与人胰腺癌相关的基因和多肽

摘要

本申请提供了一种新的人基因C1958V1或C1958V2，与相应非癌组织相比，其在胰腺癌中的表达显著提高。该基因和该基因编码的多肽可以例如在诊断胰腺癌中使用，作为靶分子或开发抵抗疾病的药物。

权利要求

1.一种基本纯的多肽，选自：

(a)如氨基酸序列SEQ ID NO：2所示的多肽；

(b)多肽C1958-myc-his，其中C1958如氨基酸序列SEQ ID NO：2所示。

2.一种编码权利要求1所述多肽的分离的多核苷酸。

3.一种含有权利要求2所述多核苷酸的载体。

4.一种含有权利要求2所述多核苷酸或权利要求3所述载体的宿主细胞。

5.一种制备权利要求1所述多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养权利要求4所述的宿主细胞；

(b)使宿主细胞表达所述多肽；和

(c)收集表达的多肽。

6.与权利要求1所述多肽特异结合的单克隆抗体。

7.小型干扰RNA，其中有意义链选自作为靶序列的由如核苷酸序列SEQ ID NO：

25，26或28所示核苷酸组成的群组。

8.一种用于检测胰腺癌细胞的诊断制剂，所述制剂用于测定获自患者的胰腺组织中编码氨基酸序列SEQ ID NO：2的基因的表达水平，其中所述诊断制剂包含如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸的探针或引物，或者如SEQ ID NO：2所示的多肽的抗体。

9.一种筛选治疗胰腺癌的候选化合物的体外方法，所述方法包括以下步骤：(a)将待测化合物与如SEQ ID NO：2的氨基酸序列所示的多肽接触；

(b)测定多肽和待测化合物的结合活性；和(c)选出与多肽结合的化合物。

10.一种筛选治疗胰腺癌的化合物的体外方法，所述方法包括以下步骤：(a)将候选化合物与表达多核苷酸的细胞接触，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；和(b)与待测化合物不存在时测定的表达水平相比，选出降低多核苷酸表达水平的化合物。

11.权利要求10所述的方法，其中所述细胞是胰腺癌细胞。

12.一种筛选治疗胰腺癌的化合物的体外方法，所述方法包括以下步骤：(a)将待测化合物与如SEQ ID NO：2的氨基酸序列所示的多肽接触；

(b)测定步骤(a)所述多肽的生物学活性；和(c)与待测化合物不存在时测定的生物学活性相比，选出抑制该多肽生物学活性的化合物。

13.权利要求12所述的方法，其中所述生物学活性是细胞增殖活性。

14.一种治疗胰腺癌的组合物，所述组合物含有药学有效量的作为活性成分的小型干扰RNA，和药学上可接受的载体，其中所述小型干扰RNA的有意义链由作为靶序列的如SEQ ID NO：25，26和28核苷酸序列所示的核苷酸组成的群组。

15.小型干扰RNA用于制备治疗胰腺癌的药物组合物的用途，其中其有意义链选自由作为靶序列的如SEQ ID NO：25，26和28核苷酸序列所示的核苷酸组成的群组。

说明书

与人胰腺癌相关的基因和多肽

[0001] 本发明申请涉及2002年9月30日提交的USSN 60/414,872和2003年2月28日提交的USSN 60/450,889，其在此引入以供参考。

技术领域

[0002] 本发明涉及生物化学领域，特别是癌症研究领域。 具体地说，本发明涉及参与细胞增殖机制的新基因C1958V1和C1958V2以及该基因编码的多肽。本发明的基因和多肽可以在诊断细胞增殖性疾病时使用，并作为开发针对该疾病的靶分子。

背景技术

[0003] 胰腺癌患者的死亡率比其他任何类型的恶性肿瘤的死亡率都要更糟，5年生存率仅为4％(Greenlee等，2001)。 此恶性瘤的不良愈后效果反应出早期诊断的艰难和现有疗法的治疗效果一般都较差(DiMagno等，1999；Greenlee等，2001)。 特别是无法获得在早期和潜在治疗期用于临床检测该疾病的肿瘤标记物。 外科切除术是目前唯一的可行疗法，但那些诊断可实施外科切除的患者占此癌症患者的少于20％(DiMagno等，1999；Klinkenbijl等，1999)。内镜超声(EUS)、内镜逆行胆管胰管造影术(ERCP)和螺旋(spiral)CT可用于筛选具有家族性胰腺癌危险的个体(Brentnall等，1999)，但从时间和筛选每个无症状个体的成本效益上来讲，这些方法都是不实际的。 因此，必须开发对胰腺癌敏感且特异的肿瘤标记物。

[0004] 几乎所有的晚期患者都无法医治。 为了克服此情况，一些临床试验已经尝试在分子技术的基础上建立治疗策略。 所述试验包括例如MMP抑制剂、抑制Ras法尼基转移酶的药物和基于抗体的方法(Hao和Rowinsky，2002；Laheru等，2001；Rosenberg，2000)。 但是这些试验对此疾病并没有明显的效果。

[0005] cDNA芯片技术已经能获得正常和恶性细胞中基因表达的全面图谱，并可对恶性和相应正常细胞中的基因表达进行比较(Okabe等，Cancer Res61：2129-37(2001)；Kitahara 等，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin 等，Oncogene 21：4120-8(2002)；
Hasegawa等，Cancer Res 62：7012-7(2002))。 该方法能揭示癌细胞的复杂特性，并帮助理解致癌机理。 肿瘤中失调基因的鉴定能使个体癌症的诊断更精确和正确，并能开发出新的治疗靶标(Bienz和Clevers，Cell 103：311-20(2000))。 为了从基因组角度揭示肿瘤潜在机理，发现诊断用靶分子和开发新的治疗性药物，本发明已经利用23040个基因的cDNA芯片对肿瘤细胞的表达谱进行了分析(Okabe等，Cancer Res61：2129-37(2001)；
Kitahara 等，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin 等，Oncogene 21：4120-8(2002)；
Hasegawa等，Cancer Res 62：7012-7(2002))。

[0006] 意欲揭示致癌机理的研究已经促进了抗肿瘤剂分子靶的鉴定。 通过分析肝细胞癌(HCC)的表达谱，例如在肿瘤细胞中检测到VANGL1基因的频繁上调，说明用反义寡核苷酸抑制该基因的表达能明显地降低HCC细胞的生长并诱导凋亡细胞死亡(Yagyu等，2002)。 此外，利用相同的基因组宽度(genome-wide)cDNA芯片(microarray)已经分离出了许多参与结肠内肿瘤发生的其他基因，如AF17(Lin等，2001)，AXUD1(Ishiguro等，
2001)，HELAD1(Ishiguro等，2002)，ENC1(Fujita等，2002)和APCDD1(Takahashi等，
2002)。 这些基因的表达水平与T-细胞因子/淋巴增强结合因子(Tcf-LEF)转录复合体的活性有关，并在结肠癌细胞中显著提高。 此外，最初用来抑制与Ras相关的生长信号通路的法尼基转移酶抑制剂(FTIs)，其活性由转译后法尼基化决定，能有效治疗动物模型中的Ras依赖性肿瘤(He等，Cell 99：335-45(1999))。 使用组合药物或抗肿瘤药物和抗HER2单克隆抗体，曲妥珠单抗(trastuzumab)已经能使人临床试验拮抗原致癌基因受体HER2/neu；并获得了改善的临床疗效，使乳腺癌患者全部存活(Lin等，Cancer Res 61：
6345-9(2001))。酪氨酸激酶抑制剂STI-571，其能选择性地使bcr-abl融合蛋白失活，该抑制剂已开发用于治疗慢性骨髓性白血病，其中bcr-abl酪氨酸激酶的基本活性在白细胞转化过程中起关键作用。 将此类型的试剂设计为抑制特定基因产物的致癌活性(Fujita等，Cancer Res 61：7722-6(2001))。 因此，一般在瘤细胞中上调的基因产物可以作为开发新抗癌试剂的潜在靶标。

[0007] 已经证明CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)能识别衍生自存在于MHC I类分子和裂解肿瘤细胞中肿瘤相关抗原(TAAs)的表位肽。 自从MAGE家族成为发现的第一个TAAs实例以来，已经利用免疫学方法发现了许多的其它TAAs(Boon，Int J Cancer 54：177-80(1993)；Boon和van der Bruggen，J Exp Med 183：725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 254：1643-7(1991)；Brichard等，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180：347-52(1994))。 现在，某些已经发现的TAAs正处于作为免疫治疗靶标的临床开发阶段。 到目前为止，已发现的TAAs包括MAGE(van der Bruggen等，Science 254：1643-7(1991))，gp100(Kawakami 等，J Exp Med 180：347-52(1994))，SART(Shichijo等，J Exp Med 187：277-88(1998))，和NY-ESO-1(Chen等，Proc Natl Acad Sci USA 94：1914-8(1997))。另一方面，已证实在肿瘤细胞中特异性过表达的基因产物可以作为诱导细胞免疫应答的靶标被识别。所述基因产物包括p53(Umano等，Brit J Cancer
84：1052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka 等，Brit J Cancer 84：94-9(2001))，CEA(Nukaya等，Int J Cancer 80：92-7(1999))等。

[0008] 尽管在TAAs的基础和临床研究方面取得了重大进步(Rosenbeg等，Nature Med 4：321-7(1998)；Mukherji 等，Proc Natl Acad Sci USA 92：8078-82(1995)；Hu等，Cancer Res 56：2479-83(1996))，仅有少量的候选TAAs是可获得的。 在肿瘤细胞中大量表达，同时其表达受到癌症细胞的限制的TAAs将可能作为免疫治疗靶标的候选物。 另外，预期对诱导有效的和特异性抗肿瘤免疫应答的新TAAs的鉴定可以增强肽疫苗策略在各种类型的癌症中的临床效用(Boon和can der Bruggen，J Exp Med 183：725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 254：1643-7(1991)；Brichard等，J Exp Med
178：489-95(1993)；Kawakami 等，J Exp Med 180：347-52(1994)；Shichijo 等，J Exp Med187：277-88(1998)；Chen 等，Proc Natl Acad Sci USA 94：1914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 88：1442-5(1996)；Butterfield 等，Cancer Res 59：3134-42(1999)；
Vissers 等，Cancer Res 59：5554-9(1999)；van der Burg 等，J Immunol156：
3308-14(1996)；Tanaka 等，Cancer Res 57：4465-8(1997)；Fujie 等，Int J Cancer 80：
169-72(1999)；Kikuchi 等，Int J Cancer 81：459-66(1999)；Oiso 等，Int J Cancer 81：
387-94(1999))。

[0009] 已经多次报道了：在51Cr-释放分析中，肽刺激的来自某些健康捐献者的外周血单核细胞(PBMCs)能引起有效量的IFN-γ应答该肽，但很少会在HLA-A24或-A0201限制性方式中表现出对抗肿瘤细胞的细胞毒性(Kawano等，Cancer Res 60：
3550-8(2000)；Nishizaka等，Cancer Res 60：4830-7(2000)；Tamura等，Jpn J Cancer Res
92：762-7(2001))。 但是，在日本人和白种人(Caucasion)中，HLA-A24和HLA-A0201都是一种常见的HLA等位基因(Date等，Tissue antigens 47：93-101(1996)；Kondo等，J Immunol 155：4307-12(1995)；Kubo等，J Immunol 152：3913-24(1994)；Imanishi等，Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams等，Tissue antigen 49：129(1997))。 因此，由这些HLAs呈递的癌症抗原性肽尤其在日本人和白种人中治疗癌症是有利的。 另外，通常体外低亲合性CTL的诱导获自使用高浓度的肽，在抗原呈递细胞(APCs)中产生高水平的特异性肽/MHC络合物，该络合物将能有效地激活这些CTL(Alexander-Miller等，Proc Natl Acad Sci USA 93：4102-7(1996))。

[0010] 发明概述

[0011] 本发明的目的是提供参与胰腺癌细胞增殖机制的新蛋白质和编码该蛋白质的基因，以及制备和在诊断和治疗胰腺癌中利用该蛋白质和基因的方法。

[0012] 为了揭示胰腺致癌机制并鉴定出新的诊断标记物和/或治疗该肿瘤的药物靶标，本发明利用含有23040个基因的全基因组(genome-wide)cDNA芯片对胰腺致癌过程中的基因表达谱进行了分析。 从药理学角度看，抑制致癌信号比激活肿瘤抑制效应在实践中更易行。 因此，本发明人对胰腺致癌过程中上调的基因进行了研究。

