含有CpG或寡/多核苷酸以及毒素或肠毒素的双功能组合物转让专利
申请号 : CN03818623.3
文献号 : CN1674935B
文献日 : 2011-03-02
发明人 : J·霍姆格伦 , A·M·哈兰迪
申请人 : 多托尔公司
摘要 :
描述了一种双功能组合物，它包含细胞内有效的免疫调节核酸成分，所述核酸成分含有至少一种免疫刺激，免疫抑制或免疫调节基序，并且是选自具有天然磷酸二酯骨架或被修饰骨架的单核苷酸，二核苷酸，寡核苷酸或多核苷酸，所述核酸成分任选地与特定的抗原组合，与在哺乳动物细胞表面结合于特异性受体的蛋白质结合，所述蛋白质可选自霍乱毒素(CT)，CT亚单位B(CTB)，大肠杆菌热不稳定性肠毒素(LT)，LT亚单位B(LTB)，以及可以与CT或LT的抗血清反应的，结合于GM1神经节苷酯的，ADP-核糖基化受体蛋白的，或者引起靶细胞内环AMP积累的蛋白质或蛋白质衍生物，以及在与特异性细胞表面成分结合之后可被内在化进入细胞的抗体其它蛋白质。这种组合物可用于治疗肿瘤、感染、移植排斥，免疫抑制状态，自身免疫性疾病和过敏症，并且伴有特定抗原时可进一步用于免疫预防，免疫治疗或耐受性诱导，以及用于在体外处理抗原提呈细胞，随后输注进入哺乳动物体内，达到疫苗接种或免疫治疗的目的。
权利要求 :
1.一种双功能组合物，其任选与特定的抗原组合，该组合物包含与在哺乳动物细胞表面的特异性受体结合的蛋白质，所述蛋白质选自霍乱毒素的亚单位B(CTB)、大肠杆菌热不稳定性肠毒素的亚单位B(LTB)以及与CTB或LTB的抗血清反应的或结合于GM1神经节苷酯的蛋白质或蛋白质衍生物，所述蛋白质偶联于
细胞内有效的免疫调节核酸成分，所述核酸成分含有至少一种未甲基化的5’-胞嘧啶，鸟嘌呤-3’二核苷酸(CpG)，并且所述核酸成分选自具有至少6个碱基或碱基对，并具有天然磷酸二酯骨架、硫代磷酸酯骨架或磷酸二酯骨架和硫代磷酸酯骨架的嵌合体的寡或多核苷酸。
2.根据权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸成分选自含有CpG的免疫刺激性寡或多核苷酸(ISS)，所述寡或多核苷酸选自单链和双链DNA、单链和双链RNA以及被修饰的多核苷酸。
3.根据权利要求2的组合物，其中的ISS来源于微生物基因组。
4.根据权利要求3的组合物，其中的微生物基因组是单纯疱疹病毒基因组。
5.根据权利要求2-4中任一项的组合物，其中的ISS是选自5’-GACGTT-3’和
5’-GTCGTT-3’。
6.根据权利要求1的组合物，其中特定的抗原选自合成的或天然的病原体来源的抗原，哺乳动物组织来源的抗原，过敏原和宿主来源的抗原。
7.根据权利要求1的双功能组合物，其用于药剂。
8.根据权利要求1-5中任何之一的双功能组合物在制备用于预防或治疗肿瘤，感染，移植排斥，免疫抑制状态，自身免疫疾病和过敏症的药物制剂中的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中药物制剂是无抗原的，并且是用于哺乳动物上皮肿瘤或非呼吸道上皮感染的局部治疗。
10.根据权利要求6的组合物在制备用于免疫预防，免疫治疗或耐受性诱导的药物制剂中的用途。
11.根据权利要求6的组合物在离体处理抗原提呈细胞中的用途，所述抗原提呈细胞随后制成用于输注进入哺乳动物体内，达到疫苗接种或免疫治疗目的的药物制剂。
说明书 :
含有CpG或寡/多核苷酸以及毒素或肠毒素的双功能组合
物
[0001] 本发明涉及一种调节免疫系统的双功能组合物及其用途。更确切地说，本发明是关于一种双功能组合物，它包含免疫调节核酸成分，任选地与特定的抗原组合，与特异性细胞表面结合蛋白质成分相结合。这种组合物可用于治疗肿瘤、感染，移植排斥，免疫抑制状态，自身免疫性疾病和过敏症，以及用于免疫预防，免疫治疗或耐受性诱导，还可用于离体处理抗原提呈细胞，随后输注进入哺乳动物体内，达到疫苗接种或免疫治疗的目的。 [0002] 背景
[0003] 已知细菌DNA中未甲基化的CpG或合成的寡脱氧核苷酸(ODN)，可作为强有力的免疫系统激活剂和多种Th1-相关免疫调节细胞因子的诱导剂，这提示有可能用于增强对感染性病原体的固有免疫性(Krieg.2001)。
[0004] 最近又描述了另外几种核酸序列，具有免疫抑制而不是激活特性，可能被用于抑制例如在不同免疫病理状态下的有害免疫反应，包括自身免疫疾病，过敏症和移植排斥。 [0005] 对于含有免疫增强CpG基序的核酸序列已提供了充分的证据，并且现在相信对于免疫抑制序列也将是这种情况，这些序列将调节固有免疫应答以及对特定抗原适应性免疫应答的强度和特征。可以被特定核酸序列增强，抑制或调节的这类适应性免疫应答，可能包括许多不同种类的抗原。这类抗原的例子包括但不局限于病原体来源的抗原，哺乳动物组织来源的抗原，过敏原和宿主来源的抗原，将它们与免疫调节核酸序列一起施用，或者在给予这种序列时它们已经存在于宿主体内，例如对于在感染正进行中病原体来源的抗原以及在自身免疫疾病正进行中或者在移植非同源器官、组织或细胞之后哺乳动物组织来源的抗原是这种情况。已有描述表明，在某些情况下，根据推测通过增加(产生抗原的)相同细胞摄入特定抗原和免疫刺激性核酸序列的机会，使免疫增强的核酸序列偶联于特定的抗原，是刺激针对所述抗原特异适应性免疫应答的特别有效的途径(Shirota等2001，Shirota等2000)。
[0006] 免疫调节的一个特别重要的方面，涉及到在粘膜表面而非胃肠外注射途径施用的特定抗原和免疫调节剂，这种粘膜施用途径包括口腔或胃肠道施用，鼻内施用，直肠内施用以及在生殖器粘膜施用。已经知道，给予抗原，带有或不带有补充的特定免疫调节剂，都可以在粘膜表面(偶尔也在全身)诱发免疫应答，或者确切地说，通过诱导外周耐受性(当通过口腔粘膜途径施用诱导时，常被称为“口腔耐受性”)可抑制对所选择抗原的全身性免疫应答。最近也有许多研究者致力于开发这种类型粘膜诱导的免疫抑制/免疫调节作用，用于对各种自身免疫、过敏或免疫病理状态达到免疫治疗目的。引入所述的这种外周耐受性的特别有效方式是，与霍乱毒素的非毒性结合亚单位(CTB)一起给予特定的致耐受性抗原(Holmgren等2003)。为了刺激，抑制或调节固有免疫性和适应性免疫应答，免疫学作用剂的另一种恰当的应用方式是通过施加在皮肤上或皮肤内。皮下注射和皮内注射给予疫苗和其它抗原是长时间确立的方法，而最近也有描述表明，局部直接施加在皮肤上(所谓的透皮免疫法)也可被用于刺激免疫应答，或者抑制特定的应答或使之发生免疫偏离。 [0007] 据我们所知，现有技术尚没有公开基于双功能免疫调节组合物的产品或其用途，这种双功能组合物包含细胞内有效的免疫调节核酸成分，任选地与特定的抗原组合，与特异性细胞表面结合蛋白质成分相结合，其中后一种成分用于特定地增加另外的细胞内有效的免疫调节核酸成分和任选地特定抗原的摄取和/或反应性。
[0008] 因此，据我们所知，现有技术也没有公开通过对哺乳动物局部给予一种无抗原药物制剂来预防或治疗上皮肿瘤或非呼吸道上皮感染的方法，此药物制剂包含至少一种含有未甲基化5’-胞嘧啶，鸟嘌呤-3’-二核苷酸的免疫刺激性寡或多核苷酸(LSS)，可选自单链和双链DNA，单链和双链RNA以及被修饰的多核苷酸，并与一种特异性细胞表面结合蛋白质成分相结合，用于在哺乳动物治疗上皮肿瘤或非呼吸道上皮感染。
发明内容
[0009] 一方面本发明提供了一种优选地协同作用的双功能免疫调节组合物(BIC)，它包含细胞内有效的免疫刺激、免疫抑制或免疫调节核酸序列(以下称为免疫调节序列，IS)，任选地与特定的抗原组合，并与特异性细胞表面结合蛋白质成分相结合，用于增加IS成分和所述任选特定抗原的摄取和/或反应性。
[0010] 因此，本发明涉及双功能组合物，它包含细胞内有效的免疫调节核酸成分，所述核酸成分含有至少一种免疫刺激，免疫抑制或免疫调节基序，并是选自具有天然磷酸二酯骨架或被修饰骨架的单核苷酸，二核苷酸，寡核苷酸或多核苷酸，所述核酸成分任选地与特定的抗原组合，与在哺乳动物细胞表面结合于特异性受体的蛋白质结合，所述蛋白质选自霍乱毒素(CT)，CT的亚单位B(CTB)，大肠杆菌热不稳定性肠毒素(LT)，LT的亚单位B(LTB)，以及与CT或LT的抗血清反应的，结合于GM1神经节苷酯的，ADP-核糖基化变体蛋白的，或者引起靶细胞内环AMP积累的蛋白质或蛋白质衍生物，以及在与特异性细胞表面成分结合之后可被内在化进入细胞的抗体或其它蛋白质。
