苔藓抑制素类化合物在制备用于活化PKC而增强sAPPα分泌和改善认知的药物中的应用

摘要

本发明涉及调节α-分泌酶和/或改善认知能力的组合物和方法。发明进一步涉及改善/增强患病个体的认知能力，特别是阿尔茨海默病患者，以及通过增加sAPP生成来治疗。大环内酯(即苔藓抑制素类和夹竹桃抑制素类)是用于本发明的优选化合物。本发明也提供增加非促淀粉样变可溶性APP产生的方法，包括通过施用有效量PKC激活剂来活化蛋白激酶C(PKC)。

权利要求

1.苔藓抑制素-1的用途，其特征在于，用于制备治疗阿尔茨海默氏病的药物，所述药物含有药物学上可接受的载体和治疗阿尔茨海默氏病有效量的苔藓抑制素-1。

2.苔藓抑制素-1的用途，其特征在于，用于制备增强患有阿尔茨海默氏病的人或动物的认知能力的药物，所述药物含有药物学上可接受的载体和增强患有阿尔茨海默氏病的人或动物的认知能力有效量的苔藓抑制素-1。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述苔藓抑制素-1的量有效导致sAPPα增加。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述sAPPα的增加还导致淀粉样斑形成减少。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述苔藓抑制素-1的量有效导致人或动物个体内α-分泌酶活性的增加，以增强认知能力。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述α-分泌酶的增加减少淀粉样斑形成。

7.苔藓抑制素-1的用途，其特征在于，用于制备一种减少阿尔茨海默病患者中淀粉样斑形成的药物，所述药物含有有效减少阿尔茨海默病患者中淀粉样斑形成的量的苔藓抑制素-1和药学上可接受的载体。

8.苔藓抑制素-1的用途，其特征在于，用于制备一种减少患阿尔茨海默病的人或动物体内可溶性Aβ-40的药物，所述药物包括药学上可接受的载体和有效减少可溶性Aβ-40的量的苔藓抑制素-1。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述个体具有提高的可溶性Aβ-40水平。

10.苔藓抑制素-1的用途，其特征在于，用于制备一种减少患阿尔茨海默病的人或动物体内可溶性Aβ-42的药物，所述药物包括药学上可接受的载体和有效减少可溶性Aβ-42的量的苔藓抑制素-1。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述个体具有提高的可溶性Aβ-42水平。

说明书

苔藓抑制素类化合物在制备用于活化PKC而增强 sAPPα

分泌和改善认知的药物中的应用

[0001] 发明的背景

[0002] (i)发明的领域

[0003] 本发明涉及调节α-分泌酶和认知增强。发明进一步涉及治疗淀粉样蛋白加工相关疾病如阿尔茨海默病的化合物和治疗这类疾病的组合物。

[0004] (ii)发明的背景

[0005] 存在影响认知的多种紊乱和疾病。认知一般描述为包括至少3种不同的组成部分：注意、学习和记忆。各组成部分和其各自水平影响受试者的总认知能力的水平。例如，当阿尔茨海默病患者丧失所有的认知且因而各个这些特征退化时，最常与疾病相关的是记忆丧失。在其它疾病中，患者罹患认知损伤更主要与不同特征的认知相关。例如，注意缺陷多动障碍(ADHD)集中于个体维持专心状态的能力。其它症状包括与其它神经病、衰老和疾病治疗相关的一般痴呆，这些疾病治疗可能导致对智力的有害效果如癌症治疗，卒中/缺血和智力迟钝。

[0006] 认知紊乱造成当今社会的多种问题。因此，科学家努力开发认知增强剂或认知激活剂。一般性分类已开发的认知增强剂或激活剂，包括蓝智药、血管舒张剂、代谢增强剂、精神刺激剂、胆碱能剂、生物胺药物和神经肽。血管舒张剂和代谢增强剂(如二氢麦角碱)主要有效用于脑血管结扎-缺血引起的认知紊乱；然而，它们对临床使用和其它类型的认知紊乱无效。在开发的认知增强剂中，通常仅代谢药物用于临床使用，其它仍在研究阶段。在益智药中，例如吡拉西坦活化外周内分泌系统，它不适用于阿尔茨海默病，因为患者中产生的类固醇浓度高，而胆碱能剂他克林有多种副作用，包括呕吐、腹泻和肝细胞毒性。

[0007] 改善患病个体的认知能力的方法是各种研究的主题。近来，涉及阿尔茨海默病的认知状态和改进患者记忆的不同方法是不同方法和策略的主题。遣憾的是，这些方法和策略仅改善患病个体的症状性和瞬时认知，但不针对疾病的进展。在阿尔茨海默病的病例中，研究了改善认知的尝试，一般是通过胆碱能途径或其它脑递质途径。主要方法取决于经药物治疗抑制乙酰胆碱脂酶。乙酰胆碱脂酶是主要的脑酶且调节 其水平能导致其它神经功能的各种变化并引起副作用。

[0008] 尽管这些和其它方法可改善认知，至少暂时改善，它们不改变疾病进展或针对疾病起因。例如，阿尔茨海默病通常与淀粉样前体蛋白积聚形成的斑相关。通过抗淀粉样蛋白和斑形成治疗引起免疫应答的尝试在动物模型中进行，但未成功地扩展到人。

[0009] 此外，胆碱脂酶抑制剂仅产生短时间的一些症状性改善且仅在部分阿尔茨海默病患者用于缓和症状，因而仅是总患者群中小部分人的有用治疗。更关键的是改善认知的本努力不治疗疾病症状，仅改善症状。当前的治疗不改变疾病进展。这些治疗也包括使用“疫苗”治疗阿尔茨海默病患者的症状，尽管在理论上似乎合理且在小鼠试验中有效，但显示引起人中的严重副反应。

[0010] 结果，证明使用胆碱能途径治疗认知损伤不适当，特别阿尔茨海默病。另外，目前改善认知的治疗限于特定神经变性疾病且未证明有效治疗其它认知疾病。

[0011] 阿尔茨海默病与脑中特定神经元亚群的广泛损失相关，记忆丧失是最普遍的症状。(Katzman，R.(1986)New England Journal of Medicine 314：964)。很好确定了阿尔茨海默病关于神经病理学变化的特征。然而，已报导周围组织中的异常支持了阿尔茨海默病是全身性疾病的可能性，中枢神经系统的病理学最突出。(Connolly，G.，《神经障碍的成纤维细胞模型：荧光测量研究》(Fibroblast models ofneurological disorders：fluorescence measurement studies)，综述，TiPS第19卷，171-77(1998))。关于阿尔茨海默病与遗传来源和染色体1、14及21联系的讨论，参见St.George-Hyslop，P.H.等，Science 235：885(1987)；Tanzi，Rudolph等，《引起家族性阿尔茨海默病的基因缺损》(The Gene Defects Responsible forFamilial Alzheimer’s Disease)，综述，Neurobiology of Disease 3，159-168(1996)；Hardy，J.，《阿尔茨海默病的分子遗传学》(Molecular genetics ofAlzheimer’s Disease)，Acta Neurol Scand：Supplement 165：13-17(1996)>[0012] 尽管导致神经元损失的细胞变化和疾病潜在病因学仍在研究中，很好确立了APP代谢的重要性。最一致地鉴定在阿尔茨海默病患者脑中发挥生理学或病理生理学作用的2种蛋白是β-淀粉样蛋白和τ蛋白。(参见Selkoe，D.，《阿尔茨海默病：基因、蛋白和治疗》(Alzheimer’s Disease：Genes，Proteins，and Therapy)，Physiological Reviews，第81卷，2期，2001)。讨论β-淀粉样蛋白代谢缺损和异常钙稳态和/或钙激活的激酶。
(Etcheberrigaray等，《钙反应在阿尔茨海默病患者的成纤维细胞和症状前PS1载体中改变：用于早期诊断的潜在工具》(Calcium responses are altered in fibroblasts from Alzheimer’s patients andpre-symptomatic PS1 carriers：a potential tool for early diagnosis)，Alzheimer’s Reports，第3卷，5&6期，305-312页(2000)；Webb等，《蛋白激酶C同工酶：其结构、调控和在调节呼吸道平滑肌紧张性及有丝分裂发生中的作用的综述》(Protein kinase C isozymes：a review of their structure，regulation androle in regulating airways smooth muscle tone and mitogenesis)，BritishJournal of Pharmacology，130，1433-52页(2000))。

