用于口服给药的肉毒毒素制剂

摘要

用于向患者口服的含有肉毒毒素和载体的药用组合物，由于粘膜粘附、漂浮、沉淀、扩张或由一种药剂引发的胃排空延迟，制剂本身表现出胃潴留。

权利要求

1.一种肉毒毒素口服制剂，包括

(a)含有聚合物的载体，所述聚合物选自聚交酯、聚乙醇酸交酯和聚酐；

(b)与所述载体结合的稳定的肉毒毒素，从而形成肉毒口服制剂，其中治疗量的肉毒毒素可在患者的G I道中从载体中释放出来。

2.权利要求1的口服制剂，其中肉毒毒素包括：

(a)第一元件，所述第一元件含有能在生理条件下与神经元细胞表面受体特异性结合的结合元件，(b)第二元件，所述第二元件含有能促进多肽穿过神经元细胞膜转移的转运元件，(c)第三元件，所述第三元件含有治疗元件，当该治疗元件存在于神经元的细胞质中时，可抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用。

3.权利要求2的口服制剂，其中治疗元件可切割SNARE蛋白，从而抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用。

4.权利要求3的口服制剂，其中SNARE蛋白选自突触融合蛋白、SNAP-25和VAMP。

说明书

用于口服给药的肉毒毒素制剂

背景技术

[0001] 本发明涉及药用组合物。具体而言，本发明涉及用于口服给药的肉毒毒素药用组合物。

[0002] 药用组合物可制成用于口服、静脉内、肌肉、皮下或吸入及其它途径(即灌肠、鼻内、鞘内等)给药的形式。药物(作为溶液、悬浊液、片剂、胶囊等)口服给药的益处包括治疗效果快，并且方便患者。

[0003] 已知药物口服给药在胃肠道中的目标部位产生直接效果，这与药用组合物吸收到患者循环系统后(即抗酸药、缓泄药)由其活性成份产生治疗效果相反。通过粘膜粘附、漂浮、沉淀、扩张机制或通过同时给药延缓胃排空的药剂可对固体剂型药物的胃潴留(gastricretention)进行控制。

[0004] 粘膜粘附是一种将合成及天然大分子在体内粘附到粘膜表面的方法。然后如果将上述物质掺入药物制剂中，可提高粘膜细胞对药物的吸收或延长药物在该部位的释放时间。对于合成聚合物，如壳聚糖、卡波泊尔(carbopol)和卡波姆(carbomer)，生物/粘膜粘附机制是大量不同的物理化学相互作用的结果。生物的生物/粘膜粘合剂，如植物凝集素表现出与细胞表面和粘蛋白的特异性相互作用，从而被视为“第二代”生物粘合剂。Woodley，J.，Bioadhesion：new possibilitiesfor drug administration ？，Clin Pharmacokinet 2001；40(2)：77～84。粘膜粘附用于使口服剂型具有抵抗胃壁强大推进力的能力。通过使用粘膜粘附作为胃保持力(gastroretentive force)可克服胃粘膜不断产生粘液以代替由于蠕动收缩以及胃内容物的稀释而损失的粘液。

[0005] 对粘膜粘附纳米粒子系统(mucoadhesive nanoparticulatesystem)，包括脂质体和聚合纳米粒子已有评价。通过将粘膜粘附聚合物，如壳聚糖和卡波泊尔涂覆到粒子系统的表面可使其具有粘膜粘附力。上述表面修饰的可行性已通过测量ζ电势得到证实。评价方法包括粒子计数法，该方法使用Coulter计数器对聚合物涂覆的脂质体进行计数。粘膜粘附纳米粒子已用于口服给药的肽药物，并且比无涂覆的系统更有效，作用时间更长。Takeuchi H.等，Mucoadhesivenanoparticulate systems for peptide drug delivery，Adv DrugDeliv Rev 2001年3月23日；47(1)：39～54。

[0006] 粘膜粘附药物递送设备与传统剂型相比具有几个优势，包括具有通过控制药物向身体的释放优化其疗效的能力。已有显示多种聚(丙烯酸)(PAA)水凝胶能抑制胃肠酶，如胰岛素的水解活性，从而提高药物的生物药效率。丙烯酸基聚合物可用于将粘膜粘附递送系统(delivery system)附着到粘膜上。由亲粘膜性的(mucophilic)共聚物，如聚(乙二醇)(PEG)接枝到聚合物主链上所修饰的聚合物水凝胶可促进粘附过程。这是因为所述接枝链能从网络扩散到粘膜层。P(AA-g-EG)膜可通过UV引发的自由基溶液聚合合成。不同类型的水凝胶可用不同摩尔进料比的AA∶PEG合成。聚合物水凝胶的特征在于粘膜粘附，以量化PEG接枝的链对粘膜粘附的影响。使用张力仪可测定生物粘附的键合强度，并从而计算粘附功。含有40％AA和60％PEG(40∶60AA/EG)的水凝胶可表现出最强的粘膜粘附。上述结果可归因于两单体的协同作用。AA官能团可允许聚合物形成多个氢键并使其出现大程度扩张。PEG粘合剂(tether)用作粘膜粘附的促进剂(promoter)。它们渗透到粘膜中并桥接碱性水凝胶和粘液。上述结果还可根据最近粘膜粘附中表面覆盖的Huang-Peppas模型(2002)和链长度效应解释。

[0007] 漂浮作为潴留机制需要有可使剂型在其上漂浮的液体存在，并且还假定患者在GRI过程中保持直立姿势，因为在仰卧姿势中，幽门位于胃体上方并将加速漂浮物质的排空。因此，漂浮可作为口服制剂胃潴留的基本原理。

[0008] 沉淀作用已成功用作丸剂的潴留机制，所述丸剂小到足以滞留在幽门区附近的胃体皱褶或皱襞中，所述幽门区是器官的一部分，它在直立姿势中处于最低位置。皱褶中捕获3
的高密度丸剂(约3g/cm)也有抵抗胃壁蠕动的倾向。扩张已显示为可能可靠的潴留机制。
具有如下特征的几种设备已有描述：所述设备在给药后伸展，打开或由设备中产生的二氧化碳膨胀。如果上述剂型在扩张状态下的直径超过约12～18mm，则将被排出在幽门括约肌的通道之外。多种机制确保扩张的完全可逆性。

[0009] 可由口服给药的药用组合物治疗的胃肠病可包括异常肠功能、腹胀、便秘、科恩病(Cohn’s disease)、腹泻、脂肪吸收障碍、食物变态反应(food allergy)、胃肠瘘、葡萄糖耐受不良(intolerance)、谷蛋白耐受不良、消化吸收损伤、乳糖耐受不良、肠功能受限(limitedgut function)、吸收不良综合征、胰腺障碍、短肠综合征、容积不耐受(volume intolerance)、呕吐、恶心、胃灼热、阑尾炎、憩室病、胆结石、胃肠反流、炎症、消化性溃疡、痔疮、疝气和肥胖症。

[0010] 胃肠运动(motility)可通过消化系统的活动以及其中内容物的转运定义。当消化道任何部分中的神经或肌肉未以非常协调的方式运行时，人就会出现与运动性问题相关的症状。上述症状可包括从胃灼热到便秘。其它症状还可能包括腹胀、恶心、呕吐和腹泻。

[0011] 口服制剂可制成在特定时间段以预定速度将药物递送到GI道中。通常，药物从口服制剂中释放出来的速度随着口服制剂材料和包括的药物的生物化学性能变化。一般而言，口服制剂包括由很少或不引起宿主应答的惰性物质制成的载体。

[0012] 口服制剂可包括掺入载体材料中的具有生物活性的药物。载体可为聚合物或生物陶瓷材料。口服制剂可在吞咽后以产生所需治疗功效的方式和量释放药物。

[0013] 扩散、化学反应或溶剂激活以及磁、超声波或温度变化等因素的影响可使聚合载体材料释放药物。扩散可源自贮库(reservoir)或基体(matrix)。通过聚合物降解或药物从聚合物切开可进行化学控制。溶剂激活可涉及聚合物的溶胀或渗透效应。参考例如Science 249；1527～1533：1990。

[0014] 膜口服制剂或贮库口服制剂依赖于生物活性剂穿过聚合物膜扩散。基体口服制剂由聚合物基体组成，生物活性剂在基体中均匀分布。溶胀控制的释放系统通常基于亲水的玻璃聚合物，所述聚合物在有生物流体存在时或在特定环境刺激下发生溶胀。

[0015] 口服制剂可包括基本无毒性、不致癌的非致免疫性载体。适宜的口服制剂材料可包括下列聚合物，如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)(对-HEMA)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(对-NVP)+，聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、乙烯-乙酸乙烯共聚物(EVAc)、乙烯基吡咯烷酮/丙烯酸甲酯共聚物、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚酐、聚(原酸酯)、胶原质和纤维素衍生物以及生物陶瓷，如羟基磷灰石(HPA)、磷酸三钙(TCP)和磷酸铝钙(ALCAP)。乳酸、乙醇酸、胶原质及其共聚物均可用于制造可生物降解的口服制剂。

[0016] 可生物降解的口服制剂可用于克服不可生物降解的口服制剂的明显不足。参考，例如美国专利No.3,773,919和4,767,628。可生物降解的聚合物可为表面腐蚀聚合物(surface eroding polymer)，这与表现出整体或均匀降解的聚合物不同。表面腐蚀聚合物仅从其外表面降解，因此药物释放与聚合物的腐蚀速度成比例。适宜的上述聚合物可为聚酐。口服制剂可为如下形式：固体圆柱体口服制剂、丸状微囊或微球。Drug Development and Industrial Pharmacy24(12)；1129～1138：1998。可生物降解的口服制剂可基于生物活性物质的膜释放或基体释放。口服给药的可生物降解的微球可通过压成圆片或丸剂制得。

[0017] 口服制剂可由可生物降解的材料制造，例如已知的聚合物有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己酸内酯和胆固醇。

[0018] 已知至少有三种方法制备聚合物微球，包括由可生物降解的聚合物组成的微球。参考，例如Journal of Controlled Release 52(3)；227～237：1998。例如，固体药物制品(preparation)可分散到由可生物降解的聚合物在有机溶剂中形成的连续相中，或者药物的水溶液可乳化为聚合物-有机相。然后可通过喷雾干燥、相分离或复乳剂技术(double emulsion technique)形成微球。

[0019] 肉毒毒素

[0020] 根据形态学和功能的分类，梭菌属有超过127个种类。厌氧的革兰氏阳性菌肉毒梭菌产生有效的多肽神经毒素即肉毒毒素，它在人类和动物中导致被称为肉毒中毒的神经麻痹疾病。肉毒梭菌的孢子发现存在于土壤中并且可在家庭式罐头厂未正确消毒的密封食品容器中生长，这是导致多起肉毒中毒的原因。肉毒中毒作用通常出现于食用被肉毒梭菌培养物或孢子感染的食品后的18～36小时。显然，肉毒毒素可不衰减地穿过肠的衬里层(lining)并攻击外周运动神经元。肉毒毒素中毒的症状可从行走、吞咽和说话困难进行到呼吸肌麻痹和死亡。

