肿瘤内差异表达的基因产物及其应用

摘要

本发明涉及与肿瘤相关的基因产物的鉴别，涉及编码所述产物的核酸。本发明也涉及如下疾病的治疗和诊断，所述疾病中基因产物的异常表达与肿瘤相关，蛋白质、多肽和肽的表达与肿瘤相关。本发明还涉及编码所述多肽、肽和蛋白质的核酸。

权利要求

1.用于检测编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸的药剂、或用于检测肿瘤相关抗原或其部分的药剂在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于诊断特征在于肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病，所述诊断通过：用肿瘤相关抗原在分离自患者的生物样品中进行：所述编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸的检测，和/或所述肿瘤相关抗原或其部分的检测，

所述肿瘤相关抗原具有由选自如下的核酸所编码的序列：(a)包含选自SEQ ID NO：7-8，117和119的核酸序列之核酸，其部分或其衍生物，(b)在严格条件下与(a)所述核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)的核酸简并的核酸，以及

(d)与(a)、(b)或(c)的核酸互补的核酸。

2.按照权利要求1的用途，其中所述用于检测编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸的药剂、或用于检测肿瘤相关抗原或其部分的药剂是特异性结合编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸的药剂、或者结合肿瘤相关抗原或其部分的药剂，其中所述检测包括(i)将生物样品与所述药剂接触，以及(ii)检测药剂与核酸或其部分、或者与肿瘤相关抗原或其部分之间复合物的形成。

3.按照权利要求1或2的用途，其中所述检测与相当的正常生物样品中的检测相比较。

4.按照权利要求1的用途，其中用于检测核酸或其部分的药剂是特异性杂交所述核酸或其部分的多聚核苷酸探针。

5.按照权利要求4的用途，其中所述多聚核苷酸探针包含编码肿瘤相关抗原的核酸之

6-50个连续核苷酸序列。

6.按照权利要求1的用途，其中所述核酸或其部分的检测是通过选择性扩增所述核酸或其部分进行。

7.按照权利要求1的用途，其中用于检测所述肿瘤相关抗原或其部分的药剂是特异性结合所述肿瘤相关抗原或所述其部分的抗体。

8.用于监测编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸的量的药剂、或用于监测肿瘤相关抗原或其部分的量的药剂在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于测定特征在于肿瘤相关抗原表达或异常表达之疾病的缓解、过程或开始，通过监测来自患有所述疾病或被怀疑患有所述疾病的患者之生物样品的：所述编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸的量，或

所述肿瘤相关抗原或其部分的量，

所述肿瘤相关抗原具有由选自如下的核酸编码的序列：(a)包含选自SEQ ID NO：7-8，117和119的核酸序列之核酸，其部分或其衍生物，(b)在严格条件下与(a)所述核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)的核酸简并的核酸，以及

(d)与(a)、(b)或(c)的核酸互补的核酸。

9.按照权利要求8的用途，所述核酸或其部分的量、或者肿瘤相关抗原或其部分的量在第一个样品中第一个时间点和另一个样品中第二个时间点进行测定，并且其中通过比较两个样品来测定疾病的过程。

10.按照权利要求8的用途，其中用于监测所述核酸或其部分的量的药剂是特异性杂交所述核酸或其部分的多聚核苷酸探针。

11.按照权利要求10的用途，其中所述多聚核苷酸探针包含编码肿瘤相关抗原的核酸之6-50个连续核苷酸的序列。

12.按照权利要求8的用途，其中所述核酸或其部分的量的监测是通过选择性扩增所述核酸或其部分进行。

13.按照权利要求8的用途，其中用于监测所述肿瘤相关抗原或其部分的量的药剂是特异性结合所述肿瘤相关抗原或其部分的抗体。

14.按照权利要求4-5、7、10-11和13中任一项的用途，其中多聚核苷酸探针或抗体用可检测的方式进行标记。

15.按照权利要求14的用途，其中所述的可检测的标志物是放射活性的标志物或酶标志物。

16.按照权利要求1或8的用途，其中所述生物样品包含体液和/或机体组织。

17.结合肿瘤相关抗原或其部分并偶联于诊断药剂的抗体在制备用于诊断或监测特征在于所述肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病的药物组合物中的用途，所述肿瘤相关抗原具有由选自如下的核酸编码的序列：(a)包含选自SEQ ID NO：7-8，117和119的核酸序列之核酸，其部分或其衍生物，(b)在严格条件下与(a)所述核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)的核酸简并的核酸，以及