[0013] 进一步关于正常和异常记忆，已证明K+和Ca2+通道在记忆贮存和回忆中起关键作用。例如，发现钾通道在记忆贮存中变化。(Etcheberrigaray，R.等(1992)Proceedingof National Academy of Science 89：7184；Sanchez-Andres，J.V. 和 Alkon，D.L.(1991)Journal of Neurobiology 65：796；Collin，C.等(1988)Biophysics Journal 55：955；Alkon，D.L. 等 (1985)Behavioral and Neural Biology 44：278；Alkon，D.L.(1984)Science 226：1037)。此观察结合阿尔茨海默病患者中几乎普遍的记忆丧失症状，导致研究钾通道功能作为阿尔茨海默病病理学的可能位点和PKC调节对认知的作用。

[0014] PKC鉴定为非受体丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的最大基因家族之一。由于Nishizuka和同事在80年代早期发现PKC(Kikkawa等，J.Biol.Chem.，257，13341(1982)，它鉴定为佛波酯的主要受体(Ashendel等，CancerRes.，43，4333(1983))，许多生理信号机制归咎于此酶。对PKC的强烈兴趣来源于它在体外受钙和二酰甘油(和其佛波酯模拟物)活化的独特能力，效应物的形成通过生长和分化因子的作用与磷脂更新偶联。

[0015] PKC基因家族目前由11个基因组成，它们分成4个亚组：1)经典的PKCα、β1、β2(β1和β2是相同基因的交替剪接形式)和γ，2)新的PKCδ、ε、η和θ，3)非典型的PKCζ、λ、π和ι，4)PKCμ。PKCμ类似新PKC同种型，但差异在于有推定的跨膜结构域(Blohe等，Cancer Metast.Rev.，13，411(1994)；Ilug等，Biochem J.，291，329(1993)；2+
Kikkawa等，Ann.Rev.Biochem.，58，31(1989)综述)。α、β1、β2和γ同种型依赖于Ca 、磷脂和二酰甘油并代表PKC的经典同种型，而其它同种型由磷脂和二酰甘油活化但不依赖
2+
于Ca 。所有同种型涵盖5个可变(V1-V5)区，α、β和γ同神型包含4个(C1-1C4)高度保守的结构域。除PKCα、β和γ外，所有同种型缺乏C2结构域，λ、η和同种型也缺乏C1中二个富半胱氨酸锌指结构域中的9个，这些结构域结合二酰甘油。C1结构域也包含在所有同种型中高度保守的假底物序列，它通过阻断底物-结合位点起自身调节作用以生成酶的失活构象(House等， Science，238，1726(1987))。

[0016] 由于这些结构特征，认为多种PKC同种型在响应生理刺激的信号转导(Nishizuka，Cancer，10，1892(1989))以及致瘤性转化和分化(Glazer，《蛋白激酶C》(Proteinkinase C)，J.F.Kuo主编，Oxford U.Press(1994)，171-198页)中有高度特化的作用。对于已知PKC调节剂的讨论，参见PCT/US97/08141、美国专利号5,652,232；6,043,270；6,080,784；5,891,906；5,962,498；5,955,501；5,891,870和5,962,504。

[0017] 考虑到PKC在信号转导中发挥的关键作用，证明PKC是调节APP加工的刺激靶。很好确定了PKC在APP加工中发挥作用。例如，佛波酯显示经PKC活化显著增加分泌的非促淀粉样变可溶性APP(sAPP)的相对量。然而，佛波酯活化PKC似乎不导致APP分子的直接磷酸化。不论作用的精确位点，佛波醇诱导的PKC活化增加或有利α-分泌酶、非促淀粉样变途径。因此，PKC活化是影响非有害sAPP生成和甚至产生有益sAPP的有吸引力方法并同时降低Aβ肽的相对量。然而，由于其肿瘤促进活性，佛波酯不是用于最终药物开发的合适化合物。(Ibarreta等，苯并内酰胺(BL)增强成纤维细胞和PC12细胞中的sAPP分泌(Benzolactam(BL)enhances sAPP secretion infibroblasts and in PC12 cells)，NeuroReport，第10卷，5&6期，1035-40页(1999))。

[0018] 越来越多的证据说明各PKC同工酶在生物过程中起不同作用，有时是相反作用，提供2个药理学应用的方向。一个是设计特定(优选同工酶特定)PKC抑制剂。催化结构域不是主要产生PKC同型特异性的结构域，这使此方法复杂。其它方法是开发同工酶-选择性、调节位点-定向的PKC激活剂。这些可提供方法超越具有相反生物效应的其它信号转导途径。另外，急性活化后诱导PKC下调，PKC激活剂可引起长期拮抗。苔藓抑制素目前在临床试验中作为抗癌剂。已知苔藓抑制素结合PKC的调节域并活化酶。苔藓抑制素是PKC的同工酶-选择性激活剂的例子。除苔藓抑制素之外，已发现调节PKC的化合物。(参见例如WO 97/43268)。

[0019] 仍需要制定治疗方法用于改善总体认知，通过认知能力的特定特征或一般认知。同样仍需要制定方法用于改善认知增强，无论它是否涉及特定疾病状态或认知紊乱。本发明的方法和组合物满足这些需求且大幅改善阿尔茨海默病和其它神经变性疾病的临床治疗，以及改善认知增强。方法和组合物也通过调节α-分泌酶来提供治疗和/或增强认知状态。

[0020] 发明概述

[0021] 发明涉及治疗与认知能力的增强/改善相关的疾病的化合物、组合物和方法。在一个较佳实施方案中，本发明进一步涉及治疗与淀粉样蛋白加工(如阿尔茨海默病)相关的疾病的化合物、组合物和方法，使被治疗的受试者的认知能力改善/提高。特别是本发明的化合物和组合物选自苔藓抑制素和夹竹桃抑制素类的大环内酯。

[0022] 另一方面，发明涉及调节α-分泌酶活性的大环内酯化合物、组合物和方法。特别感兴趣的是苔藓抑制素和夹竹桃抑制素类化合物，更感兴趣的是苔藓抑制素-1。

[0023] 发明的另一方面涉及苔藓抑制素和夹竹桃抑制素类化合物，作为PKC激活剂用于改变与淀粉样蛋白加工相关的状况以增强产生可溶性α-淀粉样前体蛋白(αAPP)的α-分泌酶途径，从而防止β-淀粉样积聚和改善/提高认知能力。例如，这种活化可用于治疗阿尔茨海默病，特别是苔藓抑制素-1。

[0024] 又一方面，发明涉及治疗斑形成的方法如与阿尔茨海默病相关，和改善/提高受试者的认知状态的方法，包括施用有效量的苔藓抑制素或夹竹桃抑制素类化合物给受试者。在一个更佳实施方案中，化合物是苔藓抑制素-1。

[0025] 发明的另一方面涉及治疗斑形成和改善/提高认知能力的组合物，包括：(i)大环内酯，其量有效提高可溶性β-淀粉样蛋白、产生可溶性αAPP和防止β-淀粉样积聚；(ii)药学上有效的载体。在一个较佳实施方案中，组合物用于改善/提高阿尔茨海默病相关的认知能力。大环内酯优选选自苔藓抑制素或夹竹桃抑制素类化合物，特别是苔藓抑制素-1。

[0026] 在发明的一个实施方案中，活化PKC同工酶使认知能力改善。在一个实施方案中，改善的认知能力是记忆。在另一个实施方案中，改善的认知能力是学习。在另一个实施方案中，PKC同工酶由大环内酯(即苔藓抑制素类和夹竹桃抑制素类)活化。苔藓抑制素-1到18和夹竹桃抑制素特别用于活化PKC同工酶。在一个较佳实施方案中，使用苔藓抑制素-1。

[0027] 另一方面，发明包括PKC同工酶激活剂的组合物，其施用量有效改善认知能力。在一个较佳实施方案中，PKC同工酶激活剂选自大环内酯(即苔藓抑制素类和夹竹桃抑制素类)。在一个较佳实施方案中，施用的PKC激活剂的量有效增加sAPP的生成。在一个更佳实施方案中，施用的组合物的量不引起肌痛。

[0028] 在一个较佳实施方案中，PKC同工酶在受试者中活化，受试者正患或已患神经病、卒中或缺氧。在一个更佳实施方案中，PKC同工酶在阿尔茨海默病受试者或模型中活化。