[0021] A型肉毒毒素是人类已知的最致命的天然生物剂。大约50皮克的市售A型肉毒1
毒素(纯化的神经毒素络合物) 即达到小鼠的LD50(即1个单位)。每单位 含有
-17
约50皮克(约5.6×10 摩尔)的A型肉毒毒素络合物。有趣的是，在摩尔级上，A型肉毒毒素的致死性比白喉高约18亿倍，比氰化钠高约6亿倍，比眼镜蛇毒素高约3千万倍，比霍乱高约1.2千万倍。Singh，Critical Aspects of BacterialProtein Toxins，Natural Toxin II的63～84页(第四章)，B.R.Singh等编辑，Plenum Press，纽约(1996)(根据约0.05ng 等于1单位的事实对其中定义的A型肉毒毒素0.3ng等于1U这一LD50
进行了校正)。1单位(U)的肉毒毒素定义为将其腹膜内注射到重18～20克的雌性Swiss Webster小鼠中的LD50。

[0022] 七种免疫学上不同的肉毒神经毒素已有表征，分别为血清A、B、C1、D、E、F和G型肉毒神经毒素，各种血清型通过用类型特异性抗体中和区分。不同血清型的肉毒毒素在其感染的动物物种以及所引起的麻痹的严重程度和持续时间上均不相同。例如，据测定根据在大鼠中所测得的麻痹产生的速度，A型肉毒毒素比B型肉毒毒素强500倍。此外，据测定在灵长类动物中B型肉毒毒素在480U/kg的剂量下是无毒性的，而该剂量是A型肉毒毒素灵长类LD50的约12倍。Moyer E等，Botulinum Toxin Type B：Experimental and Clinical Experience，“Therapy With Botulinum Toxin”的第6章，71～85页，Jankovic，J.等编辑(1994)，Marcel Dekker，Inc.。肉毒毒素显然以高亲和力与胆碱能运动神经元结合，并转运到神经元中，从而阻断乙酰胆碱的释放。

[0023] 不论何种血清型，其毒素中毒的分子机理似乎都是相似的并包括至少三个步骤或阶段。在过程的第一个步骤中，毒素通过重链即H链和细胞表面受体之间特异性的相互作用与靶神经元的突触前膜结合；一般认为对于各种类型的肉毒毒素和破伤风毒素，上述受体是不同的。H链的羧基端片断HC似乎对于毒素靶向细胞表面很重要。

[0024] 在第二个步骤中，毒素穿过中毒细胞的质膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用(endocytosis)被细胞吞没并形成含有毒素的内体。

[0025]

[0026] 从加利福尼亚欧文市的阿勒根公司购得，商标为 每瓶100单位

[0027] 然后毒素从内体中逃离到细胞的细胞质中。这一步骤被认为是由H链的氨基端片断HN介导的，当pH为约5.5或以下时，HN即产生应答引发毒素的构象变化。已知内体具有降低内体内pH的质子泵。构象变化使疏水残基暴露在毒素中，从而允许毒素将自身嵌入内体膜中。然后毒素(或至少轻链)通过内体膜转运到细胞质中。

[0028] 肉毒毒素活性机制的最后一步似乎涉及连接重链H链和轻链L链的二硫键的还原。肉毒毒素和破伤风毒素的全部毒性活性均包含在全毒素的L链中；L链是一种锌(Zn++)内肽酶，它选择性切割含有神经递质的小泡识别和停靠质膜胞质表面以及小泡与质膜融合所必需的蛋白质。破伤风神经毒素以及B、D、F和G型肉毒毒素导致一种突触小体膜蛋白即小突触泡膜蛋白(又称为小泡相关膜蛋白(VAMP))降解。上述切割活动中的任何一者都将导致大部分存在于突触小泡细胞质表面的VAMP被移除。血清型A和E肉毒毒素切割SNAP-25。血清型C1肉毒毒素最初被认为切割突触融合蛋白，但后来发现其切割突触融合蛋白以及SNAP-25。各种肉毒毒素特异性切割不同的键，除了B型肉毒毒素(以及破伤风毒素)切割相同的键。

[0029] 虽然所有肉毒毒素血清型在神经肌肉接头均显然抑制神经递质乙酰胆碱的释放，但它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点切割上述蛋白进行的。例如，A型和E型肉毒均切割25千道尔顿(kD)的突触小体相关蛋白(SNAP-25)，但它们在所述蛋白中靶向的氨基酸序列是不同的。B、D、F和G型肉毒毒素均作用于小泡相关蛋白(VAMP，又称为小突触泡蛋白)，但各血清型在不同的位点切割所述蛋白。最后，C1型肉毒毒素表现为切割突触融合蛋白和SNAP-25。上述作用机理的不同可能影响各种肉毒毒素血清型的相对效能(potency)和/或作用的持续时间。显然，可在多种不同的细胞类型中发现肉毒毒素底物。参考例如Gonelle-Gispert，C.等SNAP-25a and-25b isoforms are both expressed in insulin-secreting cells andcan function in insulin secretion，Biochem J.1；339(第一部分)：159-65：1999和Boyd R.S.等，The effect of botulinumneurotoxin-B on insulin release from a Ξ-cell line，以及BoydR.S.等，The insulin secreting Ξ-cell line，HIT-15，containsSNAP-25 which is a target for botulinum neurotoxin-A，上述两着均发表于Mov Disord，10(3)：376：1995(胰岛B细胞含有至少SNAP-25和小突触泡蛋白)。

[0030] 对于七种已知的肉毒毒素血清型，其肉毒毒素蛋白分子的分子量为约150kD。有趣的是，肉毒毒素是作为含有150kD的肉毒毒素蛋白分子和相关的无毒素蛋白的络合物从梭菌中释放出来的。因此，A型肉毒毒素络合物可由梭菌以900kD、500kD和300kD的形式产生。B型和C1型肉毒毒素显然以仅为700kD或500kD的络合物产生。D型肉毒毒素以约300kD和500kD的络合物产生。最后，E型和F型肉毒毒素以仅为约300kD的络合物产生。
所述络合物(即分子量大于约150kD)被认为含有非毒素的血凝素蛋白以及非毒素和无毒性的非血凝素蛋白。上述两种非毒素的蛋白(它们与肉毒毒素分子组成相关的神经毒素络合物)可能发生作用以向肉毒毒素分子提供稳定性以抗变性，并在毒素被摄取时保护其以防消化酸。此外，有可能较大的(分子量大于约150kD)肉毒毒素络合物可使肉毒毒素从肉毒毒素络合物肌肉注射部位的扩散速度减慢。

[0031] 所有的肉毒毒素血清型均由肉毒梭菌作为无活性的单链蛋白产生，所述蛋白必需经由蛋白酶切割或切口以具有神经活性。产生血清型A和G肉毒毒素的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此血清型A和G可主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反地，血清型C1、D和E肉毒毒素由非蛋白酶解的菌株合成并因此在从培养物中回收时，通常是无活性的。血清型B和F由蛋白酶解和非蛋白酶解的菌株产生，因此可以活性或无活性形式回收。然而，即使是产生，例如，血清B型肉毒毒素的蛋白酶解菌株也仅切割所产生毒素的一部分。
切口分子与无切口分子的精确比例取决于培养时间长短以及培养温度。因此，一定百分比的任何制品，如B型肉毒毒素很可能是无活性的，从而可能解释为什么B型肉毒毒素比A型肉毒毒素的效能低。临床制品中无活性肉毒毒素分子的存在对制品的全蛋白载荷(overall protein load)有贡献，这与抗原性增大有关联，却未促进临床功效。

[0032] 肉毒毒素和毒素络合物可从，例如List BiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，加利福尼亚；the Centre for AppliedMicrobiology and Research，Porton Down，英国；Wako(日本大阪)以及密苏里州圣路易斯的Sigma Chemicals购得。市售的含有肉毒毒素的药用组合物包括 (A型肉毒毒素的神经毒素络合物与人类血清白蛋白以及氯化钠，可从加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.购得，100单位瓶装的冻干粉末，使用前用0.9％的氯化钠复原)、 (制剂中有A型肉毒毒素的血凝素络合物与人类血清白蛋白以及乳糖，可从英国贝克郡的Ipsen Limited购得，粉末状，使用前用0.9％TM
的氯化钠复原)以及MyoBloc (一种可注射的溶液含有B型肉毒毒素、人类血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠，pH为约5.6，可从爱尔兰都柏林的Elan Corporation购得)。

[0033] A型肉毒毒素在治疗多种临床症状中的成功引起了对其它肉毒毒素血清型的兴趣。此外，纯肉毒毒素已用于治疗人类。参考例如，KohlA.等，Comparison of the effect of botulinum toxin A(Botox(R))with the highly-purified neuro toxin(NT 201)in the extensordigitorum brevis muscle text，Mov Disord 2000；15(增补本3)：165。例如，可使用纯肉毒毒素制备药用组合物。

[0034] A型肉毒毒素已知可溶于pH为4～6.8的稀水溶液中。当pH大于约7时，特别是当pH和温度升高时，起稳定作用的无毒性蛋白从神经毒素中游离出来，导致毒性逐渐丧失。Schantz E.J.等，Preparationand characterization of botulinum toxin type A for humantreatment(特别是44～45页)，Jankovic，J.等，Therapy withBotulinum Toxin的第3章，Marcel Dekker，Inc(1994)。

[0035] 肉毒毒素分子(约150kDa)以及肉毒毒素络合物(约300～900kDa)，如A型毒素络合物对由表面变性、热和碱条件引起的变性也非常敏感。失活的毒素形成可能为致免疫性的类毒素蛋白。得到的抗体可使患者抵抗毒素注射。

[0036] 体外研究已表明肉毒毒素抑制钾阳离子引起的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原代细胞培养物中的释放。此外，据报道在脊髓神经元的原代培养物中，肉毒毒素抑制甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，并且在脑突触小体制品中，肉毒毒素抑制各种神经递质的释放，所述神经递质包括乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素(Hebermann E.等，Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins InhibitNoradrenaline Release From Cultured Mouse Brain，J Neurochem51(2)；522～527：1988)CGRP、物质P和谷氨酸 (Sanchez-Prieto，J. 等，Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From GuineaPig Cerebral Cortical Synaptosomes，Eur J.Biochem 165；675～681：1987)。因此，当使用的浓度足够时，肉毒毒素将阻断刺激诱发的大部分神经递质的释放。参考，例如Pearce，L.B.，PharmacologicCharacterization of Botulinum Toxin For Basic Science andMedicine，Toxicon 35(9)；1373～1412中的1393页；Bigalke H.等，Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic SynapticTransmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture，BrainResearch 360；318～324：1985；Habermann E.，Inhibition3 3
by Tetanusand Botulinum A Toxin of the release of [H]Noradrenaline and[H]GABA From Rat Brain Homogenate，Experientia 44；224～226：1988，Bigalke H.等，Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin InhibitRelease and Uptake of Various Transmitters，as Studied withParticulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 316；244～251：1981；以及Jankovic J.等，Therapy With Botulinum Toxin，Marcel Dekker，Inc.，(1994)，第五页。