[0013] 从这些上调基因中鉴定出了一种新的人基因C1958，该基因在能获得表达数据的胰腺癌例中明显上调70％。 通过对由胰腺癌细胞系Capan-1制成的cDNA文库进行筛选，本发明人发现了三个变异转录物。通过Northern印迹分析，这三个变体中编码76个氨基酸的蛋白质的C1958V1和编码20个氨基酸的蛋白质的C1958V2在胰腺癌细胞系中特异性表达。 另外，免疫组织化学染色显示此C1958V1产物位于COS7细胞的胞质器官上。此外，C1958V1翻译为比由Western印迹分析预测的基因产物尺寸更大的基因产物，说明它可能是通过翻译后修饰产生的。

[0014] 另外，由于转染了C1958V1或C1958V2的特异性反义S-寡核苷酸或小型干扰性RNAs使得C1958V1或C1958V2的表达降低，而抑制了胰腺癌细胞的生长。 许多抗癌药物，如DNA和/或RNA合成抑制剂，代谢抑制剂，和DNA嵌入剂不仅对癌细胞有毒，而且对正常的生长细胞也有毒。 但由于基因的正常表达主要在胎盘中观察到，而很少在肝、甲状腺、气管或骨髓中观察到的事实，抑制C1958V1或C1958V2表达的试剂可能并不会对其他器官产生不利影响，因此这些试剂对于治疗癌症来说就是非常重要的。

[0015] 因此，本发明提供了分离的新基因，C1958V1和C1958V2，其为癌症诊断标记物的候选物而且可能作为开发诊断新策略的潜在靶标和有效的抗癌剂。 进一步，本发明提供了由这些基因编码的多肽，以及所述多肽的制备和用途。 更具体地，本发明提供如下：

[0016] 本申请提供了新的人多肽，C1958V1和C1958V2或其功能等同物，该多肽促进细胞增殖并在细胞增殖性疾病如胰腺癌中上调。

[0017] 在优选的实施方案中，C1958V1多肽包括与推测蛋白质[大鼠(Rattusnorvegicus)](XP_226536)有约59％同一性的推测的76个氨基酸的蛋白质。 C1958V1由SEQ ID NO：1的开放阅读框编码。 C1958V1多肽优选包括显示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本申请还提供了至少由部分C1958V1多核苷酸序列编码的分离蛋白质，或与显示于SEQ ID NO：1的序列至少15％，优选至少25％，或更优选60％，或更优选70％或更优选90％互补的多核苷酸序列。

[0018] 另一方面，在优选的实施方案中，C1958V2多肽包括SEQ ID NO：3的开放阅读框编码的推测的20个氨基酸的蛋白质。 C1958V2多肽优选包括显示于SEQ ID NO：4的氨基酸序列。本申请还提供了至少由部分C1958V2多核苷酸序列编码的分离蛋白质，或与显示于SEQ ID NO：3的序列至少15％，优选至少25％，或更优选60％，或更优选70％或更优选90％互补的多核苷酸序列。

[0019] 本发明进一步提供了新的人基因，C1958V1和C1958V2，与相应正常胰腺细胞相比其在大多数胰腺癌中的表达显著提高。 分离的C1958V1基因包括如SEQ ID NO：1所描述的多核苷酸序列。 更具体地，C1958V1 cDNA包括含有228个核苷酸(SEQ ID NO：1)的开放阅读框的881个核苷酸。本发明进一步包括与显示于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列杂交或与显示于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列至少15％，优选至少25％，或更优选60％，或更优选70％或更优选90％互补，并且编码C1958V1蛋白或其功能等同物的多核苷酸。 所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO：1的简并序列和等位突变体。 另一方面，分离的C1958V2基因包括如SEQ ID NO：3所描述的多核苷酸序列。 更具体地，C1958V2 cDNA包括含有60个核苷酸(SEQ ID NO：3)的开放阅读框的893个核苷酸。本发明进一步包括与显示于SEQ ID NO：3的多核苷酸序列杂交或与显示于SEQ ID NO：3的多核苷酸序列至少15％，优选至少25％，或更优选60％，或更优选70％或更优选90％互补，并且编码C1958V2蛋白或其功能等同物的多核苷酸。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO：3的简并序列和等位突变体。

[0020] 在本文中，分离的基因是结构与天然存在的多核苷酸结构不同的多核苷酸或与长度大于3个独立基因的天然存在的基因组多核苷酸的任何片段的结构不同的多核苷酸。 因此，该术语包括，例如(a)具有在天然存在的生物体基因组内天然存在的基因组DNA分子部分序列的DNA；(b)以使所得分子不同于任何天然存在的载体或基因组DNA的方式，插入载体中或插入原核生物或真核生物基因组DNA中的多核苷酸；(c)分离的分子，如cDNA、基因组片段、聚合酶链式反应(PCR)制备的片段、或限制性片段；和(d)重组的核苷酸序列也就是部分杂合基因，即编码融合多肽的基因。

[0021] 因此，一方面，本发明提供了编码本文所述多肽或其片段的分离多核苷酸。 分离的多肽优选包括与SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列有至少60％同一性的核苷酸序列。 分离的多肽更优选包括与SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高同一性的核苷酸序列。 一旦分离的多核苷酸比参考序列如SEQ ID NO：1或3的长度长或者与参考序列如SEQ ID NO：1或3的长度相等，就用全长参考序列进行比较。
分离的多核苷酸比参考序列如SEQ ID NO：1或3的长度短，就用相同长度的部分参考序列(不包括任何同源性计算所需的环)进行比较。

[0022] 本发明还提供了通过用编码C1958V1或C1958V2蛋白的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞制备蛋白和表达所述多核苷酸序列的方法。 此外，本发明还提供了含有编码C1958V1或C1958V2蛋白的核苷酸序列的载体，和含有编码C1958V1或C1958V2蛋白的多核苷酸的宿主细胞。 所述载体和宿主细胞可用于制备C1958V1或C1958V2蛋白。

[0023] 本申请还提供了识别C1958V1或C1958V2蛋白的抗体。在某种程度上，还提供了C1958V1或C1958V2基因的反义多核苷酸(例如反义DNA)、核糖酶和siRNA(小型干扰RNA)。

[0024] 本发明进一步提供了诊断细胞增殖疾病的方法，包括检测抽样生物样品中的基因表达水平，将C1958V1或C1958V2基因的表达水平与正常样品中的表达水平进行比较，并将样品中C1958V1或C1958V2基因的高表达水平定义为患有细胞增殖疾病如癌症。 适合用C1958V1或C1958V2的表达水平诊断的疾病是胰腺癌。

[0025] 此外，提供了筛选治疗细胞增殖性疾病的方法。 该方法包括将C1958V1或C1958V2多肽与待测化合物接触，选出与C1958V1或C1958V2多肽结合的待测化合物。

[0026] 本发明还提供了筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，其中该方法包括将C1958V1或C1958V2多肽与待测化合物接触，选出抑制C1958V1或C1958V2多肽表达水平或生物活性的待测化合物。

[0027] 本申请还提供了治疗细胞增殖性疾病如癌症的药物组合物。 该药物组合物可以是例如抗癌剂。可以将该药物组合物描述为至少是部分C1958V1或C1958V2多核苷酸序列的反义S-寡核苷酸或siRNA。适合的siRNA由包括选自作为靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO：25，26或28的一组核苷酸组成。由包括作为靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO：25，26或28的一组核苷酸组成的C1958V1 siRNA适用于治疗胰腺癌。 该药物组合物还可以是那些包括用本发明筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法选出的化合物的药物组合物。

[0028] 该药物组合物的理想作用途径是抑制癌细胞的生长。 可以将该药物组合物施给包括人和家养的哺乳动物在内的哺乳动物。

[0029] 本发明还提供了利用本发明提供的药物组合物治疗细胞增殖性疾病的方法。

[0030] 此外，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用C1958V1或C1958V2多肽的步骤。期望通过施用C1958V1或C1958V2多肽来诱导抗肿瘤免疫性。因此，本发明还提供了诱导抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括施用C1958V1或C1958V2多肽，以及治疗或预防癌症的药物组合物的步骤，其中所述组合物含有C1958V1或C1958V2多肽。

[0031] 应该理解前面的发明概述和随后的详细描述均为优选的实施方案，其并不限制本发明或本发明的其它可选实施方案。

[0032] 附图的简要描述

[0033] 图1(a)描述了C1958的Cy5/Cy3信号强度比，其结果是在来自18名胰腺癌患者的肿瘤细胞中通过芯片分析测出的。图1(b)描述了在来自胰腺癌患者的肿瘤细胞(PC1，PC4，PC5，PC6，PC7，PC8，PC13，PC14，PC15，PC16，PC17，PC18)和胰腺癌细胞系(Panc-1，Aspc-1，Miapaca-2，Capan-1和Capan-2)中C1958表达的半定量RT-PCR分析。

[0034] 图2描述了C1958的3个不同转录变体的基因组结构。 黑色箭头表示终止密码子，空白箭头代表起始密码子。 括号内数字说明各外显子的长度。

[0035] 图3描述了在各种人组织(a-1，a-2，a-3)和胰腺癌细胞系(b)中C1958转录物的Northern印迹分析。 分子大小显示在左侧。

[0036] 图4(a)描述了在COS7细胞中，Myc-标记的C1958V1的亚细胞定位。图4(b)描述了利用Western印迹分析，C1958V1变体在哺乳动物细胞中的表达。箭头显示C1958V1特异性条带。

[0037] 图5描述了供在胰腺癌细胞中降低C1958V1表达的小型干扰RNAs(siRNAs)的生长抑制效力。 图5(a)描述了半定量RT-PCR分析，该分析显示在将siRNAs导入KLM-1细胞后，在含有新霉素的选择性培养基中培养20天后，胰腺癌细胞(KLM-1)中C1958V1内源表达的抑制。 β-肌动蛋白(ACTB)作为内部对照。 图5(b)说明了在用psiU6BX-C1958V1或psiU6BX-EGFP治疗后，KLM-1细胞的Gimza染色结果的照片。图
5(c)描述了用psiU6BX-C1958V1或psiU6BX-EGFP转染的KLM-1细胞的MTT分析结果。
图5(d)说明了在用psiU6BX-C1958V1或psiU6BX-EGFP治疗后，PK59细胞的Gimza染
色结果的照片。 图5(e)描述了用psiU6BX-C1958V1或psiU6BX-EGFP转染的PK59细胞的MTT分析结果。 该实验进行了5次。

[0038] 发明详述

[0039] 除非另外特别说明，本文中所用″a″，″an″和″the″意为“至少一个”。

[0040] 本申请鉴定出了新的人基因C1958V1和C1958V2，相比于相应无肿瘤组织，其表达在胰腺癌中显著提高。C1958V1 cDNA由含有SEQ ID NO：1所示的228个核苷酸的开放阅读框的881个核苷酸组成。 该开放阅读框编码推测的76个氨基酸的蛋白质。 另一方面，C1958V2 cDNA由含有SEQ ID NO：3所示的60个核苷酸的开放阅读框的893个核苷酸组成。 该开放阅读框编码推测的20个氨基酸的蛋白质。

[0041] 一贯地，C1958V1或C1958V2到细胞中的外源表达可以使细胞生长增加，而用反义抗S-寡核苷酸或小型干扰RNA(siRNA)抑制C1958V1或C1958V2的表达则显著抑制癌细胞生长。此发现说明C1958V1和C1958V2赋予癌细胞致癌活性，且抑制这些蛋白的活性可能是治疗癌症的期望策略。

[0042] 本发明包括新的人基因C1958V1，该基因包括SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列以及其简并体和变体，只要它们编码C1958V1蛋白，该蛋白包括显示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其功能等同物。C1958V1多肽功能等同物的例子包括，例如与人C1958V1蛋白相应的其它生物体的同源蛋白，以及人C1958V1蛋白的变体。

[0043] 本发明包括新的人基因C1958V2，该基因包括SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列以及其简并体和变体，只要它们(to the extent)编码C1958V2蛋白，该蛋白包括显示于SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其功能等同物。 C1958V2多肽功能等同物的例子包括，例如与人C1958V2蛋白相应的其它生物体的同源蛋白，以及人C1958V2蛋白的变体。

[0044] 在本发明中，术语“功能等同物”是指目的多肽具有与C1958V1或C1958V2蛋白同样的促进细胞增殖的活性并能使癌细胞具有致癌活性。 目的多肽是否具有细胞增殖性可以通过将编码目的多肽的DNA引入表达相应多肽的细胞中，测定细胞增殖的促进或菌落形成活性的增加来确定。 所述细胞包括如NIH3T3细胞，COS7细胞。

