一种二氧化钛纳米铕荧光探针转让专利
申请号 : CN200410020716.4
文献号 : CN1707244B
文献日 : 2010-04-07
发明人 : 袁景利 , 谭明乾 , 叶志强 , 王桂兰
申请人 : 中国科学院大连化学物理研究所
摘要 :
本发明涉及无机-有机杂化的二氧化钛荧光纳米微粒，具体地说是一种二氧化钛纳米铕荧光探针及其(生物分子标记检测)应用，首先利用硅烷化试剂与三价铕-β-二酮类荧光配合物形成荧光前驱体，然后再与钛酸酯在醇-水溶液中发生溶胶-凝胶反应，生成一种表面带有生物标记活性基团的强荧光性纳米微粒，这种二氧化钛荧光纳米微粒荧光寿命在400微秒左右，荧光量子收率可以达到11％。将其作为生物分子荧光探针进行时间分辨荧光测定时可以有效消除来自生物样品的背景荧光的干扰。
权利要求 :
1.一种二氧化钛纳米铕荧光探针，其特征在于：其是按如下操作过程制备获得，首先由硅烷化试剂与三价铕-β-二酮类荧光配位体共价键合形成荧光前驱体，然后再与钛酸酯发生共聚形成杂化纳米荧光微粒；所述三价铕-β-二酮类荧光配位体中三价铕离子、β-二酮有机配位体及硅烷化试剂的单体，它们之间的摩尔比例为1∶2-3∶5-50，硅烷化试剂与钛酸酯间的体积比为20μl：0.85ml；
所述钛酸酯为四异丙氧基钛；
所述硅烷化试剂为[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷；
所述β-二酮有机配位体为二齿β-二酮类化合物或四齿β-二酮类化合物；
二齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下：
式中R1＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5；
R2为芳香烃类取代基中之一；
R3为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫腈基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；
四齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下：
式中R4为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫腈基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；R5＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5。
2.根据权利要求1所述的二氧化钛纳米铕荧光探针，其特征在于：制备过程的具体操作为，在室温条件下，将β-二酮有机配位体和硅烷化试剂发生共价结合反应，它们的用量摩尔比为2-3∶5-50，体系中β-二酮有机配位体的摩尔浓度为50～500μmol/L，制成荧光前躯体；然后将荧光前躯体、钛酸酯加入到含有EuCl3的醇-水溶液中，搅拌下室温反应24小时，离心分离即可。
3.根据权利要求2所述的二氧化钛纳米铕荧光探针，其特征在于：所述的醇为乙醇。
说明书 :
技术领域
本发明涉及可用于生物分子标记的纳米铕荧光探针，具体地说是一种二氧化钛纳米铕荧光探针及其(生物分子标记检测)应用。
背景技术
溶胶-凝胶技术为在室温条件下制备无机-有机杂化材料提供了有效的途径。近年来，无机-有机杂化材料在许多研究领域，尤其是材料科学和纳米技术领域越来越受到重视(文献1：U.Narang，R.Wang，P.Prasad，F.Bright，J.Phys.Chem.1994，98，17；文献2：H.Yanagi，T.Hishiki，T.Tobitani，A.Otomo，S.Mashiko，Chem.Phys.Lett.1998，292，332.；文献3：H.R.Li，J.Lin，H.J.Zhang，L.S.Fu，Q.G.Meng，S.B.Wang，Chem.Mater.2002，14，3651；文献4：K.Kanie，T.Sugimoto，J.Am.Chem.Soc.2003，125，10518)。已有报道表明将铕荧光配合物用溶胶-凝胶方法包裹到无机材料中，所制得的材料的物理、化学和机械性能得到了很大的改进和提高(文献5：H.Li，S.Inoue，K.Machida，G.Adachi，J.Lumin.2000，87-89，1069；文献6：L.R.Matthews，E.T.Knobbe，Chem.Mater.1993，5，1697；文献7：O.A.Serra，E.J.Nassar，G.Zapparolli，I.L.V.Rosa，J.Alloys Compd.1994，207-208，454；文献8：O.A.Serra，E.J.Nassar，I.L.V.Rosa，J.Luminescence.1997，72-74，263；文献9：H.H.Li，S.Inoue，K.Machida，G.Adachi，Chem.Mater.1999，11，3171；文献10：M.M.Silva，V.de Zea Bermudez，L.D.Carlos，A.P.P.deAlmeida，M.J.Smith，J.Mater.Chem.1999，9，1735)。然而，这些工作仅仅是将铕荧光配合物通过物理作用掺杂到无机材料中，因此在使用中会产生荧光配合物的泄漏、荧光强度下降和包裹的配合物量较少等问题，极大地妨碍了荧光杂化材料在生化检测方面的应用。