[0037] 可通过如下方法获得A型肉毒毒素：按照已知方法在发酵罐中建立并生长肉毒梭菌的培养物，然后收获并纯化发酵混合物。所有肉毒毒素血清型最初都是作为无活性的单链蛋白合成的，所述蛋白必需经由蛋白酶切割或切口以具有神经活性。产生血清型A和G肉毒毒素的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此血清型A和G可主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反地，血清型C1、D和E肉毒毒素由非蛋白酶解的菌株合成，因此在从培养物中回收时，通常是无活性的。血清型B和F由蛋白酶解和非蛋白酶解的菌株产生，因此可以活性或无活性的形式回收。然而，即使是产生，例如，血清型B肉毒毒素的蛋白酶解菌株也仅切割所产生毒素的一部分。切口分子与无切口分子的精确比例取决于培养时间长短以及培养温度。因此，一定百分比的任何制品，如B型肉毒毒素很可能是无活性的，从而可能解释已知的B型肉毒毒素比A型肉毒毒素的效能低很多。临床制品中无活性肉毒毒素分子的存在对制品的全蛋白载荷有贡献，这与抗原性增大有关联，却未促进临床功效。此外，已知B型肉毒毒素经肌肉注射后，活性的持续时间较短并且在相同的剂量水平不如A型肉毒毒素有效。

[0038] 高质量的结晶A型肉毒毒素可由肉毒梭菌的Hall A菌株生产，所述毒素特征为7
≥3×10U/mg，A260/A278小于0.60，并且在凝胶电泳上有独特的带型。已知的Schantz方法可用于获得结晶的A型肉毒毒素，如Schantz，E.J.等在Properties and use of Botulinum toxin andOther Microbial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev.56；80～99：1992所述的。通常，通过在适宜的培养基中培养A型肉毒梭菌可从厌氧发酵中分离并纯化A型肉毒毒素络合物。分离出非毒素的蛋白后，也可使用已知方法获得纯肉毒毒素，例如，分子
8
量为约150kD的纯化A型肉毒毒素，其特异性效能为1～2×10LD50U/mg或以上；分子量
8
为约156kD的纯化B型肉毒毒素，其特异性效能为1～2×10LD50U/mg或以上；分子量为约
7
155kD的纯化F型肉毒毒素，其特异性效能为1～2×10LD50U/mg或以上。

[0039] 纯肉毒毒素(即150千道尔顿的肉毒毒素分子)或毒素络合物均可用于制备药用组合物。两种分子和络合物均对由表面变性、热和碱条件引起的变性敏感。失活的毒素形成可能为致免疫性的类毒素蛋白。得到的抗体可使患者抵抗毒素注射。

[0040] 同酶一样，通常，肉毒毒素(细胞内肽酶)的生物活性至少部分取决于其三维构象。因此，通过热、多种化学药品的表面拉伸(surfacestretching)和表面干燥可使A型肉毒毒素丧失毒性。此外，已知将通过已知的培养、发酵和纯化所获得的毒素络合物稀释到非常非常低的、可用于药用组合物制剂的毒素浓度将导致毒素的快速解毒，除非有适宜的稳定剂存在。将毒素从毫克量稀释到每毫升含有毫微克的溶液有很大难度，因为经上述高度稀释后，毒素将迅速丧失特异性的毒性。由于可能在制成含有毒素的药用组合物数月或数年后才使用所述毒素，因此可用稳定剂，如白蛋白和明胶使毒素稳定。

[0041] 市售的含有肉毒毒素的药用组合物，其出售的商标为 (从加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.购得)。 由纯化的A型肉毒毒素络合物、白蛋白和氯化钠在无菌、真空形式下密封形成。A型肉毒毒素由在含有N-Z胺和酵母提取物的培养基中生长的肉毒梭菌Hall菌株的培养物制成。A型肉毒毒素络合物通过一系列酸沉淀从培养溶液中纯化为结晶的络合物，所述络合物由高分子量的活性毒素蛋白和相关的血凝素蛋白组成。将结晶络合物重新溶于含有盐水和白蛋白的溶液中，并在无菌过滤(0.2微米)后真空干燥。真空干燥的产品在-5℃或以下储存于冷冻装置中。 在肌肉注射前，可用无菌的非保存盐水复原。每小瓶 含有无菌、真空干燥形式的约100单位(U)的A型肉毒梭菌毒素纯化的神经毒素络合物，0.5毫克人类血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，并且无防腐剂。

[0042] 通过将适量的稀释液抽取到尺寸适中的注射器中以采用无防腐剂的无菌标准盐水(0.9％的氯化钠注射)使真空干燥的 复原。由于 可能因冒泡或类似的剧烈搅拌而变性，因此稀释液应轻轻地注射到小瓶中。出于保持无菌状态考虑，优选在小瓶从冷冻装置中取出并复原后四小时内给药。在这四小时中，复原的 可储存在约2℃～约8℃的冰箱中。据报道，复原冷藏的 可保持其效能至少约两周。
Neurology，48：249-53：1997。

[0043] 肉毒毒素已用于治疗以骨骼肌机能亢进为特征的神经肌肉病症的临床处置中。A型肉毒毒素 在1989年获得美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug
Administration)的许可，主要用于治疗12岁以上患者的睑痉挛、斜视和偏侧面肌痉挛。在TM
2000年，FDA批准血清A型 和血清B型(MyBloc )肉毒毒素的商用制品用于治
疗宫颈张力障碍，并且在2002年FDA批准A型肉毒毒素 用于美容治疗某些运动
机能亢进的(眉间)面部皱纹。A型肉毒毒素外周肌肉注射的临床效果通常显现于注射后一周内，某些时候几小时内。A型肉毒毒素单次肌肉注射所产生的症状缓解(即松弛的肌肉麻痹)的持续时间通常可为约3个月，虽然据报道在某些情况下，肉毒毒素作用引起的腺体，如唾液腺失去神经支配持续数年。例如，已知A型肉毒毒素的效能可高达12个月(Naumann M. 等，Botulinum toxin type A in the treatment of focal，axillary andpalmar hyperhidrosis and other hyperhidrotic conditions，European J.Neurology 6(增补本
4)：S111～S115：1999)，并且在某些情况下可长达27个月。Ragona，R.M.等，Management of parotidsialocele with botulinum toxin，The Laryngoscope 109：1344～1346：1999。
然而， 肌肉注射的普通维持时间通常为约3～4个月。

[0044] 据报道A型肉毒毒素已用于多种临床处置中，包括例如：

[0045] (1)每次肌肉注射(多块肌肉)约75～125单位的 以治疗宫颈张力障碍；

[0046] (2)每次肌肉注射5～10单位的 以治疗眉间线(眉沟)(降眉间肌肌肉注射5单位，各皱眉肌肌肉注射10单位)；

[0047] (3)向耻骨直肠肌括约肌内(intrasphincter)注射约30～80单位的 以治疗便秘；

[0048] (4)向上眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌和下眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌分别肌肉注射约1～5单位的 以治疗睑痉挛。

[0049] (5)向眼外肌肌肉注射约1～5单位的 以治疗斜视，注射的量根据待注射肌肉的大小以及所需的肌肉麻痹的程度(即所需的屈光度校正)变化。

[0050] (6)为治疗中风后的上肢痉挛，按照如下方式向五块不同的上肢屈肌肌肉注射[0051] (a)跖深屈肌：7.5U～30U

[0052] (b)跖浅屈肌：7.5U～30U

[0053] (c)尺侧腕屈肌：10U～40U

[0054] (d)桡侧腕屈肌：15U～60U

[0055] (e)肱二头肌：50U～200U。对各指定的五块肌肉在相同的治疗期进行注射，因此患者在各治疗期接受90U～360U的 的上肢屈肌肌肉注射。

[0056] (7)颅骨膜注射(对称注射到眉间肌、额肌和颞肌)25U的 以治疗偏头痛已证实具有非常有益的偏头痛的预防治疗效果，与赋形剂相比， 在25U注射后的三个月内降低了偏头痛的发病率、最大严重程度、所伴随的呕吐以及所使用的急性药物治疗。

[0057] 此外，肌肉肉毒毒素已用于治疗帕金森病患者的震颤，虽然据报道效果并不显著。Marjama-Lyons，J.等，Tremor-PredominantParkinson’s Disease，Drug & Aging 16(4)；
273～278：2000。

[0058] 已知用肉毒毒素可治疗某些胃肠病症和平滑肌病症。参考例如美国专利5,427,291和5,674,205(Pasricha)。此外，已知将肉毒毒素经尿道注射到膀胱括约肌可治疗排尿障碍(参考例如Dykstra D.D.等，Treatment of detrusor-sphincter dyssynergia with botuiinum Atoxin：A double-blind study，Arch Phys Med Rehabil 1990 年 1月；71：24-6)，相同的，将肉毒毒素注射到前列腺可治疗前列腺增生。参考例如美国专利
6,365,164(Schmidt)。

[0059] 美国专利5,766,605(Sanders)提出用肉毒毒素治疗多种自主性病症(autonomic disorder)，如多涎和鼻炎(rhinittis)。

[0060] 并且，WO 95/17904(PCT/US94/14717)(Aoki)讨论了多种可用肉毒毒素治疗的疾病，如多汗和头痛。EP 0 605 501 B1(Graham)讨论了用肉毒毒素治疗大脑性麻痹，而美国专利6,063,768(First)讨论了用肉毒毒素治疗神经性炎症。

[0061] 肉毒毒素除了在外周位置中具有药理作用外，在中枢神经系统中还可具有抑125
制 作 用。Weigand 等，( l-labelled botulinum Aneurotoxin：pharmacokinetics in cats after intramuscularinjection，Nauny-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1976；
125
292，161 ～165)和Habermann( l-labelled Neurotoxin from clostridiumbotulinum A：preparation，binding to synaptosomes and ascentto the spinal cord，Nauny-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1974；281，47～56)的研究成果表明肉毒毒素能通过逆向运输升至脊髓区。同样地，在外周位置，如肌肉注射的肉毒毒素可能逆向运输到脊髓。

[0062] 体外研究已表明肉毒毒素抑制钾阳离子引起的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原代细胞培养物中的释放。此外，据报道在脊髓神经元的原代培养物中，肉毒毒素抑制甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，并且在脑突触小体制备物中，肉毒毒素抑制各种神经递质如乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸的释放。

[0063] 美国专利No.5,989,545公开了修饰的梭菌神经毒素或其片断，优选肉毒毒素，经化学共轭或重组融合到特殊靶部分后，可通过将试剂给药到脊髓用以治疗疼痛。

