先把脂类溶于氯仿或其它适当的有机溶剂并置于容器中，如玻璃试管内。 在稳定的氮气流或其它惰性气体下蒸发除去溶剂，然后除气，例如通过将样品置于真空中0.1到48小时，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，24，25，30，36，40，42或48小时。 通常12小时就足够了。 将干燥所得的
脂质在适当的缓冲液中再次水合，例如Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)或10mM Na2HPO4，时间30-60小时，温度高于脂类相转变温度；所需的最终浓度通常在约1到
30mg/ml，典型地约25mg/ml。 然后搅拌脂类混合物。例如可以使用超声搅拌；如用微末端(microtip)450瓦超声器，在40％负载循环下工作以制备SUV。 超声处理的时间取决于脂质的量；总之，当观察到传导百分比不再进一步下降或通过粒径分析仪分析已获得正确的囊泡大小时，就停止超声处理。 如有需要，可用紫外光谱和薄层色谱(TLC)对脂质进行分析以评估氧化的程度。

[0076] 使干燥的脂质再次水合可使用其它溶液。 这些溶液包括以下缓冲液：N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)，双(2-羟乙基)氨基-三(羟乙基)甲烷
(BIS-Tris)，N-(2-羟乙基)哌嗪-N’3-丙烷磺酸(EPPS或HEPPS)，glyclclycine，
N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)，3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)，
哌嗪-N，N’-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)，碳酸氢钠，3-(N-三(羟甲基)-甲基-氨
基)-2-羟基-丙烷磺酸)TAPSO，(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(TES)，N-三
(羟甲基)甲基-甘氨酸(Tricine)和三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)。 其它适用的溶液包
括盐溶液，如Alseverr氏羊血保存液、Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、Earle氏平衡盐溶液、Gey氏平衡盐溶液(GBSS)、Puck氏盐A、Tyrode氏盐溶液、St.Thomas溶液
和University of Wisconsin溶液。

[0077] 可在SUV中加入其它成分以控制其融合速度。例如，与膜的融合有关的多肽，如fertilin、可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子联接蛋白受体(SNAREs)，SM(sec1/munc18)多肽(例如Vps33p、Slylp和Vps45p的哺乳动物的重整异构体；(Jahn和Sudhof
1999))和病毒鞘融合蛋白，如来自人免疫缺陷病毒(HIV；如，gp41)、泽姆利基森林
病毒和流感病毒的鞘融合蛋白)。 哺乳动物SNARE家族包括突触融合蛋白(1A，1B，
1C；2(和 剪 接 变 体)；3，3A，3B，3C，3D；4；5，5A，5B，6，7，8，10，11，
12，13(可以和12相同)；16(A，B，C)；和17)，Hsyn 16，rbet1，GS15，GOS32，
GOS28，Membrin，SNAPs(25，25a，25b；23，23A，23B；29)，vti1b，小突触泡蛋白
(1和剪接变体；2)，细胞短蛋白聚糖，VAMP4，VAMP5/6，Ti-VAMP，Endovrevin，
Tomosyn和msec22b(Jahn和Sudhof 1999)。 其它使膜去稳定化的两亲肽，即使它们最
初的功能并非用来调整膜的融合，也能被用于促进融合，例如膜联蛋白(Jahn和Sudhof
1999)。

[0078] 为了对特定细胞具有靶向作用，将要么与针对靶细胞的多肽相互作用，例如配体-受体反应(至少在给予SUVs的区域是这样)，要么与识别细胞特异性抗原的抗体相互作用的多肽导入SUVs。 其它靶向的多肽包括在那些在细胞内膜转运中用到的多肽和Rab GTP酶蛋白。 病毒融合蛋白也能开发用作靶向分子。也可使用膜结合物质，例如生物素基化脂质，和糖类。

[0079] ATP包封

[0080] 典型地方法是，在脂质再次水合时加入ATP的镁盐。 ATP的浓度可根据具体应用变化。优先使用的ATP的浓度包括0.01mM到200mM，优选0.1mM，1mM，2.5mM，5mM，7.5mM，10mM，25mM和50mM，更优选0.1mM、1mM和10mM。 含有ATP的
缓冲液应具有低蛋白含量以降低脂质原料的非特异性吸收的机会。含有ATP的SUV方便
起见称作ATP-SUV。

[0081] 被SUV包封的ATP易于进行评估。 例如，标记ATP分子(如标记不影响囊泡32 3
形成)，如放射性标记ATP，优选使用含氚ATP。 放射性标记包括 P和 H并且在干燥
后、再次水合时、搅拌之前加入。 溶液上Sephadex G-25柱(或其它适用的基质)以除
去未包封的ATP。收集流出物，检测囊泡的存在。SUV一般在最先被洗脱下来部分里。
包封百分率通过定量测量囊泡和上清液部分的放射性来确定，测定已包封ATP的比率并乘以100。 优选的包封率从约1％到10％。

[0082] 除ATP之外的分子也通过SUV递送到细胞，如有机和无机分子，包括药物、多肽、核酸和与细胞内抗原相互影响的抗体。

[0083] 测量SUV融合能力的检测

[0084] 融合速率是测量在孔中脂质囊泡每秒钟与HUVEC细胞融合的数目(约106个细胞)，检测包括下述步骤：

[0085] (1)培养HUVEC细胞(American Type Culture Collection(ATCC)；Manassus，VA或Bio Whittaker；MD)；

[0086] (2)制备SUV，SUV装有荧光探针，如羧基荧光素；

[0087] (3)将SUV与细胞接触使相融合；

[0088] (4)在一个选定的时间，除去剩余的SUV；和

[0089] (5)测量荧光。

[0090] 除去SUV后荧光信号的存在和强度表明SUV与细胞膜融合以及递送内容物的能力。

[0091] 以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为例。 细胞在一个标准的12-孔培养皿的内6
皮细胞生长培养基(EGM)上生长融合(例如，来自COSTAR；细胞的数目接近10)。
然后把HUVECs用缓冲液，如HBSS冲洗3次。 制备好的脂质囊泡(例如DOPC/
DOPC-e(1∶1)；DOPC/POPA(50∶1)，DOPC/POPA(1∶1)，PS，PG，MPC，PE，
cit-DOPC 和cit-DOPCe)中装入1mM羧基荧光素。 囊泡与细胞一起在37℃，95％空气
/5％CO2条件下培养120分钟，每过5分钟检测一次荧光，这段时间之后，用缓冲液洗涤细胞除去剩余的囊泡。 如果使用的是负电荷的脂质囊泡，在融合步骤中应加入钙(最终浓度0.1-10mM)。