[0011] 在本发明双功能组合物的一个实施方案中，其免疫调节核酸成分选自含有未甲基化的5’-胞嘧啶，鸟嘌呤-3’-二核苷酸的免疫刺激性寡或多核苷酸(ISS)，所述寡或多核苷酸选自单链和双链DNA，单链和双链RNA，以及被修饰的多核苷酸。
[0012] 在另一实施方案中，所述ISS选自具有至少6个碱基或碱基对的核苷酸序列，并任选地含有硫代磷酸酯骨架。
[0013] 在目前优选的实施方案中，所述ISS来源于微生物基因组，例如单纯疱疹病毒基因组。
[0014] 在目前更优选的实施方案中，所述ISS是例如5’-GACGTT-3’或5’-GTCGTT-3’。 [0015] 在还有另一实施方案中，任选存在的特定抗原实际上是存在的，是选自天然或合成的病原体来源的抗原，哺乳动物组织来源的抗原，过敏原和宿主来源的抗原。 [0016] 本发明另一方面涉及双功能组合物，其用于药物制剂。
[0017] 本发明的再一方面，涉及本发明的双功能组合物在制备用于预防或治疗肿瘤，感染，移植排斥，免疫抑制状态，自身免疫疾病和过敏症的药物制剂中的用途。 [0018] 在本发明这方面的实施方案中，该药物制剂是无抗原的，并且是用于哺乳动物上皮肿瘤或非呼吸道上皮感染的局部治疗。
[0019] 在本发明这方面的另一实施方案中，本发明包含特定抗原的组合物被用于制成免疫预防，免疫治疗或耐受性诱导的药物制剂。这种组合物还被用于离体处理抗原提呈细胞，随后制成药物制剂，用于输注进入哺乳动物体内，达到疫苗接种或免疫治疗的目的。 [0020] 本发明更进一步涉及预防或治疗感染、肿瘤、自身免疫疾病、过敏症、移植排斥和其它免疫病理或免疫抑制状态的方法，包括对哺乳动物给予有效剂量的上述双功能免疫调节组合物(以下称为“双功能免疫调节复合物”，BIC)，可通过粘膜，皮肤，深部胃肠外羊膜内施用途径，无论是单独或与特定抗原组合施用，或者通过给予细胞，已离体用BIC处理过这种细胞，然后输注进入哺乳动物体内。
[0021] 因此，本发明包括在哺乳动物预防或治疗肿瘤、感染、移植排斥，免疫抑制状态，自身免疫疾病或过敏症的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予预防或治疗有效剂量的本发明药物制剂的步骤。
[0022] 在本发明这方面的实施方案中，该药物制剂是无抗原的并且治疗是针对哺乳动物的上皮肿瘤或非呼吸道上皮感染，并且施用方法是对哺乳动物上皮肿瘤或非呼吸道上皮感染的部位局部施用。
[0023] 本发明还涉及对哺乳动物免疫预防，免疫治疗或耐受性诱导的方法，包括对哺乳动物给予预防或治疗有效剂量含有特定抗原的本发明组合物的步骤。
[0024] 本发明进一步涉及离体用包含特定抗原的本发明组合物处理抗原提呈细胞，随后输注进入哺乳动物体内达到疫苗接种或免疫治疗的目的。
[0025] 应该理解的是，照这样，这种药物制剂和双功能组合物还可能包含惰性稀释剂，赋形剂，以及为全身或粘膜施用所必需的其它添加剂成分，例如在美国药典或欧洲药典中所述的。
[0026] 名词“细胞内有效的免疫调节核酸成分”，被用于描述所述免疫调节核酸成分可通过细胞内效应器信号改变或调节免疫应答的诱导。
[0027] 在本发明中使用的药物制剂的预防或治疗有效剂量，将由主治医生或兽医根据厂商说明书的指导，所用哺乳动物，该哺乳动物的大小，以及本领域技术人员普遍了解的其它标准来决定。
[0028] 虽然主要通过描述有关免疫刺激性IS研究的实施方案来对本发明进行说明，所述免疫刺激性IS包含至少一种以化学键与CTB连接的含有甲基化5’-胞嘧啶，鸟嘌呤-3’二核苷酸(CpG)的免疫刺激性IS，但是，本发明权利要求保护的范围是由如下证据所支持。 [0029] 几乎在二十年前就产生了免疫刺激性DNA的概念，当时有人描述，从细菌纯化得到的DNA可抑制多种动物肿瘤的生长，增加自然杀伤(NK)细胞的活性，并可从小鼠脾细胞和人外周血淋巴细胞诱导IFN-α/β和-γ。从那时起，已有许多研究揭示，细菌DNA对脊椎动物免疫系统的刺激作用，是由带有适合侧翼区(CpG基序)的未甲基化CpG引起的。细菌DNA中或合成的寡核苷酸(ODN)中未甲基化CpG基序与抗原提呈细胞(APC)如树突状细胞和巨噬细胞中toll-样受体-9(TLR-9)受体之间的相互作用，通过toll/IL-1受体信号途径，迅速地刺激该细胞产生前炎性Th1极化细胞因子如IFN-γ，IL-1-β和IL-12，上调APC上的共刺激性分子，并激活β-细胞增殖，产生抗体和分泌IL-6(Holmgren等，2003，Krieg.2001；Krieg 2002)。
[0030] 已证明，不存在抗原时经胃肠外给予免疫刺激性CpG DNA，将诱发针对由几种不同病原体引起的感染产生保护性非特异Th1-样固有免疫应答。这种在整体水平的概念框架最近被延伸至粘膜的固有免疫性，由于发现不存在任何抗原时单独阴道粘膜给予免疫刺激性CpGODN，可在雌性小鼠的生殖道和/或生殖淋巴结内诱导迅速产生Th1-相关的细胞因子IFN-γ，IL-2和IL-18，并产生CC化学因子RANTES，Mip-1α和Mip-1β(Harandi等，2003)。CpG DNA除了影响固有免疫应答的诱导之外，一些研究还显示出，CpG DNA还具有疫苗佐剂的作用。使用CpG DNA作佐剂的许多研究都是以全身施用途径进行的，但是最近已发现，以CpG DNA作佐剂进行粘膜免疫，也可诱发粘膜的和全身性抗原特异性免疫应答(Holmgren等2003)。
[0031] 还已证明原有CpG DNA组合物的几种变异形式提供了有效的IS。例如来自天然磷酸二酯骨架的几种变异形式，不但确实发挥了功能，而且为IS提供了补充效力。后一种作用可能主要是通过使IS稳定，避免降解，但在某些情况下，例如带有硫代磷酸酯骨架的未甲基化DNA所显示的，已表明其ODN具有内在的免疫刺激活性，即使不存在任何有关的CpG基序，通过作为APCs表面的化学吸引剂而起作用时也如 此(Baek等2001)。所述有效骨架的实例包括但不限于，不同的磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架，以及这二种类型的嵌合体。 [0032] 还描述了IS的免疫刺激序列的几种变异形式，能够在不同种动物使它们的效力最佳化，提供免疫抑制性而不是免疫刺激性活性，以及/或者具有不同的免疫调节活性而导致其免疫应答向Th1型或Th2型应答倾斜。关于对不同种动物最佳的不同序列，有充分证据表明，用于刺激免疫应答的最佳CpG基序，对于小鼠的与对于人的不同；对于人已经发现了几种几种不同的活性序列，并且还证明，围绕关键性CpG基序的侧翼区可进一步决定其对不同类型APC的最佳活性。关于是免疫抑制性而不是免疫刺激性IS，已充分地证明甲基化的DNA和ODN可以具有免疫抑制性活性而不是刺激性活性。但是，沿着同样的思路已证明，只要其骨架是硫代磷酸酯，含有四个可能的单核苷酸碱基中二个的ODN可以抑制从APC产生细胞因子，并可抑制APC的激活和成熟(Zhu等2002)。还已证明，在CG二核苷酸后面紧连地安排二个鸟苷(三个连续的鸟苷)，将使刺激性ODN转变成免疫抑制性ODN(Stung等2002)。因此，既取决于序列，又取决于骨架结构，DNA不仅可以刺激免疫应答，还可以抑制免疫应答。进而还描述了随意合成的不带CpG基序的ODN可作为佐剂诱导Th2分化，而含有CpG基序的ODN可诱发Th1倾斜的强免疫应答(Sano等，2003)。
[0033] 类似于对BIC的IS成分所描述的，其特异性细胞结合成分也可以被修饰或改变。在最好的研究实例中，对CTB作任何一种结构修饰后，只要不显著地影响其分子的GM1神经节苷酯受体结合活性或其稳定性，都应该可以代替原来的CTB分子，对于类似的密切相关的E-Coli热不稳定性肠毒素结合亚单位蛋白(LTB)也是这样。同样地，其它许多微生物蛋白质，对包括APC的哺乳动物细胞表面的特定受体也具有特异性结合亲和性，也应该可以代替CTB作为BIC的第二种成分。此种蛋白质的例子包括但不限于，微生物毒素的结合亚单位或结合区，纤毛或其它类型的微生物粘附蛋白，病毒附着蛋白，以及植物来源的外源凝集素。