[0064] 肉毒毒素还被推荐用于治疗多汗(流汗过多，美国专利5,766,605)、头痛(美国专利6,458,365)、偏头痛(美国专利5,714,468)、手术后疼痛和内脏疼痛(美国专利6,464,986)、疼痛(脊柱内给药)(美国专利6,113,915)、帕金森病(颅骨内给药)(美国专利6,306,403)、头发生长(hair growth)和头发保持(hair retention)(美国专利
6,299,893)、牛皮癣和皮炎(美国专利5,670,484)、肌肉受损(美国专利6,423,319)、多种癌症(美国专利6,139,845)、胰腺病症(美国专利6,143,306)、平滑肌病症(美国专利
5,437,291(包括将肉毒毒素注射到上下食管、幽门和肛门的括约肌))、前列腺病症(美国专利6,365,164)、炎症、关节炎和痛风(美国专利6,063,768)、青少年大脑性麻痹(美国专利6,395,277)、内耳病症(美国专利6,265,379)、甲状腺病症(美国专利6,358,513)、甲状旁腺病症(美国专利6,328,977)。此外，已知有控释的毒素植入物(美国专利6,306,423和6,312,708)。

[0065] 据报道在大鼠中静脉注射肉毒毒素导致五肽胃泌素刺激酸和胃蛋白酶分泌下降。Kondo T.等，Modification of the action ofpentagastrin on acid secretion by botulinum toxin，Experientia1977；33：750-1。此外，据推测肉毒毒素可用于减少胃肠分泌物，如胃分泌物。参考WO95/17904的16～17页。并且，肉毒毒素已推荐用于在肠神经系统病症中治疗胃肠肌肉病症(美国专利5,437,291)以及治疗多种自主性病症(美国专利5,766,605)。肉毒毒素已注射到狗的胃底。Wang Z.等，Effects of botulinum toxin on gastricmyoelectrical and vagal activities in dogs，Gastroenterology2001年4月；120(5增补本1)：A-718。此外，将肉毒毒素肌肉注射到胃窦已推荐作为肥胖症的治疗方法。参考例如Gui D.等，Effects ofbotulinum toxin on gastric emptying and digestive secretions.A possible tool for correction of obesity？，Naunyn SchmiedebergsArch Pharmacol 2002年6月；365(增补本2)：R22；Albanese A.等，The use of botulinum toxin on smooth muscles，Eur J Neurol1995年11月；2(增补本3)：29～33；以及Gui D.等，Botulinum toxininjected in the gastric wall reduces body weight and food intakein rats，Aliment Pharmacol Ther 2000年6月；14(6)：
829～834。并且，A型肉毒毒素已推荐作为控制胃中分泌物的治疗方法。Rossi S.等，Immunohistochemical localization of SNAP-25 protein in thestomach of rat，Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002；365(增补本2)：R37。

[0066] 值得注意的是，据报道将肉毒毒素注射到下食管括约肌以治疗弛缓不能(achalasia)将在食管中形成溃疡。Eaker，E.Y.等，Untowardeffect of esophageal botulinum toxin injection in the treatmentof achalasia，Dig Dis Sci 1997年4月；42(4)：724-7。已知将肉毒毒素注射到幽门溃疡患者的痉挛幽门括约肌可使幽门肌打开。Wiesel P.H.等，Botulinum toxin for tefractory postoperativepyloric spasm，Endoscopy 1997；29(2)：132。

[0067] 破伤风毒素及其衍生物(即具有非天然的靶部分)、片断、杂合物和嵌合体也可具有治疗效用。破伤风毒素与肉毒毒素有很多相似之处。例如，破伤风毒素和肉毒毒素是由密切相关的梭菌物种(分别为破伤风梭菌和肉毒梭菌)制成的多肽。此外，破伤风毒素和肉毒毒素均是由轻链(分子量为约50kD)和重链(分子量为约100kD)组成的双链蛋白质，所述轻链和重链通过单个二硫键共价结合。因此，破伤风毒素和七种肉毒毒素(非络合的)的分子量均为约150kD。此外，对于破伤风毒素和肉毒毒素，轻链含有的域表现出细胞内生物(蛋白酶)活性，而重链含有受体结合(致免疫性的)域和细胞膜转运域。

[0068] 并且，破伤风毒素和肉毒毒素在突触前胆碱能神经元的表面对神经节(gangliocide)受体表现出高特异性亲和力。由受体介导的外周胆碱能神经元对破伤风毒素的胞吞作用导致逆向轴突运输，从而阻断抑制性神经递质从中枢突触中的释放和痉挛麻痹。相反地，受体介导的外周胆碱能神经元对肉毒毒素的胞吞作用几乎未引起逆向运输，从而抑制了中毒外周运动神经元对乙酰胆碱的胞吐作用并产生松弛麻痹。

[0069] 最后，破伤风毒素和肉毒毒素彼此在生物合成和分子结构上也非常相似。例如，破伤风毒素和A型肉毒毒素之间共有34％的蛋白质序列相同，而对于某些功能域，序列的同一性高达62％。Binz T.等，The Complete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A andComparison with Other Clostridial Neurotoxins，J BiologicalChemistry265(16)；9153～9158：1990。

[0070] 乙酰胆碱

[0071] 通常在哺乳动物的神经系统中，每一种神经元仅释放一种类型的小分子神经递质。神经递质乙酰胆碱由很多脑区中的神经元分泌，但特异性地由下述神经元分泌，包括运动皮层的大锥体细胞、基底神经节中几种不同的神经元、支配骨骼肌的运动神经元、自主神经系统(交感神经和副交感神经)的神经节前神经元、副交感神经系统的神经节后神经元以及交感神经系统的某些神经节后神经元。基本上，只有通向汗腺、竖毛肌(piloerector muscle)和少数血管的神经节后交感神经纤维是胆碱能性的，而交感神经系统的大部分神经节后神经元分泌的神经递质是去甲肾上腺素。在多数情况下，乙酰胆碱具有兴奋作用。然而，已知乙酰胆碱在某些外周副交感神经末梢具有抑制作用，例如通过迷走神经抑制心率。

[0072] 自主神经系统的传出信号通过交感神经系统或副交感神经系统传递到身体中。交感神经系统的神经节前神经元延伸自位于脊髓中间外侧角(intermediolateral horn)中的神经节前交感神经元细胞体。从细胞体延伸出来的神经节前交感神经纤维与位于脊椎旁的交感神经节中或椎骨前神经节中的神经节后神经元形成突触。由于交感神经系统和副交感神经系统的神经节前神经元都是胆碱能性的，因此对神经节应用乙酰胆碱将刺激交感和副交感神经节后神经元。

[0073] 乙酰胆碱活化两种类型的受体，毒蕈碱和烟碱受体。毒蕈碱受体发现存在于所有由副交感神经系统的神经节后神经元以及交感神经系统的神经节后胆碱能神经元所刺激的效应细胞中。烟碱受体发现存在于肾上腺髓质以及自主神经节中，即在神经节后神经元的细胞表面上，所述神经元在交感和副交感神经系统的神经节前与神经节后神经元之间的突触中。烟碱受体还发现存在于很多非自主性神经末梢中，例如神经肌接点处的骨骼肌纤维的膜中。

[0074] 当小而透明的细胞内小泡与突触前神经元细胞膜融合时，乙酰胆碱即从胆碱能神经元中释放出来。多种非神经元分泌细胞，如肾上腺髓质(以及PC12细胞系)和胰岛细胞分别从大致密核心小泡中释放儿茶酚胺和副甲状腺激素。PC12细胞系是大鼠嗜铬细胞瘤细胞的克隆，被广泛用作研究交感肾上腺发育的组织培养模型。肉毒毒素经渗透(如电穿孔一样)或直接注射到去神经细胞中后，将在体外抑制两种类型的化合物从两种类型的细胞中的释放。还已知肉毒毒素阻断神经递质谷氨酸从皮质突触小体细胞培养物中的释放。

[0075] 神经肌肉接点是通过轴突接近肌肉细胞而在骨骼肌中形成的。通过神经系统传递的信号引起末端轴突处的作用电位，并活化离子通道，导致神经递质乙酰胆碱在例如神经肌肉接点的运动终板处从神经元内的突触小泡中释放出来。乙酰胆碱穿过细胞外间隙与乙酰胆碱受体蛋白在肌肉终板的表面上结合。一旦发生了足够的结合，肌肉细胞的作用电位即引起特异性的膜离子通道变化，从而导致肌肉细胞收缩。然后乙酰胆碱从肌肉细胞中释放出来并通过胆碱脂酶在细胞外间隙中代谢。代谢产物回收到末端轴突中以再加工为乙酰胆碱。

[0076] 因此需要的是生物相容的肉毒毒素口服制剂。

发明内容

[0077] 本发明满足上述需要，提供一种生物相容的肉毒毒素口服制剂。

[0078] 根据本发明，将肉毒毒素合成为口服剂型以在患有GI病症的患者的胃中或十二指肠中释放毒素活性成份。肉毒毒素口服制剂的制备可易于通过如下步骤完成，将冻干的或冷冻干燥的肉毒毒素粉末与适宜的载体，如面粉、糖或明胶混合，然后将混合物压制以制得可摄取的片剂。对载体以及压制程度进行选择以使得到的片剂(或者可制得含有治疗量的肉毒毒素的胶囊，所述毒素与载体混合或不掺入载体)可用于吞咽，并且载体以及载体的特性应使载体在胃中快速溶解，以释放肉毒毒素活性成份。

[0079] 本发明提供的肉毒毒素口服制剂克服了与反复大量注射(bolus)或皮下注射肉毒毒素相关的现有难题、困难和缺陷，以治疗GI病症。

[0080] 本发明范围内的肉毒毒素口服制剂可含有载体物质以及与载体相结合的肉毒毒素。毒素可通过与载体混合或由载体密封与载体结合，从而形成肉毒毒素口服制剂这一肉毒毒素递送系统。口服制剂经口服给药后可在患者的GI道中从载体中释放出治疗量的肉毒毒素。

[0081] 载体可含有大量聚合物微球(即聚合物基体)并且在肉毒毒素与载体结合前，大量肉毒毒素并未转化为肉毒类毒素。也就是说，大量与载体结合的肉毒毒素，其毒性与载体结合前的肉毒毒素的毒性相比基本未变。

[0082] 根据本发明，肉毒毒素可在GI道中从载体中释放出来，并且载体由基本可生物降解的物质组成。肉毒毒素选自A、B、C1、D、E、F和G型肉毒毒素中的一种，并且优选A型肉毒毒素。肉毒毒素可以约1单位～约10,000单位的量与载体结合。优选的与载体结合的肉毒毒素的量为约10单位～约2,000单位的A型肉毒毒素。当肉毒毒素是B型肉毒毒素时，优选的与载体结合的肉毒毒素的量为约500单位～约10,000单位的B型肉毒毒素。

[0083] 本发明的一个具体实施方案可包括肉毒毒素口服制剂，所述口服制剂含有可生物降解的聚合物以及约10单位～约10,000单位的由聚合物载体密封的肉毒毒素，从而形成控释系统(controlled releasesystem)，其中治疗量的肉毒毒素可在患者的GI道中从载体中释放出来。

[0084] 一种制造本发明范围内口服制剂的方法，包括如下步骤：将聚合物溶于溶剂中形成聚合物溶液；将肉毒毒素混合到或分散于聚合物溶液中以形成聚合物-肉毒毒素混合物；以及静置或固化聚合物-肉毒毒素混合物，从而制得用以释放肉毒毒素的口服制剂。所述方法还可包括在混合步骤后蒸发溶剂。