随着现代科学技术的飞速发展，超微量、高灵敏度生物检测技术对医学及生命科学起着越来越重要的作用，其中纳米荧光探针技术是一个具有重要应用前景、超高灵敏度的生物分析检测技术，目前已经开发出来的纳米荧光探针主要有(1)半导体纳米晶(又称量子点)；(2)包有荧光分子的复合纳米荧光探针(其中一类是高分子塑料纳米荧光探针，另一类是内包三联二吡啶钌荧光配合物的纳米硅胶微粒)。这些荧光探针存在灵敏度较低、发光易闪烁、标记过程复杂、荧光分子容易泄漏以及严重的背景荧光干扰等问题，而袁景利等最近开发的铕荧光配合物(文献11：袁景利，王桂兰，三价铕-β-二酮荧光标记物及其应用，中国发明专利，申请号：02132910.9)，可以将吸收的激发光能量高效率地传递给中心铕离子，其既具有较强荧光性能，又具有可用于标记的活性基团，并且已经成功地将其制备成共价键合型的以二氧化硅为基质材料的无机-有机杂化荧光材料(文献12：袁景利，谭明乾，海晓丹，王桂兰，β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应用，中国发明专利，申请号：03133857.7)。其最大优点就是可用于时间分辨荧光测定，完全消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度。
但是，已有的无机-有机荧光杂化材料的研究工作主要以二氧化硅无机材料作为骨架结构为主，很少涉及到其它的无机材料。二氧化钛无机材料化学性质稳定，具有优良的吸收紫外光的性能，已经广泛地应用于高级颜料、化妆品等方面。利用烷氧基钛酸酯在纯水中水解制备成的二氧化钛纳米粒子，由于静电力、范德华力以及短距离相互排斥力等导致纳米粒子易发生团聚，单分散性下降。最近，Eiden-Assmann等人详细研究了溶液离子强度对制备纳米二氧化钛粒子大小的影响(文献13：S.Eiden-Assmann，J.Widoniak，G.Maret，Chem.Mater.2004，16，6)，但是利用控制溶液离子强度来实现以二氧化钛为基质的发光纳米粒子的可控制备技术，并将TiO2纳米微粒用作生物分子标记材料应用于生化检测未见报道。
随着现代科学技术的飞速发展，超微量、高灵敏度生物检测技术对医学及生命科学起着越来越重要的作用，其中纳米荧光探针技术是一个具有重要应用前景、超高灵敏度的生物分析检测技术，目前已经开发出来的纳米荧光探针主要有(1)半导体纳米晶(又称量子点)；(2)包有荧光分子的复合纳米荧光探针(其中一类是高分子塑料纳米荧光探针，另一类是内包三联二吡啶钌荧光配合物的纳米硅胶微粒)。这些荧光探针存在灵敏度较低、发光易闪烁、标记过程复杂、荧光分子容易泄漏以及严重的背景荧光干扰等问题，而袁景利等最近开发的铕荧光配合物(文献11：袁景利，王桂兰，三价铕-β-二酮荧光标记物及其应用，中国发明专利，申请号：02132910.9)，可以将吸收的激发光能量高效率地传递给中心铕离子，其既具有较强荧光性能，又具有可用于标记的活性基团，并且已经成功地将其制备成共价键合型的以二氧化硅为基质材料的无机-有机杂化荧光材料(文献12：袁景利，谭明乾，海晓丹，王桂兰，β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应用，中国发明专利，申请号：03133857.7)。其最大优点就是可用于时间分辨荧光测定，完全消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度。
但是，已有的无机-有机荧光杂化材料的研究工作主要以二氧化硅无机材料作为骨架结构为主，很少涉及到其它的无机材料。二氧化钛无机材料化学性质稳定，具有优良的吸收紫外光的性能，已经广泛地应用于高级颜料、化妆品等方面。利用烷氧基钛酸酯在纯水中水解制备成的二氧化钛纳米粒子，由于静电力、范德华力以及短距离相互排斥力等导致纳米粒子易发生团聚，单分散性下降。最近，Eiden-Assmann等人详细研究了溶液离子强度对制备纳米二氧化钛粒子大小的影响(文献13：S.Eiden-Assmann，J.Widoniak，G.Maret，Chem.Mater.2004，16，6)，但是利用控制溶液离子强度来实现以二氧化钛为基质的发光纳米粒子的可控制备技术，并将TiO2纳米微粒用作生物分子标记材料应用于生化检测未见报道。
发明内容