(d)与(a)、(b)或(c)的核酸互补的核酸。

18.按照权利要求7、13或17的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。

19.按照权利要求7、13或17的用途，其中所述抗体是嵌合或人源化抗体。

20.按照权利要求7、13或17的用途，其中所述抗体是抗体的片段。

21.按照权利要求1、8或17的用途，其中肿瘤相关抗原包含选自SEQ ID NO：16-19、

111-116、118、120和137的氨基酸序列，其部分或其衍生物。

22.一种抗体，其特异性地结合蛋白质或多肽或其部分，所述蛋白质或多肽由选自如下的核酸编码：(a)包含选自SEQ ID NO：7-8，117和119的核酸序列之核酸，其部分或其衍生物，(b)在严格条件下与(a)所述核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)的核酸简并的核酸，以及

(d)与(a)、(b)或(c)的核酸互补的核酸。

23.按照权利要求22的抗体，其中所述蛋白质或多肽包含选自SEQID NO：16-19、

111-116、118、120和137的氨基酸序列，其部分或其衍生物。

24.按照权利要求22或23的抗体，其是单克隆、嵌合或人源化抗体或者抗体的片段。

25.权利要求22-24中任一项的抗体与治疗或诊断药剂之间所形成的结合物。

26.按照权利要求25的结合物，其中所述治疗或诊断药剂是毒素。

27.一种用于检测肿瘤相关抗原表达或异常表达的试剂盒，所述试剂盒包含用于如下检测的试剂：(i)编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸的检测，和/或(ii)肿瘤相关抗原或其部分的检测，

所述肿瘤相关抗原具有由选自如下的核酸编码的序列：(a)含有选自SEQ ID NO：7-8、117和119的核酸序列之核酸，其部分或其衍生物，(b)在严格条件下与(a)所述核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)的核酸简并的核酸，以及

(d)与(a)、(b)或(c)的核酸互补的核酸。

28.权利要求27的试剂盒，其中所述用于检测编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸之试剂是用于选择性扩增所述核酸的核酸分子。

29.权利要求28的试剂盒，其中用于选择性扩增核酸的所述核酸分子包含编码肿瘤相关抗原的核酸之6-50个连续核苷酸的序列。

说明书

肿瘤内差异表达的基因产物及其应用

[0001] 尽管各学科间的方法和经典治疗程序的充分使用，癌症仍然是死亡的主要原因之一。较新治疗概念旨在通过使用重组肿瘤疫苗和其他特异性措施例如抗体治疗，将患者的免疫系统整合进整体治疗概念之中。这样一个策略成功的先决条件是肿瘤特异性或肿瘤相关抗原或抗原决定簇被患者的免疫系统识别，其免疫系统的效应物功能被干预性地增强。肿瘤细胞在生物学上与其同起源的非恶性细胞有生物特性的本质性不同。这些差异是因为肿瘤发展中获得的基因改变，导致尤其是癌症细胞内定性或定量改变的分子结构的形成。
此类被荷瘤宿主特异性的免疫系统识别的肿瘤相关结构，被称为肿瘤相关抗原。肿瘤相关+ +
抗原的特异性识别涉及细胞和激素机制，它们是两个功能性相互连接的单元：CD4 和CD8T淋巴细胞分别识别被递呈在MHC(主要组织相容性复合物)II型和I型分子上的加工过的抗原，而B淋巴细胞生产直接与未加工过的抗原结合的循环抗体分子。免疫系统对肿瘤细胞上抗原的识别导致细胞毒性效应物(effector)装置的启动以及在有T辅助细胞的情况下造成癌症细胞的消除，上述事实产生了肿瘤相关抗原潜在的临床治疗重要性(Pardoll，Nat.Med.4：525-31，1998)。相应地，肿瘤免疫学的中心目标是在分子水平定义这些结构。
这些抗原的分子性质在很长时间都是迷。只有在发展合适的克隆技术之后，才有可能为了肿瘤相关抗原而通过分析细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的靶结构(van der Bruggen等人，Science 254：1643-7，1991)或者通过将循环自身抗体用作探针(Sahin等人，Curr.Opin.Immunol.9：709-16，1997)系统地筛选肿瘤的cDNA表达文库。为了这个目标，cDNA表达文库从新鲜的肿瘤组织制备并且在合适的系统中重组表达为蛋白质。分离自患者的免疫效应物，就是有肿瘤特异性溶解模式的CTL克隆，或循环自身抗体被用来克隆各自的抗原。