[0045] 制备与给定蛋白功能等同的多肽的方法为本领域技术人员所熟知，该方法包括已知的诱导蛋白突变的方法。 例如，本领域技术人员可以利用定点诱变对蛋白中任何氨基酸序列诱导适当的突变来制备与人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽 (Hashimoto-Gotoh 等，Gene 152：271-5(1995)；Zoller 和 Smith，Methods Enzymol
100：468-500(1983)；Kramer 等，Nucleic Acids Res.12：9441-9456(1984)；Kramer和 Fritz，Methods Enzymol 154：350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82：
488-92(1985)；Kunkel，Methods Enzymol 85：2763-6(1988))。 也可以自然发生氨基酸突变。本发明多肽包括那些含有一个或多个氨基酸突变的人C1958V1或C1958V2蛋白的氨基酸序列的蛋白，条件是所得突变多肽与人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同。通常在所述突变体中的突变氨基酸数量为10个氨基酸或更少，优选6个氨基酸或更少，更优选
3个氨基酸和更少。

[0046] 突变或修饰的蛋白，含有某氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基经过取代、缺失、插入和/或添加的修饰氨基酸序列的蛋白已知还保存原有的生物活性(Mark等，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；Zoller 和 Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarl和等，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。

[0047] 优选将待突变的氨基酸残基突变为不同的氨基酸，且其仍保存该氨基酸侧链特性(此过程称为保守氨基酸取代)。 氨基酸侧链特性的例子是疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，和一般含有下述功能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱侧链(R，K，H)；和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。 说明：括号内字母表示氨基酸单字母符号。

[0048] 将人C1958V1或C1958V2蛋白的氨基酸序列添加一个或多个氨基酸残基的多肽的例子是含有人C1958V1或C1958V2蛋白的融合蛋白。 融合蛋白是人C1958V1或C1958V2蛋白与其它肽或蛋白融合，且其包括在本发明中。 可采用本领域所熟知的技术制备融合蛋白，如将编码本发明的C1958V1或C1958V2蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白的DNA连接，从而使其框架匹配，将融合DNA插入表达载体并在宿主中表达。 对于与本发明的蛋白融合的肽或蛋白并无限制。

[0049] 已知可用作与本发明的蛋白融合的肽包括，例如FLAG(Hopp等，Biotechnology6：1204-10(1988))，含6个His(组氨酸)残基的6xHis，10xHis，流感凝集素(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7-tag，HSV-tag，E-tag，SV40T抗原片段，lck-tag，α-微管蛋白片段，B-tag，蛋白C片段等。 可以与本发明蛋白融合的蛋白的例子包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)，流感凝集素(HA)，免疫球蛋白恒定域。 β-半乳糖苷酶，MBP(麦芽糖结合蛋白)等。

[0050] 可以通过将编码上述融合肽或蛋白的商购DNA与编码本发明的多肽的DNA融合，使制备的融合DNA表达来制备融合蛋白。

[0051] 分离功能等同多肽的本领域已知的其它方法是，例如利用杂交技术的方法(Sambrook等，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989))。本领域的技术人员可以很容易地分离出与编码人C1958V1或C1958V2蛋白(即SEQ ID NO：1或3)的全部DNA序列或部分DNA序列具有高同源性的DNA，并从分离的DNA
中分离出人C1958V1或C1958V2蛋白的功能等同多肽。 本发明的多肽包括由与编码人C1958V1或C1958V2蛋白的全部DNA序列或部分DNA序列杂交的DNA编码的多肽，
和与人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽。所述多肽包括与衍生自人的蛋白相应的哺乳动物同源物(如猴、鼠、兔和牛基因编码的多肽)。 在分离与编码人C1958V1或C1958V2蛋白的DNA高度同源的cDNA时，尤其优选使用胎盘、肝、甲状腺、导管或骨髓组织。

[0052] 分离编码与人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽的DNA的杂交条件可由本领域技术人员常规选择。例如，杂交条件如下：使用“Rapid-hyb缓冲液”(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃进行30分钟或更长时间的预杂交，加入标记探针，68℃加热1小时或更长。 例如在低严格条件下进行接下来的洗涤步骤。 低严格条件是：例如42℃，2X SSC，0.1％SDS，或优选50℃，2X SSC，0.1％SDS。 更优选使用高严格条件。 高严格条件是：例如在室温条件下用2X SSC，0.01％SDS洗涤20分钟，洗涤3次，然后在
37℃用1x SSC，0.1％SDS洗涤20分钟，洗涤3次，和在50℃用1x SSC，0.1％SDS，洗涤20分钟，洗涤2次。 然而，许多因素如温度和盐浓度会影响杂交的严格性，本领域技术人员能合适地选出获得所需严格性的因素。

[0053] 除杂交之外，可采用基因扩增法，例如聚合链式反应(PCR)，利用以蛋白编码DNA(SEQ ID NO：1或3)的序列信息为基础合成的引物，分离出与人C1958V1或C1958V2蛋白功能相同的多肽的编码DNA。

[0054] 由采用上述杂交技术或基因扩增技术分离得到的DNA编码的与人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽通常与人C1958V1或C1958V2蛋白的氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”通常是指40％的同源性或更高，优选60％或更高，更优选80％或更高，甚至更优选95％或更高。 多肽的同源性可根据“Wilbur和Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)”中的运算法则确定。

[0055] 可以采用本领域熟知的方法，以重组蛋白或天然蛋白制备本发明多肽。 重组蛋白可以通过如下方式制备：将DNA插入合适的表达载体中，其中所述DNA编码本发明的多肽(例如，含有SEQ ID NO：1或3核苷酸序列的DNA)，将该载体导入合适的宿主细胞，获得提取物，对提取物进行层析，例如利用结合有本发明蛋白对应抗体的柱子进行离子交换层析、反向层析、凝胶过滤或亲和层析，或者组合使用多于一种的前述柱子使多肽纯化。

[0056] 而且，当本发明的多肽在宿主细胞(例如动物细胞和E.coli)中以与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白融合的蛋白或添加多组氨酸的重组蛋白表达时，可以使用谷胱甘肽柱或镍柱对表达的重组蛋白进行纯化。 另外，当本发明的多肽以标记有c-myc、多组氨酸或FLAG的蛋白表达时，可分别使用c-myc、His或FLAG抗体对其进行检测和纯化。

[0057] 在对融合蛋白进行纯化后，还可以根据需要用凝血因子或Xa因子切割除去目的多肽之外的区域。

[0058] 可以采用本领域技术人员熟知的方法分离天然蛋白，例如将亲和柱与表达本发明多肽的组织或细胞的提取物接触，在所述亲和柱中结合有与后面所述C1958V1或C1958V2蛋白结合的抗体。 所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

[0059] 本发明还包括本发明多肽的部分肽。 所述部分肽含有对本发明多肽特异的氨基酸序列并至少由7个氨基酸，优选8个或更多氨基酸，更优选9个或更多氨基酸组成。可以用部分肽制备针对本发明多肽的抗体，筛选与本发明多肽结合的化合物和筛选本发明多肽的抑制剂。

[0060] 可以采用基因工程技术、已知的肽合成法，或用合适的肽酶裂解本发明多肽来制备本发明的部分多肽。 对于肽合成法，可以使用如固相合成法或液相合成法。

[0061] 另外，本发明提供了编码本发明多肽的多核苷酸。 如上所述，本发明的多核苷酸可用于体内或体外制备本发明多肽，或者在由编码本发明蛋白的基因的基因异常所致疾病的基因治疗中使用。 可以使用任何形式的本发明的多核苷酸，只要它编码本发明的多肽，包括mRNA，RNA，cDNA，基因组DNA，化学合成的多核苷酸。 本发明的多核苷酸包括含有给定核苷酸序列的DNA及其简并序列，只要获得的DNA编码本发明的多肽。

[0062] 可以采用本领域技术人员熟知的方法制备本发明的多核苷酸。 例如，本发明的多核苷酸可以如下制备获得：从表达本发明的多肽的细胞制备cDNA文库，利用本发明的DNA(如SEQ ID NO：1或3)的部分序列作为探针进行杂交。 cDNA文库可以利用，如Sambrook等，分子克隆，冷泉港出版社(1989)中所描述的方法来制备；或者使用可商购的cDNA文库。 cDNA文库还可以如下制备获得：从表达本发明多肽的细胞中提取RNA，在本发明的DNA序列(例如SEQ ID NO：1或3)的基础上合成寡核苷酸，利用该寡核苷酸作为引物进行PCR，扩增出编码本发明蛋白的cDNA。

[0063] 此外，通过对获得的cDNA的核苷酸进行测序，可以常规地测定出由cDNA编码的翻译域，并能很容易地获得本发明多肽的氨基酸序列。 另外，通过利用所得cDNA或其部分作为探针对基因组DNA文库进行筛选，可以分离出基因组DNA。

[0064] 更具体的是，可以首次从表达本发明的目的多肽的细胞、组织或器官(如胎盘、肝、甲状腺、导管或骨髓)中制备出mRNA。 可以是使用已知方法分离mRNA：例如可以利用胍超离心法(Chirgwin等，Biochemistry18：5294-9(1979))或AGPC法(Chomczynski和Sacchi，Anal Biochem162：156-9(1987))制备总RNA。此外，可以利用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等从总RNA中对mRNA进行纯化，或者利用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接对mRNA进行纯化。。

[0065] 利用逆转录酶，用所得mRNA合成cDNA。 可以使用可商购试剂盒，如AMV逆转录酶First-strand cDNA Synthesis Kit(Seikagaku Kogyo)合成cDNA。 另外，可以按照
5’-RACE法(Frohman等，Proc Natl Acad Sci USA 85：8998-9002(1988)；Belyavsky等，Nucleic Acids Res 17：2919-32(1989))合成和扩增cDNA，该方法利用本文所述引物和类似物，5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech)和聚合酶链式反应(PCR)。

[0066] 从PCR产物制得所需DNA片段，并将该片段与载体DNA连接。利用该重组载体转化大肠杆菌等，从所选菌落中获得所需重组载体。 可以利用传统方法，如双脱氧链终止法测定所需DNA的核苷酸序列。

[0067] 可以通过计算在用于表达的宿主中密码使用的频率(Grantham等，Nucleic Acids Res 9：43-74(1981))，对本发明多核苷酸的核酸序列进行设计，而使该核酸序列更有效地表达。可以采用商购试剂盒或常规方法改变本发明的多核苷酸序列。 比如，可以通过用限制性酶消化，插入合成的寡核苷酸或合适的多核苷酸片段，添加接头，或插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA，TGA或TAG)来使序列改变。

[0068] 更具体的说，本发明的多核苷酸包含含核酸序列SEQ ID NO：1或3的DNA。

[0069] 另外，本发明提供了一种多核苷酸，该多核苷酸在严谨条件下与具有SEQ ID NO：1或3的核酸序列的多核苷酸杂交，并且编码与上述本发明C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽。本领域的技术人员可以恰当地选择严谨条件。 例如，可以使用低严谨条件。 更优选使用高严谨条件。 这些条件与前面所述的条件相同。 上述杂交的DNA优选是cDNA或染色体DNA。

[0070] 本发明还提供了一种载体，其中本发明的多核苷酸插入该载体内。 本发明的载体对在宿主细胞中保持本发明的多核苷酸，尤其是DNA表达本发明的多肽是有用的。

[0071] 当大肠杆菌是宿主细胞时，载体在大肠杆菌(如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue)中扩增并大量繁殖。该载体应含有可使载体在大肠杆菌中扩增的″ori″，和用于选择转化的大肠杆菌的标记基因(例如，利用药物如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等选择的药物抗性基因)。 例如，可以使用M13系载体，pUC系载体，pBR322，pBluescript，pCR-Script等。此外，pGEM-T，pDIRECT和pT7以及上述载体还可以用于亚克隆和提取cDNA。 当用载体制备本发明的蛋白时，优选使用表达载体。 例如，能在大肠杆菌中表达的表达载体应具有前面描述的特性，从而能使载体在大肠杆菌中表达。
当用大肠杆菌如JM109，DH5α，HB101或XL1 Blue作为宿主细胞时，载体应含有启动子，例如lacZ启动子(Ward等，Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1992))，araB启动子(Better等，Science 240：1041-3(1988))，或T7启动子等，从而使所需基因在大肠杆菌中有效表达。 这样，可以用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIA表达系统”(Qiagen)，pEGFP和pET(在这种情况下，宿主细胞优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)代替上述载体。 此外，载体还可以包含适合多肽分泌的信号序列。 指导多肽分泌到大肠杆菌周质的可用信号序列是pelB信号序列(Lei等，J Bacteriol 169：4379(1987))。
将载体导入靶宿主细胞的方法包括，例如氯化钙法和电穿孔法。

[0072] 除了大肠杆菌之外，可以用例如源自哺乳动物的表达载体(如pcDNA3(Invitrogen) 和 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1990))，pEF，pCDM8)，源自昆虫细胞的表达载体(如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO
BRL)，pBacPAK8)，源自动物病毒的表达载体(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，源自植物的表达载体(如pMH1，pMH2)，源自逆转录病毒的表达载体(如pZIpneo)，源自酵母的表达载体(如“Pichia表达试剂盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)和源自枯草芽孢杆菌的表达载体(如pPL608，pKTH50)制备本发明的多肽。