[0092] 用胰蛋白酶处理从培养皿中除去细胞。 使用荧光分光光度计或其它合适的仪器检测荧光(在495nm下激发，在520nm下发射)。

[0093] ATP-SUV组合物的融合速率约为20个囊泡融合/秒至8.0×1011囊泡融合/秒，8 7 6 7
包括500到1×10 囊泡融合；750000到50×10 囊泡融合/秒；5×10 到1×10 囊泡融
6 8 7 8 7
合/秒；包括1×10 到8×10 囊泡融合/秒；1×10 到5×10 囊泡融合/秒；和5×10
8 4 5 6 7 8
到1×10 囊泡融合/秒。 例如融合速率是至少100，1000，10，10，10，10，10，
9 10 11
10，10 ，10 囊泡融合/秒。 这些数值有一部分是通过在37℃下使用DOPC、DOPC/
DOPC-e和DOPC/POPA，加入和不加入钙，使用人内皮细胞实验获得的结果。

[0094] 因为细胞浆膜的脂质组合物因细胞类型不同而变化，所以需要仔细考虑选择检测用细胞，最好与靶细胞类型相匹配。 例如，肝细胞浆膜含有约7％的磷脂酰胆胺，而红细胞浆膜含有18％(Albert等2002)。 原代培养细胞以及细胞系(购自American Type TissueCollection(ATCC)；Manassus，VA)都可以使用，尽管因为细胞浆膜脂质组合物在转化细胞中可能被改变而优选原代培养物。 细胞类型包括胰、肠、免疫系统、神经元(包括脑、眼、鼻和耳的)、肺、心、血液、循环(淋巴和血液)、骨、软骨、生殖、腺、牙釉质、脂肪、皮肤和肝的细胞。细胞系包括衍生自这些组织中的细胞，如Madin-Darby犬肾(MDCK)，中国仓鼠卵巢(CHO)，Hela，等。细胞也可以是来自其它有机体，如植4 5
物、真菌(包括酵母)和细菌。 这些细胞类型融合速率包括至少100，1000，10，10，
6 7 8 9 10 11
10，10，10，10，10 和10 囊泡融合/秒。除非另有注明，融合速率指的是HUVECs
6
在上述指定条件下的融合速率。 其它细胞类型的融合速率是约10 个细胞，使用缓冲液如HBSS测得的，囊泡与细胞一起在37℃，95％空气/5％CO2条件下培养120分钟，之
后，用缓冲液洗涤细胞除去剩余的囊泡。

[0095] 最佳融合速率的检测

[0096] 在特定的囊泡组合物与特定的细胞类型的融合速率达到最佳时，对融合速率的检测方法还能进一步修改。 例如，脂质囊泡可含有的荧光或放射性示踪剂，它是囊泡双层膜的一部分。

[0097] 也可以使用其它荧光探测剂。 这些探测剂包括荧光素异硫氰酸盐；荧光素二氯三嗪和荧光素的荧光类似物；萘并荧光素羧酸及其琥珀酰亚胺酯；羧基若丹明6G；吡啶噁唑衍生物；Cy2，3和5；藻红蛋白、包括丙酸琥珀酰亚胺酯和戊酸琥珀酰亚胺酯的琥珀酰亚胺脂，羧酸，异硫氰酸，磺酰氯和丹磺酰氯的荧光种类；羧基四甲基若丹明的琥珀酰亚胺酯；若丹明Red-X琥珀酰亚胺酯；Texas Red磺酰氯；Texas Red-X琥珀酰亚胺酯；Texas Red-X四氟苯酚钠酯；Red-X；Texas Red染料；四甲基若丹明；丽丝胺若丹明B；四甲基若丹明；四甲基若丹明异硫氰酸盐；萘并荧光素；香豆素衍生物；芘；吡啶唑衍生物；dapoxyl染料；级联蓝和黄染料；苯并呋喃异硫氰酸盐；四氟苯酚钠；和4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene。这些化合物的激发波长各不相同。在一定比例的示踪剂1∶800脂质/探测剂存在的条件时制备脂质囊泡。 其它有效的比例包括
1∶200到1∶10,000，包括1∶400，1∶500，1∶600，1∶700，1∶800，1∶900
和1∶1000。

[0098] 改变融合速率

[0099] 任何脂质囊泡的融合速率都能通过多种因素的改变来调整，例如温度、离子、脂质浓度、脂质囊泡组合物、流速、脂质囊泡大小，等。对SUV磷脂的剂型进行改变可用于使融合速率最大化以及毒性最小化。 例如，为了保护用于移植的器官或悬浮液(如血液)中的细胞，需要具有较低、缓慢的融合速率的SUV。 只含DOPC的囊泡能获得这样的融合速率。 另一方面，如果迅速提升细胞内ATP的含量至关重要，例如对于中风、心脏病发作或创伤的患者，则期望获得具有很快递送速率的SUV；例如，DOPC/PODA
组合物在不到五分钟内能递送足够的ATP(参见实施例)。

[0100] 四种常规的方法可用于通过控制脂质组合物改变融合速率：

[0101] (1)加强静电相互作用；

[0102] (2)使双层膜去稳定化；

[0103] (3)增加非双层相；和

[0104] (4)生成不同的脂相。

[0105] 加强静电相互作用

[0106] 静电相互作用能用于提升融合速率。 磷脂根据其电荷进行分类(阳离子、阴离子和两性离子)。许多阳离子磷脂如PE，和阴离子磷脂如磷脂酸(POPA)，在生理pH条件下不能形成封闭的囊泡。 但是混合有两性离子磷脂酰胆碱的阳离子和阴离子脂质能在生理pH条件下形成封闭的囊泡。

[0107] 大多数细胞浆膜的带负电荷。 因为这些负电荷，存在一层保持荷电平衡的离子，典型的有钙、镁、钠和钾离子，它们具有正的净电荷。 利用脂质体和细胞浆膜之间静电的相互作用，将SUV设计成具有净的负电荷，以使得细胞脂质囊泡融合最大化。然而，一些细胞浆膜含有较多的阳离子脂质，它们通过一个阴离子层保持电荷平衡。 在这些情况下，将SUV设计成具有正的净电荷以使细胞脂质囊泡融合最大化。