[0085] 一种使用本发明范围内的肉毒毒素口服制剂的方法可以是，通过吞咽含有肉毒毒素的聚合物口服制剂，从而治疗受胆碱能神经支配影响的GI病症。

[0086] 本发明的另一例实施方案可为含有聚合物的载体以及与所述载体相结合的稳定的肉毒毒素，所述聚合物选自聚交酯(polylactides)和聚乙醇酸交酯(polyglycolides)，从而形成肉毒毒素口服制剂，其中治疗量的肉毒毒素可在人类患者摄取口服制剂后在GI道中从载体中释放出来。载体可包括大量不连续批次的掺有肉毒毒素的聚合物微球，其中各批聚合物具有不同的聚合组成。

[0087] 根据本发明用于口服制剂中的肉毒毒素可包括第一元件、第二元件和第三元件，其中第一元件含有能在生理条件下与神经元细胞表面受体特异性结合的结合元件，第二元件含有能促进多肽穿过神经元细胞膜转移的转运元件，第三元件含有治疗元件，当该治疗元件存在于神经元的细胞质中时，可抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用。治疗元件可切割SNARE蛋白，从而抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用，并且SNARE蛋白可选自突触融合蛋白、SNAP-25和VAMP。通常，受到肉毒毒素影响的神经元是支配例如GI道肌肉(平滑肌、横纹肌或混合的平滑肌和横纹肌)或GI道分泌腺组织的突触前胆碱能神经元。虽然胆碱能神经元可对肉毒毒素(即通过毒素受体)表现出高亲和力，但肌肉细胞和腺细胞可通过低亲和力机制(即胞饮作用)直接吸收毒素。因此，神经元和非神经元细胞均可成为肉毒毒素的靶。

[0088] 在指定时期，由本发明范围内的连续释放系统给药的肉毒毒素的量，对于A型肉-3毒毒素，可为约10 U/kg～约35U/kg，而对于其它的肉毒毒素，如B型肉毒毒素，可为最多约
2000U/kg。35U/kg或2000U/kg是上限，因为已分别接近某些神经毒素，如A型肉毒毒素或B型肉毒毒素的致死剂量。例如，据报道约2000单位/kg的市售B型肉毒毒素制品已接近B型肉毒毒素的灵长类致死剂量。Meyer K.E.等，Acomparative Systemic Toxicity Study of Neurobloc in AdultJuvenile Cynomolgus Monkeys，Mov.Disord 15(增补本2)；54；
2000。

[0089] 在指定时期，通过口服制剂给药的A型肉毒毒素的量优选为约10-2U/kg～约25U/-2kg。通过口服制剂给药的B型肉毒毒素的量优选为约10 U/kg～约1000U/kg，因为据报道低于约1000U/kg的B型肉毒毒素可肌肉给药到灵长类动物中而不产生全身作用。出处同-1
上。更优选地，A型肉毒毒素以约10 U/kg～约15U/kg的量给药。最优选地，A型肉毒毒素以约1U/kg～约10U/kg的量给药。在很多实例中，给药约1单位～约500单位A型肉毒毒素提供有效的长期治疗缓解。更优选地，可使用约5单位～约300单位的肉毒毒素，如A型肉毒毒素，并且最优选地，可将约10单位～约200单位的神经毒素，如A型肉毒毒素局部给药到GI道靶组织中以获得有效结果。在本发明具体的优选实施方案中约1单位～约100单位的肉毒毒素，如A型肉毒毒素可通过口服给药所公开的口服剂型局部给药到GI靶组织中获得有效结果。

[0090] 肉毒毒素可由肉毒梭菌产生。此外，肉毒毒素可为修饰的肉毒毒素，即与天然的或野生型肉毒毒素相比，肉毒毒素可有至少一个氨基酸缺失、修饰或取代。此外，肉毒毒素可为重组产生的肉毒毒素或其衍生物或片断。

[0091] 值得注意的是，据报道由肉毒毒素治疗的腺组织可在注射毒素后的长达27个月内表现出分泌活性降低。Laryngoscope 1999；109：1344～1346，Laryngoscope 1998；108：381～384。

[0092] 本发明涉及神经毒素GI释放的口服制剂以及制造并使用所述口服制剂的方法。口服制剂可包括含有肉毒毒素的聚合物基体。口服制剂设计为在口服给药时给药有效水平的神经毒素。

[0093] 本发明还涉及一种组合物以及制造和使用组合物的方法，以控制稳定的生物活性神经毒素。本发明的控释组合物可包括聚合物基体，即生物相容的聚合物以及分散在生物相容聚合物中的稳定的生物活性神经毒素。

[0094] 定义

[0095] 本发明采用如下定义。

[0096] “约”表示限定值的正负10％。

[0097] “生物相容的”表示口服制剂经摄取后没有显著的炎症应答。

[0098] “生物活性化合物”表示可在接受给药的对象中产生有益变化的化合物。例如“生物活性化合物”包括神经毒素。

[0099] “有效量”当应用于生物活性化合物时表示通常足够在对象中产生所需变化的化合物的量。例如，当所需效果是松弛肌肉麻痹时，化合物的有效量即为使所需肌肉至少基本麻痹的量，但所述量基本未使不需麻痹的相邻肌肉麻痹，并且未引起显著的全身毒性反应。

[0100] “有效量”当应用于口服制剂的非活性组分(如用于形成基体或涂层组分的聚合物)时表示非活性组分的量足以积极影响生物活性剂在所需时间段以所需速度释放。例如，当所需效果是通过使用单剂口服制剂使肌肉麻痹时，“有效量”即指有助于将释放延长至约60天～6年的量。所述“有效量”可根据说明书所述的以及本领域的一般知识确定。

[0101] “有效量”当应用于口服制剂表面积的量时表示口服制剂表面积的量足以引起生物活性化合物的流出(flux)，以达到所需效果，如肌肉麻痹或腺分泌活性下降。通过测量具体活性化合物所达到的释放可确定和调整所需面积。口服制剂或口服制剂涂层的表面积指完全密封生物活性化合物所需的膜的量。表面积取决于口服制剂的几何形状。优选的表面积应尽可能地小以降低口服制剂的尺寸。

[0102] “口服制剂”表示药物递送系统。口服制剂由生物相容的聚合物或天然物质组成，所述天然物质含有或可用作生物活性分子的载体。口服制剂可供人类患者吞咽。

[0103] “神经毒素”表示如下试剂，它可中断神经脉冲传递穿过神经肌肉或神经腺体接头，阻断或降低神经递质的神经元胞吐作用或在神经元的钠通道电压门(voltage gate)改变作用电位。神经毒素的实例包括肉毒毒素、破伤风毒素、蛤蚌毒素和河豚毒素。

[0104] “治疗”表示哺乳动物中疾病的任何治疗，并且包括：(i)预防疾病发生；或(ii)抑制疾病，即抑制其发展；(iii)缓解疾病，即降低疾病症状的发生率或导致疾病消退。

[0105] 本发明范围内用以控制神经毒素释放的口服制剂的制造方法可包括将生物相容的聚合物溶于聚合物溶剂中以形成聚合物溶液，将稳定的生物活性神经毒素的颗粒分散到聚合物溶液中，然后使聚合物固化以形成含有神经毒素颗粒分散系的聚合物基体。

[0106] 本发明包括固体形式的肉毒毒素口服制剂，所述口服制剂含有肉毒毒素以及与肉毒毒素相结合的载体，从而形成固体形式的肉毒毒素口服制剂。制得的载体可在患者的胃肠道中溶解，并从而在其中释放治疗量的肉毒毒素。此外，固体形式的肉毒毒素制剂可通过下列方法或同时给药延缓胃排空的药剂表现出胃潴留，所述方法选自粘膜粘附、漂浮、沉淀和扩张。“胃潴留”表示口服制剂的保留时间(residencytime)大于通常摄取的食品或营养物的GI道保留时间，所述食品或营养物未经处理以表现出粘膜粘附、漂浮、沉淀、扩张的特征或不与延缓胃排空的药剂同时给予。

[0107] 优选的口服制剂不包括大量在肉毒毒素与载体结合前转变为肉毒类毒素的肉毒毒素。因此，口服制剂优选包括与载体结合的肉毒毒素，其中毒素的毒性与肉毒毒素和载体结合前的肉毒毒素的毒性相比基本未变。

[0108] 口服制剂的载体可包括生物相容的、可生物降解的物质，所述物质选自面粉、糖和明胶。口服制剂的肉毒毒素可选自A、B、C1、D、E、F和G型肉毒毒素。优选的肉毒毒素是A型肉毒毒素。与载体结合的肉毒毒素的量为约1单位～约10,000单位的肉毒毒素或为约10单位～约2,000的A型肉毒毒素。

[0109] 肉毒毒素可包括第一元件、第二元件和第三元件，其中第一元件含有能在生理条件下与神经元细胞表面受体特异性结合的结合元件，第二元件含有能促进多肽穿过神经元细胞膜转移的转运元件，第三元件含有治疗元件，当该治疗元件存在于神经元的细胞质中时，可抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用。治疗元件可切割SNARE蛋白，从而抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用。SNARE蛋白可选自突触融合蛋白、SNAP-25和VAMP。

[0110] 另一种本发明范围内的肉毒毒素口服制剂可包括A型肉毒毒素以及与A型肉毒毒素相结合的载体，从而形成肉毒毒素口服制剂，其中载体制成在患有胃溃疡的患者的胃肠道中释放治疗量的A型肉毒毒素，而不引起显著的免疫系统应答，并且其中载体包括生物相容的，可生物降解的物质，并且可通过如下方法或同时给药延缓胃排空的药剂获得控制胃潴留的固体剂型，所述方法选自粘膜粘附、漂浮、沉淀和扩张。

[0111] 本发明范围中的另一种制剂可包括用于向患者的胃肠道口服给药的肉毒毒素制剂，所述制剂包括生物活性肉毒毒素以及与肉毒毒素相结合的生物相容的，可生物降解的无毒性载体，其中载体具有在患者的胃肠系统中快速降解的特性，从而向患者的胃肠系统释放治疗量的生物活性肉毒毒素，而不对摄取的肉毒毒素产生显著的免疫系统应答。

[0112] 口服制剂的载体可包括大量聚合物微球或者载体可包括聚合物基体。本发明范围的方法可包括使用肉毒毒素口服制剂的方法，该方法包括摄取肉毒毒素的口服制剂。

[0113] 本发明范围内的具体实施方案可为包括下列物质的肉毒毒素口服制剂：

[0114] (a)含有聚合物的载体，所述聚合物选自聚交酯、聚乙醇酸交酯和聚酐；

[0115] (b)与载体结合的稳定的肉毒毒素，从而形成肉毒口服制剂，

[0116] 其中治疗量的肉毒毒素可在患者的GI道中从载体中释放出来。

具体实施方式

[0117] 本发明基于对肉毒毒素有治疗效果的口服剂型的发现。例如，申请人发现摄入与可在胃肠道中溶解的适宜载体相混合的肉毒毒素，如A型肉毒毒素可将治疗量的生物活性肉毒毒素递送到胃肠病症及其附近。通常，在其后的数天内，GI症状表现出明显的治愈(消退)迹象并且可在口服肉毒毒素制剂给药后的数周内完全痊愈。副作用可包括胃肠肌运动减少以及体重下降。