[0073] 为了使载体在动物细胞如CHO，COS或NIH3T3细胞中表达，载体应含有在所述细胞中表达所需的启动子，如SV40启动子(Mulligan等，Nature277：108(1979))，MMLV-LTR启动子，EF1α启动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res 18：5322(1990))，CMV启动子等，并优选含有选择转化体的标记基因(如利用药物选择的药物抗性基因(如新霉素，G418))。 具有所述特性的已知载体的例子包括如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。

[0074] 此外，可以用本发明的方法稳定地表达基因，并同时在细胞中扩增出大量基因。例如可以将含有互补DHFR基因的载体(如pCHO I)导入CHO细胞，其中在该CHO细胞中除去了核酸合成途径，然后利用氨甲喋呤(MTX)扩增。 此外，一旦基因瞬时表达，就可以使用将含有复制起始点SV40的载体(pcD等)转化入在染色体上含有SV40 T抗原表达基因的COS细胞中的方法。

[0075] 如上获得的本发明多肽可以是从宿主细胞的内部或外部(如培养基)分离出的，并纯化为基本纯的同源多肽。 本文中所用术语对给定多肽来讲“基本纯的”是指多肽基本不含其他生物大分子。 基本纯的多肽是以干重计至少为75％(如至少80，85，95或99％)纯的多肽。 可用任何适合的常规方法测定纯度，例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。 分离和纯化多肽的方法并不限于任何特定的方法，事实上，任何常规方法都可以使用。

[0076] 例如，可以将柱层析、过滤、超虑、盐析、溶剂沉淀(solvent precipitation)、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、渗析和重结晶进行合适地选择和组合来分离并纯化多肽。

[0077] 层析的例子包括如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification和Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。 这些层析可通过液态层析进行，如HPLC和FPLC。这样，本发明提供了通过上述方法制备的高度纯化的多肽。

[0078] 本发明的多肽，在纯化前或纯化后，可用合适的蛋白修饰酶处理，从而使多肽任选地修饰或部分去除。 可用的蛋白修饰酶包括，但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酸内肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。

[0079] 本发明提供了与本发明多肽结合的抗体。 可以以任何形式利用本发明的抗体，如单克隆或多克隆抗体，所述抗体包括通过用本发明多肽免疫动物如兔而获得的抗血清、所有类型的多克隆和单克隆抗体、人抗体和通过基因重组制得的人源化抗体。

[0080] 作为可获得抗体的抗原的本发明多肽可以源自任何动物，但优选源自哺乳动物如人、小鼠或大鼠，更优选源自人。 人源多肽可以获自本文所公开的核苷酸或氨基酸序列。

[0081] -根据本发明，欲作为免疫抗原的多肽可以是完整蛋白或蛋白的部分肽。部分肽可以包括，例如本发明多肽的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。

[0082] 此处，将抗体定义为与本发明多肽全长或片段反应的蛋白。

[0083] 可以将编码本发明多肽的基因或其片段插入已知的表达载体，然后如本文所述将该载体用于转化宿主细胞。 可以采用任何常规方法从宿主细胞的外部或内部进行所需多肽或其片段的回收，随后将该多肽或其片段作为抗原使用。 另外，可以将表达多肽的完整细胞或其裂解物，或化学合成的多肽作为抗原。

[0084] 任何哺乳动物都可以用抗原免疫接种，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。 通常使用啮齿类(Rodentia)、兔类(Lagomorpha)或灵长类(primate)动物。 啮齿类动物包括如小鼠、大鼠和仓鼠。兔类动物包括如兔子。 灵长类动物包括如狭鼻亚目(Catarrhini)猴(旧大陆猴)，如食蟹猴(Macaca fascicularis)、猕猴(rhesus monkey)、阿拉伯狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzees)。

[0085] 用抗原免疫接种动物的方法为本领域所熟知。 腹膜内注射或皮下注射抗原是哺乳动物免疫接种的常规方法。 更具体地，抗原的稀释和悬浮可以使用合适量的磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水等。 如果需要的话，将抗原悬浮液与适量的常规佐剂如弗氏(Freund’s)完全佐剂混合，制成乳剂，然后施给哺乳动物。优选地，随后每4-21天进行与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原的多次给药。 还可以将适合的载体用于免疫接种。在上述免疫接种后，利用所需抗体量增加的常规方法检测血清。

[0086] 针对本发明多肽的多克隆抗体的制备可以通过从免疫动物中收集血液，该免疫动物已检出其血清中所需抗体增加，并通过采用任何常规方法从血液中分离血清来进行。 多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，而且含有多克隆抗体的级分可以分离自血清。 可以从只识别本发明多肽的级分中制得免疫球蛋白G或M，利用例如结合有本发明多肽的亲和柱，并进一步用蛋白A或蛋白G柱对此级分进行纯化。

[0087] 为了制备单克隆抗体，免疫细胞收集自用抗原免疫且如上所述对血清中所需抗体的增长水平已进行核查的哺乳动物，并进行细胞融合。 用于细胞融合的免疫细胞优选获自脾。 其它优选的与上述免疫细胞融合的亲本细胞包括，例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选具有适合用药物选择融合细胞的所需特性的骨髓瘤细胞。

[0088] 上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的融合可以按照已知方法进行，如Milstein等的方法(Galfre和Milstein，Methods Enzymol 73：3-46(1981))。

[0089] 利用细胞融合获得的杂交瘤可以通过在常规选择性培养基，如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶的培养基)中培养而选出。 通常将细胞培养物继续在HAT培养基中培养几天至几周，直至可以使除所需杂交瘤之外的所有其它细胞(未融合细胞)全部死亡。然后，用常规限度稀释法(limiting dilution)筛选并克隆产生所需抗体的杂交瘤细胞。

[0090] 除上述方法外，其中该方法用抗原免疫接种非人类动物来制备杂交瘤，可以将人淋巴细胞，如EB病毒感染的人淋巴细胞用多肽、多肽表达细胞或其体外裂解物免疫接种。然后，将免疫接种的淋巴细胞与能无限分裂的人源骨髓瘤细胞，如U266融合，从而获得制备所需人抗体的杂交瘤，即能获得与所述多肽结合的抗体(未审查的日本公开专利申请(JP-A)Sho63-17688)。

[0091] 随后，将所得杂交瘤移植至小鼠腹腔内，并抽取腹水。 所得单克隆抗体可以利用，例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或加有本发明多肽的亲和层析柱进行纯化。 本发明的抗体不但可以用于纯化和检测本发明的多肽，而且可以作为本发明多肽的拮抗剂的候选物。 此外，该抗体可以在与本发明多肽的相关疾病的抗体治疗中使用。 当将所得抗体对人体给药(抗体治疗)时，人抗体或人源化抗体是可优选的，以降低免疫原性。

[0092] 例如，可以用选自多肽、多肽表达细胞或其裂解物的抗原免疫接种含人抗体基因库的转基因动物。 然后，从该动物中收集抗体产生细胞，并将该抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤，从该杂交瘤中可以制得针对所述多肽的人抗体( 参 见 WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735 和WO96-34096)。

[0093] 另外，可以利用癌基因将产生抗体的免疫细胞，如免疫接种的淋巴细胞永生化，并用于制备单克隆抗体。

[0094] 所得的单克隆抗体还可以是利用基因工程技术(参见如Borrebaeck和Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，由英国MacMillan Publishers LTD(1990)出版)重组制成的。 例如，可以从免疫细胞，如产生抗体的杂交瘤或免疫接种的淋巴细胞中克隆出编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体中，并导入宿主细胞，从而制备重组抗体。 本发明还提供了上述重组抗体。

[0095] 此外，本发明的抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要其能与一种或多种本发明的多肽结合。 比如，抗体片段可以是Fab，F(ab’)2，Fv或单链Fv(scFv)，其中重链和轻链Fv片段由合适的接头连接(Huston等，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。 更具体地，抗体片段可以是用酶，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体产生的。 另外，编码抗体片段的基因可以是构建的，将该基因插入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见如Co等，J Immunol 152：2968-76(1994)；Better和Horwitz，Methods Enzymol178：476-96(1989)；Pluckthun 和 Skerra，Methods Enzymol 178：
497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux等，Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird和Walker，Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。

[0096] 抗体可以通过与各种分子，如聚乙二醇(PEG)结合进行修饰。 本发明提供了所述修饰的抗体。所述修饰抗体可以是通过对抗体进行化学修饰而获得的。 这些修饰方法是本领域常用的。

[0097] 另外，本发明的抗体可以以连接衍生自非人类抗体的可变区和衍生自人抗体的恒定区的嵌和抗体，或人源化抗体来获得，其中人源化抗体含有衍生自非人类抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人抗体的构架区(FR)和恒定区。 所述抗体可以利用已知技术加以制备。

[0098] 可以将如上所得的抗体纯化为均一性抗体。 例如，抗体的分离和纯化可以根据常规蛋白所用的分离和纯化方法进行。 例如，抗体可以通过合适选择和组合使用柱层析，如亲和层析、过滤、超滤、盐析、渗析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦等(Antibodies：A Laboratory Manual。Ed Harlow和David Lane，冷泉港实验室(1988))进行分离，但并不限于此。 蛋白A柱和蛋白G柱可以作为亲和柱使用。 可用的示例性蛋白A柱包括，如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。

[0099] 除亲和层析之外，示例性层析包括，例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等，冷泉港实验室出版社(1996))。 层析步骤可以采用液相层析如HPLC和FPLC进行。

[0100] 例如，吸光度量法、酶联免疫吸附实验(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和/或免疫荧光法可用于测定本发明抗体的抗原结合活性。 在ELISA中，将本发明的抗体固定在平板上，将本发明的多肽加至平板内，然后，加入含有所需抗体的样品，如抗体产生细胞的培养物上清液或纯化的抗体。 然后，加入可识别第一抗体的二抗，且该二抗是用酶如碱性磷酸酶标记的，对平板进行孵育。 接着，在洗涤后，将酶底物如对硝基苯磷酸加至平板中，并测量吸光度，从而评价样品的抗原结合活性。可以将多肽片段，如C-末端或N-末端片段作为评价抗体结合活性的抗原。 可以使用BIAcore(Pharmacia)评价本发明抗体的活性。

[0101] 通过将本发明的抗体与假定含有本发明的多肽的样品接触，检测或测定抗体和多肽所形成的免疫复合物，上述方法能够对本发明的多肽进行测定和检测。

[0102] 由于本发明多肽的检测或测定方法能够特异性地检测或测定多肽，该方法对于使用该多肽的各种实验都是有用的。

[0103] 本发明还提供了与编码人C1958V1或C1958V2蛋白(SEQ ID NO：1或3)的多核苷酸或其互补链杂交的多核苷酸，其至少含有15个核苷酸。本发明的多核苷酸优选是与编码本发明多肽的DNA特异性杂交的多核苷酸。 本文中所用术语“特异性杂交”是指在常规杂交条件下，优选在严谨杂交条件下，不明显与编码其它蛋白的DNA发生交叉杂交。所述多核苷酸包括探针、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(如反义寡核苷酸和核酶)，其与编码本发明的多肽的DNA或其互补链特异性杂交。此外，所述多核苷酸可以用于制备DNA芯片。

[0104] 本发明包括与SEQ ID NO：1或3核苷酸序列中任何位点杂交的反义寡核苷酸。此反义寡核苷酸优选针对SEQ ID NO：1或3核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。 甚至更优选在该上面提及的至少15个连续核苷酸中含有一个起始密码子的反义寡核苷酸。

[0105] 反义寡核苷酸的修饰产物或衍生物可以用作反义寡核苷酸。 所述修饰产物的例子包括低级烷基磷酸酯修饰物，如甲基-磷酸酯型或乙基-磷酸酯型、硫代磷酸酯修饰物和氨基磷酸酯修饰物。

[0106] 本文所用术语“反义寡核苷酸”不仅是指那些其与由DNA或mRNA特异性区域组成的核苷酸相一致的核苷酸完全互补的反义寡核苷酸，而且是指那些含有一个或多个错配核苷酸的反义寡核苷酸，只要该DNA或mRNA和反义寡核苷酸能与SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列特异性地杂交。

[0107] 所述多核苷酸包括在，在“至少15个连续的核苷酸序列区”中，有至少70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高同源性的多核苷酸之中。本文所规定的算法可以用于测定同源性。 所述多核苷酸对于作为分离或检测编码本发明的多肽的DNA的探针，如在随后实施例中所述，或作为扩增引物是有用的。