[0034] 在描述本发明双功能组合物时使用的名词“与...结合”和“与......组合”，试图包括其成分之间的各种连接，混合和其它结合形式。
[0035] 在给出的实施例中，如由CpG ODN和CTB例证说明的BIC的二 种成分，是通过偶联技术使它们相互连接，此偶联技术是基于对此二种成分的化学修饰，对其IS应用硫化作用，而对CTB使用马来酰亚胺活化。存在许多可供选择的，用于使不同类型分子连接在一起的化学方法，并且是本领域熟知的，因此，在此不作进一步展开论述。同样地，通过间隔分子将两种分子连接在一起的方法也是本领域熟知的，所述两种分子包括免疫活性蛋白质，或者包含或包括特定抗原的其他分子。还有另一种本领域熟知的修饰法，是通过多种非共价方式中的任何一种，使BIC的不同成分相结合，这种非共价方式包括但不限于，使它们在一起乳化后包进脂质体或其它基于脂质的结构中，将它们掺入微粒中或使它们附着于微粒表面，或者将它们简单地混合在一起，配制成适合于使它们能够同时协同对细胞发挥作用的剂型。
[0036] 本发明还涉及几种用于刺激、抑制、或调节固有免疫性和/或获得性(适应性)抗原特异性免疫应答的方法。为此目的，可以通过许多不同途径中的任何一种，以有效剂量对哺乳动物给予BIC。可以通过多种可能的粘膜途径施用，包括但不限于口腔途径，胃肠道途径，直肠途径，生殖器粘膜途径，鼻内途径，呼吸道吸入途径，结膜粘膜途径或中耳粘膜途径。还可以通过皮肤相关的途径给予BIC，例如在皮肤表面表皮施用，皮内或皮下施用。另外还可以通过深部非肠道施用给予BIC，包括但不限于静脉注射，肌内注射，腹膜内注射，羊膜内注射，子宫内注射，关节内注射，以及靶定的淋巴结注射。还有另一种BIC的施用方式，可以以细胞如APC的形式施用，先离体用BIC处理细胞，然后通过上述的任何一种全身或粘膜施用途径，对哺乳动物给予这种细胞。
[0037] 本发明还涉及BIC用于预防或治疗感染或其它一些疾病的用途。在所提供的实施例中，BIC被用于预防或治疗性处理由单纯疱疹2型病毒(HSV-2)引起的病毒感染，但是取决于所使用BIC的类型和施用途径，其预防或治疗作用的潜力可延伸至由病毒、细菌、真菌或原生动物以及其它寄生生物引起的非常大范围的感染；不同类型的肿瘤；不同类型的自身免疫疾病和过敏症；包括对移植器官、组织或细胞的移植排斥；以及不同类型的其它免疫状态，包括不同类型的免疫抑制状态(例如由HIV感染引起的免疫抑制)。 [0038] 现在将通过下面对附图和实施方案的描述对本发明进行例证说 明，但应该理解的是，并不打算将本专利的保护范围局限于这些被描述的细节。另外，所涉及的引用教导在此被引入作为参考。
[0039] 附图描述
[0040] 图1二个曲线图(A)和(B)，显示离体以递增浓度的CTB，CpGODN，CTB和CpG的混合物，或CTB:CpG偶联物刺激之后，鼠脾细胞的增殖应答。
[0041] 图2曲线图显示，CTB的马来酰亚胺活化或CpG ODN的硫醇化不影响增殖应答。在有递增浓度的CTB，马来酰亚胺活化的CTB，CpGODN或硫醇修饰的CpG ODN存在时，孵育鼠脾细胞72小时，然后收获细胞，如在材料和方法中所述的测定细胞增殖应答。数据以刺激指数(S1)表示。
[0042] 图3二个曲线图(A)和(B)，显示以CTB:CpG1，recCTB，CpG ODN或recCTB和CpG ODN的混合物刺激鼠脾细胞之后IP-10的产生。在有不同浓度的CTB:CpG1，recCTB，CpG ODN或recCTB和CpG ODN的混合存在时，孵育来自天然C57b1/6小鼠的脾细胞，取培养上清液作IP-10ELISA试验：(A)24h，(B)48小时。(数据代表两次不同的实验)。
[0043] 图4显示在有CTB:CpG I[20μg/ml]，recCTB[20μg/ml]，CpGODN[3.3μg/ml]或recCTB和CpG ODN的混合物[20μg/ml+3.3μg/ml]存在时孵育的鼠脾细胞产生MIP-1α的三个直框图(A)，(B)和(C)。数据表示为平均值±标准误。(A)24小时，(B)48小时，(C)72小时。来自两次不同实验的数据被合并在一起。
[0044] 图5显示在有CTB:CpG II[20μg/ml]，recCTB[20μg/ml]，CpGODN[8.0μg/ml]或recCTB和CpG ODN的混合物[20μg/ml+8.0μg/ml]存在时孵育的混合脾细胞上清液中，由鼠细胞增殖产生MIP-1α的三个直框图(A)，(B)和(C)。数据表示为平均值±标准误。(A)24小时，(B)48h，(C)72小时。来自两次不同实验的数据被合并在一起。 [0045] 图6显示在有CTB:CpG I[20μg/ml]，recCTB[20μg/ml]，CpG ODN[3.3μg/ml]或recCTB和CpG ODN的混合物[20μg/ml+3.3μg/ml]存在时孵育的鼠脾细胞产生RANTES的三个直框图(A)，(B)和(C)。 数据表示为平均值±标准误。(A)24小时，(B)48h，(C)72小时。来自两次不同实验的数据被合并在一起。
[0046] 图7显示在有CTB:CpG II[20μg/ml]，recCTB[20μg/ml]，CpGODN[8.0μg/ml]，或recCTB和CpG ODN的混合物[20μg/ml+8.0μg/ml]存在时孵育的鼠脾细胞产生RANTES的三个直框图(A)，(B)和(C)。来自两次不同实验的数据被合并在一起，以平均值±标准误表示。(A)24小时，(B)48小时，(C)72小时。
[0047] 图8三个曲线图显示阴道内给予CpG ODN或CTB:CpG之后阴道粘膜中CC化学因子产生的时间进程。用DP预处理几组自然的小鼠，6天后以CpG ODN或CTB:CpG对它们阴道内施用，并在不同的时间点处死这些小鼠。切取阴道，进行皂角苷提取，然后应用ELASA试验测定化学因子含量。数据以pg/ml/10mg阴道表示。
[0048] 图9三个曲线图显示，在有不同浓度CpG ODN，CTB，CpG ODN的混合物或CTB:CpG存在时孵育的人PBMC上清液中，MIP-1α产生的时间进程。CpG ODN和CTB的浓度相当于偶联物中所用的浓度。
[0049] 图10四个直框图，显示在CTB(11.25μg/ml)，CpG ODN(3μg/ml)，CpG ODN和CTB的混合物，CTB:CpG或无-CpG的对照ODN(3μg/ml)存在下孵育的人PBMC上清液中MIP-1α的产生。数据以平均值±标准误表示。
[0050] 图11四个直框图，显示与CTB(11.25μg/ml)，CpG ODN(3μg/ml)，CpG ODN(3μg/ml)和CTB(11.25μg/ml)的混合物，CTB:CpG(11.25μg/ml)，或无-CpG的对照ODN(3μg/ml)共孵育的人PBMC上清液中MIP-1β的产生。数据以平均值±标准误表示。 [0051] 图12显 示 在有CTB(11.25μg/ml)，CpG ODN(3μg/ml)，CpGODN(3μg/ml) 和CTB(11.25μg/ml)的混合物，或无-CpG的对照ODN(3μg/ml)存在时孵育的人PBMC产生RANTES的四个直框图。数据以平均值±标准误表示。
[0052] 图13六个直框图，显示在有CTB(11.25μg/ml)，CTB-马来酰亚胺(11.25μg/ml)，CpG ODN(3μg/ml)或硫醇CpG ODN(3μg/ml)存在时孵育的人PBMC上清液中，CC化学因子(MIP-1α，MIP-β和RANTES)的产生。数据以平均值±标准误表示。
[0053] 实施方案描述