[0108] 生成不同的脂相

[0109] 细胞浆膜含有富集特定脂质的脂域或脂筏。 在这样一种膜的边界上，筏就是不同脂质的区域。 这些区域具有潜在的不稳定性，影响到了该膜与其它膜之间相互作用的方式。 已知有几种磷脂有助于脂筏的形成，包括磷脂酰胆碱、鞘磷脂和胆固醇的混合物。 例如，在制备SUV时，DOPC，18∶0鞘磷脂和胆固醇以1∶1∶1的比例混合。胆固醇优先在鞘磷脂相中分配，形成DOPC富集而胆固醇很少的区域，和鞘磷脂和胆固
醇都富集的区域。

[0110] 改变融合的物理参数，如温度，浓度、离子强度和融合期，也能影响到融合速率。通过改变温度，系统的自由能(G)被改变，产生不同的融合速率。提高脂质囊泡的浓度也会影响膜的融合速率，尤其在很高浓度下。 融合期(融合的长度)和融合期的数量也会影响递送SUV中包封的内容物的速率。

[0111] 温度

[0112] ATP-SUV与组织一起在组织的保藏温度下(4℃-低温，22℃-室温，37℃-温度正常)培养5、10、15、30、60或120分钟。 升高囊泡溶液的温度导致囊泡的动能增
加，融合能力因之获得增强。 温度也会影响囊泡的自由扩散。

[0113] 囊泡融合的浓度

[0114] 凭直觉，浓度升高，SUV内容物的递送也会提高，但膜的融合速率并非线性变化。一旦SUV脂质占据所有可能的细胞浆膜的表面，进一步融合就受到了限制。与细胞浆膜融合的程度影响膜的通量和性质，例如离子渗透性和脂质结构。 因此，当给予SUV时，必须控制SUV的浓度以使靶细胞得到有效的处理。

[0115] 融合期

[0116] 能够进行融合的时间长度可用于控制已包封物质递送的程度。 优选的融合期是1-180分钟，例如1，5，10，30，60，120和180分钟。为了停止融合，需除去囊泡(例
如通过缓冲液洗去)，或给予的囊泡浓度正好使囊泡在在预期时间的终点耗尽。融合也可以被优化以使囊泡的递送总量可以通过一种或多次给药加以控制。 例如，如果目标融合期是120分钟，就可以使用两个60分钟，或四个30分钟，12个10分钟，或24个5分钟
的融合期。如果有合适的装置，1分钟或更短的融合期也是可以实现的，尽管这样短的融合期经常是难于实现并需要一定的技术。

[0117] 测定靶细胞和组织对ATP的需求

[0118] 给予ATP的最佳速率是接近细胞基础代谢对ATP需求的速率；这可以通过本领域已知的任何方法测定。 可以计算耗氧速率、丙酮酸盐、葡萄糖、乳酸盐和质子泄漏(proton leak)，由这些数据可以测定组织消耗ATP的量，以所消耗的ATP/分钟为单位。

[0119] 组织耗氧量

[0120] 将组织样品置于预冷至-20℃的玻璃匀浆器中。 加入以冰水冷却分离缓冲液，如200mM蔗糖、70mMKCl、5mM马来酸盐和40mMpH7.3的Tris，将组织缓缓匀化。匀浆快速地离心除去未被匀浆的物质。 然后将五毫升氧合缓冲液置于测氧计中并使其平衡至37℃。 将细胞置于一个YSI氧浴搅拌器(Yellow Springs，OH)以使最终蛋白质的浓度为2-3mg/ml。 将氧探针放在溶液中，并用YSI测氧计测量溶液中氧的百分数。 然后将ADP加入浴液测得状态2呼吸速率，然后通过加入谷氨酸盐测得状态3呼吸速率。 一旦
谷氨酸盐被组织消耗，就测得最终的呼吸状态，状态4。根据状态3呼吸速率对加入匀浆中的ADP量的曲线，可计算出磷/氧(P/O)的比例。 该值测定组织每分钟可以从ADP
产生的ATP量，这是组织每分钟耗ATP的量的指标。

[0121] 膜电位和质子泄漏

[0122] 将组织样品分离出来，与膜电位荧光探测剂(Sigma；St.Louis，MO)一起培养。 MC540的荧光因加入钾量的不同而变化，按先前所述的方法(Brand，1995)以膜电位和质子泄漏作指标进行测量。

[0123] 葡萄糖、丙酮酸盐与乳酸盐水平

[0124] 这些代谢的中间产物使用标准方法或用市售分析试剂盒(例如购自Sigma公司的试剂盒)测定。 这些中间产物的水平被校至蛋白质水平，在一个超过120分钟的时间段内进行测定。

[0125] ATP消耗量的测定

[0126] 根据乳酸盐、丙酮酸盐和葡萄糖蓄积量、耗氧量和质子泄漏的比值，按照Ainscow和Brand所述的反应化学计量法计算所有通过系统的流出物是可能的。

[0127] 给药

[0128] 药物组合物

[0129] 在许多情况下，可将ATP-SUV以一种含有ATP-SUV和用来制备ATP-SUV的缓冲液的简单组合物形式递送。 然而如有需要，也可以加入其它产品，如在传统上用作药物组合物载体的产品。

[0130] “药学上可接受的载体”包括与药物给药方式相适应的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等(Remington2000)。优选的这类载体或稀释剂的例子包括水、盐水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。也可将作为补充的活性化合物加入到组合物中。

[0131] 总体考虑

[0132] 将本发明的药物组合物配制成与所设计的给药途径相适应的剂型，包括静脉内、皮内、皮下、口服、吸入、经皮给药、经粘膜给药和直肠给药。 作非胃肠道、皮内或皮下应用的溶液和混悬液包括灭菌的稀释剂，如注射用水、盐溶液、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对甲基苯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢(bisulfite)钠；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和张力调节剂如氯化钠和葡萄糖。 非胃肠道制剂可以密封在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量的小瓶内。

[0133] 如果带负电荷的脂质囊泡用于ATP-SUV，其中必然包括钙，最终在融合点钙的浓度优选在0.1mM-10mM之间，包括0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。