针对以上的问题，本发明的目的在于提供一种以二氧化钛为基质材料的杂化纳米铕荧光探针及其可控制备和生物分子标记检测应用
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种二氧化钛纳米铕荧光探针，其是按如下操作过程制备获得，首先由硅烷化试剂(多为含有三烷氧基硅基团的化合物)与三价铕-β-二酮类荧光配合物发生共价键合反应形成荧光前驱体，然后再将其与钛酸酯发生溶胶-凝胶反应制备成杂化纳米铕荧光微粒；所述三价铕离子、β-二酮有机配位体、硅烷化试剂的单体及钛酸酯，它们之间的摩尔比例为1∶2～3(三价铕离子与四齿β-二酮和二齿β-二酮有机配位体的摩尔比分别为1∶2和1∶3)∶5-50∶200-1000。
所述可与钛酸酯共聚合的硅烷化试剂的单体为3-氨基丙基三烷氧基硅或[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷等，所述钛酸酯的分子式为Ti(OR)4，其中的R是-CnH2n+1，n＝1～5。
所述β-二酮有机配位体为二齿β-二酮类化合物或四齿β-二酮类化合物；
二齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下：
式中R1＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5；
R2为芳香烃类取代基中之一；
R3为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫腈基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；
四齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下：
式中R4为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫腈基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；R5＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1其中n＝1、2、3、4或5。
二氧化钛为基质材料的杂化纳米铕荧光探针的具体制备过程为：
在室温条件下，将β-二酮和硅烷化试剂发生共价结合反应，它们的用量摩尔比为1∶5～1∶50，体系中β-二酮的摩尔浓度为50～500μmol/L，制成荧光前躯体；然后将荧光前躯体、钛酸酯加入到含有EuCl3的醇-水(体积比为250∶1)溶液中，搅拌下室温反应4～24小时，离心分离即可。
本发明以三价铕与β-二酮类配位体所形成的强荧光性配合物为发光物质，采用化学共价键合的方法将铕荧光配合物牢固地固定在纳米二氧化钛的网络结构中，通过简单的溶胶凝胶技术制备二氧化钛纳米铕荧光探针，并且同时在纳米微粒表面导入可与生物分子共价键合的活性官能团。
所述β-二酮和硅烷化试剂的用量摩尔比为1∶5～1∶50；所述的醇为甲醇、乙醇或异丙醇。
本发明二氧化钛纳米铕荧光探针用于生物分子的标记方法，将二氧化钛杂化纳米荧光微粒分散到0.1mol/L～0.05mol/L磷酸缓冲溶液中，用超声波振荡后，加入生物分子，然后在搅拌下加入戊二醛，室温反应，加入NaBH4还原，室温反应，用磷酸缓冲溶液洗涤数次后备用。生物分子为各种具有生物活性的小分子药物、氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸或核酸。
β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针可在时间分辨荧光测定法中应用。所述的时间分辨荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法，时间分辨荧光DNA杂交测定法，时间分辨荧光显微镜成象测定法，时间分辨荧光细胞测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法。
本发明二氧化钛纳米铕荧光探针具有如下优点：
(1)稳定性好。本发明采用共价键合方法将铕荧光配合物牢牢地固定在纳米微球内，因此获得的纳米铕荧光探针具有十分稳定的结构，解决了采用物理包裹的方法制备的纳米荧光微球易发生荧光分子泄漏，而造成纳米探针荧光强度减弱的问题。
(2)发光强度高。由于采用具有活性官能团的β-二酮类配位体与硅烷化试剂以共价键合的方式形成前驱体，再与钛酸酯进行共聚，因此可以使得到的单个纳米荧光微粒中固定有大量的β-二酮-铕配合物，极大地提高了纳米铕荧光探针的发光强度。
(3)制备方法简单。相对于现有的微乳液制备方法而言，溶胶凝胶方法更为简便，在制备纳米荧光微粒的同时(在前驱体中硅烷化试剂的单体相对于铕荧光配合物是过量的)，在纳米微粒的表面一次性地导入了氨基等可直接用于生物分子的标记的活性官能团，省却了繁琐的纳米微粒表面修饰过程。