[0108] 本发明的反义寡核苷酸衍生物能对产生本发明多肽的细胞起作用，通过将该衍生物与编码所述多肽的DNA或mRNA结合，抑制其转录或翻译，促使所述mRNA降解，并抑制本发明多肽的表达，从而能抑制所述多肽的功能。

[0109] 通过将本发明的反义寡核苷酸衍生物与适合的碱性物质混合，该碱性物质无法使所述衍生物失活，可以将本发明的反义寡核苷酸衍生物制成外用制剂，如擦剂或膏药。

[0110] 而且，在需要的时候，通过添加赋形剂、等渗剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、止痛剂和类似物，可以将该衍生物制成片剂、粉剂、颗粒、胶囊、脂质胶囊、注射剂、溶液、滴鼻药剂和冻干剂。 它们可以通过下述常规方法制备。

[0111] 反义寡核苷酸衍生物通过下述方法施给患者：将其直接涂在病痛处或注射入血管内，从而使其能到达病患处。反义封固介质可用于增加耐久性和膜渗透性。例如脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂褐质或其衍生物。

[0112] 本发明的反义寡核苷酸衍生物的用量可以根据患者的情况进行适当调节，并以所需量使用。 例如，施用的剂量为0.1-100mg/kg，优选0.1-50mg/kg。

[0113] 本发明还包括小型干扰RNA(siRNA)，其包括SEQ ID NO：1或3核苷酸序列的有义链核酸和反义链核酸的组合。 更具体地，抑制C1958V1表达的所述siRNA包括那些其有义链含有作为靶序列的SEQ ID NO：25，26或28核苷酸序列的siRNA。 术语“siRNA”是指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。 可用常规技术将siRNA导入细胞，包括那些将DNA作为转录为RNA的模板的细胞。 siRNA包括编码人C1958V1或
C1958V2蛋白(SEQ ID NO：1或3)的多核苷酸的有义核酸序列和反义核苷酸序列。 构建SiRNA，从而使单一转录物(双链RNA)含有来自靶基因有义序列和互补的反义序列，如发夹。

[0114] 例如由于细胞恶性转化，可利用方法改变细胞的基因表达，即使C1958V1或C1958V2的表达上调。 在靶细胞中siRNA与C1958V1或C1958V2转录物的结合会导致细胞产生的蛋白减少。寡核苷酸的长度至少为10个核苷酸，并且可以与天然存在的转录物等长。优选地，寡核苷酸长度为19-25个核苷酸。 最优选地，寡核苷酸长度小于75，50，25个核苷酸。C1958V1 siRNA寡核苷酸的例子，该siRNA寡核苷酸在哺乳动物细胞中抑制表达，包括含有SEQ ID NO：25，26或28之一作为靶序列的寡核苷酸。

[0115] siRNA的核酸序列可以利用可从Ambion网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)获得的siRNA设计计算机程序对其进行设计。 以下述协议为基础，利用计算机程序可以选出siRNA的核酸序列：

[0116] siRNA靶位点的选择：

[0117] 1.从目标转录物的AUG起始密码开始，向下游寻找“AA”二核苷酸序列，并记下出现的每个AA和其3’端相邻的19个核苷酸，作为潜在的siRNA靶位点。 Tuschl等建议在设计siRNA时，不要针对5’和3’端的非编码区(UTRs)和邻近起始密码的区域(75个碱基范围内)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合位点。 UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA。

[0118] 2.将潜在的靶位点和人基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列明显同源的所有靶序列。可以利用BLAST进行同源性检索，其基于NCBI服务器：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

[0119] 3.选出合适的靶序列进行合成。按照Ambion，优选沿基因长度，选出多个靶序列进行评价。

[0120] 本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明多肽的表达，从而其可用于抑制本发明多肽的生物活性。 而且，由于它们能抑制本发明多肽的生物活性，因此含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂是有用的。 因此，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗细胞增殖性疾病如癌症。

[0121] 另外，本发明提供了诊断细胞增殖性疾病的方法，该方法利用本发明多肽的表达水平作为诊断标记物。

[0122] 该诊断方法包括以下步骤：(a)测定本发明的C1958V1或C1958V2基因的表达水平；和(b)将表达水平的提高与细胞增殖性疾病如癌症相联系。

[0123] 在特定样品中，C1958V1或C1958V2基因的表达水平可以通过对与C1958V1或C1958V2基因相应的mRNA或由C1958V1或C1958V2基因编码的蛋白进行定量来测定。进行mRNA定量的方法是本领域技术人员所熟知的。 例如，与C1958V1或C1958V2基因相应的mRNA的水平可以通过Northern印迹或RT-PCR进行测定。 由于C1958V1或
C1958V2基因的全长核酸序列显示于SEQ ID NO：1或3，任何本领域的技术人员都能设计出可以对C1958V1或C1958V2基因进行定量的探针或引物的核酸序列。

[0124] 而且，C1958V1或C1958V2基因的表达水平可以是在该基因编码的蛋白活性或数量的基础上进行分析的。 测定C1958V1或C1958V2蛋白量的方法如下所示。 例如，免疫分析法对生物材料中的蛋白测定是有用的。 任何生物材料都可用来进行蛋白或其活性的测定。例如，对血液样品进行评价血清标记物编码蛋白的分析。 另一方面，根据各待分析蛋白的活性，可以选择合适的方法进行C1958V1或C1958V2基因编码蛋白的活性测定。

[0125] 对样品(待测样品)中的C1958V1或C1958V2基因表达水平进行检测，并与正常样品中的C1958V1或C1958V2基因表达水平进行比较。当该比较显示靶基因的表达水平高于正常样品的靶基因表达水平时，就判定该受试对象患有细胞增殖性疾病。 可以同时对正常标本和受试对象样品中的C1958V1或C1958V2基因表达水平进行检测。另外，表达水平的正常范围可以在对事先采自对照组样品中的基因表达水平进行分析而获得结果的基础上，通过统计学方法来确定。 将通过比较受试对象的样品获得的结果与正常范围进行比较；当结果不落在正常范围内时，就判定受试对象患有细胞增殖性疾病。 在本发明中，优选诊断的细胞增殖性疾病是癌症。更优选，当对C1958V1或C1958V2基因的表达水平进行测定并与正常样品中的表达水平进行比较时，诊断出的细胞增殖性疾病是胰腺癌。

[0126] 在本发明中，还提供了用于诊断细胞增殖性疾病如癌症，包括胰腺癌的诊断剂。本发明的诊断剂含有与本发明的多核苷酸或多肽结合的化合物。 优选地，将与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷酸，或与本发明的多肽结合的抗体作为所述化合物。

[0127] 另外，本发明提供了利用本发明的多肽筛选治疗细胞增殖性疾病化合物的方法。 该筛选方法的实施方案包括以下步骤：(a)将待测化合物与本发明的多肽接触，(b)测定本发明的多肽与检待测化合物间的结合活性，和(c)选出与本发明的多肽结合的化合物。

[0128] 用于筛选的本发明多肽可以是重组多肽或源自天然的蛋白，或其部分肽。 可以使用任何待测化合物，例如细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物的产物、海洋生物的提取物、植物提取物、纯化的或粗蛋白、肽、非肽类化合物、合成的微分子化合物和天然化合物。 与待测化合物接触的本发明多肽可以是，例如纯化的多肽、可溶蛋白、与载体结合的形式、或与其它多肽融合的融合蛋白。

[0129] 本领域的技术人员可使用许多已知方法作为筛选蛋白的方法，例如利用本发明的多肽，与本发明的多肽结合的蛋白。 所述筛选可通过如免疫沉淀法，特别是以下述方式进行。 编码本发明多肽的基因在动物细胞中表达，其后通过将基因插入外源基因表达载体中，如pSV2neo、pcDNA I和pCD8。 用于表达的启动子可以是常规是使用的任何启动子，包括，如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-1α 启 动 子 (Kim 等，Gene 91：217-23(1990))，CAG启 动 子 (Niwa 等，Gene 108：193-200(1991))，RSV LTR启 动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))，SRα启 动 子 (Takebe 等，Mol Cell Biol 8：466(1988))，CMV立即早期启动子(Seed和Aruffo，Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987))，SV40晚期启动子(Gheysen和Fiers，J Mol Appl Genet1：
385-94(1982))，腺病毒晚期启动子(Kaufman等，Mol Cell Biol 9：946(1989))，HSV TK启动子等。 可根据任何方法使基因导入表达外源基因的动物细胞中，例如电穿孔法(Chu等，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))，磷酸钙法(Chen和Okayama，Mol Cell Biol
7：2745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopata等，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；
Sussman和Milman，Mol Cell Biol 4：1642-3(1985))，脂转染法(Derijard，B Cell 7：
1025-37(1994)；Lamb等，Nature Genetics 5：22-30(1993)；Rabindran等，Science 259：
230-4(1993))等。 本发明的多肽可以通过将单克隆抗体的表位导入本发明多肽的N-或C-末端，以含有单克隆抗体的识别位点(表位)的融合蛋白表达，其中单克隆抗体表位的其特异性已经被公开。 可使用商购的表位抗体系统(Experimental Medicine 13：
85-90(1995))。 通过利用多克隆位点，表达与例如β-半乳糖苷酶，麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽S-转移酶，绿色荧光蛋白(GFP)和类似物融合的蛋白的载体是可商购的。

[0130] 还报导了通过仅将由几个至12个氨基酸组成的小型表位导入，而不改变本发明多肽的特性，制得的融合蛋白。可以使用表位，如多组氨酸(His-tag)，流感凝集素HA，人c-myc，FLAG，水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)，T7基因10蛋白(T7-tag)，人简单疱疹病毒糖蛋白(HSV-tag)，E-tag(一种在单克隆噬菌体上的表位)和类似物，和识别它们的单克隆抗体作为筛选与本发明多肽结合的蛋白的表位抗体体系(Experimental Medicine13：85-90(1995))。

[0131] 在免疫沉淀反应中，通过将这些抗体加至利用合适的去污剂制备的细胞裂解物中形成免疫复合物。 免疫复合物由本发明的多肽，具有与本发明多肽结合活性的多肽，和抗体组成。 除了利用针对上述表位的抗体外，其中表位的抗体可以如上所述制备而成，还可以利用针对本发明多肽的抗体进行免疫沉淀反应。

[0132] 例如当抗体是鼠IgG抗体时，可以利用蛋白A琼脂糖或蛋白G琼脂糖对免疫复合物进行沉淀。 如果本发明的多肽是以与表位融合的融合蛋白制备而成的话，如GST，就可以以针对本发明多肽的抗体所用的相同方式，利用与这些表位，如谷胱甘肽-琼脂糖4B特异性结合的物质形成免疫复合物。

[0133] 可按照或根据，如文献(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))中的方法进行免疫沉淀。

[0134] SDS-PAGE常用于对免疫沉淀的蛋白进行分析，利用具有合适浓度的凝胶，可以对结合蛋白的蛋白分子重量进行分析。 由于与本发明多肽结合的蛋白很难用常规染色35
方法，如Coomassie染色或银染色检测出来，可以采用在含有放射性同位素， S-蛋氨酸
35
或 S-cystein的培养基中培养细胞，对细胞中的蛋白进行标记，并对蛋白进行测定，来提高检测蛋白的敏感性。当知道蛋白的分子量后，可以直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶对目标蛋白进行纯化，并测定其序列。

[0135] 作为利用本发明多肽筛选与本发明多肽结合的蛋白的方法，可以使用如West-Western印迹分析(Skolnik等，Cell 65：83-90(1991))。 特别是，与本发明多肽结合的蛋白可以通过下述方法获得：利用噬菌体载体(如ZAP)，从细胞、组织、器官(如胎盘、肝脏、甲状腺、气管或骨髓)或预期将表达与本发明多肽结合的蛋白的培养细胞中制备cDNA文库，在LB-琼脂糖上表达蛋白，将表达的蛋白固定在滤器上，将纯化的和标记的本发明多肽与上述滤器反应，根据标记对表达与本发明多肽结合的蛋白的空斑进行检测。 本发明的多肽可以利用生物素和抗生物素蛋白间的结合，或利用与本发明多肽特异性结合的抗体，或与本发明多肽融合的肽或多肽(如GST)进行标记。利用放射性同位素或荧光和类似物的方法也是可以使用的。

[0136] 另外，在本发明的筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂 交 体 系( “MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“Mammalian MATCHMAKERTwo-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybrid system”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)； 文 献“Dalton and Treisman，Cell 68：
597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。

[0137] 在双杂交体系中，本发明的多肽与SRF-结合域或GAL4-结合域融合，并在酵母细胞中表达。 从预期将表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞中制备cDNA文库，从而在表达时，该文库可以与VP16或GAL4转录激活域融合。然后，将该cDNA文库导入上述酵母细胞中，并从测定的阳性克隆(当与本发明多肽结合的蛋白在酵母细胞中表达时，两者的结合将会激活报道基因，并使阳性克隆可测)中分离出衍生自文库的cDNA。 cDNA编码的蛋白可以通过将上述分离的cDNA导入大肠杆菌中，并使蛋白表达来制备。