[0134] ATP-SUV中的ATP通常与ATP-SUV周围任何溶液中的ATP保持平衡；典型地，只有ATP总量1-10％在ATP-SUV里面。 剩余的ATP与受体结合，例如与嘌呤
受体P2y结合，使离子流出细胞，影响离子平衡和内环境稳定。 尽管细胞通常可以重
建离子平衡和内环境稳定，但毕竟这一过程消耗了额外的ATP。 因此，特别是对组织
而言，需要即时的存储功能(例如，在器官移植中，或断肢再接中)，在组合物中包括
一种或多种嘌啉受体P2y拮抗剂也是有利的。 由于嘌啉受体P2y拮抗剂不需置于SUV
内，所以拮抗剂优选在囊泡形成后加入，或者在给药前不久加入。 嘌啉受体P2y拮抗
剂的例子包括吡哆醛5-磷酸盐、维他命B6(吡哆醛-5-磷酸)和Reactive Blue2(1-氨
基-4-[[4-[[4-氯-6-[[3(或4)-磺苯基]氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]-3-磺苯基)
氨基-9，1 0-二氢-9，10-二氧-2-蒽磺酸)，及其组合。 优选使用嘌啉受体P2y拮抗
剂的浓度为0.1到250微摩尔/升，更优选1-100微摩尔/升。

[0135] 注射制剂

[0136] 适合作为注射剂的药物组合物包括用于即时制备无菌注射用溶液或分散体的无菌水溶液或分散体。 对于静脉给药，适宜的载体包括生理盐水、制菌水、CREMOPHOR TMEl (BASF，Parsippany，N.J.)或者磷酸盐缓冲液(PBS)。无论如何，组合物必须无菌和流体的，这样就可以通过注射器给药。 这类组合物应在制备和储存中保持稳定，必须保持不被微生物如细菌和真菌污染。 载体可以是含有如水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)和其它相容的、合适的混合物在内的适宜分散体介质。 不同的抗菌剂和抗真菌剂，如尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫汞撒会制约微生物污染。
组合物中可包括等渗剂如糖、多元醇，多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化钠。 组合物可以包括延迟吸收剂如单硬脂酸铝和明胶。

[0137] 无菌注射液的制备可通过将需要量的ATP-SUV和一种所需成分或多种所需成分的组合一起加入到适宜的溶剂中，然后进行灭菌处理。 制备用于制备无菌注射液的无菌固体的方法包括真空干燥和冷冻干燥以获得一种固体，固体中含有ATP-SUV脂质和任意所需成分(如ATP)无菌溶液。

[0138] 口服组合物

[0139] 口服组合物一般包括惰性稀释剂和可食用的载体。 被密封于明胶胶囊或压成片剂。 为了口服治疗给药，活性化合物与赋型剂一起加入并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。 口服组合物可用流体载体制备作为漱口剂使用，其中流体载体中的化合物通过口服使用。 药学上相容的粘合剂，和/或助剂材料也可包括在内。 片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何下列成分，或性能相近的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋型剂如淀粉或乳糖，崩解剂如藻酸，PRIMOGEL，或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或
STEROTES；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、甲基水
杨酸盐或桔味剂。

[0140] 吸入剂组合物

[0141] 对于吸入给药，化合物通过喷雾剂或高压容器以气溶胶喷雾递送，喷雾器或高压容器含有合适的抛射剂，例如二氧化碳气体。

[0142] 经粘膜或经皮肤给药

[0143] 可以经粘膜或经皮肤给药。 对于经粘膜或经皮肤给药，选择可以渗透进入靶屏障的渗透剂。经粘膜的渗透剂包括，去污剂，胆汁盐和梭链孢酸衍生物。 喷鼻剂或栓剂作经粘膜给药用。对于经皮肤给药被配制成软膏、油膏、明胶或霜剂。 也可以制成栓剂(例如使用椰子油或其它甘油酯作为基质)或保留灌肠剂(retention enemas)进行直肠递送。

[0144] 载体

[0145] 在一个实施方案中，用保护化合物不被身体快速排出的载体配制活性化合物，例如控释制剂，包括植入片和微囊包封递送系统。 可以使用可生物降解和生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯，和聚乳酸。 这类材料可购自ALZACorporation(Mountain View，CA)和NOVA Pharmaceuticals，Ins.
(LakeElsinore，CA)，或者由本领域技术人员制备。

[0146] 剂量

[0147] 剂量决定于并直接依赖于ATP-SUV的独特的特性，ATP-SUV的独特的特性随不同SUV脂质组合物、具体所需的疗效和给药途径而变化。具体的剂量水平和次数对于任何特定的患者或应用都是可变的。 应考虑各种因素，其中包括(1)给药和发生融合时的温度；(2)给药部位的离子环境和ATP-SUV组合物的离子强度；和(3)融合发生的时
间长度。 控制这些因素有助于控制已包封物质包括ATP的递送范围。

[0148] 当给予SUV时，通过用SUV使细胞浆膜饱和来控制SUV的浓度以有效处理靶细胞而不抑制其功能。 优选的SUV浓度依赖于脂质组合物、给药的靶细胞的散布和
体积，可以是0.5mg/ml-100mg/ml，比如0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、
20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml
和100mg/ml。

[0149] 囊泡融合经静电相互作用发生，这一过程受到钙和或镁浓度变化的显著影响，也在较轻程度上受到钠和或钾浓度变化的影响。调节这这些离子浓度，在给予ATP-SUV之前或之后或者在将用于给予ATP-SUV的组合物中进行或者在已给药到靶点的组合物中进行，它们影响了对剂量的考虑。 优选地，所用的离子浓度为0.01nm到1nm，包括
0.1nm、1nm、10nm、100nm、1000nm，10毫摩尔/L和100毫摩尔/L。

[0150] 可以使用长期的或单剂量的给药，并根据治疗的类型、给药途径和囊泡本身进行选择。 优选的融合期包括1-180分钟，例如1、5、10、30、60、120和180分钟。 为了停止融合，需除去ATP-SUV(例如通过缓冲液洗去)，或给予的囊泡浓度正好使囊泡在在预期时间的终点耗尽。 融合也可以被优化以使囊泡的递送总量可以通过一种或多次给药加以控制。 例如，如果目标融合期是120分钟，就可以使用两个60分钟，或四个30分钟，12个10分钟，或24个5分钟的融合期。