[0029] 在发明的另一个实施方案中，PKC活化引起淀粉样前体蛋白代谢的调节。PKC活 化的调节进一步导致α-分泌酶途径增加。α-分泌酶途径产生涉及认知损伤的非毒性、非促淀粉样变片段。结果，受试者的认知情况改善。在发明的又一个实施方案中，PKC活化减少促淀粉样变和毒性片段Aβ40和Ab42。

[0030] 发明的另外一个实施方案是通过活化PKC同工酶提高认知能力的方法。在发明的又一个实施方案中，PKC活化在“正常”受试者中发生。在发明的另外一个实施方案中，PKC活化在罹患疾病认知力退化或认知功能障碍的受试者中发生。在一个较佳实施方案中，方法是治疗阿尔茨海默病的方法。

[0031] 在发明的另一个实施方案中，通过使用非肿瘤促进剂调节PKC导致认知能力改善。在一个较佳实施方案中，PKC激活剂选自苔藓抑制素-1到18和夹竹桃抑制素。在一个更佳实施方案中，使用苔藓抑制素-1。在另一个实施方案中，苔藓抑制素-1与非苔藓抑制素类化合物使用以提高认知能力和减少副作用。

[0032] 在发明的另一个实施方案中，经大环内酯(即苔藓抑制素类和夹竹桃抑制素类)调节PKC体外用于测试阿尔茨海默病相关疾病。体外使用可包括例如测试成纤维细胞、血细胞或监控细胞模型中的离子通道电导率。

[0033] 在发明的一个较佳实施方案中，化合物和组合物经口服和/或注射形式施用，注射形式包括静脉内和心室内。

[0034] 因此本发明提供治疗受试者记忆损伤或学习障碍的方法，方法包括施用治疗有效量的一种本发明化合物。本化合物因而可用于治疗发生记忆缺损或学习受损的临床症状。用此方法能改善记忆和学习。从而改善受试者的情况。

[0035] 组合物和方法用于治疗临床疾病和紊乱，其中产生受损记忆或学习障碍作为主要特征或相关症状。这种能用本化合物治疗的疾病例子包括阿尔茨海默病、多发性脑梗死性痴呆和阿尔茨海默病的卢伊体变体，它与帕金森氏病相关或不相关；克-雅氏病和科尔萨科氏病。

[0036] 组合物和方法也可用于治疗与年龄相关的受损记忆或学习，随电痉挛治疗发生或是引起脑损伤的结果，例如卒中、麻醉事故、头部外伤、低血糖症、一氧化碳中毒、锂中毒或维生素缺乏。

[0037] 化合物的另外优点是非肿瘤促进和已进入II期临床试验。

[0038] 发明涉及的药物组合物用于增强认知、防止和/或治疗认知紊乱。它更具体涉及药物组合物包括大环内酯(即苔藓抑制素类和夹竹桃抑制素类)和其衍生物，作为增强认知、防止和/或治疗认知紊乱的活性成分。

[0039] 因此发明的主要目的是提供药物组合物用于增强认知、防止和/或治疗认知紊乱。 药物组合物包括大环内酯，特则是苔藓抑制素类和夹竹桃抑制素类，或药学上可接受盐或其衍生物和药学上可接受的载体或赋形剂。

[0040] 根据发明的药物组合物用于增强认知、预防和/或治疗认知紊乱，其中认知紊乱包括但不限于本文所述学习获得、记忆巩固和恢复。

[0041] 发明涉及治疗神经病相关的淀粉样变的方法，包括阿尔茨海默病，通过施用有效量的至少1种调节或影响哺乳动物细胞中蛋白磷酸化的试剂给患者。

[0042] 发明也提供治疗阿尔茨海默病的方法，包括施用有效量的大环内酯(即苔藓抑制素类和夹竹桃抑制素类)给患者。

[0043] 在另一个实施方案中，苔藓抑制素或夹竹桃抑制素类化合物可用于上述方法，结合不同佛波酯以防止或减少受试者的致瘤反应。

[0044] 附图的简述

[0045] 图1(a)阐述不同PKC抑制剂和浓度对sAPPα分泌的效果，苔藓抑制素-1在低于对照和苯并内酰胺-苔藓抑制素的浓度(0.1nM，实心柱)显示更高效率，在很好确定特征、尸检确认的AD细胞系中孵育3小时后，显著增加培养基中的sAPP-α量(p＜0.0001，ANOVA)。图单位相对于单独载体DMSO。苔藓抑制素在相同(0.1nM)浓度比另一种PKC激活剂BL显著(p＜0.01，Tukey后检验)更有效。用星形孢菌素(100nM)预处理(最右面的柱)完全去除苔藓抑制素(0.1nM)的作用。苔藓抑制素也有效增强2个对照细胞系中的分泌，尽管程度小于AD细胞系(阴线柱)；

[0046] 图1(b)阐述不同苔藓抑制素-1的浓度在时程中对sAPPα分泌的效果-分泌在15分钟孵育(苔藓抑制素，0.1nM)时明显接近增强且在160分钟孵育时接近最大，保持增强直至3小时。较低浓度0.01nM苔藓抑制素更缓慢，但在120分钟孵育后对分泌有大致相同的效果；

[0047] 图1(c)阐述不同实验条件和细胞系下的sAPPα分泌，通过蛋白质印迹在人成纤维细胞中呈现sAPP-α；

[0048] 图2阐述不同苔藓抑制素-1的浓度对PKCα同工酶的效果。

[0049] 图3阐述与对照相比治疗大鼠学习水迷宫所需的时间量-Morris水迷宫的学习曲线显示苔藓抑制素(i.v.o.)改善动物的表现，由从早期试验中减少逃脱潜伏期所证明；

[0050] 图4(a)阐述对照大鼠在不同象限中游泳所用时间量-对照和治疗动物都显示保持对靶象限的优选(也参见图4(b))；

[0051] 图4(b)阐述治疗大鼠在不同象限中游泳所用时间量。

[0052] 图4(c)阐述与对照大鼠相比治疗大鼠在靶象限所用时间量间的差异-与对照相比治疗动物显示改善保持力。

[0053] 图5(a)阐述人成纤维细胞中的PKC转位，柱图显示膜结合PKC(P＝微粒)的免疫反应性(通过总蛋白含量标准化)与胞质部分(S＝可溶)检测免疫反应性间的比例。30分钟孵育后，用0.1nM苔藓抑制素标记PKC-α转位(实心柱)。180分钟孵育时仍存在转位(P＞S)(最右面的柱)。

[0054] 图5(b)阐述检测其它PKC同工酶且其转位水平可与观察到的PKC-α水平相比。

[0055] 图6(a)阐述用转基因小鼠(年轻动物)的体内测试，治疗在刚断奶(3周)后开始，用BL 1mg/kg(腹膜内，每日)17周。与单用载体相比，治疗组的脑中sAPP-α显著增加。

[0056] 图6(b)阐述相同动物有成比例的Aβ40降低。

[0057] 图7(a)阐述用约6个月大转基因小鼠(成年动物)的体内测试，小鼠接受7周BL和LQ12治疗，剂量和方案如柱图所示。通过实心柱所示随着治疗sAPP-α小幅增加。

[0058] 图7(b)阐述用BL和LQ12治疗的动物中观察到小幅Aβ40降低(不显著)，BL和LQ12均为10mg/kg-每周(实心柱)。用BL-10mg/kg-每日治疗的动物中观察到未预期(阴线柱)的Aβ40增加。

[0059] 图8阐述对照和AD细胞施用苔藓抑制素0.1nM后，人成纤维细胞中的sAPPα分泌。

[0060] 图9阐述AD细胞中苔藓抑制素施用后的sAPP免疫印迹。

[0061] 图10阐述苔藓抑制素对治疗小鼠的正作用和寿命相较对照的增加。

[0062] 图11阐述治疗动物相对未治疗动物在水试验中花费的持续时间。

[0063] 图12阐述相对对照，治疗动物中的可溶性Aβ-40浓度减少。

[0064] 图13阐述相对对照，治疗动物中的可溶性Aβ-42浓度减少。

[0065] 图14阐述硫黄素S染色后，与对照相比在治疗动物中发现斑的百分比减少。

[0066] 较佳实施方案的详细描述

[0067] 记忆丧失和学习能力受损是临床疾病症状范围的特征。例如，记忆丧失是痴呆状态的最普通症状，包括阿尔茨海默病。记忆缺损也伴随其它痴呆种类的出现，如多属性脑梗死性痴呆(MID)、脑血管缺陷引起的老年性痴呆、阿尔茨海默病的卢伊体变体，它与帕金森氏病相关或不相关、或克-雅氏病。记忆丧失是脑损伤患者的普通特 征。脑损伤可能在例如典型卒中后发生，或作为麻醉事故、头部外伤、低血糖症、一氧化碳中毒、锂中毒或维生素(B1，硫胺和B12)缺乏或过量使用酒精或科尔萨科氏病的结果。此外，记忆损伤可与年龄相关；回忆信息如姓名、位置和单词的能力似乎随着年龄增大而降低。电痉挛治疗(BCT)后，罹患重症抑郁障碍的患者中也发生瞬时记忆丧失。阿尔茨海默病事实上是引起年老群体中进行性痴呆的最重要的临床实体，而缺氧/卒中引起不涉及神经障碍的显著的记忆缺损。