[0118] 肉毒毒素口服给药的治疗剂量应使由肠衬里吸收到循环系统的任何肉毒毒素仅引起微弱的或不显著的全身作用。因此，200单位的肉毒毒素可注射到患有糖尿病性胃轻瘫(diabetic gastroparesis)患者的幽门(胃下端)括约肌而不会在以后产生任何全身毒性。Crowell，M.D.等，Botulinum toxin reduces pyloric dysfunction in patientswith diabetic gastroparesis，Gastroenterology 2002年4月；122(4增补本1)：A451～A452。虽然没有证据表明肉毒毒素有畸胎形成作用，但这里公开的本发明范围内的方法不打算用于如下患者，包括孕妇、护理人员或计划在治疗期间受孕的人。

[0119] 由于不希望受到理论的束缚，可对本发明的功效提出如下生理机制。例如，已熟知肉毒毒素作用于胆碱能神经，包括胃肠道中促使GI肌肉运动的胆碱能神经。Pasricha，P.J.，Botulinum toxin forspastic gastrointestinal disorders，Bailliere’s ClinGastroenterol 1999；13(1)：131～143。此外，胃壁细胞分泌胃泌素和产生HC l极大地取决于迷走神经以及在胃肠道中作用于神经腺接头的肠肌层纤维的胆碱能活性。Rossi S.等，Immunohistochemicallocalization of SNAP-25 protein in the stomach of rat，NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol 2002；365(增补本2)：R37。并且，A型肉毒毒素BTX-A的细胞内底物(SNAP-25)存在于胃壁细胞中。GuiD.等，Effects of botulinum toxin on gastric emptying anddigestive secretions.A possible tool for correction ofobesity？，Naunyn Schiedebergs Arch Pharmacol 2002年6月；365(增补本2)：R22。因此，肉毒毒素的口服制剂可用于通过，例如降低胆碱能支配的胃肠肌肉的运动性或减少胆碱能支配的胃肠腺的过量分泌治疗多种不同的GI病症。

[0120] 口服给药的肉毒毒素可在GI道苛刻的环境中保留其生物活性。例如，肉毒梭菌分泌的肉毒毒素是一种络合物，该络合物包括由大量非毒素蛋白分子包围的约150kDa的单链蛋白毒素分子。值得注意的是，非毒素蛋白用以保护毒素，使其在络合物穿过GI道时免于酸水解以及酶降解，因此毒素络合物能在极端pH以及蛋白酶解酶等苛刻的条件下存活并仍然用作高度有效的神经毒素。已证实与肉毒毒素分子络合的非毒素蛋白用于在胃肠道中保护150kDa的毒素分子，使其免受消化酸。Hanson，M.A.等，Structural view of botulinum neurotoxin innumerous functional states，Brin M.F.等编辑的Scientific andtherapeutic aspects of botulinum Toxin的 第 二 章，11 ～27 页，Lippincott，Williams & Wilkins(2002)。

[0121] 本发明范围内的肉毒毒素口服制剂能将治疗量的肉毒毒素释放到患有GI病症的患者的GI道中。释放的肉毒毒素的量可包括(对于A型肉毒毒素)仅约10单位(即治疗婴儿的GI运动病症)到高达500单位(即治疗高大成年人中GI腺的多发性过度分泌)。疗效所需的肉毒毒素的量可根据不同肉毒毒素血清型已知的临床效能变化。例如，通常需要高几个数量级的单位的B型肉毒毒素以获得可与使用A型肉毒毒素相当的生理作用。

[0122] 由本发明范围内的口服制剂以治疗有效量释放的肉毒毒素优选为基本有生物活性的肉毒毒素。换言之，从口服制剂中释放出来的肉毒毒素能以高亲和力结合胆碱能神经元并至少有部分穿过神经元膜转运，而且通过其在神经元细胞质中的活性抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用。本发明排除有意将肉毒类毒素用作抗原的情况，由于类毒素的致免疫性，它可以通过形成抗体(免疫应答)赋予对肉毒毒素的免疫性。本发明的目的在于允许微量的肉毒毒素从口服给药的制剂中释放出来以在体内于患者的GI道中抑制胞吐作用，从而达到所需的治疗效果，如减少肌肉痉挛或肌肉紧张，预防肌肉收缩或减少胃肠道中受胆碱能影响的分泌细胞或腺的过量分泌。

[0123] 口服制剂制成使肉毒毒素基本均匀地分散在可生物降解的载体中。本发明范围内的另一种口服制剂可包括由可生物降解的涂层包覆的载体，其中涂层厚度和涂层材料是可以改变的。

[0124] 口服制剂的厚度可用以控制本发明组合物对水的吸收，从而控制神经毒素从本发明组合物中释放出来的速度，较厚的口服制剂对多肽的释放慢于较薄的口服制剂。

[0125] 神经毒素控释组合物中的神经毒素还可与其它赋形剂混合，如填充剂或添加的稳定剂，例如用于在冻干过程中稳定神经毒素的缓冲剂。

[0126] 载体优选由无毒性的、非致免疫性的、生物相容的物质组成。适宜的口服制剂物质可包括如下聚合物：聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)(对-HEMA)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(对-NVP)+，聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、乙烯-乙酸乙烯共聚物(EVAc)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙烯基吡咯烷酮/丙烯酸甲酯共聚物、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚酐、聚(原酸酯)、胶原质和纤维素衍生物以及生物陶瓷，如羟基磷灰石(HPA)、磷酸三钙(TCP)和磷酸铝钙(ALCAP)。

[0127] 可生物降解的载体可由如下聚合物制得：聚交酯、聚乙醇酸交酯、胶原质、交酯-乙醇酸交酯共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酰胺酯、聚酐、聚(氨基酸)、聚原酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚(对-二噁酮)、聚(草酸亚烃酯)、可生物降解的聚氨酯、及其混合物和共聚物。特别优选的载体可作为乳酸-乙醇酸(“PLGA”)的聚合物或共聚物形成，其中交酯：乙醇酸交酯的比例可根据所需的载体降解速度改变。

[0128] 可生物降解的PLGA聚合物已用于形成可再吸收的缝线和骨板并已用在数种市售微粒制剂中。PLGA通过主要部分的腐蚀而降解以产生乳酸和乙醇酸，并且多种分子量和聚合物端基(例如月桂醇或游离酸)的PLGA有市售。聚酐是另一类批准用于人类的聚合物，并已用于递送蛋白质和抗原。与PLGA不同，聚酐通过表面腐蚀而降解，并在载体表面释放捕获的神经毒素。

[0129] 为制备适宜的口服制剂，可将载体聚合物溶于有机溶剂，如二氯甲烷或乙酸乙酯中，然后将肉毒毒素混入聚合物溶液中。形成微球的常规方法有溶剂蒸发法和溶剂(凝聚)法。水-油-水(W/O/W)复乳剂法是广泛使用的将蛋白抗原密封到PLGA微球中的方法。

[0130] 肉毒毒素的水溶液也可用于制造口服制剂。将肉毒毒素的水溶液加入聚合物溶液(先将聚合物溶于适宜的有机溶剂中)中。水(神经毒素)溶液与有机(聚合物)溶剂的体积比是确定微球释放特性及其对神经毒素的密封功效(理论蛋白载荷与实验蛋白载荷的比值)的重要参数。

[0131] 还可通过加大聚合物溶液的运动粘度提高密封功效。通过降低操作温度和/或提高聚合物在有机溶剂中的浓度可提高聚合物溶液的运动粘度。

[0132] 因此，在低体积比的水相(神经毒素)：有机相(聚合物)下(即水相体积：有机相体积≤0.1ml/ml)，基本上100％的神经毒素可由微球密封，并且微球可表现出三相释放：最初破裂(第一脉冲)、鲜有或无神经毒素释放的滞后相以及第二释放相(第二脉冲)。

[0133] 滞后相的长度取决于聚合物的降解速度，而降解速度又取决于聚合物的组成和分子量。因此，介于第一(破裂)脉冲和第二脉冲之间的滞后相随着交酯含量的提高而延长，或在交酯∶乙醇酸交酯的比值不变时随着聚合物分子量的加大而延长。除了低水相(神经毒素)体积外，如上所述，低温(2～8℃)操作也提高密封功效，并缩短最初破裂，促进神经毒素抗热失活稳定性的提高。

[0134] 适宜于在体内控制神经毒素，如肉毒毒素释放的本发明范围内的口服制剂，可制成在GI道中释放神经毒素的口服制剂。

[0135] 优选的口服制剂以可忽略毒素血清水平的方式释放肉毒毒素。本发明范围内的口服制剂还可制成用于摄取的悬浊液。所述悬浊液可通过制药领域所熟知的普通技术生产，例如在装有适宜网筛，如120目网孔的超高速离心研磨机中研磨聚交酯/多肽混合物，然后在用于注射的溶剂中悬浮研磨、过筛的颗粒，所述溶剂包括例如丙二醇、水(可任选包括常规的增加粘度的试剂或混悬剂、油或其它已知的适宜于口服摄取的液体赋形剂。

[0136] 优选地，生物活性神经毒素在体内的释放在神经毒素的释放期间不产生显著的免疫系统应答。

[0137] 肉毒毒素口服制剂优选允许肉毒从可生物降解的聚合物微球中以生物活性形式(即具有基本天然的毒素构象)释放出来。为稳定神经毒素，不论是在所用的神经毒素与适宜的可形成口服制剂基体的聚合物(即粉状的神经毒素已冷冻干燥或已冻干)混合的形式下，还是在神经毒素存在于或掺入所选的聚合物基体中时，均可使用多种药用赋形剂。适宜的赋形剂可包括淀粉、纤维素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、垩石、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、白蛋白和干脱脂乳。神经毒素口服制剂中的神经毒素可与赋形剂、填充剂、稳定剂和缓冲剂混合以在冻干或冷冻干燥时稳定神经毒素。

[0138] 已发现稳定的神经毒素可包括与至少一类多价金属阳离子络合的具有生物活性的非聚集神经毒素，所述金属阳离子为+2价或以上。

[0139] 适宜的多价金属阳离子包括生物相容的金属阳离子组分所包含的金属阳离子。如果阳离子组分在所用量对接受者是无毒性的，并且对接受者的身体没有产生显著有害的或不适当的影响，例如口服给药制剂后有致免疫性反应，则金属阳离子组分是生物相容的。

[0140] 对于稳定神经毒素的金属阳离子而言，金属阳离子组分和神经毒素的摩尔比优选在约4∶1到约100∶1之间，并且更一般的在约4∶1到约10∶1之间。

[0141] 用于稳定肉毒毒素的金属阳离子优选Zn++，因为已知肉毒毒素是锌内肽酶。优选二++价的锌阳离子是因为已知肉毒毒素是二价锌内肽酶。在更优选的实施方案中，含有Zn 阳离子的金属阳离子组分与神经毒素的摩尔比为约6∶1。