[0151] ATP-SUV的用途

[0152] 因为细胞对ATP的普遍需求，ATP-SUV和其它SUV/ATP组合物横跨生物界具有广泛的用途。

[0153] 血液

[0154] 血可以冷藏储存约45天，之后红细胞死亡。 通常红细胞在体循环中存活约120天，此后就被脾和肝除去并破坏。 因此如果不能存活的细胞用于输血，它们同样从体循环中被迅速除去。

[0155] 加入ATP-SUV或其它SUV包封ATP的组合物，以收集血液使红细胞存活更久，延长存活状态下的储藏时间和提高了细胞留在体循环中不被破坏的可能性。

[0156] 脂质组合物可以进行改变以优化ATP的递送。例如，因为血液在4℃下储存时，代谢对ATP的需求降低。即使在该温度下SUV的融合速率会降低，但该融合速率对于获得存活储存和SUV脂组合物可能还是太高以致不能满足血细胞的代谢需求。

[0157] 但所有收集的血液在存储时与本发明的组合物相接触，白细胞和血小板也会受益并存活更长时间。

[0158] 支持离体部分再植入

[0159] 在身体某部分被切断(通常是无意的)后，成功的再植入很大程度上依赖于肢体离体后的存活能力。 局部缺血时间越长，再植入后得到正常机能的肢体的可能性就越小，或者无论如何都不会成功。

[0160] 在一实施例中，捡回的断肢(recovered severed 1imb)的主要给养动脉进行插管灌注。肢体灌注ATP-SUV，每四小时一次，或根据组织ATP水平变化的需要灌注。灌注期间监控肢体的动脉压力，以降低流动诱导损伤的机会，并且通过病肢的高灌注压全面监控病肢的保存情况，病肢的高灌注压可指示肢体的发病。在保存期之后，肢体用Ringers或其它合适的溶液冲洗以除去ATP-SUV的痕迹。 然后使用公知的方法通过外科手术将
肢体再连接上。 吻合术后肢体功能的外部指标被评估(颜色、微血栓的迹象、温度、脉搏、氧饱和度、Doppler流体测量仪)以监控是否成功。再植入之前或之后，推荐用肝素和抗菌疗法以减少感染的可能。

[0161] 心脏骤停

[0162] 在缺氧发作后立即或尽可能快的将ATP-SUV通过静脉或心内注射注入心脏。小心地控制SUV脂质组合物使ATP递送符合心脏组织代谢的需要，使心脏性能最佳。在生理条件下ATP-SUV可以持续灌入心脏直至局部缺血的危险过去。

[0163] 为保存器官递送ATP

[0164] 器官(例如心脏、肝、肺或胰)从捐献者体内摘除，器官内主要的给养动脉被切断。 器官内的血液从器官中用盐水、Ringers溶液或其它适合的溶液冲洗。 将ATP-SUV加入常规的保藏溶液或缓冲液，并缓缓灌入器官，灌注次数取决于器官。

[0165] 同样的ATP-SUV被用于动物实验布置。 例如采用Lagendorff心脏(或其它器官)灌注设备。 切断大动脉并将心脏置于灌注室。 把加入ATP-SUV的氧合灌注液灌入
心脏中。 注射高浓度的钾溶液室心博停止。 ATP-SUV下的心麻痹可在保存期间采用。
心脏可以再灌注进行功能性研究或在缺血保存后移植。

[0166] 系统递送ATP

[0167] 诸多理由需要给予有机体ATP-SUV。 例如，使用ATP补充体内能量(优选的给药途径为口服、局部或吸入)，或使用ATP降低整个身体对氧的依赖(优选的给药途径为静注)。当经由颈动脉的动脉持续注入给予动物体ATP-SUV时，心率和血压降低，呼
吸停止。 甚至在9分钟的低氧状态后动物仍可苏醒(参见实施例)。

[0168] ATP-SUV用于创伤

[0169] 因为流向创伤的血液减少，供给创伤上和创伤周围细胞的氧变少。 氧的递送的下降导致ATP产生的下降，这就延缓了创伤愈合许多必需的细胞过程，包括蛋白质和核酸的合成、离子通道的功能、信号转导和运动。

[0170] 因为创伤愈合和ATP消耗的程度而需要将ATP-SUV应用于创伤。 例如，给创伤的边缘细胞提供充足的ATP以促进创伤封口。 ATP-SUV优选一天使用1-12次，比如
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次/天。优选地，通过一个专门设计的涂药器将ATP-SUV直接置于创伤上，涂药器可使以水为基质的ATP-SUV直接与创伤相接触。

[0171] 另外，ATP-SUV的应用形式可以是霜剂或其它局部给药的局部给药药物组合物。

[0172] ATP-SUV可以和其它起治愈作用的组合物一起使用，进一步促进愈合。 例如ATP-SUV可以和贝卡勒明联用，见于 。贝卡勒明之外的创伤治疗成分包括
防腐剂、抗生素和麻醉剂。 术语“创伤治疗成分”不包括SUVs。

[0173] ATP-SUV用于出血性休克

[0174] 内伤或外伤所致的出血性休克会导致大量失血。 因为供血不充分，主体常会形成低血压，导致器官衰竭和猝死。

[0175] 为了抵消出血性休克的影响，将ATP-SUV通过静脉灌注作为输血法的补充。当全身含氧量改善时可降低ATP-SUV用量。

[0176] ATP-SUV用于血小板储存

[0177] 血小板具有大约5天的贮存期，之后就必须弃去。 血小板功能的丧失部分是因为ATP的损失。

[0178] 给予分离出的血小板ATP-SUV以满足维持细胞内ATP水平的需求。 血小板的贮存期延长。 将ATP-SUV混悬于适当的溶液中用于血小板储存，例如盐水。 SUV脂质
组合物可以改变以优化给药。 例如因为血小板在室温下储存(22-24℃)，对ATP的代谢需求会低于生理温度(37C)。 即使在该温度下SUV的融合速率会降低，但融合速率对于获得存活储存可能还是太高，将SUV脂质组合物衍生化将更好地与血小板的代谢需求相匹配。