[0054] 作为对所公开实施方案的背景材料，下面将对这些实物材料作简明描述，此实施方案涉及(CpG和)针对单纯疱疹病毒(HSV)感染的雌性生殖道粘膜免疫力。 [0055] 具有比较大量CpG基序和CpG寡核苷酸的细菌DNA可以激活免疫应答。离体CpG ODN可直接刺激脾细胞、单核细胞、树状细胞和巨噬细胞分泌多种细胞因子。例如1FN-γ[yamamoto 1992]，IL-1β(Lipford，1997)，肿 瘤 坏 死 因 子-α(TNF-α)[Sparwasser.1997]，IL-12[Lipford，1997]和IL-18[Roman，1997]，并且可激活B细胞分泌IL-6和增殖(Yi1996)。此外，CpG还可激活NK细胞、巨噬细胞[Sparwasser，1997]，B细胞[Krieg，1995]和树状细胞[Sparwasser 1998]而上调1类主要组织相容性复合物(MHC)，II类MHC，以及共刺激分子如CD80和CD86。在体内，已证明以CpG ODN全身施用可提高NK活性[Yamamoto1992]，增加脾中B细胞的百分数[Krieg 1995]，并可增加IFN-γ[Yamamoto，1992]，IL-6[Yi，1996]，TNF-α[Sparwasser，1997]和IL-12[Zimmermann，1998]的血浆浓度，或者增加组织中mRNA表达。最近还证明，在该疾病的动物模型中，CpG ODN能够阻止疟疾和单核细胞增生李斯特氏菌感染[Germazinski，2001；Elkins，1999；Krieg 1998]。 [0056] 除了对固有免疫应答起作用之外，还表明CpG ODN可增强对共施用抗原的特异性免疫应答[Ban，2000]。最近已有几份研究报告证实，在以多种抗原和以DNA疫苗对该疾病的不同动物模型作疫苗接种时，CpG ODN具有强有力的佐剂活性[述评见Krig，2001]。重要的是，人的一期临床试验报告证实，CpG ODN与抗原共施用具有免疫刺激性，并可以很好地被耐受。尽管已证明CpG ODN对全身性免疫应答具有冲击作用，但是，关于CpG DNA在粘膜表面诱导免疫的作用却知之甚少。最近已发现，以CpG ODN对雌性鼠阴道单独施用，可在鼠生殖道粘膜内引发强Th1-相关的细胞因子的化学因子应答(Harandi等2003)。 [0057] HSV-2是一种性传播病原体，它可感染人生殖道粘膜，并引起人类最普遍的生殖器溃疡病例。在许多国家HSV-2感染的流行很广泛，有10-50％成年女性人群被感染[Kinghom，1994]，并且在全世界其发病率正在不断升高[Nahmias，1990]。获得HSV-2感染通常是通过生殖器 接触的传播的结果。急性生殖器疱疹感染的特征是，在短暂的时间内大量的病毒脱落进入阴道分泌物，这对该病毒的传播是很重要的。生殖器溃疡是常见的，而且是传播性疾病，并且对于免疫损伤的个体还可能发生威胁生命的并发症如脑膜炎。对于早期妊娠，HSV-2可以跨越胎盘屏障而影响胎儿，这可能导致自发性流产，或者对胎儿造成严重的损害，包括智力障碍[Whitley，1991]。因此，对于生殖器疱疹感染，仍然迫切需要发展预防性对策，因为生殖器溃疡容易引起人免疫缺陷病毒的传播。
[0058] 我们研究了不带有抗原共施用的CpG ODN-CTB BIC对诱导生殖器局部免疫，以及防止性传播病原体HSV-2的效果。结果显示出CpGODN-CTB BIC对作为性传播的病毒疾病模型系统的生殖器疱疹感染具有强有力的预防潜力。
[0059] 材料和方法：
[0060] 小鼠
[0061] 6-8周龄的雌性C57BI/6小鼠被用于全部实验。小鼠购自M&B，在 大学Sahlgrensic研究院EBM动物实验室，小鼠被饲养保存在特定的无菌条件下的通风鼠笼内。进行所有的实验都得到瑞典 动物实验伦理学委员会的批准。
[0062] ODNs
[0063] ODNs购自Cybergene AB(瑞典Novum Research Park)或Qiagen。用于小鼠研究的CpG ODN是TCC ATG ACG TTC CTG ACGTT(SEQ ID No：1)，含有2拷贝GACGTT基序的20链节具有核酸酶抗性的硫代磷酸酯(PS)骨架。鼠对照ODN是TCC AGG ACT TCTCTC AGG TT(SEQ ID No：2)，不含有CpG基序的20链节具有核酸酶抗性的硫代磷酸酯骨架。对于人体外试验，所使用的CpG ODN是TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(SEQ ID No：3)，含有3拷贝GTCGTT基序的24链节具有核酸酶抗性的硫代磷酸酯(PS)骨架。所使用的人对照ODN是TGC TGC TTT TGT GCT TTT GTGCTT(SEQ ID No：4)，不含有CpG基序的24链节具有核酸酶抗性的硫代磷酸酯骨架。
[0064] 将最适的鼠和人CpG ODN化学连接于CTB：
[0065] 按如下三步使CTB偶联于鼠或人CpG ODN：
[0066] a)使巯基CpG ODN的二硫键去保护：
[0067] 为了断开巯基修饰的CpG ODN(Qiagen)的连接键，使此ODNs与二硫苏糖醇(DTT)(Sigma)混合，在室温下孵育90分钟(小鼠构建I和人偶联物)，或者在37℃孵育16小时(小鼠构建物II)。此后，随之通过用葡聚糖凝胶G 25(DNA级0.9×21.6cm层析柱，PharmaciaAmersham Biosciences)凝胶过滤纯化去保护的巯基修饰的CpGODNs，并用pH7.2含0.15M NaCl和0.01M EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液洗脱，通过分光光度计在260nm测定纯化的巯基修饰的CpG ODN的光吸收度。
[0068] b)马来酰亚胺活化CTB：
[0069] 通过在室温下与过量磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)(Pierce Chemicals)共孵育90分钟，达到将马来酰亚胺基导入CTB分子的目的，随后通过用G 25(PD 10Pharmacia)过滤纯化，并用pH7.2，含0.15M NaCl和0.01M EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液2ml洗脱。
[0070] c)使CTB与CpG ODN偶联：
[0071] 使马来酰亚胺活化的CTB和去保护的巯基修饰CpG ODNs在室温下共同孵育过夜，然后通过Viva spin 5000MWCO离心浓缩。使被浓缩的材料在Superdex 200 10/30上分离开，收集高分子量的组份并通过5000MWCO离心进一步浓缩。对此偶联物作SDS-PAGE分析。分别用Coomassie兰和SYBR GREEN使CTB和CpG ODN显色。通过GM1-ELISA试验测定偶联物的GM1结合能力。
[0072] 鼠增殖测定
[0073] 使天然C57BI/6小鼠的脾脏穿过尼龙网而分离出脾细胞。通过在37℃以氯化铵(NH4Cl)孵育此细胞10分钟，使其中红细胞溶解，然后洗细胞，并用台盼兰染色，在büchner5
室内计数活细胞。将此细胞一式三份(2×10 细胞/孔)接种在96孔平底培养板(Nune)的Iscove氏培养基中，此培养基增补了L-谷氨酰胺，50μM α-巯基乙醇，庆大霉素和10％胎牛血清。在37℃单独地，或者在有不同浓度如下成分存在时孵育此细胞：rec CTB，CTB-马来酰亚胺，CpG ODN，CpG-硫醇基，对照ODN，rec CTB和CpG ODN的混合物，CTB-马来酰亚胺 和CpG-硫醇基的混合物，或者CTB:CpG偶联物。所使用的recCTB和CpG ODN浓度相当于它们在偶联物中的浓度。孵育24，48和72小时之后，收集培养上清液，测定化学因子的含
3
量。在第3天，用1μCi[H]胸苷(Amersham Pharmacia)脉冲细胞6-8小时，然后用玻璃纤维滤器收集细胞DNA，并用β-计数器测定放射活性胸苷的掺入，记录每分钟脉冲数(cpm)。
数据以刺激指数(SI)表示，相当于有上述物质存在时孵育细胞的平均cpm除以单独孵育细胞的平均cpm。
室内计数活细胞。将此细胞一式三份(2×10 细胞/孔)接种在96孔平底培养板(Nune)的Iscove氏培养基中，此培养基增补了L-谷氨酰胺，50μM α-巯基乙醇，庆大霉素和10％胎牛血清。在37℃单独地，或者在有不同浓度如下成分存在时孵育此细胞：rec CTB，CTB-马来酰亚胺，CpG ODN，CpG-硫醇基，对照ODN，rec CTB和CpG ODN的混合物，CTB-马来酰亚胺 和CpG-硫醇基的混合物，或者CTB:CpG偶联物。所使用的recCTB和CpG ODN浓度相当于它们在偶联物中的浓度。孵育24，48和72小时之后，收集培养上清液，测定化学因子的含