[0142] 金属阳离子对稳定神经毒素的适用性可由所属技术领域的普通技术人员通过多种稳定性指示技术确定，例如对含有金属阳离子的神经毒素的冻干颗粒采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、反相色谱法、HPLC以及效能法以测定神经毒素冻干后的效能以及从微粒中释放出来的持续时间。在稳定的神经毒素中，由于水合作用或由于形成缓释组合物的过程或由于缓释组合物的化学特性，神经毒素在体内水合过程中有聚集在微粒中的倾向和/或丧失生物活性或效能的倾向，所述倾向通过在神经毒素与聚合物溶液接触前，使至少一类金属阳离子与神经毒素络合而降低。

[0143] 通过本发明，稳定的神经毒素在控释期间是稳定的，没有明显的聚集。明显的聚集被定义为聚集的量导致有约15％或以上的聚合物密封的或聚合物基体掺入的神经毒素聚集。优选的聚集维持在神经毒素的约5％以下。更优选的聚集维持在聚合物中神经毒素的约2％以下。

[0144] 在另一例实施方案中，神经毒素的控释组合物还含有第二金属阳离子组分，该金属阳离子组分未包含在稳定的神经毒素颗粒中并且分散于载体内。第二金属阳离子组分优选含有与稳定的神经毒素中所包含种类相同的金属阳离子。或者，第二金属阳离子组分可包含一种或更多不同种类的金属阳离子。

[0145] 第二金属阳离子组分用于调节神经毒素从口服制剂的聚合基体中的释放，例如通过用作金属阳离子的贮备以进一步延长持续时间，期间神经毒素由金属阳离子稳定以提高神经毒素在组合物中的稳定性。

[0146] 用于调节释放的金属阳离子组分通常含有至少一类多价金属阳离子。适用于调节神经毒素释放的第二金属阳离子组分的实例包括或含有，例如，Mg(OH)2、MgCO3(例如，4MgCO3Mg(OH)25H2O)、ZnCO3( 如 3Zn(OH)22ZnCO3)、CaCO3、Zn3(C6H5O7)2、Mg(OAc)2、MgSO4、Zn(OAc)2、ZnSO4、ZnCl2、MgCl2和Mg3(C6H5O7)2。第二金属阳离子组分与聚合物之间的适宜重量比在约1∶99到约1∶2之间。最适宜的比值取决于所使用的聚合物和第二金属阳离子组分。

[0147] 本发明的神经毒素口服制剂可制成多种形状，如薄膜、丸剂、圆柱体、圆片或微球。本发明所定义的微球包括直径小于约1毫米并且其中分散有稳定的神经毒素的载体组分。
微球可为球形、非球形或不规则的形状。微球优选是球形的。为便于摄取，微球通常悬浮于适宜的液体中。微球的优选尺寸范围，其直径在约1～约180微米之间。

[0148] 在本发明方法中，为了形成用于GI释放生物活性的非聚集神经毒素的组合物，将适量的稳定的生物活性神经毒素的颗粒分散于载体中。

[0149] 本发明所定义的适宜的聚合物载体溶剂，指聚合物在其中可溶但稳定的神经毒素在其中基本不溶并且无反应性的溶剂。适宜的聚合物溶剂的实例包括极性有机液体，如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和丙酮。

[0150] 为制备稳定的生物活性神经毒素，使神经毒素在适宜的水性溶剂中与至少一种适宜的金属阳离子组分在适宜于形成金属阳离子与神经毒素络合物的pH条件下混合。通常，络合的神经毒素以浑浊的沉淀形式悬浮于溶剂中。然而，络合的神经毒素也可在溶液中。在++更优选的实施方案中，神经毒素与Zn 络合。

[0151] 形成神经毒素络合物的适宜pH条件通常包括pH值在约5.0到约6.9之间。通常，通过使用水性缓冲剂，如碳酸氢钠作为溶剂获得适宜的pH条件。

[0152] 适宜的溶剂指神经毒素和金属阳离子组分在其中均至少微溶的溶剂，例如水性碳酸氢钠缓冲液。对于水性溶剂，所使用的水优选为去离子水或用于注射的水(WFI)。

[0153] 神经毒素在与金属阳离子组分接触前可为固态或溶解状态的。并且，金属阳离子组分在与神经毒素接触前可为固态或溶解状态的。在优选实施方案中，神经毒素的缓冲水溶液与金属阳离子组分的水溶液混合。

[0154] 通常，络合的神经毒素以浑浊的沉淀形式悬浮于溶剂中。然而，络合的神经毒素也++可在溶液中。在优选的实施方案中，神经毒素与Zn 络合。

[0155] 然后可使Zn++络合的神经毒素干燥，例如通过冻干以形成稳定的神经毒素颗粒。++
悬浮或溶液中的Zn 络合的神经毒素可大量冻干，或可分成较小的体积后再冻干。在优选++
的实施方案中，通过使用例如超声波喷嘴使Zn 络合的神经毒素悬浊液微粉化，然后冻干++
以形成稳定的神经毒素颗粒。冻干Zn 络合的神经毒素混合物的可用方法包括所属领域已知的方法。

[0156] 在另一例实施方案中，未包含在稳定的神经毒素颗粒中的第二金属阳离子组分也分散在聚合物溶液中。

[0157] 应理解第二金属阳离子组分和稳定的神经毒素可依次、以相反的顺序、间歇、分别或通过同时加入分散到聚合物溶液中。或者，聚合物、第二金属阳离子组分和稳定的神经毒素可依次、以相反的顺序、间歇、分别或通过同时加入混合到聚合物溶剂中。然后在该方法中使聚合物溶剂凝固以形成含有稳定的神经毒素分散系的聚合物基体。

[0158] 由聚合物溶液形成神经毒素口服制剂的适宜方法有溶剂蒸发法，该方法在美国专利No.3,737,337、3,523,906、3,691,090以及4,389,330中有描述。溶剂蒸发法可用作形成神经毒素口服制剂的方法。

[0159] 在溶剂蒸发法中，含有稳定的神经毒素颗粒分散系的聚合物溶液混合在连续相中或与连续相搅拌，其中聚合物溶剂部分可溶，以形成乳液。连续相通常是水性溶剂。乳化剂通常包括在连续相中以稳定乳液。然后蒸发聚合物溶剂数小时或以上，从而使聚合物凝固以形成具有所含稳定的神经毒素颗粒分散系的聚合物基体。

[0160] 由聚合物溶液形成神经毒素控释微球的优选方法在美国专利No.5,019,400中有描述。该微球形成的方法，与其它方法，如相分离法相比还可减少生产具有特定神经毒素含量的口服制剂所需的神经毒素的量。

[0161] 在所述方法中，加工含有稳定的神经毒素分散系的聚合物溶液以制成液滴，其中至少有相当部分的液滴含有聚合物溶液和稳定的神经毒素。然后通过适于形成微球的方式冷冻上述液滴。加工聚合物溶液分散系以形成液滴的方法的实例包括使分散系穿过超声波喷嘴、压力喷嘴、瑞利喷口或通过其它已知方式将溶液制成液滴。

[0162] 将冷冻微液滴中的溶剂作为固体和/或液体提取到非溶剂中以形成含有稳定的神经毒素的微球。与单独使用乙醇相比，将乙醇与其它非溶剂，如己烷或戊烷混合可提高溶剂从某些聚合物，如交酯-乙醇酸交酯共聚物中的提取速度。

[0163] 另一种由聚合物溶液形成神经毒素口服制剂的方法包括薄膜铸造法(film casting)，例如在模具中形成薄膜或外形。例如，先将含有稳定的神经毒素分散系的聚合物溶液注入模具中，然后通过所属领域已知的方法除去聚合物溶剂，或降低聚合物溶液的温度直至获得具有恒定干燥重量的薄膜或外形。

[0164] 对于可生物降解的聚合物口服制剂，神经毒素的释放由聚合物的降解引起。降解的速度可通过改变影响聚合物水合速度的聚合物性能加以控制。所述性能包括，例如形成聚合物的不同单体，如交酯和乙醇酸交酯的比值；用单体的左旋异构体代替外消旋混合物；以及聚合物的分子量。上述性能可影响控制聚合物水合速度的亲水性和结晶性。还可掺入亲水性的赋形剂，如盐、碳水化合物和表面活性剂以促进水合作用并改变聚合物的腐蚀速度。

[0165] 通过改变可生物降解的聚合物的性能，可控制扩散和/或聚合物降解对神经毒素释放的贡献。例如，提高交酯-乙醇酸交酯共聚物中乙醇酸交酯的含量并降低聚合物的分子量可促进聚合物的水解，并从而增加由聚合物腐蚀所释放的神经毒素。此外，在非中性pH下，聚合物水解的速度有所提高。因此，可向用以形成微球的聚合物溶液中加入酸性或碱性赋形剂，以改变聚合物的腐蚀速度。

[0166] 根据采用神经毒素治疗各种病症的已知参数可向人类给药本发明范围内的口服制剂以提供所需剂量的神经毒素，如上所述。

[0167] 适于给药的口服制剂的具体剂量易于由所属技术领域的普通技术人员根据上述因素确定。剂量还可取决于待治疗的或去除神经支配的组织块的大小以及毒素的商用制品。此外，对人类中适宜剂量的估算可由所确定的其它组织有效去除神经支配所需的肉毒的量外推得到。例如，待注射的A型肉毒的量与治疗组织的质量以及活性水平成比例。通常，本发明的口服制剂每单位时间段(即每2～4个月内或一次)可释放约0.01单位/kg～约35单位/kg患者体重的肉毒毒素，如A型肉毒毒素以有效获得所需的肌肉麻痹。低于约0.01U/kg的肉毒毒素对肌肉无显著疗效，而约35U/kg以上的肉毒毒素接近神经毒素，如A型肉毒毒素的毒性剂量。仔细制备口服制剂可防止全身出现显著量的肉毒毒素。更优选的剂量范围为约0.01U/kg～约25U/kg的肉毒毒素，如制成的 待给药的肉毒毒素的实际量(U/kg)取决于如下因素，如待治疗组织的范围(质量)和活性水平以及所选择的给药途径。本发明方法中优选使用的肉毒毒素血清型是A型肉毒毒素。

[0168] 用于实施本发明范围内方法的神经毒素优选为肉毒毒素，如血清型A、B、C、D、E、F或G肉毒毒素中的一种。优选使用的肉毒毒素是A型肉毒毒素，因为其在人类中的效能高、易于获得，并且已知当其通过肌肉注射局部给药时对于治疗骨骼肌和平滑肌病症是安全有效的。

[0169] 本发明范围包括任何神经毒素的用途，所述神经毒素在用于治疗运动病症或受胆碱能神经支配影响的疾病时，其疗效的持续时间长。例如，由任何种类的产生毒素的梭菌，如肉毒梭菌、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和巴氏梭菌(Clostridium beratti)所产生的神经毒素均可用于或适用于本发明方法中。并且，所有肉毒血清型A、B、C、D、E、F和G型均可方便地用于实施本发明，虽然如上所述A型是最优选的血清型。实施本发明可提供从1个月到约5或6年的有效缓解。