[0138] 除了HIS3基因之外，可使用例如Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，荧光酶基因等作为报道基因。

[0139] 还可以利用亲和层析筛选与本发明多肽结合的化合物。 例如，可将本发明的多肽固定在亲和柱的载体上，将含有能与本发明多肽结合的蛋白的待测化合物加到柱上。本文中的待测化合物可以是，例如细胞提取物，细胞裂解物等。 在将待测化合物上样后，对柱子进行洗涤，并制得与本发明多肽结合的化合物。

[0140] 当待测化合物是蛋白时，对获得的蛋白的氨基酸序列进行分析，在该序列的基础上合成寡核苷酸，并利用该寡核苷酸作为获得编码该蛋白的DNA的探针对cDNA文库进行筛选。

[0141] 利用表面电浆共振(surface plasmon resonance)现象的生物传感器可以作为对本发明中的结合化合物进行测定或定量的手段。 当使用该生物传感器时，仅利用微量且未标记的多肽(例如，BIAcore，Pharmacia)，可以通过表面电浆共振信号对本发明多肽与待测化合物间的相互作用进行实时观察。因此，利用生物传感器如BIAcore，能够对本发明多肽和待测化合物之间的结合进行评价。

[0142] 当固定的本发明多肽暴露时，对会与合成的化学化合物，或天然物质库，或随机噬菌体肽展示文库结合的分子进行筛选的方法，和在组合化学技术(Wrighton等，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature 384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))的基础上，利用高通量筛选，从而使与本发明的蛋白结合的蛋白和化学化合物(包括激动剂和拮抗剂)分离的方法是本领域技术人员所熟知的。

[0143] 另外，本发明的筛选方法可包括下述步骤：

[0144] a)将候选化合物与细胞接触，该细胞已导入了含有一个或多个标记基因的转录调节域和报道基因的载体，该载体在控制转录调节区域的条件下表达，其中所述一个或多个标记基因选自C1958V1或C1958V2；

[0145] b)测定所述报道基因的活性；和

[0146] c)与对照对比，选出降低所述报道基因表达水平的化合物。

[0147] 适合的报道基因和宿主细胞是本领域所熟知的。 进行筛选所需的报道基因构建体可以利用标记基因的转录调节域来加以制备。 当标记基因的转录调节域是本领域已知的时，可利用现有序列信息来制备报道基因构建体。 当标记基因的转录调节域还未确定时，可以以标记基因的核苷酸序列信息为基础，从基因组文库中分离出含有转录调节域的核苷酸片段。

[0148] 经筛选分离获得的化合物是抑制本发明多肽活性、治疗或预防属于例如细胞增殖性疾病，如癌症的疾病的候选药物。通过添加、缺失和/或取代是保守的，化合物的部分结构是用本发明的筛选方法获得的，并具有与本发明多肽结合活性的化合物，包括在经本发明的筛选方法获得的化合物之中。

[0149] 在另一个实施方案中，本发明提供了筛选候选剂的方法，该候选剂是治疗细胞增殖性疾病的潜在靶。如上所讨论的，通过控制C1958V1或C1958V2的表达水平，人们可以控制胰腺癌的进攻和发展。 因此，候选剂，其中候选剂是治疗细胞增殖性疾病的潜在靶，是可以通过利用C1958V1或C1958V2的表达水平和活性作为指标进行筛选而鉴定出的。 在本发明正文中，所述筛选可以包括，例如下述步骤：

[0150] a)将候选化合物与表达C1958V1或C1958V2的细胞接触；和

[0151] b)与当待测化合物不存在时测定的表达水平相比，选出降低C1958V1或C1958V2表达水平的化合物。

[0152] 至少能表达C1958V1或C1958V2之一的细胞包括，如自胰腺癌建立的细胞系，所述细胞能在上述本发明的筛选方法中使用。可用本领域熟知的方法评价表达水平。 在筛选方法中，可以将C1958V1或C1958V2中至少一种的表达水平降低的化合物选作候选剂。

[0153] 在筛选用于治疗本发明的细胞增殖性疾病的化合物的方法的另一个实施方案中，该方法利用本发明多肽的生物活性作为指标。由于本发明的C1958V1或C1958V2蛋白具有促进细胞增殖性的活性，因此促进或抑制本发明所述蛋白之一的细胞增殖性活性的化合物可以是利用此活性作为指标筛选获得的。该筛选方法包括步骤：(a)将待测化合物与本发明多肽接触；(b)测定步骤(a)的多肽的生物活性；和(c)与当待测化合物不存在时测定的生物活性相比，选出抑制此多肽生物活性的化合物。

[0154] 任何多肽都可以用于筛选，只要它们具有C1958V1或C1958V2蛋白的生物活性。 所述生物活性包括人C1958V1或C1958V2蛋白的细胞增殖性。 例如，可以使用人C1958V1或C1958V2蛋白，而且可以使用此蛋白的多肽功能等同物。所述多肽可以是细胞内源或外源表达的。

[0155] 可以使用任何待测化合物，如细胞提取物、细胞培养上清液、发酵微生物的产物、海洋生物的提取物、植物提取物、纯化的或粗蛋白、肽、非肽类化合物、合成的微分子化合物、天然化合物。

[0156] 通过此筛选方法分离的化合物是本发明多肽的拮抗剂的候选物。 术语“拮抗剂”是指通过与本发明多肽结合而抑制本发明多肽的功能的分子。 另外，通过此筛选方法分离的化合物是抑制本发明多肽与分子(包括DNA和蛋白)体内相互作用的候选物。

[0157] 当本方法中待测的生物活性是细胞增殖性时，可以通过制备表达本发明多肽的细胞，在存在待测化合物的条件下培养该细胞，和测定该细胞增殖的速度，测量细胞周期等，以及通过测量菌落形成活性来测定细胞增殖性。

[0158] 通过上述筛选方法分离获得的化合物是抑制本发明多肽活性的药物候选物，并且该化合物可用于治疗与本发明多肽相关的疾病，如细胞增殖性疾病，包括癌症。 更具体地，当C1958V1或C1958V2蛋白的生物活性作为指标时，就将经本发明的方法筛得的化合物作为治疗胰腺癌药物的候选物。

[0159] 另外，通过添加、缺失和/或取代改变抑制C1958V1或C1958V2蛋白活性的化合物部分结构的化合物，也包括在通过本发明的筛选方法获得的化合物之中。

[0160] 当将利用本发明的方法分离获得的化合物作为治疗细胞增殖性疾病(如癌症)的药物，对人和其它哺乳动物，如小鼠、大鼠、荷兰猪(guinea-pigs)、兔、鸡、猫、狗、羊、猪、牛、猴、狒狒(baboon)、黑猩猩给药时，该分离获得的化合物是可以直接施用的，或者利用已知的药物制备方法配成剂型。 例如，根据需要，该药物可以以糖衣片剂、胶囊、酏剂(elixirs)和微囊口服使用，或以无菌液或水悬浮液，或任何其它药学上可接受液体的注射形式非口服使用。 例如，可以以一般公认的药物施用所需的单位剂型，将该化合物与药学上可接受的载体或介质，特别是无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂和类似物混合。 对制剂中的活性成分进行控制，从而使在给定范围内获得合适剂量。

[0161] 可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘合剂如凝胶、玉米淀粉、黄芪胶和阿拉伯树胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；调味剂如薄荷、腺毛白珠树(Gaultheria adenothrix)油和樱桃。 当单位剂型为胶囊形式时，可进一步将液体载体如油同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法利用载体如注射用的蒸馏水制备注射用无菌组合物。

[0162] 可用生理盐水，葡萄糖和包括其它助剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠)的等渗溶液作为注射用的液体溶液。 并可与合适的助溶剂如醇，尤其是乙醇，聚醇如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂如聚山梨醇酯80(TM)和HCO-50结合使用。

[0163] 芝麻油或豆油可作为油性液体，并可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用，并可缓冲液如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液；镇静剂如盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)；稳定剂如苯甲醇、苯酚；和抗氧化剂结合使用。 制备的注射物可添加到合适的安培瓶中。

[0164] 可用本领域熟知的方法对患者给药，如动脉内、静脉内、经皮肤注射和鼻内、经支气管、肌肉内或口服给药。 给药剂量和方法依赖于患者的年龄和体重而异；但是本领域的技术人员能对其进行常规地选择。 如果所述药物可被DNA编码，则可将该DNA插入用于基因治疗的载体，并施用该载体进行治疗。 给药剂量和方法依赖于患者的体重、年龄和症状而异，但本领域的技术人员可适合地对其进行选择。

[0165] 例如，虽然依赖于症状而异，在对正常成人(体重60kg)口服给药时，与本发明多肽结合并调节其活性的化合物剂量为约0.1mg-约100mg/天，优选约1.0mg-约50mg/天，更优选约1.0-约20mg/天。

[0166] 当对正常成人(体重60kg)非胃肠道给药时，注射形式依赖于患者、靶器官、症状和给药方法而异，但优选静脉注射剂量为约0.01mg-约30mg/天，优选约0.1mg-约20mg/天，更优选约0.1mg-约10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

[0167] 另外，本发明提供了利用针对本发明多肽的抗体治疗或预防细胞增殖性疾病，如癌症的方法。 根据该方法，施用了针对本发明多肽的抗体的药学有效量。 由于C1958V1或C1958V2蛋白的表达在癌症细胞中上调，抑制这些蛋白的表达将会降低细胞增殖性，因此认为通过将这些蛋白与抗体结合就能治疗或预防细胞增殖性疾病。 因此，以足以降低本发明蛋白的活性的剂量施用针对本发明多肽的抗体，每天为0.1-约250mg/kg。成人的剂量范围通常为约5mg-约17.5g/天，优选约5mg-约10g/天，更优选每天约100mg-约3g/天。

[0168] 另外，可以将与细胞表面标记物结合的抗体用作药物传递工具，其中该细胞表面标记物对肿瘤细胞是特异性的。 例如，以足以损害肿瘤细胞的剂量施用与细胞毒性剂共轭的抗体。

[0169] 本发明还涉及诱导抗肿瘤免疫性的方法，包括施用C1958V1或C1958V2蛋白或其免疫活性片段，或编码该蛋白的多核苷酸或其片段的步骤。C1958V1或C1958V2蛋白或其免疫活性片段作为针对细胞增殖性疾病的疫苗是有利的。 在某些情况下，可以将所述蛋白或其片段以与T细胞受体(TCR)结合的形式或由抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞、树突细胞(DC)或B-细胞呈递的形式给药。由于树突细胞的强呈递能力，在APCs中更优选使用DC。

[0170] 在本发明中，针对细胞增殖性疾病的疫苗是指在接种动物后，具有诱导抗肿瘤免疫性功能的物质。根据本发明，认为由SEQ ID NO：1或3编码的多肽是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，它们能诱导有效的和针对胰腺癌细胞的特异性免疫应答，该胰腺癌细胞表达C1958V1或C1958V2。 通常，抗肿瘤免疫性包括如下免疫应答：

[0171] -诱导针对肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，

[0172] -诱导识别肿瘤的抗体，和

[0173] -诱导抗肿瘤细胞因子产生。

[0174] 因此，当将某个蛋白给动物接种后，该蛋白能诱导任一种所述免疫应答时，就认为该蛋白具有抗肿瘤免疫诱导效力。 由该蛋白引起的抗肿瘤免疫诱导是通过在体内或体外对该宿主免疫系统针对该蛋白的应答进行观察来测定的。

[0175] 例如，用于测定诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法是已知的。 进入活体的外源物质是由抗原呈递细胞(APC)的作用呈递给T细胞和B细胞的。 由于抗原的刺激以及随后的增殖(也就是由于T细胞的激活)，以抗原特异性方式，对APC呈递的抗原起反应的T细胞分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL)。因此，某肽引起的CTL诱导可以通过用APC将该肽呈递给T细胞，并测定CTL的诱导来进行评价。 另外，APC具有激活CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的效力。 由于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫性中也是很重要的，则可利用这些细胞的激活效力作为指示剂，对该肽的抗肿瘤免疫诱导作用进行评价。

[0176] 利用树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞(APC)评价CTL诱导作用的方法是本领域已知的。树突细胞是在抗原呈递细胞中具有最强CTL诱导作用的典型抗原呈递细胞。在该方法中，先将待测多肽与树突细胞接触，然后将此树突细胞与T细胞接触。 在T细胞与此树突细胞接触后，对具有针对感兴趣细胞的细胞毒性效力的T细胞测定显示该待测51
多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。 例如，利用 Cr-标记的肿瘤细胞裂解物作为指示
3
剂，对CTL的抗肿瘤活性进行测定。 另外，利用 H-胸腺嘧啶核苷吸收活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指示剂，评价肿瘤细胞损坏程度的方法也是已知的。