3
量。在第3天，用1μCi[H]胸苷(Amersham Pharmacia)脉冲细胞6-8小时，然后用玻璃纤维滤器收集细胞DNA，并用β-计数器测定放射活性胸苷的掺入，记录每分钟脉冲数(cpm)。
数据以刺激指数(SI)表示，相当于有上述物质存在时孵育细胞的平均cpm除以单独孵育细胞的平均cpm。
[0074] 阴道内治疗：
[0075] 用溶于150μl磷酸缓冲盐水(PBS)的3.0mg Depo-Provera(upjohns.a.，Puurs，Belgium)，通过皮下注射(s.c)对小鼠作预先处理。6天后，用异氟烷(Baxter Medical AB)麻醉小鼠，按如下分组对小鼠阴道内施用：给予recCTB；或者给予1μg CpG ODN，单独游离形式或连接于CTB(CTB:CpG偶联物)或者不治疗。
[0076] 从阴道中提取化学因子
[0077] 通过应用PERFEXT法(Johensson，1998)的改良形式实施从阴道中提取化学因子。简略地说，在阴道内施用后的不同时间点处死小鼠，切取阴道并称重，然后在-20℃贮存于含有2mM苯甲基磺酰氟，0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂(sigma)和0.05M EDTA的PBS液中。
为进行PGE2测定，对此组织样品加入消炎痛(Sigma)。使组织样品解冻后，在PBS中以最终浓度2％(重量/体积)的皂角苷(sigma)，4℃渗透过夜。然后将此组织样品13000rpm离心5分钟，并应用ELISA试验分析其上清液和浆液中化学因子的含量。
为进行PGE2测定，对此组织样品加入消炎痛(Sigma)。使组织样品解冻后，在PBS中以最终浓度2％(重量/体积)的皂角苷(sigma)，4℃渗透过夜。然后将此组织样品13000rpm离心5分钟，并应用ELISA试验分析其上清液和浆液中化学因子的含量。
[0078] 病毒和病毒攻击：
[0079] 用非洲绿猴肾细胞(GMK-AH1)的细胞单层培养和滴定HSV-2333株[seth，1974]，并且通过一次冻/融循环制备，随后通过离心除去细胞碎片。为了进行HSV-2攻击，给每只小鼠皮下注射溶于PBS中的3.0mgDP。6天以后用异氟烷(Baxter Medical AB Sweden)麻醉4
小鼠，并通过阴道内接种溶于10μl Hanks平衡盐溶液(HBSS)的HSV-2毒株9×10PFU(噬斑单位)对小鼠作感染攻击。
小鼠，并通过阴道内接种溶于10μl Hanks平衡盐溶液(HBSS)的HSV-2毒株9×10PFU(噬斑单位)对小鼠作感染攻击。
[0080] 对感染的监测：
[0081] a.病毒复制阴道内HSV-2感染之后，通过用吸管注入40μl无菌HBSS，并收集从阴道流出的阴道液，直至回收到分散的粘膜团块， 然后再进行第二次冲洗，合并二次流出液，贮存于-70℃。应用标准的方法，通过用GMK-AH1细胞单层作噬斑试验，测定HSV-2的滴度。
[0082] b.炎症和疾病HSV-2感染之后每天检查小鼠是否有阴道炎症，神经学病症和死亡。疾病严重程度如下分级，0：健康，1：生殖器红斑，2：中度生殖器炎症，3：严重的化脓性生殖器损伤，4：后肢麻痹，5：由于麻痹而死亡。
[0083] 人PBMC增殖测定
[0084] 通过应用Ficoll-Hypaque梯度离心分离法从健康成人的血液样品中分离出人PBMC。将此细胞接种于平底96孔培养板的ISCOVE氏培养基中，此培养基补充了L-谷氨酰胺，50μM 2-巯基乙醇，庆大霉素和胎牛血清，并且加入了递增浓度的CTB，CpG ODN，CTB和CpGODN的混合物，或者人CTB-CpG偶联物，CTB和CpG ODN的浓度相当于它们在偶联物中的浓度。在5，24，48，72小时收集培养物上清液，测定其CC或CXC化学因子的含量。72小时3
之后，用1μCi[H]胸苷(Amersham Pharmacia)脉冲细胞并孵育6-8小时。将细胞DNA收集在玻璃纤维上，并用β-计数器测定放射活性胸苷的掺入，记录每分钟脉冲数(cpm)。数据以刺激指数(SI)表示，相当于有上述物质存在时孵育细胞的平均cpm除以单独孵育细胞的平均cpm。
之后，用1μCi[H]胸苷(Amersham Pharmacia)脉冲细胞并孵育6-8小时。将细胞DNA收集在玻璃纤维上，并用β-计数器测定放射活性胸苷的掺入，记录每分钟脉冲数(cpm)。数据以刺激指数(SI)表示，相当于有上述物质存在时孵育细胞的平均cpm除以单独孵育细胞的平均cpm。
[0085] 化学因子定量测定：
[0086] 测定组织提取物和培养物上清液中RANTES，MIP-α，MIP-1β，MIP-2和IP-10的浓度，使用购自R&D Systems(Abingdon，UnitedKingdom)或Pepro Tech EC公司(用于IP-10测定)的ELISA试剂盒，按照制造商的建议进行测定。
[0087] 实施例
[0088] 实施例1 构建CTB:CpG偶联物
[0089] 为了使CpG ODN与CTB连接，增强CpG ODN的免疫刺激作用，可将硫醇化的CpG ODN化学偶联于马来酰亚胺活化的CTB。为了使硫醇修饰的CpG去保护，使用了二种方法，导致产生了鼠CTB:CpG偶联物的二种构建物，即材料和方法中所述的CTB:CpG I和CTB:CpGII。对于人，只产生了一种CTB:CpG构建物(见材料和方法)。对偶联物作SDS-PAGE电泳分析，并用Coomassie兰(蛋白质染色)和SYBR GREEN II(DNA染色)染色，证明偶联是成功的(资料未显示)。
[0090] 这二种鼠偶联物中CTB和CpG的含量不同。对于CTB:CpG I和II，CTB与CpG的比率分别为6和2.5。应用GM1 ELISA试验测定偶联物的GM1结合能力。
[0091] 实施例2 CpG ODN与CTB偶联可增强CpG ODN诱导的鼠脾细胞增殖应答 [0092] 将来自天然C57 BI/6小鼠的脾细胞与不同浓度的如下成分共孵育：recCTB，CpG ODN，对照ODN，CTB:CpG I或CTB:CpG II。CTB:CpG I
[0093] 如图1A所示，脾细胞与最高浓度的该偶联物(20μg/ml)共孵育，导致的SI为22.6，而相应浓度(3.3μg/ml)的CpG ODN导致的SI仅为9.1。最低浓度的该偶联物(1.25μg/ml)刺激细胞增殖达到与最高浓度的单独CpG ODN或者CTB和CpG混合物相同的程度。以任何浓度使用的recCTB对细胞增殖都没有刺激作用(图1A)。在与CpG [0094] ODN相同的浓度，对照ODN对细胞增殖没有作用(资料未被显示)。CTB:CpG II： [0095] 与偶联物I相似，同CpG ODN单独(SI＝12.6)或者同CTB和CpG的混合物(SI＝
9.9)相比较，偶联物II在最高浓度对细胞增殖具有较强的刺激作用(SI＝23.3)。与最高浓度的CpG ODN或者CTB和CpGODN的混合物相比较，当该偶联物的浓度降低至2.5μg/ml时，检测到相同或者甚至更强的增殖应答(SI＝12)。以任何一种浓度单独使用的CTB对细胞增殖没有刺激作用(图1B)。
9.9)相比较，偶联物II在最高浓度对细胞增殖具有较强的刺激作用(SI＝23.3)。与最高浓度的CpG ODN或者CTB和CpGODN的混合物相比较，当该偶联物的浓度降低至2.5μg/ml时，检测到相同或者甚至更强的增殖应答(SI＝12)。以任何一种浓度单独使用的CTB对细胞增殖没有刺激作用(图1B)。
[0096] 与不同浓度的如下成分共孵育的，来自2只天然C57bI/6小鼠的混合脾细胞增殖72小时之后以SI表示的细胞增殖：偶联的CTB:CpG I，CTB:CpG II，CpG ODN，recCTB，或recCTB和CpG ODN的混合物。在图(A)和(B)中，recCTB和CpG ODN的浓度均相当于它们在偶联物中的浓度。
[0097] (a)CTB:CpG I.(b)CTB:CpG II.