[0179] ATP-SUV用于器官和组织工程

[0180] 组织可以在体外高效生长。 然而，这样的组织缺乏连接血液供给的脉管系统。ATP-SUV有助于克服这一不足。

[0181] ATP-SUV可选择性地用于分离组织中血管网的保存，例如骨骼肌中的。所制备的ATP-SUV中的脂质组合物不会轻易从血管中逃逸。

[0182] 给予ATP-SUV以维持脉管系统，但对实质无效，它们会死亡。在合适的条件下用能分化成特定组织的干细胞接种并培养完整的脉管系统。 在体外制备的组织可以通过这种方式形成血管，例如肝、胰、心、肺和脾。

[0183] 另外，进行体外构建的器官也可以通过相同方式部分地形成血管，不包括器官细胞开始生长后采集和处理脉管系统。

[0184] 在外科手术中使用ATP-SUV

[0185] 在大部分外科手术过程中都会伴生血流和氧的下降。ATP-SUV可以全身给药或给予与外科手术过程有关的区域以使损伤最小化，不产生缺血症和低氧症。 例如可用到ATP-SUV的外科手术包括冠状动脉搭桥术、开放式心脏手术，游离瓣转移，和某些整形外科手术。

[0186] 在一些外科手术中，脊髓因为在手术过程中接受不到足够的氧而导致麻痹。 常见于主动脉瘤切除。将ATP-SUV应用于所波及的区域或经静脉给药，使外科医生获得更多时间进行手术，降低了过分缺氧所致伤害的可能性，并降低了发病率。

[0187] ATP-SUV用于中风

[0188] 目前，中风后迅速服用高浓度的葡萄糖溶液，用以降低流向大脑的血液减少的影响。人们期望葡萄糖能提高神经细胞ATP的水平并减少神经细胞的死亡。但是，当氧的供应受限制时，该目标难以实现。 ATP-SUV能更为有效地为神经组织提供ATP。

[0189] ATP-SUV用于呼吸问题

[0190] 许多呼吸性养料降低了生命的质量。并经常导致死亡。 在这些情况下，死亡的主导因素是血液中氧的缺乏，并导致组合和器官死亡。向受治疗者灌注以ATP-SUV可以降低血氧水平下降的影响。

[0191] ATP-SUV用于癌症患者

[0192] 末期癌症患者因并发症死亡。 是因为癌症或治疗使其变得虚弱，癌症患者经常死于肺炎。 导致虚弱的原因是癌细胞夺取了宝贵的代谢资源因而使健康细胞枯竭，或非癌健康细胞在治疗中被破坏。 或二者都有。 癌症患者每日服用ATP-SUV以补充全身ATP水平，因而能降低癌细胞侵吞代谢资源的影响。通过服用ATP-SUV，癌症的后遗症
减轻，延长了存活时间。

[0193] ATP-SUV用于化学毒物

[0194] 通过用ATP-SUV可以成功地抵制氰化物和其它阻碍了线粒体生产ATP或以其它方式降低细胞产出ATP的化学物质。 当细胞和组织浸泡在氰化物中，ATP-SUV维持了
它们的存活和功能。ATP-SUV在线粒体制备的ATP缺失的情况下增加了胞质中的ATP。
ATP-SUV可以作为氰化物和其它作用方式类似于氰化物的有毒物质的解毒剂。ATP-SUV
也可用于降低一氧化碳中毒的影响。

[0195] ATP-SUV用于蛋白质、糖类、核苷酸和其它药物的递送。

[0196] 高度融合的含有ATP-SUV的脂质囊泡可以制成水溶液或膜结合蛋白、糖类、核苷酸和其它药物的形式，因此得以向细胞质或细胞膜有效递送任何前述物质。 这种给药方式绕过了许多传统的问题，和(1)允许导入不能透过膜的药物，因而大大拓展了可用药物的范围以及提高了膜渗透率较低的药物的透过率；和(2)允许直接向细胞膜内导入多肽和糖类。 最后的益处在于例如允许进行置换疗法，绕过了不确定的基因疗法的方式。例如受治疗者的细胞上缺少一个受体，该受体可以导入ATP-SUV样的SUVs中，以
适当方式给药。

[0197] 这些方法类似于将ATP导入细胞的方法，除了SUV用囊泡内的物质和/或膜能合并的分子装填之外。

[0198] ATP-SUV用于低氧环境

[0199] 潜水、太空行走、高海拔和其它情况下，氧的稀缺导致递送到身体的氧减少。为了补偿氧的短缺，可经静脉、口服和通过吸入给予ATP-SUV。

[0200] ATP-SUV用于肉类保存

[0201] 在用于组织、器官保存和动物、患者之外，ATP-SUV可使肉的细胞在缺氧条件下成活。宰杀后，动物出血且残留的血从屠体中冲走。 通过颈动脉或其它大动脉给动物灌注ATP-SUV，用ATP-SUV填充血管系统。

[0202] 含有ATP-SUV的动物进行运送时，保持了动物细胞存活因而延长了肉类的储存期，类似于ATP-SUV延长了血液的储存期。由于ATP-SUV利用的是内源性成分，肉的口感和质构不受影响。

[0203] ATP-SUV用于植物

[0204] 植物利用光合作用维持生命和生长。 光合作用可分成两步：光反应，该步骤从太阳光中获得能量并将其转化为化学能，即ATP和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)；和暗反应，该反应使用ATP和NADPH固定CO2。

[0205] 通过根系统或直接应用于叶、茎、花、分生组织和其它植物部分来给植物提供ATP-SUV。ATP-SUV递送植物细胞暗反应所需的ATP。使用ATP-SUV进行ATP的递送减少或绕过了对阳光的需要，使植物在黑暗条件或在少光条件下生长。 此外，ATP-SUV促进了植物生长，维持了植物生命，重要的方面是在市场、插花业和水耕园艺上使植物保鲜。

[0206] 用于生物反应器的ATP-SUV

[0207] 对于生物反应器的产率而言，主要的限制因素是细菌和酵母，这些物质的初级产物，必须具有充足的底物用以制造ATP。 因而，细菌或酵母的数量在任何一种培养物中都受到限制。 ATP-SUV被诸如生物反应器以提高微生物的数量，提高生物反应器的产出。 该应用不限于细菌和真菌，是因为培养的昆虫、动物、植物和其它真核细胞对于ATP的制备有同样的需求。
实施例