[0177] 除树突细胞之外，可以用外周血单核细胞(PBMC)作为抗原呈递细胞。据报道，在存在GM-CSF和IL-4的条件下培养PBMC能提高CTL的诱导性。 相似地，在存在匙孔血蓝蛋白(KLH)和IL-7的条件下，培养PBMC能够诱导CTL。

[0178] 利用此方法证实具有CTL诱导活性的该待测多肽是具有树突细胞激活效力和CTL诱导活性的多肽。因此，能诱导CTL抗肿瘤细胞的多肽可作为抗肿瘤疫苗。另外，经与该多肽接触而获得诱导CTL抗肿瘤活性的APC可作为抗肿瘤疫苗。另外，由于APC对该多肽抗原的呈递而获得细胞毒性的CTL也可作为抗肿瘤疫苗。 利用由APC和CTL引起的抗肿瘤免疫活性进行的所述肿瘤治疗方法称为细胞免疫疗法。

[0179] 通常，当用多肽进行细胞免疫疗法时，通过将具有不同结构的多种多肽进行组合，并与DC接触而使CTL诱导效力增加是已知的。 因此，当用蛋白片段对树突细胞进行刺激时，优选使用多种类型的片段混合物。

[0180] 另外，由多肽引起的抗肿瘤免疫活性可以通过对抗体产物针对肿瘤的诱导进行观察来确定。 例如，当针对多肽的抗体已在用该多肽免疫的实验动物中诱导产生，并且当此抗体能抑制肿瘤细胞生长时，就断定该多肽具有诱导抗肿瘤免疫性的能力。

[0181] 通过施用本发明的疫苗可以诱导抗肿瘤免疫活性，而且抗肿瘤免疫活性的诱导能治疗和预防细胞增殖性疾病如胰腺癌。 抗癌疗法或癌症攻击的预防包括如下任一步骤：如抑制癌细胞生长、癌症衰退和抑制癌症发生。 患癌个体死亡率的降低、血液中肿瘤标记物的减少、癌症并发可测症状的缓和等都包括在癌症治疗和预防的范围内。 其治疗和预防效力优选是在统计学上有效的。 例如，观察到的显著性水平为5％或更低，其中抗细胞增殖性疾病疫苗的治疗或预防效力是与未施用疫苗的对照进行比较获得的。 例如，可利用Student T检测法，Mann-Whitney U检测法或ANOVA法进行统计学分析。

[0182] 可以将上述具有免疫活性的蛋白或编码该蛋白的载体与佐剂组合。 佐剂是指在与具有免疫活性的蛋白联合(或相继)给药时，能提高针对该蛋白的免疫应答的化合物。佐剂的例子包括霍乱毒素、沙门氏菌毒素、矾等，但并不限于此。 另外，可以将本发明的疫苗与药学上可接受的载体适当组合。 所述载体的例子是无菌水、生理盐水、磷酸缓冲液、培养液等。 另外，如果需要疫苗可以包括稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。疫苗采用全身性或局部给药。 疫苗给药可以采用一次注射，或采用多次注射的加强给药。

[0183] 当利用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以通过体外方法治疗或预防肿瘤。更具体地，收集接受过治疗或预防的受试对象的PBMC，在体外将该细胞与所述多肽接触，并接着对APC或CTL进行诱导，可以将该细胞施给受试对象。还可以在体外通过将编码该多肽的载体导入PBMCs中，而使APC诱导。 可以在给药前，对体内诱导的APC或CTL进行克隆。 通过对具有高破坏靶细胞活性的细胞进行克隆和培养，能够更有效地进行细胞免疫治疗。 另外，以此方式分离的APC和CTL可用于细胞免疫治疗，该细胞免疫治疗不仅针对该细胞所来自的个体，而且针对来自其他个体的相似类型肿瘤。

[0184] 另外，提供了含有药学有效量的本发明多肽的治疗或预防细胞增殖性疾病如癌症的药物组合物。 该药物组合物可用于提高抗肿瘤免疫性。 C1958V1或C1958V2的正常表达主要在胎盘中观察到，而很少在肝、甲状腺、气管或骨髓中观察到。 所以，抑制C1958V1或C1958V2基因可能并不会对其他器官产生不利影响。因此，优选用C1958V1或C1958V2多肽治疗细胞增殖性疾病，尤其是胰腺癌。 在本发明中，将该多肽或其片段以足以诱导抗肿瘤免疫性的剂量给药，其范围为0.1mg-10mg，优选0.3mg-5mg，更优选0.8mg-1.5mg。 可以重复给药。 例如，每隔两周施用1mg肽或其片段，共4次，从而诱导抗肿瘤免疫活性。

[0185] 下述实施例意在阐明本发明，并帮助普通技术人员能够制造和使用相同的发明。 实施例并不以任何方式限制本发明的范围。

[0186] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员所一般理解具有相同的意思。 虽然，在实践和检测本发明时，可以使用与本文所述方法和材料相似或等同的方法和材料，但适合的方法和材料在下面进行描述。 将本文引证的任何专利、专利申请和公开物都引入以供参考。

[0187] 实施本发明的最佳方式

[0188] 通过下述实施例对本发明进行详细描述，但并不限制到这些实施例。

[0189] 1.材料和方法

[0190] (1)细胞系和临床材料

[0191] 人胰脲癌细胞系Capan-1，Capan-2，Panc-1，Aspc-1和MIApaca-2，KLM-1和PK59是由Dr.Jae-Gahb Park(韩国细胞系库，Tumor Research Institute，Seoul National University College of Medicine，韩国)惠赠的。 将所有细胞在合适的培养基中培养，如培养Capan-1，Capan-2和Aspc-1的RPMI-1640(Sigma，St.Louis，MO)；培养MIApaca-2，Panc-1，COS7的Dulbecco改进的Eagle培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)。 在各培养基中加入10％胎牛血清(Cansera)和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)。将细胞保存于37℃，空气湿度为5％CO2。 临床样本(胰腺癌和正常胰导管)获自外科样本，所用样品所有患者均表示同意。

[0192] (2)在我们的cDNA芯片中以点#C1958表示的新人基因的分离

[0193] cDNA微分析载玻片的制造已有描述(Ono等，2000)。 为了对各表达谱进行分析，制备出含有23,040个cDNA点的载玻片复制体(dupl.icate sets of slides)，从而降低实验的波动性。 简单的讲，从各激光微切细胞样本中分离出总RNA，进行以T7为基础的RNA扩增，从而获得用于芯片实验所需的足够RNA量。 利用逆转录，分别用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)对从胰腺癌细胞和正常胰导管细胞扩增出的RNA等分试样进行标记。如现有技术(Ono等，2000)所述进行杂交，洗涤和测定。 在肿瘤细胞中表现上调的基因中，发明人聚焦于自定义鉴定号为C1958的基因，因为在多于50％的信息性胰腺癌例中，该基因的表达率大于5.0。

[0194] (3)Northern印迹分析

[0195] 将人多个组织的Northern印迹(Clontech，Palo Alto，CA)与[α32P]-dCTP-标记的C1958扩增产物进行杂交，其中C1958扩增产物是利用RT-PCR(见下)制得的。 按照提供商的推荐方案进行预杂交，杂交和洗涤。 于-80℃，用强化掩
蔽(intensifying screens)对印迹进行10天自显影。 利用如下的特异性引物对：
5’-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3’(SEQ ID NO：5)和

[0196] 5’-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3’(SEQ ID NO：6)，通过PCR制备C1958外显子4的特异性探针。

[0197] (4)半定量的RT-PCR分析

[0198] 将从激光微切的细胞临床样品中提取获得的总RNAs加至350μl RLT裂解缓冲液(QIAGEN，Hilden，Germany)中，在1单位Rnase抑制剂(TOYOBO，Osaka，Japan)存在的条件下，将提取的RNAs用DNase I(Roche，Basel，Switzerland)处理，以去除所有污染的基因组DNA。 在用DNase I处理后，按照制造商的推荐方案，用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)对RNA进行纯化。 对所有用DNase I处理的RNA都进行以T7为基础的RNA扩增。按照制造商的方案，利用TRIzol试剂(Invitrogen)从培养细胞中提取总RNA。
每个提取的RNA都用DNase I(Roche)进行处理。

[0199] 利用随机引物(Roche)或寡(dT)16引物和Superscript II逆转录酶(Roche)，将扩增的RNA或总RNA逆转录为单链cDNAs。 通过监测作为定量对照的微管蛋白，alpha3(TUBA3)，制得适合用于随后PCR扩增的各单链cDNA稀度。 引物序列为：

[0200] 5′-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3′(SEQ ID NO：7)和

[0201] 5′-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3′(SEQ ID NO：8)，TUBA3所用；

[0202] 5’-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3’(SEQ ID NO：9)和

[0203] 5’-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3’(SEQ ID NO：10)，C1958所用。 所有反应包括在Gene Amp PCR system 9700(PE Applied Biosystems)上，在94℃进行首次变性2分钟，接着进行如下22个循环(用于TUBA3)或28个循环(用于C1958)：94℃30
秒，58℃30秒和72℃1分钟。

[0204] (5)表达载体的构建

[0205] 用引物C1958V1-正向

[0206] (5’-CCGGAATTCGACATGGGGCTTAAGATGTCC-3’(SEQ ID NO：11)) 和C1958V1- 反 向 (5’-CCGCTCGAGGGCTTCTGGGTCGATTTCTCC-3’(SEQ ID NO：
12))RT-PCR扩增出C1958V1 cDNA的完整编码序列。 将该产物插入pcDNA3.1(+).myc.his(Invitrogen)的EcorI和XhoI位点，其携带细胞巨细胞病毒(CMV)启动子和新霉素抗性基因。 利用DNA测序对该结构(pcDNA3.1(+)-C1958-myc-his)进行确定。

[0207] (6)免疫细胞化学染色

[0208] 按照制造商的说明书，利用Fugene 6(Roche)，将pcDNA3.1(+)-C1958V1-myc-his瞬时转染入COS7细胞，然后用含4％多聚甲醛的PBS固定COS7细胞15分钟，在4℃用含0.1％Triton X-100的PBS通透2.5分钟。 在4℃，在PBS中用3％BSA将该细胞封闭12小时，阻断非特异性杂交，用1∶1000稀释的小鼠抗-myc抗体(Sigma)进行孵育。
在用PBS洗后，细胞用FITC结合的抗小鼠二抗(organon Teknika)染色。 核仁用4’，
6’-联脒-2’-苯基吲哚二盐酸(4’，6’-diamidine-2’-phenylindole dihydrochloride，DAPI)复染。 在ECLIPSE E800显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)下获得荧光图像。

[0209] (7)Western印迹分析

[0210] 按照制造商的说明书，利用FuGene 6(Roche)，将pcDNA3.1(+)-C1958-myc-his瞬时转染入COS7细胞，然后用PBS洗两次，并在裂解缓冲液(150mM NaCl，1％Triton X-100，50mM Tris-HCl pH 7.4，1mM DTT，和1X完全蛋白酶抑制剂Cocktail(Boehringer))中收集。 在细胞匀浆后，以10,000xg离心30分钟，利用Bradford法(Bio-Rad)测定上清液的蛋白浓度。用12％SDS-PAGE将蛋白分开，并用鼠抗-myc(SANTA CRUZ)抗体进行免疫印迹。

[0211] (8)psiU6X3.0的构建

[0212] 由于snRNA U6基因已知能够被RNA聚合酶III转录，其在3’末端产生具有尿苷的短转录物，我们利用引物对：

[0213] 5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQ ID NO：13)，和

[0214] 5’-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’(SEQ ID NO：14)，以人胎盘DNA作为模板，对含有其启动子域的snRNA U6基因的基因组片段进行PCR扩增。 纯化产物，并按照供应商的方案(Invitrogen)，利用TA cloning kit将产物克隆至pCR质粒载体内。纯化含有snRNA U6基因的BamHI，XhoI片段，并克隆至pcDNA3.1(+)质粒的1257至56核
苷酸片段内，其用引物对：

[0215] 5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQ ID NO：15)和

[0216] 5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ ID NO：16) 进 行PCR扩增。 用连接的DNA作为PCR模板，引物为：

[0217] 5’-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3’(SEQ IDNO：17)和

[0218] 5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQ ID NO：18)。 用HindIII消化产物，随后其自连获得psiU6BX3.0载体质粒。 对于对照，通过将双链寡核苷酸