[0002] 近年来，运用这些方法在多种肿瘤中定义了抗原的多重性。然而，上面举例说明的经典方法中用于抗原鉴别的探针是来自通常已经有晚期癌症的患者的免疫效应物(循环自身抗体或CTL克隆)。许多数据指出肿瘤会导致，例如，耐受和T细胞的无反应性，以及疾病的过程中，尤其是那些能引起有效免疫识别的特异性从免疫效应分子的全部特性(repertoire)中丢失。当前的患者研究并未得出任何可靠的证据来证实以前发现和使用的肿瘤相关抗原的真实作用。相应地，不能排除引起自发免疫反应的蛋白质是错误的靶结构。

[0003] 本发明的目的是提供用于癌症的诊断和治疗的靶结构。

[0004] 根据本发明，这个目的通过权利要求的主题内容可以达到。

[0005] 根据本发明，采用了用于鉴别和提供表达与肿瘤相关的抗原以及为此编码该抗原的核酸的策略。这个策略基于一个事实，即以器官特异性方式(例如仅在结肠、肺或肾组织中)表达的特定基因，在各个器官的肿瘤细胞中被激活，并且在其它组织的肿瘤细胞中以异位的和禁止的方式也被激活。首先，数据采集提出所有已知器官特异性基因尽可能完整的清单，然后依靠特异性RT-PCR通过表达分析来评价不同肿瘤内它们的异常激活。然而，在传统策略中，正常组织文库的转录产物组(transcriptoms)通常用电子手段从肿瘤组织库中减去，假定剩下的基因是肿瘤特异性的(Schmitt等人，Nucleic Acids Res.27：4251-60，1999；Vasmatzis 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：300-4，1998；Scheurle 等人，Cancer Res.60：4037-43，2000)。

[0006] 然而，被证明更加成功的本发明的概念是基于利用数据采集用电子手段提取所有器官特异性的基因，然后评价所述基因在肿瘤中的表达。

[0007] 因而本发明一方面涉及用于鉴别肿瘤内差异表达的组织特异性基因的策略。所述的策略将公用序列库的数据采集(“在芯片上”)(“insilico”)与其后的实验室试验研究的评价(“湿试验台”)(“wet bench”)联合起来。

[0008] 根据本发明，基于两个不同的生物信息程序的联合策略使得新的肿瘤基因能够被鉴别。这些基因以前被分类为纯粹器官特异性的。这些基因在肿瘤细胞内异常激活的发现允许它们被赋予有功能意义的实质上新的性质。根据本发明，这些肿瘤相关基因及其编码的基因产物被鉴别并给予独立的免疫原性作用。

[0009] 根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原具有由选自如下的核酸编码的氨基酸序列，(a)包含选自SEQ ID NO：1-8、41-44、51-59、84、117和119的核酸序列之核酸，其部分或其衍生物，(b)在严格条件下与(a)的核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)的核酸简并的核酸，(d)与(a)、(b)或(c)的核酸互补的核酸。在优选的实施方案中，根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原具有由选自SEQ ID NO：1-8、41-44、51-59、84、117和119的核酸编码的氨基酸序列。在进一步优选的实施方案中，根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原包含选自SEQ ID NO：9-19、
45-48、60-66、85、90-97、100-102、105、106、1111-116、118、120、123、124和135-137的氨基酸序列，其部分或其衍生物。

[0010] 本发明一般涉及根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分或其衍生物的用途，为其编码的核酸或抗所述编码核酸的核酸的用途，抗根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或部分或其衍生物的抗体的用途。这个应用既涉及这些抗原、功能片段、核苷酸、抗体等等的单个体也涉及两个或多个的联合，在一个实施方案中，也与其它肿瘤相关基因和抗原联合，作为诊断、治疗和进展的对照。