[0170] 本发明范围包括：(a)神经毒素络合物以及由下列方法获得或处理的纯神经毒素，所述方法包括培养细菌、提取毒素、浓缩、保存、冷冻干燥和/或复原；以及(b)修饰的或重组的神经毒素，通过已知的化学/生物化学氨基酸修饰方法或通过使用已知的宿主细胞/重组载体的重组技术使神经毒素有一个或多个氨基酸或氨基酸序列故意缺失、修饰或取代以及由此制造的神经毒素的衍生物或片断，并且包括具有一个或多个附着靶部分的神经毒素，所述靶部分针对存在于细胞上的细胞表面受体。

[0171] 根据本发明使用的肉毒毒素可以冻干或真空干燥的形式减压存储于容器中。在冻干前，肉毒毒素可与药用赋形剂、稳定剂和/或载体，如白蛋白结合。冻干或真空干燥的物质可用盐水或水复原。

[0172] 本发明范围还包括使用口服制剂以提供GI病症的治疗缓解。因此，神经毒素可由能被吞咽的适宜聚合物基体所包埋、吸收或承载。

[0173] 确定适宜的给药途径和剂量的方法通常由主治医师根据各个病例的基本情况决定。上述确定过程是所属技术领域的普通技术人员的日常事务(参考，例如，Harrison’s Principles of Internal Medicine(1998)，Anthony Fauci等编辑，第14版，McGraw Hill发行)。因此，本发明范围内的口服制剂可通过吞咽给药。

[0174] 已知冻干的破伤风类毒素的高含水量可导致固相聚集并在类毒素密封到微球中后使其失活。例如，如果破伤风类毒素的水含量为10％(每100克蛋白质中水的克数)，则有约25％的毒素发生聚集，而水含量为5％时，仅有约5％的类毒素聚集。参考，例如251页，Schwendeman S.P.等，Peptide，Protein，and Vaccine Delivery FromOral formulationable Polymeric Systems，Park K.，Controlled DrugDelivery Challenges and Strategies，American Chemical Society(1997)的第12章(229～267页)。值得注意的是，由 的生产方法得到的冷冻干燥的A型肉毒毒素络合物，其水分含量小于约3％，在该水分水平下，可预料仅有微量的固相聚集。

[0175] 制造可生物降解的肉毒毒素口服制剂的一般方法如下所示。口服制剂可包括约25％～约100％的聚交酯，所述聚交酯是乳酸的聚合物。提高口服制剂中交酯的量可延长口服制剂开始生物降解之前的延续时间，从而延长口服制剂释放肉毒毒素之前的时间。口服制剂还可为乳酸和乙醇酸的共聚物。乳酸可为外消旋形式或光学活性形式，并且可溶于苯且特性粘度为0.093(1g/100ml，于氯仿中)～0.5(1g/100ml，于苯中)或者不溶于苯且特性粘度为0.093(1g/100ml，于氯仿中)～4(1g/100ml，于氯仿或二噁英中)。口服制剂还可包括均匀分散于载体聚合物中的0.001％～50％的肉毒毒素。

[0176] 口服制剂一旦开始吸收水即表现出两连续并通常可区分的神经毒素释放相。在第一相中，神经毒素通过最初的扩散作用穿过与口服制剂外表面相连的水性神经毒素区释放出来。神经毒素释放后随即出现第二相即可生物降解的载体(即聚交酯)的降解。扩散相和降解诱导相时间上可明确区分。当口服制剂置于水性生理环境中时，水扩散到聚合物基体中并隔开在神经毒素和聚交酯之间以形成水性神经毒素区。水性神经毒素区随着吸收水的增多而扩大，直至水性神经毒素区的连续性达到足够高的水平，以与口服制剂的外表面相连。因此，神经毒素通过扩散穿过由水性神经毒素区形成的水性多肽通道从口服制剂中释放出来，而第二相持续到几乎所有的残留神经毒素被释放出来。

[0177] 本发明范围还包括悬浮液形式的口服制剂，其制备是通过将神经毒素密封的微球悬浮在适宜的液体，如生理盐水中。

[0178] 实施例

[0179] 下列实施例提出本发明所包括的具体组合物和方法，但不用于限制本发明的范围。

[0180] 实施例1

[0181] 制造用于口服摄取的肉毒毒素片剂的方法

[0182] 肉毒毒素可合成为用于将毒素活性成份释放到胃或十二指肠中的口服制剂。通过下述方法易于达到上述目的：用乳钵和研棒混合(在室温下，不加入任何水或盐水)50单位的市售冻干的肉毒毒素粉末，如非复原的 (或200单位的 粉末)与可生物降解的载体，如面粉或糖。或者，可通过均化法或声裂法混合肉毒毒素以在载体中形成粉末毒素的均匀分散系。然后用制片机(如压片机，可从Scheu& Kniss购得，1500W.Ormsby Ave，路易斯维尔，KY40210)压缩混合物即制得可摄取的片剂。或者，可通过已熟知的方法用明胶配制毒素以生产可摄取的明胶片剂(geltab)。

[0183] 实施例2

[0184] 治疗肥胖症的方法

[0185] 通过给药实施例1的肉毒毒素口服制剂治疗42岁的男性肥胖症患者。患者每四天吞服一片50单位的A型片剂。患者在两周中减掉10磅，并且在四周末体重下降增至20磅，显然是由于胃肠运动减少。

[0186] 实施例3

[0187] 制造可生物降解的肉毒毒素口服制剂的方法

[0188] 通过将适量的稳定肉毒毒素制品(即非复原的 )分散到由可生物降解的聚合物在挥发性有机溶剂，如二氯甲烷中形成的连续相中可制备含有肉毒毒素和适宜载体聚合物的可生物降解的口服制剂。PLGA和聚酐均不溶于水，因此在微密封过程中需要使用有机溶剂。

[0189] 将聚合物溶解在有机溶剂中，如二氯甲烷或乙酸乙酯中以促进微球的构成。然后通过均化法或声裂法混合肉毒毒素以在聚合物/有机溶剂中形成毒素的均匀分散系，当使用水性蛋白溶液时，形成的分散系是乳液，当将固体蛋白制剂与聚合物-有机溶剂溶液混合时，形成的分散系是悬浊液。形成微球的常规方法有溶剂蒸发法和溶剂(凝聚)法。通过将预制的蛋白药物和聚合物-有机溶剂的悬浊液与含水的乳化剂(即聚乙烯醇)混合可形成微球。然后加入更多的水以促进有机溶剂从微球中移除，从而使微球变硬。干燥最后得到的微球以生成自由流动的粉末。

[0190] 所使用的聚合物可为PLA、PGA或其共聚物。或者，可通过将神经毒素的水溶液(即复原的 )乳化到聚合物-有机相中(从而得到W/O乳液)制备掺入聚合物中的肉毒毒素。不论是哪种方法均采用高速搅拌机或超声波以确保毒素与聚合物均匀混合。将乳液雾化到热气流中，通过溶剂蒸发(喷雾干燥技术)引起颗粒形成以形成直径为1～50μm的微粒。或者，可通过加入非溶剂，如硅油使聚合物凝聚(相分离技术)或通过制备W/O/W乳液(复乳剂技术)促使颗粒形成。

[0191] 待与肉毒毒素混合的铸液或其它溶液的pH维持在4.2～6.8，因为当pH大于约7时，稳定的非毒素蛋白可从肉毒毒素中游离出来，导致毒性逐渐丧失。优选的pH在约5～6之间。并且混合物/溶液的温度应不超过约35℃，因为当溶液/混合物加热到约40℃以上时，易于使毒素丧失毒性。

[0192] 冷冻液滴以形成微粒的方法包括：将液滴引到液化气，如液态氩气或液氮中或其附近以形成冷冻微液滴，然后使其从液化气中分离出来。接着可使冷冻的微液滴暴露于液态非溶剂，如乙醇，或混有己烷或戊烷的乙醇中。

[0193] 通过改变液滴的大小，如通过改变超声波喷嘴的直径可制得多种大小的肉毒毒素口服制剂微粒。如果需要非常大的微粒，则可使微粒穿过注射器直接挤出到冷却液体中。提高聚合物溶液的粘度也可增大微粒的尺寸。通过上述方法可生产如下尺寸的微粒，例如微粒的直径在大于约1000微米到约1微米。然后可用掺有肉毒毒素的微粒填满可摄取的胶囊，密封即制得肉毒毒素口服制剂。

[0194] 或者，可用与适量惰性载体(以提供足够体积的物质填充胶囊)，如面粉或糖混合的适量非复原BOTOX(不再处理到微球中)粉末填充胶囊。

[0195] 实施例4

[0196] 制造聚酐肉毒毒素口服制剂的方法

[0197] 可生物降解的聚酐聚合物可作为20∶80的聚羧苯氧丙烷和癸二酸的共聚物产生。聚合物和肉毒毒素(如非复原的 )可在室温下一起溶于二氯甲烷中并使用实施例3的技术喷雾干燥为微球。任何残留的二氯甲烷可在真空干燥器中蒸发掉。

[0198] 根据所需的口服制剂的大小以及由此确定的肉毒毒素的量，适量的微球可在模具中于约8000p.s.i压缩5秒或在3000p.s.i压缩17秒以形成口服制剂圆片密封的神经毒素。例如，微球可在氮气中压模压缩到密封于铝箔囊中的直径为1.4cm，厚1.0mm的圆片并用2.2×104Gy的γ射线杀菌。

[0199] 实施例5

[0200] 制造可生物降解的肉毒毒素口服制剂的油包水(water in oil)法

[0201] 通过在室温下轻微搅拌将80∶20的聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物溶于10％w/v的二氯甲烷中可生产肉毒毒素口服制剂。然后通过向1份1∶5的Tween 80(聚氧乙烯20失水山梨醇单油酸酯，可从新泽西州Fairlawn的Acros Organics N.V.购得)和Span 85(失水山梨醇三油酸酯)的混合物及11份75单位的 (A型肉毒毒素络合物)和Qui1A(辅助剂)的水性混合物中加入88份聚合物溶液可制得油包水型的乳液。混合物用高速搅拌机搅拌，然后立即用装有60/100/120喷嘴的Drytec Compact Laboratory Spry Dryer在雾化压力为15psi，入口温度为65℃下雾化干燥。得到的微球直径为约20μm并作为自由流动的粉末收集。残留的痕量有机溶剂通过真空蒸发除去。

[0202] 实施例6

[0203] 制造可生物降解的肉毒毒素口服制剂的低温法

[0204] 可在低温下制造肉毒毒素口服制剂以抑制毒素变性。方法如下：在低温(2～8℃)下，将每毫升二氯甲烷或乙酸乙酯中0.3g的PLGA与每毫升聚合物-有机溶剂中0.1ml的神经毒素溶液混合。如实施例1所述的(通过将聚合物溶解在二氯甲烷中形成的聚合物溶液)，由特性粘度(dL/g)为约0.62(可由MTI获得)的75∶25的交酯∶乙醇酸交酯聚合