(4)二氧化钛纳米荧光微粒具有良好的分散性。本发明制备的二氧化钛纳米粒子不团聚，在缓冲溶液中分散良好。由于是利用控制EuCl3在醇-水溶液中的浓度，来实现对二氧化钛纳米粒子大小及形态的控制，因此比较巧妙地实现了通过调控反应液的离子强度来控制纳米粒子的目的，避免了引入其它外源性离子对制备的杂化荧光材料性质的影响，同时也解决了由于静电力、范德华力以及短距离相互作用力等而导致纳米粒子易发生团聚的问题，实现了单分散。
(5)应用范围广。本发明的纳米荧光材料用于生物标记后的生物分子可用于各种时间分辨荧光生物检测技术，如时间分辨荧光免疫测定、DNA杂交测定、细胞识别、显微镜成像测定、单细胞原位测定、生物芯片测定等。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种二氧化钛纳米铕荧光探针，其是按如下操作过程制备获得，首先由硅烷化试剂(多为含有三烷氧基硅基团的化合物)与三价铕-β-二酮类荧光配合物发生共价键合反应形成荧光前驱体，然后再将其与钛酸酯发生溶胶-凝胶反应制备成杂化纳米铕荧光微粒；所述三价铕离子、β-二酮有机配位体、硅烷化试剂的单体及钛酸酯，它们之间的摩尔比例为1∶2～3(三价铕离子与四齿β-二酮和二齿β-二酮有机配位体的摩尔比分别为1∶2和1∶3)∶5-50∶200-1000。
所述可与钛酸酯共聚合的硅烷化试剂的单体为3-氨基丙基三烷氧基硅或[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷等，所述钛酸酯的分子式为Ti(OR)4，其中的R是-CnH2n+1，n＝1～5。
所述β-二酮有机配位体为二齿β-二酮类化合物或四齿β-二酮类化合物；
二齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下：
式中R1＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5；
R2为芳香烃类取代基中之一；
R3为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫腈基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；
四齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下：
式中R4为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫腈基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；R5＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1其中n＝1、2、3、4或5。
二氧化钛为基质材料的杂化纳米铕荧光探针的具体制备过程为：
在室温条件下，将β-二酮和硅烷化试剂发生共价结合反应，它们的用量摩尔比为1∶5～1∶50，体系中β-二酮的摩尔浓度为50～500μmol/L，制成荧光前躯体；然后将荧光前躯体、钛酸酯加入到含有EuCl3的醇-水(体积比为250∶1)溶液中，搅拌下室温反应4～24小时，离心分离即可。
本发明以三价铕与β-二酮类配位体所形成的强荧光性配合物为发光物质，采用化学共价键合的方法将铕荧光配合物牢固地固定在纳米二氧化钛的网络结构中，通过简单的溶胶凝胶技术制备二氧化钛纳米铕荧光探针，并且同时在纳米微粒表面导入可与生物分子共价键合的活性官能团。
所述β-二酮和硅烷化试剂的用量摩尔比为1∶5～1∶50；所述的醇为甲醇、乙醇或异丙醇。
本发明二氧化钛纳米铕荧光探针用于生物分子的标记方法，将二氧化钛杂化纳米荧光微粒分散到0.1mol/L～0.05mol/L磷酸缓冲溶液中，用超声波振荡后，加入生物分子，然后在搅拌下加入戊二醛，室温反应，加入NaBH4还原，室温反应，用磷酸缓冲溶液洗涤数次后备用。生物分子为各种具有生物活性的小分子药物、氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸或核酸。
β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针可在时间分辨荧光测定法中应用。所述的时间分辨荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法，时间分辨荧光DNA杂交测定法，时间分辨荧光显微镜成象测定法，时间分辨荧光细胞测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法。
本发明二氧化钛纳米铕荧光探针具有如下优点：