[0011] 治疗和/或诊断的优选疾病是那些选择性表达或异常表达根据本发明鉴别的一个或多个肿瘤相关抗原的疾病。

[0012] 本发明还涉及表达与肿瘤细胞相关的核酸和基因产物。

[0013] 此外，本发明涉及基因产物，即核酸和蛋白质或肽，其由已知基因剪接的改变(剪接变异体)或使用选择性开放阅读框的翻译的改变而产生。在这方面，本发明涉及核酸，所述核酸包含选自根据序列列表的SEQID NO：3-5的序列之核酸序列。而且，在这方面，本发明涉及蛋白质或肽，所述蛋白质或肽含有选自根据序列列表的SEQ ID NO：10和12-14的序列之氨基酸序列。本发明的剪接变异体根据本发明能用作肿瘤疾病诊断和治疗的靶点。

[0014] 尤其是，本发明涉及根据序列列表的SEQ ID NO：10的氨基酸序列，所述序列由根据本发明鉴别的一个选择性开放阅读框编码，并且在蛋白质的氨基端上有额外的85个氨基酸而与前述的蛋白质序列(SEQ ID NO：9)不同。

[0015] 非常不同的机制可导致剪接变异体的产生，例如：

[0016] -可变的转录起始位点的利用

[0017] -额外的外显子的利用

[0018] -来自单个或两个或多个外显子的完全或不完全剪接

[0019] -经由突变改变的剪接调节子序列(新的供体/受体序列的缺失或产生)

[0020] -内含子序列的不完全去除

[0021] 基因改变的剪接导致改变的转录序列(剪接变异体)。剪接变异体在其改变的序列区域中的翻译导致发生改变的蛋白质，其与原先的蛋白质在结构和功能上截然不同。肿瘤相关剪接变异体可产生肿瘤相关转录产物和肿瘤相关蛋白质/抗原。这些可被利用作为肿瘤细胞检测和肿瘤治疗靶点的分子标志物(marker)。例如根据本发明，血液、血浆、骨髓、唾液、支气管灌洗液、体内分泌物和组织活检中肿瘤细胞的检测，例如，在提取核酸之后用剪接变异体特异性的寡聚核苷酸通过PCR扩增来进行。尤其是，成对引物适合作为寡聚核苷酸，至少其中的一个在严格条件下与肿瘤相关剪接变异体的区域结合。根据本发明，为此目的在实施例中描述的寡聚核苷酸是合适的，尤其是寡聚核苷酸具有或包含选自序列列表的SEQ ID NO：34-36、39、40和107-110的序列。根据本发明，所有序列依赖性的检测系统适合用于检测。除了PCR，这些检测系统是，例如，基因芯片/微阵列系统、Northern blot、RNAse保护试验(RDA)及其它。所有检测系统共同具有以特异性杂交于至少一个剪接变异体特异性的核酸序列为基础的检测。然而，肿瘤细胞也可，根据本发明，通过识别剪接变异体编码的特异性抗原决定簇的抗体进行检测。在这方面，本发明涉及尤其是具有或包含选自序列列表的SEQ ID NO：17-19、111-115、120和137之序列的肽以及抗这些肽的特异性抗体。适合免疫的尤其是其抗原决定簇与基因产物的变异体截然不同的氨基酸，所述氨基酸优选地在健康细胞中产生。用抗体检测肿瘤细胞此处可以在分离自患者的样品上或者静脉给予抗体后成像而进行。除诊断的用途以外，具有新的或改变的抗原决定簇的剪接变异体是免疫治疗很有吸引力的靶点。本发明的抗原决定簇可用于靶向治疗活性的单克隆抗体或T淋巴细胞。在被动免疫治疗中，识别剪接变异体特异性的抗原决定簇的抗体或T淋巴细胞在这里被过继性转移。在其他抗原的情况下，抗体也可以通过使用标准技术(动物的免疫，用于分离重组抗体的淘选策略(panningstrategies))利用包括这些抗原决定簇的多肽来生产。或者，可能为了免疫使用编码含有所述抗原决定簇的寡聚肽或多肽的核酸。用于体外或体内产生抗原决定簇特异性的T淋巴细胞的各种技术是已知的，并且已有详细描述(例如Kessler JH，等人，2001，Sahin等人，1997)，并且同样地以利用含有剪接变异体特异性的抗原决定簇或编码所述寡聚肽或多肽的核酸的寡聚肽或多肽为基础。含有剪接变异体特异性的抗原决定簇或编码所述多肽的核酸的寡聚肽或多肽也可用作主动免疫治疗(疫苗接种和疫苗治疗)中的药物活性物质。