[0068] 患阿尔茨海默病的个体特征是进行性记忆损伤、失去语言和视觉空间技能及行为缺陷(MoKhann等，1986，Neurology，34：939-944)。患阿尔茨海默病的个体的认知损伤是位于脑皮层、海马、基底前脑和其它脑区域的神经元细胞退化的结果。组织分析尸体解剖时获得的阿尔茨海默病脑证明核周质中存在神经纤维缠结(NFT)且退化神经元的轴突、胞外神经炎(老年)斑和淀粉样斑存在于一些受影响脑区域的血管内和周围。神经纤维缠结是异常丝状结构，含以螺旋方式配对的纤维(直径约10nm)，因此也称为成对螺旋纤丝。神经炎斑位于退化神经末梢(轴突和树突)，包含淀粉样蛋白纤维的核心化合物。总之，阿尔茨海默病的特征是某些神经病理学特征，包括主要由细胞骨架蛋白组成的胞内神经纤维缠结、胞外实质和脑血管淀粉样蛋白。此外，本领域现有方法区分阿尔茨海默病患者、正常老年人、患其它神经变性疾病的人，如帕金森氏病、亨廷顿舞蹈症、韦-科综合征或精神分裂症，进一步描述于例如美国专利5,580,748和美国专利6,080582。

[0069] 阿尔茨海默病是脑功能障碍，特征是蛋白分解代谢改变和特性上存在早期记忆丧失。AD的最特征性的临床表现是记忆丧失。记忆丧失通常在疾病进程的早期发生并主要影响最近信息的学习。与正常联想记忆贮存相关且在AD患者的细胞中受影响或不调节的分子和细胞过程是治疗或缓解AD和/或改善记忆的方法。记忆获得与记忆丧失间合聚的中央和潜在关键位点是蛋白激酶C。一些对动物模型中联想记忆重要的分子和分子事件显示+在AD中改变或缺损。这些包括K 通道、钙调节和蛋白激酶C(PKC)。PKC也参与淀粉样前体蛋白(APP)加工，APP是AD病理生理学中的一个重要成分。阿尔茨海默病中发现的胞内神经纤维缠结的形成包含改变的蛋白磷酸化。也研究了蛋白磷酸化在淀粉样前体蛋白(APP)的分解代谢中的作用，从APP获得AD中发现的淀粉样斑的主要成分。阿尔茨海默病的病理学的主要特征是斑内积沉积粉样蛋白。

[0070] 淀粉样前体蛋白(APP)加工确定稍后聚集形成淀粉样沉积的片段生成，淀粉样沉积是阿尔茨海默病(AD)的特征，称为老年或AD斑。因此，APP加工是AD中的早期和 关键病理生理学事件。

[0071] 已鉴定3个另外的APP加工途径。前面定义为“正常”的加工包括酶的参与，酶在Aβ序列内残基Lys16(或在Lys16和Leu17间；APP770命名)切割APP，产生非使淀粉样变片段：大的N-末端胞外结构域和小的9kD膜结合片段。此酶称为α-分泌酶，有待充分鉴定。2种另外的分泌酶参与APP加工。1个可供选择的途径包括在Aβ结构域外的Met671和Asp672间切割APP(通过β-分泌酶)和内体-溶酶体系统的参与。另一个切割位点出现在Aβ部分的羧基末端，在Aβ肽的氨基酸39之后的质膜内。分泌酶(γ)作用产生胞外氨基酸末端，它包含完整Aβ序列和约6kDa的细胞相联片段。因此，β和γ分泌酶加工产生潜在的促淀粉样变片段，因为它们包含完整Aβ序列。一些证据显示所有可供选择的途径在特定系统中发生且可溶性Aβ可以是“正常产物”。然而，也有证据表明CSF和血浆中的循环Aβ量在携带“Swedish”突变的患者中提高。此外，转染此突变或APP717突变的培养细胞分泌转大量的Aβ。最近，其它APP突变和PS1及PS2突变的载体显示分泌增加量的特定形式、长(42-43个氨基酸)Aβ。

[0072] 因此，尽管所有可供选择的途径可正常发生，家族性和或许散发AD中发生有利促淀粉样变加工的不平衡。这些增强的促淀粉样变途径最终导致AD患者的脑中形成小纤维和斑。因而，对有利非促淀粉样变、α-分泌酶途径的干涉有效地使APP加工的平衡移向推定的非致病过程，与潜在的毒性Aβ肽相比此过程增加sAPP的相对量。

[0073] PKC同工酶提供关键、特异和限速分子靶，从而能证明生化、生物物理与行为效率的独特相关性并应用到受试者以改善认知能力。

[0074] 本发明者研究苔藓抑制素作为蛋白激酶(PKC)的激活剂。阿尔茨海默病(AD)患+者中成纤维细胞的改变包括PKC的改变以及钙调节和钾(K)通道的改变。PKC活化显示恢+ 2+
复正常K 通道功能，如TEA-诱导的[Ca ]上升所测量。进一步的膜片钳数据证实PKC激+ +
活剂对恢复113pS K 通道活性的效果。因此，确定以PKC激活剂为基础的K 通道恢复为研究AD病理生理学的方法，且提供AD疗法的有用模型。(参见待审批专利申请09/652,656，全部纳入本文。)

[0075] 使用来自阿尔茨海默病(AD)患者的外周组织和动物神经元细胞可鉴定一些细胞/分子改变，这些改变反映AD脑中可比较的过程，因而有病理生理相关性(Baker等，1988；Scott，1993；Huang，1994；Scheuner等，1996；Etcheberrigaray和Alkon，1997；Gasparini等，1997)。已鉴定成纤维细胞(Etcheberrigaray等，1993)和血细胞(Bondy等，1996)中钾通道功能的改变，细胞获得自AD患者。此外，显示广泛 认可为AD病理生理学中主要参预者的β-淀粉样蛋白(Gandy和Greengard，1994；Selkoe，1994；Yankner，1996)能诱导对照+ +
成纤维细胞中的AD-类似K 通道改变(Etcheberrigaray等，1994)。β-淀粉样蛋白对K通道的类似或可比较效果在来自实验室动物的神经元中报导(Good等，1996；综述也参见+
Fraser等，1997)。早期观察到AD脑中蜂毒明肽-敏感K 通道的海马改变(如蜂毒明肽结+
合所测量)，这提供另外的支持提示K 通道可能在AD中病理生理上相关(Ikeda等，1991)。
此外，蛋白激酶C(PKC)在AD患者的外周和脑组织中表现出平行变化。此酶的水平和/或活性引入AD患者的脑和成纤维细胞(Cole等，1988；Van Huynh等，1989；Govoni等，1993；
Wang等，1994)。用免疫印迹分析的研究揭示多种PKC同工酶在成纤维细胞中显著减少，主要是α同种型(Govoni等，1996)，而α和β同种型在AD患者脑中降低(Shimohama等，
1993；Masliah等，1990)。这些脑PKC改变可能是疾病过程的早期事件(Masliah等，1991)。
同样有趣的是注意到PKC活化似乎有利于非促淀粉样变加工淀粉样前体蛋白APP(Buxbaum等，1990；Gillespie 等，1992；Selkoe，1994；Gandy 和 Greengard，1994；Bergamashi 等，+
1995；Desdouits等，1996；Ethimiopoulus等，1996)。因此，PKC和K 通道改变在AD中共存，AD中有外周和脑表达。