(1)稳定性好。本发明采用共价键合方法将铕荧光配合物牢牢地固定在纳米微球内，因此获得的纳米铕荧光探针具有十分稳定的结构，解决了采用物理包裹的方法制备的纳米荧光微球易发生荧光分子泄漏，而造成纳米探针荧光强度减弱的问题。
(2)发光强度高。由于采用具有活性官能团的β-二酮类配位体与硅烷化试剂以共价键合的方式形成前驱体，再与钛酸酯进行共聚，因此可以使得到的单个纳米荧光微粒中固定有大量的β-二酮-铕配合物，极大地提高了纳米铕荧光探针的发光强度。
(3)制备方法简单。相对于现有的微乳液制备方法而言，溶胶凝胶方法更为简便，在制备纳米荧光微粒的同时(在前驱体中硅烷化试剂的单体相对于铕荧光配合物是过量的)，在纳米微粒的表面一次性地导入了氨基等可直接用于生物分子的标记的活性官能团，省却了繁琐的纳米微粒表面修饰过程。
(4)二氧化钛纳米荧光微粒具有良好的分散性。本发明制备的二氧化钛纳米粒子不团聚，在缓冲溶液中分散良好。由于是利用控制EuCl3在醇-水溶液中的浓度，来实现对二氧化钛纳米粒子大小及形态的控制，因此比较巧妙地实现了通过调控反应液的离子强度来控制纳米粒子的目的，避免了引入其它外源性离子对制备的杂化荧光材料性质的影响，同时也解决了由于静电力、范德华力以及短距离相互作用力等而导致纳米粒子易发生团聚的问题，实现了单分散。
(5)应用范围广。本发明的纳米荧光材料用于生物标记后的生物分子可用于各种时间分辨荧光生物检测技术，如时间分辨荧光免疫测定、DNA杂交测定、细胞识别、显微镜成像测定、单细胞原位测定、生物芯片测定等。
附图说明
图1是二氧化钛杂化纳米荧光微粒的透射电子显微镜照片。
图2是二氧化钛杂化纳米铕荧光微粒的常规荧光光谱(a)和时间分辨荧光光谱(b)。
图3是不同温度条件下处理的纳米微粒的X射线粉末衍射图(A)室温，(B)360℃煅烧4小时以及(C)500℃煅烧4小时。
图4是二氧化钛杂化纳米荧光微粒的TG-DSC图。
图5是BHHCT配位体，纯TiO2纳米微粒以及键合有BHHCT-Eu3+二氧化钛纳米微粒的红外光谱图。
图6是BHHCT配位体，APTS-BHHCT以及APTS-BHHCT-Eu3+的紫外-可见吸收光谱图。
图7是用二氧化钛杂化纳米微粒标记牛血清白蛋白BSA分子的时间分辨荧光测定曲线。
图8是用二氧化钛杂化纳米荧光粒子标记测定牛血清白蛋白BSA的工作曲线。
图2是二氧化钛杂化纳米铕荧光微粒的常规荧光光谱(a)和时间分辨荧光光谱(b)。
图3是不同温度条件下处理的纳米微粒的X射线粉末衍射图(A)室温，(B)360℃煅烧4小时以及(C)500℃煅烧4小时。
图4是二氧化钛杂化纳米荧光微粒的TG-DSC图。
图5是BHHCT配位体，纯TiO2纳米微粒以及键合有BHHCT-Eu3+二氧化钛纳米微粒的红外光谱图。
图6是BHHCT配位体，APTS-BHHCT以及APTS-BHHCT-Eu3+的紫外-可见吸收光谱图。
图7是用二氧化钛杂化纳米微粒标记牛血清白蛋白BSA分子的时间分辨荧光测定曲线。
图8是用二氧化钛杂化纳米荧光粒子标记测定牛血清白蛋白BSA的工作曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例仅用于对本发明进行说明，基于相同原理和类似原料的方法也属本发明的范围。
实施例1
二氧化钛杂化纳米荧光微粒的制备及表征
(1)共价键合二齿铕-β-二酮类配合物的二氧化钛纳米荧光微粒的制备：
将12.0mg二齿-β-二酮类配位体加入到20μl[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(APTS)中，超声波作用下反应20分钟，然后在搅拌状态下，将β-二酮类配位体-APTS结合体和200μlEuCl3(EuCl3的摩尔用量为二齿-β-二酮类配位体摩尔量的三分之一)水溶液加入到50ml乙醇中，搅拌10分钟后，加入0.85ml四异丙氧基钛(TTIP)，室温反应24小时后，制备的杂化纳米荧光微粒用丙酮沉淀出来，离心收集沉淀，用乙醇和水洗以除去未反应的原料。
(2)共价键合四齿BHHCT-Eu3+配合物的二氧化钛纳米荧光微粒的制备：
将7.1mg BHHCT加入到20μl APTS中，超声波作用下反应20分钟，然后在搅拌状态下，将BHHCT-APTS结合体和200μlEuCl3(EuCl3的摩尔用量为BHHCT摩尔量的二分之一)水溶液加入到50ml乙醇中，搅拌10分钟后，加入0.85ml四异丙氧基钛(TTIP)，室温反应24小时后，制备的杂化纳米荧光微粒用丙酮沉淀出来，离心收集沉淀，用乙醇和水洗以除去未反应的原料。
(3)共价键合四齿BCDOT-Eu3+配合物的二氧化钛纳米荧光微粒的制备：
将7.3mg BCDOT加入到20μl APTS中，超声波作用下反应20分钟，然后在搅拌状态下，将BHHCT-APTS结合体和200μlEuCl3(EuCl3的摩尔用量为BHHCT摩尔量的二分之一)水溶液加入到50ml乙醇中，搅拌10分钟后，加入0.85ml四异丙氧基钛(TTIP)，室温反应24小时后，制备的杂化纳米荧光微粒用丙酮沉淀出来，离心收集沉淀，用乙醇和水洗以除去未反应的原料。