[0098] 为了测定以马来酰亚胺活化CTB，或者使硫醇偶联于CpG ODN对脾细胞增殖是否有作用，可在有不同浓度的马来酰亚胺活化的CTB或硫醇化CpG ODN存在时孵育脾细胞。 [0099] 同单独的CpG ODN或CTB相比较，以任何不同浓度使硫醇基团 与CpG ODN偶联，或者马来酰亚胺活化CTB，都没有导致更高水平的细胞增殖(图2)。同单独的CpG ODN相比较，与CTB-马来酰亚胺和CpG-硫醇基的混合物共孵育脾细胞，对细胞增殖没有任何辅助作用(数据未显示)。
[0100] 实施例3 CpG与CTB偶联增强CpG ODN诱导的鼠脾细胞CXC和CC化学因子应答 [0101] 为了评价recCTB与CpG ODN的偶联物对诱导化学因子产生的作用，使脾细胞与CTB:CpG I，CTB:CpG II，recCTB，CpG ODN或recCTB和CpG ODN的混合物共孵育。在不同的时间点，测定上清液中CXC和CC化学因子的含量。
[0102] CXC化学因子(以IP-10例证说明)
[0103] CTB:CpG I脾细胞在完全培养基内孵育24小时之后收集的上清液中，检测出6 6
IP-101250pg/ml/10 个细胞，48小时之后显著地下降(122.5pg/ml/10 个细胞)。脾细胞与CTB:CpG I共孵育诱导IP-10产生。其产量随该偶联物的浓度递增而增加。与未用偶联物处理的细胞相比较，所使用的最高浓度偶联物(20μg/ml)导致在24小时和48小时IP-10的产量分别增加20倍和40倍。
IP-101250pg/ml/10 个细胞，48小时之后显著地下降(122.5pg/ml/10 个细胞)。脾细胞与CTB:CpG I共孵育诱导IP-10产生。其产量随该偶联物的浓度递增而增加。与未用偶联物处理的细胞相比较，所使用的最高浓度偶联物(20μg/ml)导致在24小时和48小时IP-10的产量分别增加20倍和40倍。
[0104] 当脾细胞与单独的CpG ODN或CTB和CpG ODN的混合物共孵育时，检测出更低浓度的IP-10。在24小时，与最高浓度的单独CpGODN或recCTB和CpG ODN的混合物相比较，最低浓度的CTB:CpG1(1.25μg/ml)诱导了较高的IP-10产量。
[0105] 在所测定的任何时间点，所检测的recCTB的任何浓度都没有诱导IP-10产生(图3A和3B)。
[0106] CTB:CpG II在单独培养的细胞中，24小时和48小时时IP-10的浓度都是1000pg/6
ml/10 个细胞。单独CpG ODN或CTB和CpG ODN的混合物在24小时诱导产生相同水平的IP-10(增加7-8倍)。重要的是，在CTB:CpG II处理后24小时内IP-10的产量增加了16倍。在48小时，IP-10的产量进一步增加了(增加18倍)。48小时之后，与偶联物相比较，单独的CpG ODN以及CTB和CpG ODN的混合物产生IP-10的水平低得多。在所测的任何时间点，单独RecCTB都不诱导IP-10产生。
ml/10 个细胞。单独CpG ODN或CTB和CpG ODN的混合物在24小时诱导产生相同水平的IP-10(增加7-8倍)。重要的是，在CTB:CpG II处理后24小时内IP-10的产量增加了16倍。在48小时，IP-10的产量进一步增加了(增加18倍)。48小时之后，与偶联物相比较，单独的CpG ODN以及CTB和CpG ODN的混合物产生IP-10的水平低得多。在所测的任何时间点，单独RecCTB都不诱导IP-10产生。
[0107] MIP-2
[0108] 在CpG ODN处理的脾细胞培养上清液中，未检测出有MIP-2产生。 [0109] 实施例4 CC化学因子(以MIP-1α和RANTES例证说明)
[0110] MIP-1α
[0111] 在24小时，48小时和72小时，取自单独细胞培养的上清液中发现有低浓度的6
MIP-1α(122.5-150pg/ml/10 个细胞)。在任何时间点recCTB都没有诱导产生MIP-1α(图
4和5)。
MIP-1α(122.5-150pg/ml/10 个细胞)。在任何时间点recCTB都没有诱导产生MIP-1α(图
4和5)。
[0112] CTB:CpG I.如在图5中所示，与CTB:CpG I共孵育脾细胞导致MIP-1α的产量在24小时增加了70倍，在48小时增加了180倍，在72小时进一步增加至186倍。但是，recCTB和CpG ODN的混合物在24小时诱导产生MIP-1α达到与此偶联物相同的程度。MIP-1α的产量随时间推移而减少，在72小时还显示出有130倍的增加。以CpGODN单独处理的细胞不产生可比较水平的MIP-1α。CpG ODN在48小时诱导MIP-1α的产量增加了73倍，在
72小时内降低至50倍，在所测定的任何时间点recCTB都没有诱导产生任何可检测水平的MIP-1α(图4)。
72小时内降低至50倍，在所测定的任何时间点recCTB都没有诱导产生任何可检测水平的MIP-1α(图4)。
[0113] CTB:CpG II.与CTB:CpG II共孵育脾细胞，在24小时诱导MIP-1α增加55倍，在48小时增加150倍，直至72小时都维持在此水平。recCTB和CpG ODN的混合物也诱导产生MIP-1α(50倍)，在48小时这种诱导作用增加至120倍，并维持至72小时。CpG ODN在48小时诱导MIP-1α的产量增加50倍，在72小时下降至40倍(图5)。
[0114] RANTES
[0115] 类似于MIP-1α，在24小时，48小时和72小时，取自单独细胞培养的上清液中发6
现有低浓度的RANTES(450-600pg/ml/10 个细胞)。在任何时间点recCTB都没有诱导产生RANTES(图6和7)。
现有低浓度的RANTES(450-600pg/ml/10 个细胞)。在任何时间点recCTB都没有诱导产生RANTES(图6和7)。
[0116] CTB:CpG I.在24小 时 采 集 的 上 清 液 中，CpG ODN诱 导 出 高 水 平 的6
RANTES(11000pg/ml/10 个细胞)，与CTB:CpG I或recCTB和CpG ODN混合物共孵育的细胞产生RANTES的量比较低。CpGODN处理的细胞在48小时和72小时产生的RANTES水平降低了，而以偶联物处理的细胞产生的RANTES水平至少在72小时内保持不变(图6)。 [0117] CTB:CpG II.在以CTB:CpG II，单独的CpG ODN或recCTB和 CpG ODN的混合物处理的脾细胞培养上清液中，在24小时检测出可比较水平的RANTES。48小时之后CTB:CpG II仍然诱导产生同样水平的RANTES，而在其它组RANTES的产量降低了。在与此偶联物共孵育的细胞上清液中，72小时之后RANTES的产量最高(图7)。
RANTES(11000pg/ml/10 个细胞)，与CTB:CpG I或recCTB和CpG ODN混合物共孵育的细胞产生RANTES的量比较低。CpGODN处理的细胞在48小时和72小时产生的RANTES水平降低了，而以偶联物处理的细胞产生的RANTES水平至少在72小时内保持不变(图6)。 [0117] CTB:CpG II.在以CTB:CpG II，单独的CpG ODN或recCTB和 CpG ODN的混合物处理的脾细胞培养上清液中，在24小时检测出可比较水平的RANTES。48小时之后CTB:CpG II仍然诱导产生同样水平的RANTES，而在其它组RANTES的产量降低了。在与此偶联物共孵育的细胞上清液中，72小时之后RANTES的产量最高(图7)。