[0208] 提供下述实施例以举例说明本发明。 本领域技术人员对本发明的组合物和方法可以进行不显著的改变。 无论如何实施例都不能被理解为对本发明的限制。

[0209] 实施例1脂质囊泡的构造

[0210] 囊泡由1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)；1，2-二油酰-sn-甘油-乙基磷酸胆碱(DOPC-e)和1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸盐(POPA)脂质构
成。(均购自Avanti Polar Lipids；Alabaster，AL).脂质在使用时不需要进一步纯化。将脂质溶于氯仿，然后置于玻璃试管内，在稳定的氮气流下蒸发除去氯仿，接着进行抽真空处理过夜。在高于相转移温度(25℃)下，将干燥后的脂质在HBSS实验缓冲液(Sigma；
St.Louis，MO)中再次水合30分钟。 将两个玻璃珠加入缓冲液/脂质混合物，混悬液涡旋5分钟制成多层囊泡。 乳状液用微末端(microtip)Branson Sonifier 450超声处理，微末端置于试管内。 将囊泡在5级水平、40％负载循环条件下超声5分钟，以制得小的单层囊泡(SUV)。

[0211] 实施例2 ATP的包封

[0212] 为了验证实施例1中的囊泡已掺入ATP，在制备多层囊泡前将30μCi的3
H-ATP(Amersham；Arlington Height，IL)加入实验缓冲液。混悬液过Sephadex(Sigma) G-25柱(1cm×40cm)以除去未包封的ATP。 在最初的50ml流出液中收集囊泡。 包封
百分率通过用液闪计数器测量囊泡中和上清液里的放射性来确定。 含有DOPC，DOPC/
COPC-e(1∶1)；DOPC/POPA(50∶1)和DOPC/POPA(1∶1)的囊泡均显示出近乎相
同ATP包封百分率，在溶液中ATP原始量的1到2.5％之间变化。

[0213] 实施例3囊泡对HUVEC的融合速率以及包封内容物在细胞质中的释放

[0214] 为了测定SUV的融合速率，将SUV装上荧光探针，呈递至体外的细胞，冲洗，并分析细胞的荧光。

[0215] 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自BioWhitaker(Walkersville，MD)的1代，培养直到8代为止，之后就不能再用。 HUVEC是在内皮细胞生长介质(EGM；Bio
Whiaker)，在12-孔培养皿的EGM介质上生长融合。然后将HUVEC用HBSS冲洗3次。
脂质囊泡按实施例1的方法制备，但囊泡中加入1mM羧基荧光素。囊泡与细胞一起在潮
湿的培养箱中于37℃下培养5、10、30、45、60和90、120和240分钟，然后将囊泡从
细胞上洗脱，细胞用胰蛋白酶轻轻从培养皿上除去。 羧基荧光素在HUVEC中的荧光用
Perkin-Elmer LS5OBLuminescence Spectrophotometer(Wellesly，MA)测量，在495nm下激发、在520nm下发射。 在一些试验中，细胞不用胰蛋白酶处理，拍摄细胞的显微照片以证明融合过程中的同质性。 该试验荧光单位(Fus)的范围在0到450个单位之间。 融合速率高度依赖于SUV的脂质组合物。 在前30分钟DOPC极少融合或完全不融合，此后
融合速率呈对数级增长，直至约350Fus。与之对比，DOPC∶DOPC-e(1∶1)给出更快
的初始融合速度和较低的最终融合率(在5分钟时约35Fus；在120分钟时约100Fus)。
在用DOPC∶POPA(1∶1)时产生了最快的融合速率，表现为在5分钟内递送了大量的
ATP。 正如预期的一样，三种囊泡的融合速率明显分为快、中、慢三种。

[0216] 要解决的一个问题是囊泡是否确实与细胞融合还是仅仅聚集在细胞表面。 为了检验这一点，将HUVEC暴露于脂质囊泡，且不从培养孔中除去，通过荧光显微镜法检查荧光的分布。 将细胞暴露于所有三种组合物，5分钟后荧光扩散遍布细胞而不是形成荧光斑点，如果是后者则提示脂质体正隔离(sequestering)囊泡，阻断了羧基荧光素进入细胞。或者是，囊泡聚集于细胞表面。这些结果验证了脂质囊泡与细胞的融合，在细胞质内释出已包封的内容物而不是聚集于细胞表面或被脂质体隔离。

[0217] 为了测定是否ATP也象羧基荧光素一样被导入细胞，接下来使用实施例2的含3
H-ATP的囊泡测定囊泡的融合和在HUVEC中ATP的释放。 囊泡和HUVEC一起培养
5、10、15、30、45、60、90、120或240分钟。 结果见图1是ATP在细胞内1小时后的
分配系数。DOPA/POPA在较长时间下获得最大的掺入百分比，其次是DOPC/DOPC-e，
3
然后是单独的 H-ATP(非囊泡)。当细胞重复冲洗，细胞的放射性发生显著变化。DOPC
显示出放射性有轻微但显著的降低；DOPC/DOPC-显示出冲洗后放射性没有降低，而游
3
离的 H-ATP显示出放射性完全失去，这证实了游离的ATP不能穿透细胞膜。 这些数据
与融合数据一起，表明DOPC囊泡被完全胞饮，DOPC/DOPC-e融合，而游离的ATP没
有进入细胞。 DOPC∶POPA囊泡也不能冲洗掉，表明了它们也和细胞发生了融合并将
包封的内容物递送到细胞质内。

[0218] 实施例4内皮大分子渗透性

[0219] 与直接将分子递送到细胞相比，任何使用本发明囊泡在体内通过循环系统递送已包封的大分子都要求囊泡和/或细胞必须穿透血管内皮。 血管内皮构成屏障，但细胞与细胞之间的屏障可穿越，例如，当白细胞离开体循环进入间质间隙。 为了陈述该论点，需要测量本发明脂质囊泡的影响。

[0220] HUVEC在EGM中的微孔(0.8μm)过滤器上生长至汇合。将细胞置于一个专用的可以测量通过内皮单层蛋白流量的室中。 用于检查脂质囊泡对内皮渗透性的影响的示踪剂是FITC-albumin(1mg/ml)。 FITC-albumin和脂质囊泡一起在零时间时加入。 每隔
5分钟，收集500μl上清液样品，用Perkin-Elmer LS5OB LuminescenceSpectrophotometer分析荧光。 DOPC囊泡对渗透性没有影响，而HUVEC渗透性在DOPC/DOPC-e存在时
提高，这表明这些囊泡在相邻的内皮细胞间生成了小间隙。