(4)二氧化钛杂化纳米荧光微粒的性质表征
(a)纳米荧光微粒的形态及大小尺寸
图1是二氧化钛杂化纳米荧光微粒的透射电子显微镜照片，从照片可见键合有BHHCT-Eu3+配合物的二氧化钛杂化纳米荧光微粒为类球状，尺寸在100nm左右，微粒之间分散性较好。微粒的大小可以通过改变反应液的离子强度、反应溶剂等来控制。
(b)荧光光谱特性
图2是二氧化钛杂化纳米荧光微粒在0.05mol/L pH值9.1的Tris-HCl(含0.05％Tween-20)缓冲溶液中的荧光光谱和时间分辨荧光光谱。图中可见杂化纳米粒子的荧光光谱的发光峰存在严重的散乱光干扰峰，而它的时间分辨荧光光谱的发光峰则彻底没有干扰峰的存在，其发射光谱则为尖锐的窄峰。自由配合物BHHCT-Eu3+的荧光光谱上最大发光波长是612nm，而制成纳米荧光微粒后其荧光光谱的最大发光波长也是612nm，波长没有发生变化。该法制得的纳米荧光微粒的荧光寿命经测定为0.394毫秒，说明纳米荧光微粒的荧光仍保持了铕配合物的长荧光寿命的特征。
(c)杂化纳米荧光微粒的晶态
X射线粉末衍射测定结果见图3。由图中可见，室温条件下制备的二氧化钛纳米荧光微粒为非晶态的无定形结构，将纳米微粒在360℃煅烧4小时后仍为无定形结构，而经500℃煅烧4小时后就转变成锐钛矿型结构，同时夹带有少量板钛矿的晶型结构。
(d)杂化纳米荧光微粒的热分析
热分析的实验结果(见图4)表明无定形结构的杂化纳米微粒中明显有水存在。示差扫描量热曲线有3个峰，第一个峰从50℃开始到240℃结束，是一个吸热过程，失重达到20％左右，这是因为纳米微粒释放结合水的结果。第二个峰大约在330℃左右，是放热过程，继续失重28％左右，这主要为BHHCT和APTS等有机物部分分解的结果。而第三个放热峰大约在490℃附近，表明发生了从无定形向锐钛矿的晶型转变，这与500℃煅烧后纳米微粒的XRD检测结果相一致。
(e)杂化纳米荧光微粒的红外光谱
图5为BHHCT配位体、纯TiO2纳米微粒以及键合有BHHCT-Eu3+二氧化钛纳米微粒的红外光谱图。由图5B和C可见，在3200and 610cm-1的两个强吸收峰是-OH的伸缩和弯曲振动吸收，1044～1129cm-1附近是Ti-O-C和C-O键的强吸收，说明醇氧基的存在。此外从两个纳米微粒的红外谱图上均能发现位于1442cm-1附近的-C-H的弯曲振动和位于1404cm-1附近的C-O-H的弯曲振动峰。从BHHCT配位体的红外光谱图(图5A)可见位于1231和1343cm-1附近的C-F特征峰，同样这两个峰也出现在键合有BHHCT-Eu3+二氧化钛纳米微粒的红外光谱图上，图5C中在1609cm-1处较弱的峰也是来自于BHHCT-Eu3+配合物，这些都说明杂化二氧化钛纳米微粒中有BHHCT-Eu3+配合物的存在。
(f)BHHCT配位体、APTS-BHHCT结合体以及APTS-BHHCT-Eu3+的紫外-可见吸收光谱图
与BHHCT配位体的紫外-可见吸收光谱图相比，图6B所示的APTS-BHHCT结合体在261nm处出现一个新的吸收峰，而位于337nm处的主要吸收峰没有发生变化，这说明形成了APTS-BHHCT结合体(APTS经测量证明在230-300nm没有吸收)。当加入EuCl3后，APTS-BHHCT结合体的吸收峰均发生了红移(较小的吸收峰从261nm移动到274nm，最大吸收峰从337nm红移到340nm)。这些都说明在APTS-BHHCT-EuCl3溶液中，形成了APTS-BHHCT-Eu3+配合物结合体。
实施例2
使用二氧化钛杂化纳米荧光微粒作为荧光探针的时间分辨荧光测定法测定牛血清白蛋白(简称BSA)。
(a)二氧化钛杂化纳米荧光微粒标记牛血清白蛋白
将3.2mg二氧化钛杂化纳米荧光微粒分散到1.0ml的0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.1)中，用超声波振荡20分钟后，加入8.5mg牛血清白蛋白，然后在搅拌下加入500μl的1％戊二醛(磷酸缓冲溶液)，室温反应24小时，加入1.0mgNaBH4还原，室温反应2小时，用磷酸缓冲溶液洗涤数次后备用。
(b)二氧化钛杂化纳米荧光微粒标记牛血清白蛋白的检测灵敏度
将45μl倍比稀释的二氧化钛纳米微粒-BSA结合体BSA浓度(从10-13到10-7mol/L)加入到96微孔板的孔中，每一个浓度的溶液平行加到的4个孔中，取其荧光强度的平均值。在含有0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液和0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液的稀释曲线见图7。测定用仪器为Perkin Elmer VICTOR 1420多标记计数仪(PerkinElmer LifeScience公司产)，测定条件为：激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算BSA测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限分别为6.2×10-12mol/L(在0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液中)和9.1×10-12mol/L(在0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液中)。