[0118] 实施例4 在雌性鼠生殖道粘膜中CTB:CpG偶联物可诱发强烈的CC化学因子应答 [0119] 为了测定CTB与CpG ODN的偶联物对雌性生殖道内化学因子应答的作用，先用黄体酮处理几组小鼠，随后阴道内单独给予CTB，CpGODN或CTB:CpG偶联物。在施用后不同的时间点，切取阴道在皂角苷提取之后测定CC化学因子MIP-1α，MIP-1β和RANTES的水平。
[0120] MIP-1α
[0121] 在自然小鼠的阴道内检测出低水平的MIP-1α(12pg/ml/10mg阴道)。在所测定的任何时间点，阴道内给予CTB都没有诱导产生MIP-1α。阴道内给予CpG ODN，在8小时内MIP-1α水平增加5倍，然后下降，48小时内回到基础水平。观察到用CTB:CpG偶联物处理的小鼠在2小时内MIP-1α快速增加13倍，维持达8小时(增加12倍)，24小时内下降(4倍)，48小时回到基础水平(图8)。
[0122] MIP-1β
[0123] 在自然小鼠的阴道内检测出低水平的MIP-1β(30pg/ml/10mg阴道)。在所测定的任何时间点，阴道内给予CTB都没有诱导产生MIP-1β。阴道内给予CpG ODN在8小时内导致MIP-1β水平增加4倍，在24小时内上升(增加6倍)。然后MIP-1β的产量下降，至48小时回到基础水平。阴道内CTB:CpG处理引起MIP-1β的产量在2小时内快速增加6倍，随后在24小时达到峰值(增加8倍)，48小时内下降(增加3倍)(图2)。 [0124] RANTES
[0125] 在自然小鼠的阴道内检测到低水平的RANTES(140pg/ml/10mg阴道)。在所测定的任何时间点，阴道内给予CTB都没有诱导RANTES产生。阴道内给予CpG ODN在8小时内增加RANTES水平达到6倍，到24小时下降(增加3倍)，48小时内恢复到基础水平。CTB:CpG施用后8小时内，RANTES的水平增加10倍，维持24小时(增加11倍)，然后至48小时下降(增加4倍)(图8)。
[0126] 实施例5 CpG ODN与CTB的偶联显著地增加对抗生殖器疱疹感染的预防性免疫力
[0127] 以前我们曾显示，不伴有抗原共同施用的CpG ODN单独阴道施用(60μg/小鼠)，在雌性鼠生殖道粘膜内可诱导抗生殖器疮疹感染的强粘膜预防性免疫。因为已经发现离体CTB与CpG ODN的偶联物可诱发较强的细胞增殖和化学因子应答，所以我们试图测定，CTB与CpGODN的偶联对诱导抗生殖器HSV-2感染的预防性免疫的作用。为此，先以1μg CpG ODN单独，或者与CTB偶联的形式对几组DP-处理的雌性C 57BI/6小鼠阴道内施用，24小时后以HSV-2的正常致死剂量进行阴道内攻击。对1组小鼠用recCTB处理。早在HSV-2攻击后的第3天，对照组小鼠以及CTB-处理的小鼠就开始显出宏观的病症，并且在感染后8天内死于神经性病症。类似地，所有以1mg CpG ODN作阴道内施用的小鼠也在12天内显出宏观病症并死亡。相反地，阴道内给予CTB:CpG偶联物，对HSV-2引起的死亡给予了80％的保护作用。这些资料表明，阴道粘膜给予微量CTB:CpG偶联物，可产生抗生殖器疱疹感染的强预防性免疫。
[0128] 实施例6 CTB与CpG ODN的偶联对人外周血液单核细胞(PBMC)的增殖和化学因子应答的作用
[0129] 为了评价CTB与CpG ODN偶联物对人PBMC的增殖和化学因子产生的作用，将PBMC与CpG ODN，CTB，CTB:CpG或CpG ODN和CTB的混合物共孵育，在不同的时间点收集培养上清液，通过ELISA试验测定化学因子的含量。孵育72小时之后收集这些细胞进行增殖测定。所显示的数据代表3次实验的结果。
[0130] a)CpG ODN与CTB的偶联对CpG ODN诱导的人PBMC增殖应答没有补充作用 [0131] 使PBMC分别与不同浓度的如下成分一起共孵育：CTB，CpGODN，CpG ODN和GTB的混合物，对照ODN，或者CTB:CpG偶联物。孵育3天之后，应用标准的方法(见材料和方法)测定细胞增殖应答。不同浓度CTB存在时孵育PBMC不引起任何可检测的增殖应答。用CpG ODN处理PBMC引起强增殖应答。当存在3个最高浓度CpG ODN(3μg/ml，1μg/ml或0.3μg/ml)时孵育PBMC，观察到增殖应答。与CTB:CpG共孵育PBMC，对CpG ODN诱导的增殖应答没有 任何补充作用。如所预料的，无CpG的对照ODN可诱导微弱的增殖应答。 [0132] b)CC化学因子应答
[0133] MIP-1α
[0134] 如图10中所示，在所测定的任何时间点，以不同浓度的CpG ODN，CTB，CpG ODN和CTB的混合物，或对照ODN孵育PBMC，不诱导产生MIP-1α。与此相对比，当使用3.75μg/ml浓度的CTB:CpG时，在5小时内显示出MIP-1α水平增加(增加4倍)，维持24小时(6倍增加)，然后在48小时回到基础水平(图9)。当使用11.25μg/ml浓度的CTB:CpG时，在5小时内MIP-1α的水平增加了10倍，至24小时进一步增加(增加29倍)，然后至48小时下降(6倍增加)(图9-10)。对于CTB:CpG处理的细胞，在72小时MIP-1α的水平较低，但是与其它组相比水平仍然较高(数据未被显示)
[0135] 因为已显示出，最高浓度的CTB:CpG对诱导化学因子产生是最有效的，所以我们将此最高浓度的偶联物或相应的水平用于如下的实验。
[0136] MIP-1β
[0137] 在完全培养基内培养的PBMC上清液中检测出基础水平的MIP-1β。在所测定的任何时间点，以CTB或无CpG的对照ODN处理PBMC不诱导产生MIP-1β(图11)。与CpG ODN或CTB和CpG的混合物共孵育的PBMC在5小时内产生了相似水平的MIP-1β(4倍)，在24小时内增加(增加7-9倍)，而至72小时下降(增加3倍)。与CTB:CpG共孵育的细胞上清液中，在5小时观察到MIP-1β产量增加10倍，在48小时达到峰值(增加23倍)，在至少72小时内仍维持比较高的水平(增加13倍)(图11)。
[0138] RANTES
[0139] 在单独培养的PBMC上清液中检测出基础水平的RANTES。在有不同成分存在时孵育PBMC，在5小时不诱导RANTES水平有任何增加。与CpG ODN或CpG和CTB的混合物共孵育的细胞上清液中，RANTES的水平24小时内增加3倍，48小时内回到基础水平。与CTB:CpG共孵育此细胞导致RANTES的产量增加了4倍，维持48小时(3倍)，至72小时回到基础水平(图12)。
[0140] c)CXC化学因子应答
[0141] IP-10
[0142] 在与CpG ODN，CTB，CTB和CpG ODN的混合物，或CTB:CpG共孵育的PBMC上清液中，在所测定的任何时间点和浓度都未发现有可检出水平的IP-10。
[0143] 为了测定CTB的马来酰亚胺活化或CpG ODN的硫醇化对所观察到的CTB:CpG偶联物诱导的化学因子应答是否具有某些作用，使PBMC与CTB，CTB-马来酰亚胺，CpG ODN或硫醇CpG ODN共孵育，然后测定CC化学因子应答。在以CTB或马来酰亚胺活化的CTB处理的PBMC上清液中，检测到相似水平的MIP-1α，MIP-1β和RANTES。类似地，以CpG ODN或硫醇化的CpG ODN处理PBMC在所测定的任何时间点导致产生了相同水平的这些化学因子(图13)。因此，化学修饰CTB(马来酰亚胺活化)和CpG ODN(硫醇化)，对CTB或CpG ODN诱导的化学因子应答没有补充作用。
[0144] 参考文献
[0145] Baek K.H.，Ha S.J，and Sung Y.C.(2001)A novel function of phosphorothioateoligodeoxynucleotides as chemoattractants for primary macrophages.J.Immunol.167，2847-2854.