[0022] 本发明还描述了性质和二级修饰的程度在正常和肿瘤组织中不同的蛋白质( 例 如 Durand&Seta，2000；Clin.Chem.46：795-805；Hakomori，1996；Cancer Res.56：5309-18)。

[0023] 蛋白质修饰的分析可在Western印迹中进行。尤其是，通常具有几千道尔顿分子量的糖基化导致更大总质量的靶蛋白质，所述靶蛋白质能在SDS-PAGE中被分离出来。为了检测特异性O-和N-糖苷键，在使用SDS变性之前蛋白质溶解产物与O-和N-糖基化酶孵育(根据各自生产厂商的说明书，例如，PNgase、内切糖苷酶F、内切糖苷酶H，Roche诊断)。之后，进行Western印迹。如果靶蛋白质的分子量变小了，特异性的糖基化在与糖苷酶孵育后可照这样进行检测，并且因而，对修饰的肿瘤特异性也能进行分析。肿瘤细胞和健康细胞中差异糖基化的蛋白质区域尤其引人注意。然而，至今这样的糖基化的差异仅在一些细胞表面蛋白质有描述(例如，Mucl)。

[0024] 根据本发明，有可能检测肿瘤中Claudin-18的差异糖基化。胃肠道癌症、胰腺癌、食道肿瘤、前列腺肿瘤以及肺肿瘤具有较低水平的糖基化的Claudin-18。健康组织中的糖基化掩盖了Claudin-18的蛋白质抗原决定簇，而在肿瘤细胞上因为缺乏糖基化蛋白质，所述抗原决定簇未被掩盖。对应地，有可能根据本发明选择结合于这些结构域的配体和抗体。这样的根据本发明的配体和抗体不与健康细胞上的Claudin-18结合，因为这里的抗原决定簇由于糖基化被掩盖了。

[0025] 按照上面对源自肿瘤相关剪接变异体的蛋白质抗原决定簇的描述，因而有可能出于诊断和治疗的目的，使用差异糖基化来区别正常细胞和肿瘤细胞。

[0026] 一方面，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含识别根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原并且对具有根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原表达或异常表达的细胞有优先选择性的药剂。在特定的实施方案中，所述药剂可造成细胞死亡的诱导、细胞生长的减少、对细胞膜的损害或者细胞因子的分泌并且优选地具有肿瘤抑制活性。在一个实施方案中，所述药剂是与编码肿瘤相关抗原的核酸选择性地杂交的反义核酸。在进一步的实施方案中，所述药剂是选择性结合肿瘤相关抗原的抗体，尤其是选择性结合肿瘤相关抗原的补体激活或毒素偶联抗体。在进一步的实施方案中，所述药剂包括两个或多个药剂，每一个所述药剂选择性识别不同肿瘤相关抗原，其中至少一个是根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原。识别并不需要直接伴有抗原活性和表达的抑制。在本发明的这个方面，选择性地局限于肿瘤的抗原优选地作为标记以招募效应物装置到该特异性位点。在优选的实施方案中，所述药剂是识别HLA分子上的抗原并且溶解这样标记的细胞之细胞毒性T淋巴细胞。在进一步的实施方案中，药剂是选择性结合肿瘤相关抗原并且因而招募天然或人工效应物装置到所述细胞的抗体。在进一步的实施方案中，所述药剂是增强特异性识别所述抗原的其它细胞的效应物功能之T辅助淋巴细胞。

[0027] 一方面，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含抑制根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原的表达或活性的药剂。在优选的实施方案中，所述药剂是与编码肿瘤相关抗原的核酸选择性杂交的反义核酸。在进一步的实施方案中，所述药剂是选择性结合肿瘤相关抗原的抗体。在进一步的实施方案中，所述试剂包含两个或多个药剂，每一个所述药剂选择性抑制不同肿瘤相关抗原的表达或活性，其中至少一个是根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原。