(c)牛血清白蛋白固相时间分辨荧光测定
为了考察二氧化钛纳米荧光微粒作为荧光探针用于固相时间分辨荧光生化检测的可能性，将0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液稀释的二氧化钛纳米微粒-BSA结合体加入到微孔板中，室温反应3小时，再用含0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲液洗3次，然后进行固相时间分辨荧光测定。用该法测定BSA的工作曲线如图8所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算BSA测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为2.0ng/ml，说明这种新型的二氧化钛杂化纳米荧光微粒可以作为荧光探针用于固相时间分辨荧光生化检测。
实施例1
二氧化钛杂化纳米荧光微粒的制备及表征
(1)共价键合二齿铕-β-二酮类配合物的二氧化钛纳米荧光微粒的制备：
将12.0mg二齿-β-二酮类配位体加入到20μl[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(APTS)中，超声波作用下反应20分钟，然后在搅拌状态下，将β-二酮类配位体-APTS结合体和200μlEuCl3(EuCl3的摩尔用量为二齿-β-二酮类配位体摩尔量的三分之一)水溶液加入到50ml乙醇中，搅拌10分钟后，加入0.85ml四异丙氧基钛(TTIP)，室温反应24小时后，制备的杂化纳米荧光微粒用丙酮沉淀出来，离心收集沉淀，用乙醇和水洗以除去未反应的原料。
(2)共价键合四齿BHHCT-Eu3+配合物的二氧化钛纳米荧光微粒的制备：
将7.1mg BHHCT加入到20μl APTS中，超声波作用下反应20分钟，然后在搅拌状态下，将BHHCT-APTS结合体和200μlEuCl3(EuCl3的摩尔用量为BHHCT摩尔量的二分之一)水溶液加入到50ml乙醇中，搅拌10分钟后，加入0.85ml四异丙氧基钛(TTIP)，室温反应24小时后，制备的杂化纳米荧光微粒用丙酮沉淀出来，离心收集沉淀，用乙醇和水洗以除去未反应的原料。
(3)共价键合四齿BCDOT-Eu3+配合物的二氧化钛纳米荧光微粒的制备：
将7.3mg BCDOT加入到20μl APTS中，超声波作用下反应20分钟，然后在搅拌状态下，将BHHCT-APTS结合体和200μlEuCl3(EuCl3的摩尔用量为BHHCT摩尔量的二分之一)水溶液加入到50ml乙醇中，搅拌10分钟后，加入0.85ml四异丙氧基钛(TTIP)，室温反应24小时后，制备的杂化纳米荧光微粒用丙酮沉淀出来，离心收集沉淀，用乙醇和水洗以除去未反应的原料。
(4)二氧化钛杂化纳米荧光微粒的性质表征
(a)纳米荧光微粒的形态及大小尺寸
图1是二氧化钛杂化纳米荧光微粒的透射电子显微镜照片，从照片可见键合有BHHCT-Eu3+配合物的二氧化钛杂化纳米荧光微粒为类球状，尺寸在100nm左右，微粒之间分散性较好。微粒的大小可以通过改变反应液的离子强度、反应溶剂等来控制。
(b)荧光光谱特性
图2是二氧化钛杂化纳米荧光微粒在0.05mol/L pH值9.1的Tris-HCl(含0.05％Tween-20)缓冲溶液中的荧光光谱和时间分辨荧光光谱。图中可见杂化纳米粒子的荧光光谱的发光峰存在严重的散乱光干扰峰，而它的时间分辨荧光光谱的发光峰则彻底没有干扰峰的存在，其发射光谱则为尖锐的窄峰。自由配合物BHHCT-Eu3+的荧光光谱上最大发光波长是612nm，而制成纳米荧光微粒后其荧光光谱的最大发光波长也是612nm，波长没有发生变化。该法制得的纳米荧光微粒的荧光寿命经测定为0.394毫秒，说明纳米荧光微粒的荧光仍保持了铕配合物的长荧光寿命的特征。
(c)杂化纳米荧光微粒的晶态
X射线粉末衍射测定结果见图3。由图中可见，室温条件下制备的二氧化钛纳米荧光微粒为非晶态的无定形结构，将纳米微粒在360℃煅烧4小时后仍为无定形结构，而经500℃煅烧4小时后就转变成锐钛矿型结构，同时夹带有少量板钛矿的晶型结构。
(d)杂化纳米荧光微粒的热分析