[0221] 实施例5代谢对ATP的需求

[0222] 按测定最佳速率的例子的方法，测定大鼠肝细胞代谢对ATP的需求。 分离完整的大鼠肝，置于分离缓冲液(在pH7.2下0.25M蔗糖，0.04M Tris)中，用无菌剪刀绞碎，结缔组织的碎片仔细修剪。 将肝组织通过60#不锈钢丝网筛，将细胞流出物收集于冰上。 混悬液在4℃下离心5分钟形成片状细胞沉淀物。 弃去上清液，将细胞再次悬浮于氧合缓冲液(200mM蔗糖、70mMKCl、5mM马来酸盐和40mMTris，pH7.3)。 将五毫升
氧合缓冲液置于Yellow SpringsInstruments Oxygen Meter(Yellow Springs，OH)中，使其在
37℃达到平衡。 将50ul的细胞提取物置于反应室内，得到最终2-3mg/ml的蛋白浓度。
监控基础耗氧量1分钟，然后往细胞中加入100mM ADP，并测定状态2的呼吸作用。接
下来，加入5mM的谷氨酸盐并测定状态3的呼吸作用。 ADP/O2的比例通过测量加入的
ADP量和耗氧量来确定。因而，状态3的呼吸作用是细胞消耗的ATP的量/分钟/mg的
组织的测量值。

[0223] 实施例6 ATP-SUV加速创伤愈合

[0224] 在裸鼠的上侧颅区的外皮制造出浅表创伤(周围约80mm2)。 然后将ATP-SUV施用于创伤，每天两次，给伤口的边缘细胞提供ATP。 通过一个专门设计的涂药器将
ATP-SUV直接置于创伤上，涂药器可使以水为基质的ATP-SUV直接与创伤相接触。

[0225] 如图2所示，用ATP-SUV处理的创伤较之用对照物质处理的创伤愈合得更快。 ATP-SUV-治疗创伤的曲线标绘的是创伤区域相对于愈合时间的曲线，显示出一
条对数曲线，而对照组显示出愈合更接近线速度。 在第四天，观察到ATP-SUV治疗
2 2 2
组(≈30mm ；小于原创伤面积的一半)和对照治疗组(≈60mm)之间存在约30mm 的
差异；在第10天，ATP-SUV治疗组创伤面积基本消失，但在对照治疗组创伤仍存在
2
(≈25mm)。定性地，VitalSol治疗4天的创伤类似于对照组治疗10天的创伤，而治疗10天则类似于对照组的17天。ATP-SUV治疗的创伤在第17天愈合，而对照组在这时还没
有完全愈合。

[0226] 实施例7断肢再续

[0227] 切断大鼠后腿，病肢的主要给养动脉被切断并灌注ATP-SUV，一共装入1mMATP溶液。 每隔3小时给断肢灌注一次ATP-SUV和对照溶液(见表1)，或者根据组织
中ATP水平变化认为需要时进行灌注。 在灌注期间监控断肢的动脉压以降低流动诱导损伤的机会，并且全面监控病肢的保存情况(高灌注压可指示肢体的发病)。

[0228] 在保存一段时间后，肢体用Ringers或其它合适的溶液冲洗以除去ATP-SUV的痕迹。通过外科手术将肢体再连接上。 愈合后以外部指标评估肢体功能(颜色、微血栓的迹象、凝固、断肢温度)。 再植入之前或之后，用肝素防止止血。 此外，动物采用抗菌疗法以减少感染。 给对照组的断肢只灌注介质、或只灌注介质和ATP，或只灌注介质和SUV。

[0229] 在再植入后21小时，ATP-SUV治疗的断肢呈健康的粉红色和重新达到生理温度。超过150天后，接受ATP-SUV治疗断肢的动物在使用断肢时象没有被切断过一样。
可以被称为副作用的是趾头的卷曲，而这很大程度上似乎是没有进行理疗造成的，这个小的缺陷非常有可能被修复。但在对照组，断肢是黑色的，触感冰冷，呈坏死迹象。 这些结果的总结见于表1。 定性的结果见于图3。

[0230] 表1断肢再植入研究结果的总结

[0231]

[0232] 实施例8 ATP-SUV保护离体心脏不因低氧受损

[0233] 从大鼠身上摘除心脏，使用Lagendorff心脏灌注仪进行监控。心脏被切断后置于专门设计的反应室内，该反应室可以对心脏灌注，并允许注射ATP-SUV。停用在心脏内循环的氧合灌注液，将ATP-SUV注射入心脏。 注射高钾溶液使心跳阻滞。 在无流动条件下于37℃将ATP-SUV在心脏中保存120分钟。 然后将心脏用氧合灌注液再次冲洗，监控心脏性能。 较之对照组，ATP-SUV治疗的心脏功能得到了恢复。

[0234] 实施例9改善血液储存(预言的实施例)

[0235] 为了确认是否含ATP的囊泡能保存血液以及是否加入糖酵解中间物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和果糖-1，6-二磷酸盐(FDP)能进一步改善存活能力，进行下述试验。 按实施例2的方法，只用DOPC构建囊泡。 按标准程序将血液收集在含有标准右旋糖-柠
檬酸盐-腺嘌呤-磷酸盐混合物(Baxter；Deerfield，IL)的袋中。 对于每组试验，将一个单位的血液分成几等分，分别移至不含其它添加物的聚乙烯袋中(对照组)。按如下所示往其它等分中加入测试物质：

[0236] 对照组，不含添加剂

[0237] 对照组，含有PEP、FDP和核糖的囊泡

[0238] ATP-SUVs

[0239] 在30、45、60和90天，回收各等分，根据下述参数评估红细胞：ATP含量、血细胞比容、血红素和细胞存活能力(用到锥虫蓝(sigma)分离术或LIVE/DEAD试剂盒
(MolecularProducts；Eugene，OR)).预期的结果：细胞在含ATP囊泡存在的条件下存储状况好于对照组；也就是说，ATP的含量更高，pH值会降低(表示较少糖酵解)，并且
红细胞保持一个正常红细胞的典型两面凹形。

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