[0076] 已研究PKC和K+通道改变间的联系，因为已知PKC调节离子通道，包括K+通道，缺+ +陷PKC导致缺陷K 通道。这不仅对调节APP重要，而且对PKC和K 通道在记忆建立和回忆中发挥的作用重要。(例如参见Alkon等，1988；Covarrubias等，1994；Hu等，1996)。AD成+
纤维细胞用于证明K 通道和PKC缺陷(Etcheberrigaray等，1993；Govoni等，1993，1996)。
+
研究也显示具已知功能紊乱K 通道的成纤维细胞用PKC激活剂处理可恢复通道活性，通过
2+
存在/缺乏TEA-诱导的钙上升来监控。此外，以氯化四乙铵(TEA)-诱导[Ca ]上升为基+
础的测定用于显示功能性113pS K 通道，通道对TEA阻断敏感(Etcheberrigaray等，1993，
2+
1994；Hirashima等，1996)。因此，来自对照个体的成纤维细胞中观察到的TEA-诱导[Ca ]+
上升和K 通道活性在来自AD患者的成纤维细胞中几乎没有(Etcheberrigaray等，1993；
Hirashima等，1996)。这些研究证明使用PKC激活剂能恢复AD成纤维细胞系对TEA攻击的反应性。另外，来自这些研究的免疫印迹证据证明此恢复与α同种型的优选参与有关。

[0077] 本发明者也观察到蛋白激酶c的活化有利于α-分泌酶加工阿尔茨海默病(AD)淀粉样前体蛋白(APP)，导致产生非促淀粉样变的可溶性APP(sAPP)。因此，促淀粉样变A1-40和A1-42(3)的相对分泌减少。这是特定相关，因为成纤维细胞和其它表达APP和早老素AD突变的细胞分泌增加量的总Aβ和/或增大比例的A1-47(3)/A1-40。有趣的是， PKC缺陷在AD脑(α和β同种型)和来自AD患者的成纤维细胞(α同种型)中发现。

[0078] 研究显示其它对α、β和γ同种型选择性提高的PKC激活剂(即苯并内酰胺)在基底水平上强sAPP分泌。苯并内酰胺处理的AD细胞中sAPP分泌也稍高于对照苯并内酰胺处理的成纤维细胞，后者仅在10μM BL处理后显示明显增加的sAPP分泌。进一步报导星形孢菌素(PKC抑制剂)去除苯并内酰胺在对照和AD成纤维细胞中的作用，而相关化合物也引起PC12细胞中约3倍的sAPP分泌。本发明者发现使用苔藓抑制素作为有利非促淀粉样变APP加工的PKC激活剂具有特定治疗价值，因为它非肿瘤促进且已进入II期临床试验。

[0079] 认为记忆是涉及信息处理的脑结构中持久突触修饰的结果。认为突触是最终靶的关键位点，由此记忆相关事件实现其功能性表达，无论事件是包括变化的基因表达和蛋白2+
翻译、改变的激酶活性，还是修饰的信号级联。一些蛋白参与联想记忆，包括Ca /钙调素II
2+
激酶、蛋白激酶C、22-kDa学习相关Ca 结合蛋白calexcitin和II型里密娜碱受体。通过施用大环内酯调节PKC提供影响突触修饰的机制。

[0080] 记忆和学习损伤区在动物模型中丰富，能证明记忆和学习过程的不同特征。(参见例如Hollister，L.F.，1990，Pharmacopsychiat.，23(Suppl II)33-36)。记忆丧失和学习受损的可用动物模型包括测量动物想起不连续事件的能力。这些测试包括Morris水迷宫和被动回避过程。在Morris水迷宫中，允许动物在分成4象限的槽中游泳，仅1个象限有水下的安全平台。取出平台，测试动物相对不正确象限多久搜索到正确象限。在被动回避过程中，动物记得传递适度电击的特殊环境并在第二次时回避它。被动机回避过程的一个变型利用啮齿动物优选黑暗密闭环境超过明亮开放环境。进一步的讨论可发现于 Crawley，J.N.，1981，Pharmacol.Biochem.Bchav.，15，695-699；Costall，B. 等 1987，Neuropharmacol.，26，195-200；Costall，B. 等，1989，Pharmacol.Biochem.Behav.，32，777-785；Barnes，J.M. 等 1989，Br.J.Pharmacol.，98(Suppl)693 页；Barnes，J.M. 等，
1990，Pharmacol.Biochem.Bchav.，35，955-962。

[0081] 单词“正常”的使用包括未诊断或者目前表现认知功能减少或另外受损的个体。通过本领域很好确立的已知方法可测试和评估不同认知能力，包括但不限于从基础运动-空间技能到更复杂的记忆回忆测试。用于非灵长类动物认知能力测试的非限制性例子包括Morris水迷宫、放射式迷宫、T迷宫、眨眼条件反射、延迟回忆和线索性回忆，而用于灵长类受试者的测试可包括眨眼、延迟回忆、线索性回忆、面孔识别、Minimental和ADAS-Cog。许多这些测试通常用于AD患者的智力状态评估。类 似地，用于相似目的的动物模型的评估较好地描述于文献中。

[0082] 特别感兴趣的是作用于刺激PKC的大环内酯(即苔藓抑制素类和夹竹桃抑制素类)。在苔藓抑制素类化合物中，苔藓抑制素-1显示激活PKC且证明没有肿瘤促进活性。苔藓抑制素-1作为PKC激活剂也特别有用，因为苔藓抑制素-1的剂量反应曲线是两相的。
另外，苔藓抑制素-1证明差异调节PKC同工酶，包括PKCα、PKCδ和PKCε。进行动物和人中苔藓抑制素-1毒性和安全性研究，且积极研究苔藓抑制素-1作为抗癌剂。在研究中
2
使用苔藓抑制素-1确定人中的主要副反应是肌痛，最大剂量限制为40mg/m。本发明使用
0.1nM浓度的苔藓抑制素-1以引起sAPP分泌大幅增加。苔藓抑制素-1与单独载体比较并和另一种PKC激活剂苯并内酰胺(BL)比较，BL所用浓度高10,000倍。同样，以0.01nM使用的苔藓抑制素仍证明有效增加sAPP分泌。(参见图1(a))。PKC转位显示活化的测量在
30分钟时最大，接着部分下降，保持高于基底转位水平多达6小时。(参见图1(b)、2、8和
9)。使用PKC抑制剂星形孢菌素完全阻止苔藓抑制素对sAPP分泌的效果。数据进一步证明PKC活化调节苔藓抑制素对sAPP分泌的作用(参见图1和2)。

[0083] 大环内酯，特别是苔藓抑制素-1描述于美国专利4,560,774。大环内酯和其衍生物描述于本领域其它地方，例如美国专利6,187,568、美国专利6,043,270、美国专利5,393,897、美国专利5,072,004、美国专利5,196,447、美国专利4,833,257和美国专利4,611,066。上面的专利描述多种化合物和大环内酯的不同用途，包括它们作为消炎药或抗肿瘤剂的用途。其它有关苔藓抑制素类化合物的讨论可发现于：《苔藓抑制素1和佛波醇12-豆蔻酸盐13-乙酸盐在NIH 3T3成纤维细胞中对蛋白激酶C同工酶的差异调节》(Differential Regulation of ProteinKinase C Isozymes by Bryostatin 1 and Phorbol 12-Myristate 13-Acetate in NIH3T3 fibroblasts)，Szallasi等，Journal of Biological Chemistry，269卷，3期，2118-24页(1994)；《蛋白激酶C激活剂的天然产物抗癌剂苔藓抑制素1的临床前药理学》(Preclinical Pharmacology of the Natural Product Anticancer AgentBryostatin 1，an Activator of Protein Kinase C)，Zhang等，Cancer Research56，802-808(1996)；《蛋白激酶C激活剂苔藓抑制素1通过佛波酮在SENCAR小鼠皮肤中抑制肿瘤促进》(Bryostatin 1，an activator of protein kinase C，inhibitstumor promotion by phorbol ester in SENCAR mouse skin)，Hennings等，Carcinogenesis第8卷，9期，1343-46页(1987)；《苔藓抑制素1在复发低级非何杰金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病患者中的II期试验》(Phase II Trial of Bryostatin 1 in Patients with Relapse Low-Grade Non-Hodgkin’s Lymphoma andChronic Lymphocytic Leukemia)，Varterasian等，Clinical Cancer Research，第6卷，825-28页(2000)；综述文章：《苔藓抑制素的化学和临床生物学》(Chemistryand Clinical Biology of the Bryostatin)，Mutter等，Bioorganic和MedicinalChemistry 8，1841-1860页(2000)。