[0219] 5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO：19)和

[0220] 5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCT GCTTC-3’(SEQ ID NO：20)克隆至psiU6BX3.0载体的BbsI位点内，制得
psiU6BX-EGFP。

[0221] (9)C1958V1的基因沉默效应

[0222] 通过 将 双链 寡核 苷 酸克 隆 至表 达psiU6BX3.0载 体 内制 得siRNAs质 粒。 C1958 的 靶 序 列 是 5’-CGACAAGCACCTGGACGTG-3’(SEQID NO ：25)，5’ -ATGTGTGTCAGCAGCAGCA-3’ (SEQ ID NO ：
26)，5’ -TCCAGCCTGTCCACTTCCA-3’ (SEQ ID NO ：27) 和
5’-GTTGTTTTACAGATACGGA-3’(SEQ ID NO：28)。 将 来 自 KLM-1 和 PK59
5
细胞系的人胰腺细胞种在10-cm培养皿上(KLM-1；2.5X10 细胞/皿，PK59；
5
5X10 细胞/皿)，并按照供应商的推荐方案(Roche)，利用FuGene 6试剂，转染
psiU6BX-EGFP，或psiU6BX-C1958V1。 在转染7天后，提取细胞总RNA，然后
利用C1958V1和β-肌动蛋白(ACTB)的特异性引物作为内参；C1958的引物为
5’-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3’(SEQ ID NO：21)和5’-GAAGTTCTTGTTGG
TGCTTATGG-3’(SEQ ID NO：22)，ACTB的引物为5’-CATCCACGAAACTACCTTCA
ACT-3’(SEQ ID NO：23)和5’-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ ID NO：
24)，通过半定量RT-PCR确定siRNAs的击倒(konckdown)作用。 另外，利用KLM-1和PK59细胞系，表达siRNAs的转染子在含0.6mg/ml新霉素的选择培养基中生长9天。 在用4％的多聚甲醛固定后，用Giemsa溶液使转染细胞染色来测定克隆形成。 用MTT法量化细胞活性。 在含新霉素的培养基中培养7天后，加入浓度为0.5mg/ml的MTT溶液(3-(4，5-二甲噻基-2-基)-2，5-二苯基四唑溴盐)(Sigma)。 在37℃孵育4小时，加入酸性-SDS(0.01N HCl/10％SDS)；剧烈搅拌悬浮液，然后，于37℃培养过夜，使黑蓝晶体溶解。 用Microplate Reader550(Biorad)测定570nm吸光度。

[0223] 2.结果

[0224] (1)鉴定C1958在胰腺癌细胞中为上调基因

[0225] 当利用代表23,040个人基因(Nakamura等，2003)的cDNA芯片，对获自18名胰腺癌患者的癌细胞基因表达谱进行分析时，鉴定出一般有265个基因在胰腺癌细胞中是上调的。在这些基因中，本发明人重点关注自定编号为C1958的基因，该基因符合NCBI的UniGene数据库中的EST Hs.40530(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)。与正常胰导管相比，该基因的表达在9个胰腺癌中有7个是提高的，比芯片中的基值(cut-off)具有更高的信号强度(图1(a))。 随后与正常胰导管相比，半定量RT-PCR分析证实12个胰腺癌中有10个，5个胰腺癌细胞系中有2个表达是提高的(图1(b))。

[0226] 利用从胰腺癌细胞系Capan-1制得的cDNA文库，通过筛选实验将C1958基因分离。 有3种不同的转录变体，由4个，4个和2个外显子组成(图2，分别为(a)
C1958V1(GenBank登录号：AB115764)，(b)C1958V2(GenBank登录号：AB115765)和(c)C1958V3(GenBank登录号：AB115766))，位于染色体16q，基因组长度约为43kb。 外显子1和3有差异，外显子2是C1958V1和C1958V2共有的，外显子4是所有变体共有的。
C1958V2变体的外显子1b比C1958V1 5’端的外显子1a长34bp，外显子3b比C1958V1
5’端的外显子3a短22bp，在外显子3b内部产生了新终止密码子。 C1958V1(SEQ ID NO：1)和C1958V2(SEQ ID NO：3)变体的全长cDNA序列分别包括881和893个核苷
酸。 C1958V1和C1958V2的开放阅读框从外显子2内部开始，但翻译的起始位点位于C1958V3变体的外显子3c内。

[0227] 利用cDNA片段C1958作为探针，对多种组织印迹的Northern分析(参见Material and Method，图2)显示两个转录物约为1.8kb和1.2kb(图3(a1-3))。 1.8kb转录物在淋巴结中表达相对高些，在胃、导管和骨髓中表达较弱。另外，1.2kb转录物在胎盘中表达非常丰富，在肝、甲状腺、导管和骨髓中则较弱。 另外，利用相同的探针，对胰腺癌细胞系印迹的Northern印迹分析显示转录物约为1.2kb(图3(b))。

[0228] 为了研究C1958V1蛋白在哺乳动物细胞中的亚细胞定位，将表达C1958V1蛋白的质粒(pcDNA3.1(+)-C1958V1-myc-his)瞬时转染入COS7细胞中。如图4(a)所示，免疫组织化学染色显示该C1958V1产物位于COS7细胞的细胞器中。 另外，C1958V1翻译得到的基因产物比Western印迹分析预测的基因产物更长，表明这可能是因为翻译后修饰产生的(图4(b))。

[0229] (2)意欲降低C1958表达的小型干扰RNA(siRNA)的生长抑制效力

[0230] 为了对C1958V1的生长促进作用进行评价，我们利用以哺乳动物载体为基础的RNA干扰(RNAi)技术，在KLM-1和PK59细胞(胰腺癌细胞系)中敲除了内源C1958的表达，并对细胞生长的影响进行了检测(参见材料和方法Materials and Methods)。 如图
5(a)所示，导入psiU6BX-C1958V1(Si 8-5和Si 11-3)使C1958V1转录物在KLM-1细胞系中的表达明显降低，而用对照质粒(psiU6BX-EGFP siRNA表达载体)转染的细胞中则未观察到任何作用。为了确定由psiU6BX-C1958V1引起的基因特异性生长降低，我们对相同的两种细胞系进行了克隆形成分析；如图5(b)和5(d)所示，导入psiU6BX-C1958V1(Si
8-5)明显抑制KLM-1和PK59细胞的生长，与上述降低表达的结果相一致，
psiU6BX-C1958V1(Si 11-3)也中度抑制两种细胞系的生长，psiU6BX-C1958V1(Si 1-8)也抑制PK59细胞的生长。 另外，MTT法也显示当利用psiU6BX-C1958V1(Si 1-8，Si 8-5和Si 11-3)抑制C1958V1表达时，会抑制KLM1和/或PL59细胞的生长(图5(c)，5(e))。
每个结果都用3个独立实验进行了核实。

[0231] 工业实用性

[0232] 与非癌性胰腺组织相比，新的人基因C1958V1或C1958V2的表达在胰腺癌中显著提高。 因此，这些基因可以作为癌症的诊断性标记物，且其编码的蛋白可以在癌症的诊断性分析中使用。

[0233] 本发明人还发现细胞生长被相应于C1958V1或C1958V2基因的反义寡核苷酸或小型干扰RNA所抑制。该发现说明C1958V1或C1958V2蛋白均刺激致癌活性。因此，这些新的致癌蛋白均是抗癌药物开发的有用靶。 例如，封闭C1958V1或C1958V2表达或阻止其活性的试剂可以发现其作为抗癌症剂，尤其是胰腺癌治疗的抗癌症剂的治疗效用。所述抗癌症剂的例子包括反义寡核苷酸、小型干扰RNA和识别C1958V1或C1958V2的抗体。

[0234] 虽然已经详细并以其特定的实施方式对本发明进行了描述，本领域的技术人员可以很容易地不脱离本发明的精神和范围的条件下对其进行各种改变和修改。

[0235] 参考文献

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[0262] JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO

[0263] <120>与人胰腺癌相关的基因和多肽

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[0265] <150>US 60/414,872

[0266] <151>2002-09-30

[0267] <150>US 60/450,889

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[0269] <160>28

[0270] <170>PatentIn version 3.1

[0271] <210>1

[0272] <211>881

[0273] <212>DNA

[0274] <213>人(Homo sapiens)

[0275] <220>

[0276] <221>CDS

[0277] <222>(163)..(390)

[0278] <223>

[0279] <400>1

[0280] gggccatgac ccccgctgct ctgtcttgca ggctcgtcgc cgcggccccc cgagcccgac 60[0281] cgccgccgcc accaccacca gcgcccgggc gggcctcgcg cgcctcgggc gcggctccgc 120[0282] agtgagccca ccaagaagga agcggcctgc agaggtgccg ac atg ggg ctt aag 174[0283] Met Gly Leu Lys

[0284] 1

[0285] atg tcc tgc ctg aaa ggc ttt caa atg tgt gtc agc agc agc agc agc 222[0286] Met Ser Cys Leu Lys Gly Phe Gln Met Cys Val Ser Ser Ser Ser Ser[0287] 5 10 15 20

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[0291] gac atc atc atc acg ccc ccc acc ccc acg ggc atg atg ctg ccg agg 318[0292] Asp Ile Ile Ile Thr Pro Pro Thr Pro Thr Gly Met Met Leu Pro Arg[0293] 40 45 50

[0294] gac ttg ggg agc aca gtc tgg ctg gat gag aca ggg tcg tgc cca gat 366[0295] Asp Leu Gly Ser Thr Val Trp Leu Asp Glu Thr Gly Ser Cys Pro Asp[0296] 55 60 65

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[0312] <400>2

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[0315] Ser Ser Ser Ser Ser His Asp Glu Ala Pro Val Leu Asn Asp Lys His[0316] 20 25 30

[0317] Leu Asp Val Pro Asp Ile Ile Ile Thr Pro Pro Thr Pro Thr Gly Met[0318] 35 40 45

[0319] Met Leu Pro Arg Asp Leu Gly Ser Thr Val Trp Leu Asp Glu Thr Gly[0320] 50 55 60

[0321] Ser Cys Pro Asp Asp Gly Glu Ile Asp Pro Glu Ala

[0322] 65 70 75

[0323] <210>3

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[0325] <212>DNA

[0326] <213>人(Homo sapiens)

[0327] <220>

[0328] <221>CDS

[0329] <222>(197)..(256)

[0330] <223>

[0331] <400>3

[0332] ccgcgggagg cgcgcggctg cccgagcgcc ggccgggcca tgacccccgc tgctctgtct 60[0333] tgcaggctcg tcgccgcggc cccccgagcc cgaccgccgc cgccaccacc accagcgccc 120[0334] gggcgggcct cgcgcgcctc gggcgcggct ccgcagtgag cccaccaaga aggaagcggc 180[0335] ctgcagaggt gccgac atg ggg ctt aag atg tcc tgc ctg aaa gca gca gca 232[0336] Met Gly Leu Lys Met Ser Cys Leu Lys Ala Ala Ala[0337] 1 5 10

[0338] gca gcc acg acg agg ccc ccg tcc tgaacgacaa gcacctggac gtgcccgaca 286[0339] Ala Ala Thr Thr Arg Pro Pro Ser

[0340] 15 20

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[0353] <211>20

[0354] <212>PRT

[0355] <213>人(Homo sapiens)

[0356] <400>4

[0357] Met Gly Leu Lys Met Ser Cys Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr[0358] 1 5 10 15

[0359] Arg Pro Pro Ser

[0360] 20

[0361] <210>5

[0362] <211>21

[0363] <212>DNA

[0364] <213>人工的

[0365] <220>

[0366] <223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

[0367] <400>5

[0368] gtcctgaaag tcaagcacct g 21

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[0370] <211>23

[0371] <212>DNA

[0372] <213>人工的

[0373] <220>

[0374] <223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

[0375] <400>6

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[0377] <210>7

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[0381] <220>

[0382] <223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

[0383] <400>7

[0384] cttgggtctg taacaaagca ttc 23

[0385] <210>8

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[0387] <212>DNA

[0388] <213>人工的

[0389] <220>

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[0391] <400>8

[0392] aaggattatg aggaggttgg tgt 23

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[0395] <212>DNA

[0396] <213>人工的

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[0398] <223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

[0399] <400>9

[0400] gtcctgaaag tcaagcacct g 21

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[0402] <211>23

[0403] <212>DNA

[0404] <213>人工的

[0405] <220>

[0406] <223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

[0407] <400>10

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[0410] <211>30

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[0412] <213>人工的

[0413] <220>

[0414] <223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

[0415] <400>11

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[0422] <223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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[0424] ccgctcgagg gcttctgggt cgatttctcc 30

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[0446] <223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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[0454] <223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列

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[0486] <223>用于siRNA的人工合成靶序列

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[0552] gttgttttac agatacgga 19