热分析的实验结果(见图4)表明无定形结构的杂化纳米微粒中明显有水存在。示差扫描量热曲线有3个峰，第一个峰从50℃开始到240℃结束，是一个吸热过程，失重达到20％左右，这是因为纳米微粒释放结合水的结果。第二个峰大约在330℃左右，是放热过程，继续失重28％左右，这主要为BHHCT和APTS等有机物部分分解的结果。而第三个放热峰大约在490℃附近，表明发生了从无定形向锐钛矿的晶型转变，这与500℃煅烧后纳米微粒的XRD检测结果相一致。
(e)杂化纳米荧光微粒的红外光谱
图5为BHHCT配位体、纯TiO2纳米微粒以及键合有BHHCT-Eu3+二氧化钛纳米微粒的红外光谱图。由图5B和C可见，在3200and 610cm-1的两个强吸收峰是-OH的伸缩和弯曲振动吸收，1044～1129cm-1附近是Ti-O-C和C-O键的强吸收，说明醇氧基的存在。此外从两个纳米微粒的红外谱图上均能发现位于1442cm-1附近的-C-H的弯曲振动和位于1404cm-1附近的C-O-H的弯曲振动峰。从BHHCT配位体的红外光谱图(图5A)可见位于1231和1343cm-1附近的C-F特征峰，同样这两个峰也出现在键合有BHHCT-Eu3+二氧化钛纳米微粒的红外光谱图上，图5C中在1609cm-1处较弱的峰也是来自于BHHCT-Eu3+配合物，这些都说明杂化二氧化钛纳米微粒中有BHHCT-Eu3+配合物的存在。
(f)BHHCT配位体、APTS-BHHCT结合体以及APTS-BHHCT-Eu3+的紫外-可见吸收光谱图
与BHHCT配位体的紫外-可见吸收光谱图相比，图6B所示的APTS-BHHCT结合体在261nm处出现一个新的吸收峰，而位于337nm处的主要吸收峰没有发生变化，这说明形成了APTS-BHHCT结合体(APTS经测量证明在230-300nm没有吸收)。当加入EuCl3后，APTS-BHHCT结合体的吸收峰均发生了红移(较小的吸收峰从261nm移动到274nm，最大吸收峰从337nm红移到340nm)。这些都说明在APTS-BHHCT-EuCl3溶液中，形成了APTS-BHHCT-Eu3+配合物结合体。
实施例2
使用二氧化钛杂化纳米荧光微粒作为荧光探针的时间分辨荧光测定法测定牛血清白蛋白(简称BSA)。
(a)二氧化钛杂化纳米荧光微粒标记牛血清白蛋白
将3.2mg二氧化钛杂化纳米荧光微粒分散到1.0ml的0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.1)中，用超声波振荡20分钟后，加入8.5mg牛血清白蛋白，然后在搅拌下加入500μl的1％戊二醛(磷酸缓冲溶液)，室温反应24小时，加入1.0mgNaBH4还原，室温反应2小时，用磷酸缓冲溶液洗涤数次后备用。
(b)二氧化钛杂化纳米荧光微粒标记牛血清白蛋白的检测灵敏度
将45μl倍比稀释的二氧化钛纳米微粒-BSA结合体BSA浓度(从10-13到10-7mol/L)加入到96微孔板的孔中，每一个浓度的溶液平行加到的4个孔中，取其荧光强度的平均值。在含有0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液和0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液的稀释曲线见图7。测定用仪器为Perkin Elmer VICTOR 1420多标记计数仪(PerkinElmer LifeScience公司产)，测定条件为：激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算BSA测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限分别为6.2×10-12mol/L(在0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液中)和9.1×10-12mol/L(在0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液中)。
(c)牛血清白蛋白固相时间分辨荧光测定
为了考察二氧化钛纳米荧光微粒作为荧光探针用于固相时间分辨荧光生化检测的可能性，将0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲溶液稀释的二氧化钛纳米微粒-BSA结合体加入到微孔板中，室温反应3小时，再用含0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲液洗3次，然后进行固相时间分辨荧光测定。用该法测定BSA的工作曲线如图8所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算BSA测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为2.0ng/ml，说明这种新型的二氧化钛杂化纳米荧光微粒可以作为荧光探针用于固相时间分辨荧光生化检测。