[0084] 大环内酯包括苔藓抑制素类，代表已知化合物，它们最初来源于总合草苔虫(Bugula nerltina L)。尽管已知多种大环内酯的用途，特别是苔藓抑制素类，以前不知道大环内酯和认知增强间的关系。

[0085] 可用于本发明的化合物例子包括大环内酯(即苔藓抑制素类和夹竹桃抑制素类化合物)。尽管这些化合物的特定实施方案描述于例子和详细叙述，应理解参考文献和其衍生物所示化合物也能用于本组合物和方法。

[0086] 本领域普通技术人员也理解大环内酯化合物和其衍生物特别是苔藓抑制素类，适合于组合合成技术并因此能产生化合物库以最优化药理学参数，包括但不限于组合物的效率和安全性。另外，能分析这些库以确定优选调节α-分泌酶和/或PKC的成员。

[0087] 组合库高通量筛选天然产物和发酵液，发现一些新药物。目前，产生和筛选化学多样性作为发现前导化合物的重要技术被广泛利用，这确实是药物发现领域的一个主要的根本性进展。另外，即使鉴定“前导”化合物后，组合技术提供最优化所需生物活性的有价值工具。要理解受试者反应已使它们本身产生化合物的组合库用于筛选药物或者其它生物或医学相关活性或物质相关性质。用于本发明目的的组合库是化学相关化合物的混合物，它们可一起筛选所需性质；所述库可以是溶液或共价连接固体支持物。在单个反应中制备许多相关化合物大幅减少和简化需完成的筛选方法的数量。筛选适当生物性质可由常规方法完成。因此，本发明也提供方法确定1种或多种发明化合物结合以有效调节α-分泌酶和/或PKC的能力。

[0088] 本领域有多种技术用于产生下述组合库，但要理解本发明不想受上述例子和描述限制。参见例如Blondelle等(1995)Trends Anal.Chem.14：83；the Affymax美国专利5,359,115和5,362,899；Ellman美国专利5,288,514；Still等PCT出版物WO94/08051；Chen等(1994)JACSI 1 6：266 1；Kerr等(1993)JACSI 1 5：252；PCT出版物WO
92/10092、WO 93/09668和WO91/07087；Lemer等PCT出版物WO93/20242)。因此，能以约
16到1,000,000个或更多反向聚体(diversomer)的顺序合成多种库并筛选特定活性或性质。

[0089] 本化合物能以多种途径和剂型施用，包括口、直肠、肠胃外(如皮下、肌肉内和静脉内)、硬膜外、鞘内、关节内、局部和含服施用。成人的剂量范围取决于一些因素，包括年龄、重量和患者状况和施用途径。

[0090] 对于口服施用，含稀释剂、分散剂和/或表面活性剂的精细粉末或颗粒可以干状态存在于饮剂、水或糖浆、胶囊或小药囊，在非水悬浮液中可包括悬浮剂，或在水或糖浆的悬浮液中。当需要或必需时，可包括矫味剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂或乳化剂。

[0091] 混合物可包括的其它化合物是例如医学上惰性成分如固体和液体稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、淀粉或磷酸钙用于片剂或胶囊，橄榄油或油酸乙酯用于软胶囊和水或者植物油用于悬浮液或乳剂：润滑剂如硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；胶凝剂如胶体粘土；增稠剂如黄蓍胶或藻酸钠，粘合剂如淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂如淀粉、褐藻酸、藻酸盐或羟乙酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂如卵磷脂、聚山梨醇酯或月桂硫酸盐；其它治疗上可接受附加成分，如致湿剂、防腐剂、缓冲液和抗氧化剂，它们是这种制剂的已知添加物。

[0092] 用于口服施用的液体分散体可以是糖浆、乳剂或悬浮液。糖浆可包含例如蔗糖或有甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇的蔗糖作为载体。特别是用于糖尿病患者的糖浆仅能包含产物作为载体，例如山梨糖醇，它不代谢成葡萄糖或仅很少量代谢成葡萄糖。悬浮液和乳剂可包含载体，例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。

[0093] 用于肌肉内注射的悬浮液或溶液可与活性化合物一起，包含药学上可接受的载体如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇如丙二醇且如果需要可含适当量的盐酸利多卡因。。用于静脉内注射或输注的溶液能包含载体，例如无菌水，一般是注射水。然而，它们优选采用无菌、含水、等渗盐水溶液形式。另外，本化合物可封装在脂质体内。本化合物也可使用其它已知活性剂传递系统。

[0094] 本化合物也能以不结合其它添加物的纯形式施用，其中胶囊、小药囊或片剂是优选剂型。

[0095] 以离散单位提供的片剂和其它呈现形式可方便地包含1种本化合物的日剂量或其适当部分。例如，单位能包含5mg到500mg的本化合物，但通常从10mg到250mg。

[0096] 要理解发明组合物的药理学活性能用本领域已知的标准药理学模型证明。此外，应理解发明组合物能掺入或封装到合适聚合物基质或膜用于位点特异性传递，或能 用影响位点特异传递的特定靶向剂功能化。这些技术以及其它药物传递技术在本领域熟知。

[0097] 总之，PKC的活化影响记忆获得以及便于非促淀粉样变、α-分泌酶加工APP。非肿瘤促进物PKC激活剂苔藓抑制素1显著地提高AD患者的成纤维细胞中的α-分泌酶产物sAPPα的分泌。苔藓抑制素在亚纳摩尔浓度时效果显著。心室内注射苔藓抑制素也增强+大鼠进行Morris水迷宫范式时的表现。近来的体内研究显示以前表现出逆转K 通道缺陷并提高AD细胞中sAPPα的苯并内酰胺显著增加转基因小鼠脑中的sAPPα且减少Aβ40，小鼠携带LondonV717I APP突变。这些结果证明PKC(和其活化)可能是治疗或缓解AD相关症状和记忆丧失的工具。对苔藓抑制素1特别感兴趣，因为它不仅更有效，而且没有肿瘤促进活性并已进行人癌症治疗的临床研究。下面的实验提供证据表明苔藓抑制素1显著和有效提高APP的α-加工(产生增加量的sAPPα)且显著改善大鼠在Morris水迷宫任务中的表现。实验也提供证据表明，另一种PKC激活剂苯并内酰胺体内引起sAPPα明显增加和Aβ40减少。

[0098] 纳入本文供参考的所有书、文章或专利参考文献与本说明书一致。现在通过实施例描述本发明，旨在阐明而不是限制发明的范围。

[0099] 实施例I：

[0100] 细胞培养

[0101] 培养的皮肤成纤维细胞获得自Corlell Cell Repositories并用建立的培养综合指南生长，稍有修改(Cristofalo和Carptentier，1988；Hirashima等，1996)。细胞生长的培养基是Dulbccco改进的Eagle培养基(GIBCO)，添加10％胎牛血清(Biofluids，Inc.)。使用的成纤维细胞来自对照细胞系(AC)、病例AG07141和AG06241和家族性AD(FAD)病例(AG06848)。

[0102] PKC激活剂

[0103] 不同同工酶的不同组织分布、显然有区别的作用和病理学中的差异参与使采用药理学工具重要，这些工具能优选靶向特异同工酶(Kozikowski等，1997；Hofmann，1997)。近来在医学化学领域中的研究开发了一些PKC激活剂，例如不同的苯并内酰胺和吡咯烷酮。然而，目前研究的苔藓抑制素PKC激活剂不仅有提供同系特异性活性的益处，而且不受以前使用PKC激活剂的阻碍，如肿瘤促进性。苔藓抑制素竞争PKC的调节结构域且参与此位点内很特异的氢键相互作用。此化合物的另外有机化学和分子模型的信息能在文献中发现。

[0104] 处理

[0105] 细胞在6cm皮氏培养皿中生长5-7天至铺满。在实验当天，培养基用无血清的DMEM替换并不受干扰地保持2小时。完成2小时血清丧失后，以适当浓度(0.1和0.01nM用于苔藓抑制素；0.1nM、0.1μM和1μM BL)直接应用于Bryo、BL和DMSO培养基来完成处理。在所有情况中DMSO少于1％。在大部分情况中，处理sAPP分泌3小时后收集和加工培养基。其它时间点也用于确定分泌的时程。