[0028] 本发明此外还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含在给予时可选择性增加HLA分子和根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原的肽表位之间的复合物的量的药剂。在一个实施方案中，所述药剂包含选自如下的一个或多个组分，(1)肿瘤相关抗原或其部分，(2)编码所述肿瘤相关抗原或其部分的核酸，(3)表达所述肿瘤相关抗原或其部分的宿主细胞，以及(4)所述肿瘤相关抗原的肽表位和MHC分子之间的分离的复合物。在一个实施方案中，药剂包含两个或多个药剂，每一个所述药剂选择性增加MHC分子和不同肿瘤相关抗原的肽表位之间的复合物的量，其中至少一个是根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原。

[0029] 本发明还涉及包含一个或多个选自如下组分的药物组合物，(1)根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分，(2)编码根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分的核酸，(3)结合根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分的抗体，(4)与编码根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原的核酸特异性杂交的反义核酸，(5)表达根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分的宿主细胞，以及(6)根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分和HLA分子之间的分离的复合物。

[0030] 编码根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分的核酸可存在于药用组合物中，所述核酸在表达载体中并功能性连接于启动子。

[0031] 存在于本发明的药物组合物中的宿主细胞可以分泌肿瘤相关抗原或其部分，将其表达于表面或额外地表达结合所述肿瘤相关抗原或所述其部分的HLA分子。在一个实施方案中，所述宿主细胞内源性表达HLA分子。在进一步的实施方案中，所述宿主细胞以重组方式表达HLA分子和/或肿瘤相关抗原或其部分。所述宿主细胞优选是非增殖性的。在优选的实施方案中，所述宿主细胞是抗原递呈细胞，尤其是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。

[0032] 存在于本发明的药物组合物中的抗体可以是单克隆抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体是嵌合或人源化抗体，天然抗体或合成抗体的片段，所有的所述抗体可以通过组合技术生产。抗体可以偶联于在治疗或诊断上有用的药剂。

[0033] 存在于本发明的药物组合物中的反义核酸可以包含编码根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原之核酸的6-50个，尤其是10-30个、15-30个和20-30个连续核苷酸的序列。

[0034] 在进一步的实施方案中，由本发明的药物组合物直接或通过核酸表达提供的肿瘤相关抗原或其部分与细胞表面的MHC分子结合，所述的结合优选地造成细胞溶解效应和/或诱导细胞因子释放。

[0035] 本发明的药物组合物可以包含药物相容性载体和/或佐剂。所述佐剂可以选自皂甙、粒细胞巨噬细胞-克隆刺激因子、CpG核苷酸、RNA、细胞因子或化学因子。本发明的药物组合物优选的用于治疗特征在于肿瘤相关抗原选择性表达或异常表达的疾病。在优选的实施方案中，所述疾病是癌症。

[0036] 本发明此外还涉及治疗或诊断特征在于一个或多个肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病的方法。在一个实施方案中，治疗包括给予本发明的药物组合物。

[0037] 一方面，本发明涉及诊断特征在于根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病的方法。方法包括(1)编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸的检测和/或(2)肿瘤相关抗原或其部分的检测，和/或(3)抗肿瘤相关抗原或其部分的抗体的检测和/或(4)特异于分离自患者的生物样品中肿瘤相关抗原或其部分的细胞毒性或T辅助淋巴细胞的检测。在特定的实施方案中，所述检测包括(1)生物样品与试剂接触，所述试剂特异性结合编码肿瘤相关抗原的核酸或其部分、所述肿瘤相关抗原或所述其部分、对肿瘤相关抗原或其部分有特异性的抗体或细胞毒性或T辅助淋巴细胞，以及(2)检测所述试剂和核酸或其部分、和肿瘤相关抗原或其部分、和抗体或细胞毒性或T辅助淋巴细胞之间的复合物的形成。在一个实施方案中，所述疾病以两个或多个不同肿瘤相关抗原的表达或异常表达为特征，并且所述检测包括编码所述两个或多个不同肿瘤相关抗原或其部分的两个或多个核酸的检测，两个或多个不同肿瘤相关抗原或其部分的检测，两个或多个结合所述两个或多个不同肿瘤相关抗原或其部分的抗体的检测，特异于所述两个或多个不同肿瘤相关抗原的两个或多个细胞毒性或T辅助淋巴细胞的检测。在进一步的实施方案中，分离自患者的生物样品与相当的正常生物样品进行比较。