[0146] Ban E.，Dupre L.，Hermann E.，Rohn W.，Vendeville C.，Quatannens B.，Ricciardi-CastagnoliP.，Capron A.and Riveau G.(2000)CpG motifs induce Langerhans ceil migration invivo.Intl.Immunol.12，737-745.
[0147] Elkins K.，Rhinehart-Jones T.，Stibitz S.，Conover J.and Klinman D.(1999)Bacterial DNAcontaining CpG motifs stimulates lymphocyte-dependent protection of mice againstlethal Infection with intracellular bacteria.J.Immunol.162，2291-2298.
[0148] Gramzinski R.，Doolan D.，Sedegah M.，Davis H.，Krieg A.and Hoffman S.(2001)Interleukin-12-and gamma interferon-dependent protection against malaria conferredby CpG oligodeoxynucleotide in mice.Infect.Immun.69，1643-1649.
[0149] Harandi A.M.，Eriksson K.and Holmgren J.(2003)A protective role of locally administeredimmunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide in a mouse model of genital herpesinfection.J.Virol.77，953-962.
[0150] Holmgren J.，Harandi A.M.and Czerkinsky C.(2003)Mucosal adjuvants and anti-Infectionand anti-immunopathology vaccines based on cholera toxin，cholera toxin B subuniiand CpG DNA.ExpertRev.Vaccines 2，205-217.
[0151] Kinghom G.R.(1994)Epidemiology of genital herpes.J.Int.Med.Res.22，14A-23A.
[0152] Krieg A.(2001)Immune effects and mechanisms of action of CpG motlfs.Vaccine 19，618-622.
[0153] Krieg A.and Davis H.(2001)Enhancing vaccine with immune stimulatory CpG DNA.Curr.Opin.Mol.Ther.3，15，24.
[0154] Krieg A.，Love-Homan L.，Yi A.and Harty J.(1998)CpG DNA induces sustained IL-12expression in vivo and resistance to Listerla monocytogenes challenge.J.Immunol.161，2428-2434.
[0155] Krieg A.，Yi A.，Matson S.，Waldschmidt T.，Bishop G.，Teasdale R.，Koretzky G.andKlinman D.(1995)CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation.Nature374，546-549.
[0156] Krieg A.M.(2002)CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects.Annu.Rev.Immunol.20，709-760.
[0157] Lipford G.，Sparwasser T.，Bauer M.，Zimmermann S.，Koch E.，Heeg K.and Wagner H.(1997)Immunostimuiatory DNA：sequence-dependent production of potentLallyharmful or useful cytokines.Eur.J.Immunol.27，3420-3426. [0158] Nahmias A.J.，Lee F.K.and Beckman-Nahmias S.(1990)Sero-epidemiological and-sociological patterns of herpes simplex virus infection in the world.Scand.J.Infect.Dis.Suppl.69，19-36.
[0159] Roman M.，Martin-Orozco E.，Goodman J.，Nguyen M.，Sato Y.，Ronaghy A.，Kornbluth R.，Richman D.，Carson D.and Raz E.(1997)Immunostimulatory DNA sequencesfunction as T helper-1-promoting adjuvants.Nat.Med.3，849-854. [0160] Sano K.，Shirota H.，Terui T.，Hattori T.and Tamura G.(2003)Oligodeoxynucleotides withoutCpG motifs work as adjuvant for the induction of Th2 differentiation in a sequence-independent manner.J Immunol，2367-2373. [0161] Seth P.，Rawls W.E.，Duff R.，Rap F.，Adam E.and Melnick J.L.(1974)Antigenicdifferences between isolates of herpesvlrus type 2.Intervirology 3，1-14.
[0162] Shirota H.，Sano K.，Hirasawa N.，Terui T.，Ohuchi K.，Hattori T.，Shirato K.and Tamura G.(2001)Novel roles of CpG oligodeoxynucleotides as a leader for the sampling andpresentation of CpG-tagged antigen by dendritic cells.J.Immunol.167，66-74.
[0163] Shirota H.，Sano K.，Kikuchi T.，Tamura G.and Shirato K.(2000)Regulation of murineairway eosinophilia and Th2 cells by antigen-conjugated CpG oligodeoxynucleotidesas a novel antigen-specificimmunomodulator.J.Immunol.164，5575-5582.
[0164] Sparwasser T.，Koch E.S.，Vabulas R.M.，Heeg K.，Lipford G，B.，Ellwart G.B.and WagnerH.(1998)Bacterial DNA and immunostimulatory CpG oligonucleotides triggermaturation and activation of murine dendritic cells.Eur.J.Immunol.28，2045-2054.
[0165] Sparwasser T.，Miethke T.，Lipford G.，Borschert K.，Hacker H.，Heeg K.and Wagner H.(1997a)Bacterial DNA causes septic shock.Nature 386，336-337. [0166] Sparwasser T.，Miethke T.，Lipford G.，Erdmann A.，Hacker H.，Heeg K.and Wagner H.(1997b)Macrophages sense pathogens via DNA motifs：induction of tumor necrosisfactor-alpha-mediated shock.Eur.J.Immunol.27，1671-1679， [0167] Stunz L.L.，Lenert P.，Peckham D.，Yi A.K.，Haxhinasto S.，Chang M.，Krieg A.M.and F A.R.(2002)Inhibitory oligonucleotides specifically block effects of stimuiatory CpGoligonucleotides in B cells.Eur.J.Immunol.32，1212-1222. [0168] Whitley R.J.(1991)Perinatal herpes simplex virus infections.Rev.Med.Virol.1，101-110.
[0169] Yamada H.，Gursel I.，Takeshita F.，Conover J.，Ishii K.J.，Gursel M.，Takeshita S.andKlinman D.M.(2002)Effect of suppressive DNA on CpG-induced immune activation.J.Immunol.169，5590-5594.
[0170] Yamamoto S.，Yamamoto T.，Kataoka T.，Kuramoto E.，Yano O.and Tokunaga T.(1992a)Unique palindromic sequences in synthetic oligonucleotides are required to induceIFN-gamma and augment IFN-gamma-mediated natural killer activity.J.Immunol.148，4072-4076.
[0171] Yamamoto S.，Yamamoto T.，Shimada S.，Kuramoto E.，Yano O.，Kataoka T.and TokunagaT.(1992b)DNA from bacteria，but not from vertebrates，induces interferons，activatesnatural killer cells and inhibits tumor growth.Microbiol.Immunol.36，983-997.
[0172] Yi A.，Klinman D.，Martin T.，Matson S.and Krieg A.(1996)Rapid immune activation by CpGmotifs in bacterial DNA.Systemic induction of IL-6transcription through anantioxidant-sensitive pathway.J.Immunol.157，5394-5402.
[0173] Zhu F.-G.，Reich C.F.and Pisetsky D.S.(2002)Inhibition of murine dendritic cell activationby synthetic phosphorothioate oligodeoxynucfeotides.J.Leuk.Biol.72，1154-1163.
[0174] Zimmermann S.，Egeter O.，Hausmann S.，Lipford G.， M.，Wagner H，and Heeg K.(1998)CpG oligodeoxynucleotides trigger protective and curative Th1 responses inlethal murine leishmaniasis.J.Immunol.160，3627-3630.