[0106] PKC转位的免疫印迹测定

[0107] 免疫印迹实验用很好确定的过程进行(Dunbar，1994)。细胞在6cm皮氏培养皿中生长到铺满(约90％)。定量同工酶响应0.1nM苔藓抑制素-1处理5、30、60和120分钟的水平，所用过程从Racchi等，(1994)确立的稍有修改。成纤维细胞用冰冷PBS洗2次，在PBS中刮，通过低速离心收集。沉淀重悬于下列均化缓冲液：20mM Tris-HCl，pH7.5、2mM EDTA、2mM EGTA、5mM DTT、0.32M蔗糖和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)通过超声处理、约12,000g离心20分钟获得匀浆物，上清用作胞质部分。沉淀在含1.0％ Triton X-100的相同缓冲液中匀浆，冰中孵育45分钟，约12,000g离心20分钟。来自此批的上清用作膜部分。蛋白测定后，20μg蛋白在2X电泳样品缓冲液(Novex)中稀释，煮沸5分钟，在10％丙烯酰胺凝胶上展开，电转移至PVDF膜。膜用5％牛奶封闭剂经室温孵育1小时饱和。PKC同种型的一抗(TransduetionLaboratories)在封闭溶液中稀释(1∶1000)并4℃过液孵育膜。
二抗碱性磷酸酶抗小鼠IgG(Vector Laboratories)孵育后，膜用化学发光底物(Vector Laboratories)根据厂商说明显影。带强度通过光密度法定量，使用BioRad GS-800校准的扫描光密度计和多分析软件(BioRad)。

[0108] sAPP-确定/测量sAPP-α

[0109] 分泌的APP浓度用常规免疫印迹技术测量，操作有小修改。从各皿/处理沉淀的蛋白提取物上样到新制备的10％丙烯酰胺TrisHCl微凝胶且由SDSPAGE分离。上样样品体积根据每皿总细胞蛋白校正。随后蛋白电泳转移至PVDF膜。膜用5％脱脂奶粉饱和以封闭非特异结合。封闭膜在4℃孵育过夜，用可商业购买的抗体6E10(1∶500)，它在条件培养基(SENETEK)中识别sAPP-α。洗后，膜用缀合抗小鼠IgG二抗(Jackson’s Laboratories)的辣根过氧化物酶室温孵育。随后检测信号，使用增强的化学发光，接着暴露于Hyperfilm ECL(Amersham)。带强度通过光密度法定量，使用BioRad GS-800校准的扫描光密度计和多分析软件(BioRad)。

[0110] 如图8和9所示，苔藓抑制素-1引起强力的反应，证明PKC的活化。应注意PKC 的活化在传递30分钟后容易检测，接着用仅0.1nM的苔藓抑制素-1的剂量。

[0111] 考虑关于APP代谢的数据和其副产物的作用也是有趣的。研究证明PKC活化增加非促淀粉样变(可溶性APP，分泌酶的假定产物)相对促淀粉样变(Aβ1-40和/或Aβ1-42)分泌片段的比例量(Buxbaum等，1990；Gillespie等，1992；Selkoe，1994)。不想受此理论约束，推测具低PKC的AD细胞的sAPP分泌受损和/或变淀粉样变片段的比例增加。确实有证据表明，一些AD细胞系表现出PKC缺陷和sAPP分泌受损(Bergammaschi等，+1995；Govoni等，1996)。此外，β-淀粉样蛋白显示在成纤维细胞中诱导AD-类似K 通道缺+
陷(Etcheberrigaray等，1994)和在培养的神经元中阻断K 电流(Good等，1996)。因此，我们提出一种机制联系，即同工酶-特异PKC缺陷可能导致异常APP加工，在其它可能的有+
害作用中改变K 通道功能。最近的初步数据也提示也许β-淀粉样蛋白以不同循环方式依次引起PKC减少(Favit等，1997)。

[0112] 总之，数据提示上调PKC功能靶向特异同工酶的策略增加sAPP生成。这些研究和这种成纤维细胞模型能扩展并用作工具以监控改变潜在根本病理过程的化合物(例如苔2+
藓抑制素)效果。此外，本领域普通技术人员知道如何通过Ca 成像和电生理学进一步测试这些样品。这类化合物随后能用作合理设计此疾病药剂的基础。

[0113] 实施例II：行为研究

[0114] Morris水迷宫范式用于研究苔藓抑制素1在学习和记忆中的效果。220-250g重的Wistar白化病大鼠(n＝20)室内住1周，可自由获得食物和水。不锈钢套管置于各大鼠两侧，遵循前述过程(49)。所有动物在任何进一步实验前有1周恢复期。随后，动物随机分配到实验组和对照组。治疗和训练前至少24小时，所有动物预暴露于MWM实验环境，这是通过将它们置于水中并允许游泳120秒。训练遵循标准过程(49)且由连续4天的每天2次试验组成。在训练试验1和5前约30分钟，治疗动物接受(i.o.v.)1μl/位点的2μM苔藓抑制素1溶液。对照组接受相同体积的单独载体，方案相同。第5天，取出平台并进行保持力测试。动物移动和逃脱潜伏用自动追踪系统纪录。测量学习为试验间逃脱潜伏期的减少，治疗动物明显较低。测量记忆获得为相关象限中花费的时间(第5天)。与假注射动物相比，治疗动物中的记忆或保持显著提高(见图3到4(a)-4(c))。苔藓抑制素-1治疗的大鼠显示认知在2天治疗内比对照大鼠改善(见图3)。苔藓抑制素-1能以改进认知的浓度使用，比用于治疗肿瘤的浓度低300到300,000倍。上面的例子进一步显示通过施用苔藓抑制素-1，与其它非患病受试者相比认知能力在非患病受试者中改善。

[0115] 由于前面进行的安全性、毒理学和II期临床癌症研究，可断定使用PKC激活剂特别是苔藓抑制素-1是安全的，能加快AD治疗/认知增强的II期研究。此外，苔藓抑制素-1的亲脂性质使血脑屏障转运增加。本发明允许静脉内、口服、心室内和其它已知的施用方法。

[0116] sAPP分泌实验、PKC活化实验和动物行为实验的测试显示sAPP分泌的增加跟随PKC活化增加且导致动物行为研究中的认知改善。

[0117] 实施例III：转基因动物和体内研究

[0118] 携带V717I突变的转基因小鼠从约3周龄(断奶后)用BL处理(1mg/kg，i.p.；每日)17周(n＝4)。对照组(n＝4)仅接受载体(吐温20 1％、DMSO 25％、74％ PBS)。另一个实验组由治疗7周的5-6个月龄动物组成。这些动物的亚组用BL 1mg/kg，每日(n＝5)；BL 10mg/kg，每日(n＝3；由于2只死亡)；BL 10mg/kg，每周(n＝4；1只死亡)；LQ12
10mg/kg，每日(n＝5)；LQ12 10mg/kg，每周(n＝5)处理。另外5只动物接受相同时段的单独载体。治疗完成后，动物根据K.U.L.(比利时)指南安乐死。取出脑并制备用于生化分析APP种类。

[0119] APP tg小鼠脑中APP加工的生化分析

[0120] 免疫印迹分析。Dewachter等已描述生化分析APP代谢的中间物(《老化通过不同于突变早老素的机制在老APP/V717I转基因小鼠脑中增加淀粉样肽和引起淀粉样斑》(Aging increased amyloid peptide and cacused amyloid plaques in brain of oldAPP/V717I transgenic mice by a different mechanism than mutant presenilin1).JNeurosci.2000；20：6452-8.)。简要地，脑在6.5体积的冰冷缓冲液中匀浆，缓冲液含20mM Tris-HCl，pH8.5和蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Darmstadt，Germany)。以135,000xg 4℃离心1小时后，以200,000xg再次离心上清2小时，然后通过特定ELISA分析可溶性淀粉样肽。来自首次离心的沉淀重悬于TBS，TBS含2％TritonX-100、2％Nonidet P40和蛋白酶抑制剂，以100,000xg 4℃离心1小时。此蛋白部分用于分析膜结合APP。膜结合APP的蛋白质印迹在此含膜结合蛋白的蛋白部分进行，用单克隆抗体8E5。通过蛋白质印迹分析首次离心的上清检测总分泌的APP和α-分泌酶切割分泌的APP-α，分别用单克隆抗体8E5和单克隆抗体JRF14。蛋白在样品缓冲液中变性和还原，缓冲液含2％终浓度的SDS和1％2-ME，且在8％TRIS甘氨酸凝胶(Novex，San Deigo，CA)上分离。适当二抗孵育后，所有蛋白质印迹用ECL检测系统显影并照相记录。应用一系列稀释样品可定量。光密度扫描胶片和标准化用 有平台的光密度扫描器和专用分析和测量软件进行(Image Master；Pharmacia，Uppsala，Sweden)。