[0038] 在另外一方面，本发明涉及测定特征在于根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病的缓解、进程或开始的方法，所述方法包括监测来自具有所述疾病或怀疑患有所述疾病之患者的样品的参数，一个或多个所述参数选自(1)编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸的量，(2)肿瘤相关抗原或其部分的量，(3)结合肿瘤相关抗原或其部分的抗体的量，以及(4)特异于肿瘤相关抗原或其部分和MHC分子之间的复合物的溶细胞性T细胞或T辅助细胞的量。所述方法优选地包括测定第一个样品在第一个时间点以及另外一个样品在第二个时间点的所述参数，以及通过比较两个样品来测定疾病的进程。在特定的实施方案中，所述疾病以两个或多个不同肿瘤相关抗原的表达或异常表达为特征，并且所述监测包含监测(1)编码所述两个或多个不同肿瘤相关抗原或其部分的核酸的量，和/或(2)所述两个或多个不同肿瘤相关抗原或其部分的量，和/或(3)两个或多个结合所述两个或多个不同肿瘤相关抗原或其部分的抗体的量，和/或(4)两个或多个特异于所述两个或多个不同肿瘤相关抗原或其部分和MHC分子之间的复合物的溶细胞性T细胞或T辅助细胞的量。

[0039] 根据本发明，核酸或其部分的检测或监测核酸或其部分的量可以使用特异性杂交所述核酸或所述其部分的多聚核苷酸探针来进行，或者可以通过所述核酸或所述其部分的选择性扩增来进行。在一个实施方案中，多聚核苷酸探针包含所述核酸的6-50个，尤其是10-30个、15-30个和20-30个连续核苷酸的序列。

[0040] 在特定的实施方案中，待检测的肿瘤相关抗原或其部分存在于细胞内或细胞表面上。根据本发明，肿瘤相关抗原或其部分的检测或监测肿瘤相关抗原或其部分的量可以通过使用特异性结合所述肿瘤相关抗原或其部分的抗体来进行。

[0041] 在进一步的实施方案中，待检测的肿瘤相关抗原或其部分存在于与MHC分子，尤其是HLA分子的复合物中。

[0042] 根据本发明，抗体的检测或监测抗体的量可以通过使用特异性结合所述抗体的蛋白质或肽来进行。

[0043] 根据本发明，溶细胞性T细胞或T辅助细胞的检测或者监测特异于抗原或其部分和MHC分子之间的复合物之溶细胞性T细胞或T辅助细胞可以使用递呈所述抗原或其部分和MHC分子之间的复合物之细胞来进行。

[0044] 用于检测或监测的多聚核苷酸探针、抗体、蛋白质或肽或细胞优选地以可检测的方式被标记。在特定的实施方案中，可检测的标志物是放射活性标记或酶标记。T淋巴细胞可额外地通过检测由MHC和肿瘤相关抗原或其部分之间的复合物的特异性刺激诱发它们的增殖、它们的细胞因子生成和他们的细胞毒活性来进行检测。T淋巴细胞也可通过重组MHC分子或者两个或多个MHC分子的复合物来进行检测，所述MHC分子荷载了一个或多个肿瘤相关抗原的特定的免疫原性片段，并且能通过与特异性T细胞受体接触来鉴别特异性T淋巴细胞。

[0045] 在另外一个方面，本发明涉及治疗、诊断或监测特征在于根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病的方法，所述方法包括给予结合所述肿瘤相关抗原或其部分并且偶联于治疗或诊断药剂的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体是嵌合或人源化抗体或天然抗体的片段。

[0046] 本发明还涉及治疗具有特征在于根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病的患者之方法，所述方法包括(1)取出含有来自所述患者的免疫反应活性细胞的样品，(2)在有利于抗所述肿瘤相关抗原或其部分的溶细胞性T细胞产生的条件下，将所述样品与表达所述肿瘤相关抗原或其部分的宿主细胞接触，以及(3)将溶细胞性T细胞以适合溶解表达肿瘤相关抗原或其部分的细胞的量引入患者。本发明同样地涉及克隆抗肿瘤相关抗原的溶细胞性T细胞之T细胞受体。所述受体可以被转移进其它的T细胞，所述T细胞因而获得期望的特异性，并且按照方法(3)还可以被引入患者。