[0121] 淀粉样肽的ELISA。蛋白提取物应用于反相柱(C18-Sep-填充柱体；WaterCorporation，Milford，MA)且用增加浓度的乙腈(5、25和50％)洗，乙腈含0.1％三氟醋酸。最后部分包含淀粉样肽并过夜真空干燥和溶解用于ELISA测量。用于人Aβ40和Aβ42肽的夹心ELISA分别用捕获抗血清JRF/cAβ40/10和21F12进行，它们分别用单克隆抗体JRFcAβtot/14hrpo和3D6显影(Vanderstrichele H，VanKcrschaver E，Hcsc C，Davidsson P，Buyse MA，Andrcansen N，Minthon L，WallinA，Blcnnow K，Vanmcchelen E.《脑脊髓液和血浆中β-淀粉样蛋白(1-42)测量的标准化》(Standardization of measurements of beta-amyloid(1-42)in cerebrospinalfluid and plasma)Amyloid
2000；7：245-258)。

[0122] 在所有动物中进行标准的一般健康评估和户外(open field)评估，然后是生化评估。此外，设计半定量特定记分以测量注射后的腹部收缩(+＝虚弱，≤2分钟；++：强，≥分钟；+++：很强，≥1.2分钟)。

[0123] 实施例IV：转基因动物和用苔藓抑制素的体内研究

[0124] 使用类似过程/测试和操作的第2个转基因研究用双重转基因小鼠进行，小鼠携带V717I突变和早老素(PS1)突变，引起淀粉样形成加速，有下列主要区别。使用约40只小鼠，包括治疗和对照。治疗在约3周龄开始且由用苔藓抑制素-1的一周三次40μg/kg.i.p.治疗组成。对照给予单独载体。治疗连续约7个月，然后非治疗动物的发病率迫使实验终止(见图10)。尽管治疗和非治疗动物间的行为差异用水测试不显著(见图11)，治疗动物证明在可溶性Aβ40(见图12)和可溶性Aβ42(见图13)减少。另外，治疗小鼠证明总APP量总体较低，如图14所示，其中硫黄素S染色显示斑上样百分比较对照降低。

[0125] 上面实验的讨论

[0126] sAPPα分泌。AD细胞系AG06848用0.1nM苔藓抑制素处理3小时后，与所有其它情况相比sAPPα的分泌显著增加，总ANOVA，p＜0.0001(图1(a)，实心柱)。此效果也显著高于另一种PKC激活剂BL，BL以相同(0.1nM)浓度使用(p＜0.01，Tukey后检验)。BL0.1nM对分泌没有实际效果且它与单独载体没有差别。用100nM PKC阻断剂星形孢菌素预处理去除0.1nM苔藓抑制素的作用(图1A，最右面的柱)。也使用来 自年龄匹配对照的
2个细胞系。在这些细胞系(汇集)中，苔藓抑制素(0.1nM)也显著(与单独DMSO相比，p＜0.05，Tukey)增强sAPPα的分泌，但程度明显低于在AD细胞系中(图1A，阴线柱；p＜0.05，Tukey)。时程实验(图1(b)，插入)显示sAPPα分泌在0.1nM苔藓抑制素培养
15分钟后显著增加。在30和60分钟时观察到递增和成比例增加。在分泌的APPα量的方面，培养段2和3小时与60分钟培养无显著差异。0.01nM的较低浓度苔藓抑制素仅在60分钟培养后产生增强的APPα分泌的提高。然而，低浓度效果与2和3小时培养的较高浓度(0.1nM苔藓抑制素)难区分(图1(b))。描述不同实验条件和细胞系下sAPPα分泌的代表性免疫印迹示于图1(c)。

[0127] PKC转位：α同工酶的胞质和膜结合水平在0.1和0.01nM苔藓抑制素培养(不同时间点)后确定。在PKCα-同工酶的膜结合成分中相对增加(与单独DMSO相比)，如微粒/可溶性(P/S)免疫反应性比例所测。此增加最一致且在30分钟培养后显著不同于单独DMSO(p＝0.411；t-检验，双尾)。P/S比例递减，但即使培养180分钟后仍保持高于(虽然统计上不显著)单独DMSO(图5a)。短期培养(5分钟)不诱导一致或显著不同于单独DMSO的转位(未显示)。0.01nM苔藓抑制素的效果明显少得多并缓慢，120分钟培养时P/S比例值最大。其它PKC同工酶的转位水平在0.1nM苔藓抑制素培养30分钟时评估。用ε、β和δ同工酶的特异抗体检测明显的免疫反应性(膜结合和胞质)。所有情况中的S/P比例高于单独DMSO且可与PKC-α的水平相比较(图5b)。

[0128] 行为(MWM)：接受苔藓抑制素的组的学习曲线显著快于对照组。逃脱潜伏期从早期试验中明显减少并低于试验3的对照组。象限优选测试显示2组的保持力，与对照相比，苔藓抑制素治疗组显著提高。图3-4(c)概括了这些结果。

[0129] 转基因动物：从3周龄用BL处理17周的转基因动物显示sAPP-α中显著增加和伴随在Aβ40中成比例减少(图6(a)-(b))。Aβ42、APP膜结合和总分泌sAPP(sAPPα+sAPPβ)的量无差异。动物没有表现出一般健康差异且2组的重量增加类似。注射引起可变的腹部收缩(可逆)，2组中频率相似。BL-处理组的强度有些提高(数据未显示)。此外，BL处理的动物显示在测试分数中增加，没有达到统计显著性(未显示)。

[0130] 治疗动物在生命后期(6个月龄大)和较短阶段(约7周)没有显示APP种类方面的任何剧烈变化。然而，一般趋势(小变化)与较长期治疗(前面部分)所述的方面相同。BL 10mg/kg(每日和每周)处理动物中的sAPPα稍增加，LQ12 10mg/kg，每日处理动物中也如此(图7(b)，实心柱)。BL 1mg/kg(每日)和LQ12 10mg/kg(每周)没有效果(图5A，模式柱)。BL(n＝5)和LQ12(n＝5)处理动物中观察到Aβ40中稍增加，BL和LQ12 均为10mg/kg，每周(图7(b)，实心柱)。通过治疗，Aβ42中没有显著变化。类似地，总可溶性APP和膜结合APP无显著改变。注射时也在较老动物中观察到腹部收缩和后腿无力(可逆)。它们似乎与剂量相关，但没有清楚系统取代更精确评估。一般健康和重量也正常。一些(2-3只)动物在实验过程中死亡(总体的7.8％)，原因似乎不涉及治疗。户外测试中无差异(未显示)。

[0131] 然而，苔藓抑制素-1处理显示Aβ40、Aβ42和总APP中的显著变化(见图12-14)。另外，苔藓抑制素-1处理的动物证明寿命百分比随着时间更高(见图10)。

[0132] 这些结果证明PKC在AD病理生理学中的作用。这些结果进一步证明有普通APP库。因此，1种酶途径的增加导致可供选择的酶的底物更少。在此情况中，促淀粉样变和毒性片段(Aβ40)的减少是通过增加非致病α-分泌酶加工APP来实现。治疗和未治疗动物间的总分泌APP(α+β产物)无差异，这与解释一致并确认解释。显然sAPPα增加不是总APP提高的结果(或增加表达)，因为2组中的膜结合APP是类似的。

[0133] 重要的是注意到在生命早期开始治疗和治疗段较长的动物中观察到最显著的“有益”作用。这提示防止毒性片段的长期效果应是治疗的重要目标。如较老动物中所得结果提示，在生命后期和疾病进程后期(即使没有临床表现)干扰对防止毒性片段损害的作用小得多。同样重要的是提到此特定转基因模型首次引起生化改变，接着是认知缺陷，随后更后面是淀粉样沉积和斑。与体外研究一致，此序列显示在任何显著沉积发生前，淀粉样种类可能有害(假定以可溶性形式)。

[0134] 结果显示苔藓抑制素施用(i.o.v.)后，正常大鼠在MWM任务中的表现改善，证明PKC活化能引起认知增强，作为附加的治疗效果。另外，分泌APP本身可改进正常和健忘小鼠的记忆。这些实验和模型证明PKC调节特别是通过苔藓抑制素-1，可使sAPP增加和/或记忆改善。它们也证明包括PKC激活剂的方案能用于防止毒性片段的积累和预防记忆下降。