[0047] 在一个实施方案中，所述宿主细胞内源性表达HLA分子。在另外一个实施方案中，所述宿主细胞重组表达HLA分子和/或肿瘤相关抗原或其部分。所述宿主细胞优选是非增殖性的。在优选的实施方案中，所述宿主细胞是抗原递呈细胞，尤其是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。

[0048] 在另外一个方面，本发明涉及治疗具有特征在于肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病的患者之方法，所述方法包含(1)鉴别编码根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原并由所述疾病相关的细胞表达的核酸，(2)用所述核酸或其部分转染宿主细胞，(3)为所述核酸的表达培养被转染的宿主细胞(当得到高效率的转染时，此方法就不是必须的)，以及(4)将宿主细胞或其提取物以适合增加对患者的疾病相关细胞之免疫反应的量引入患者。方法可还包括用表达鉴别的MHC分子以及递呈所述肿瘤相关抗原或其部分的宿主细胞，鉴别递呈肿瘤相关抗原或其部分的MHC分子。免疫反应可以包含B细胞反应或T细胞反应。此外，T细胞反应可以包含溶细胞性T细胞和/或T辅助细胞的产生，所述溶细胞性T细胞和/或T辅助细胞特异于递呈肿瘤相关抗原或其部分的宿主细胞，或特异于表达所述肿瘤相关抗原或其部分的患者的细胞。

[0049] 本发明也涉及治疗特征在于根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病的方法，所述方法包括(1)鉴别来自表达异常量的肿瘤相关抗原的患者的细胞，(2)分离所述细胞的样品，(3)培养所述细胞，以及(4)将所述细胞以适合诱发对所述细胞的免疫反应的量引入患者。

[0050] 优选地，根据本发明使用的宿主细胞为非增殖性的，或者使其为非增殖性的。特征在于肿瘤相关抗原表达或异常表达的疾病尤其是癌症。

[0051] 本发明还涉及选自如下的核酸：(a)包含选自SEQ ID NO：3-5核酸序列的核酸，其部分或其衍生物，(b)与(a)的核酸在严格条件下杂交的核酸，(c)与(a)或(b)的核酸简并的核酸，以及(d)与(a)、(b)或(c)互补的核酸。本发明此外还涉及编码包含选自SEQ ID NO：10和12-14的氨基酸序列的蛋白质或多肽之核酸，其部分或其衍生物。

[0052] 在另外一个方面，本发明涉及本发明的核酸的启动子序列。这些序列可以功能性地与另一个基因相连接，优选地在表达载体中，并且因而保证所述基因在合适细胞中的选择性表达。

[0053] 在另外一个方面，本发明涉及重组核酸分子，尤其是DNA或RNA分子，其包含本发明的核酸。

[0054] 本发明还涉及含有本发明的核酸或包含本发明的核酸的重组核酸分子之宿主细胞。

[0055] 所述宿主细胞还可以包含编码HLA分子的核酸。在一个实施方案中，所述宿主细胞内源性地表达HLA分子。在进一步的实施方案中，所述宿主细胞重组表达HLA分子和/或本发明的核酸或其部分。优选地，所述宿主细胞是非增殖性的。在优选的实施方案中，所述宿主细胞是抗原递呈细胞，尤其是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。

[0056] 在进一步的实施方案中，本发明涉及与根据本发明鉴别的核酸杂交并可以用作基因探针或“反义”分子的寡聚核苷酸。与根据本发明鉴别的核酸或其部分杂交并呈寡聚核苷酸引物或有效的样品(competentsamples)形式的核酸分子，可以用于寻找与根据本发明鉴别的所述核酸同源的核酸。PCR扩增、Southern和Northern杂交可以被用来寻找同源核酸。杂交可以在低严格条件下进行，更加优选地在中等严格以及最优选地在高度严格条件下进行。术语“严格条件”根据本发明指的是允许多聚核苷酸之间特异性杂交的条件。

[0057] 在另外一个方面，本发明涉及由选自如下的核酸编码的蛋白质、多肽或肽：(a)包含选自SEQ ID NO：3-5的核酸序列之核酸，其部分或其衍生物，(b)与(a)的核酸在严格条件下杂交的核酸，(c)与(a)或(b)的核酸简并的核酸，以及(d)与(a)、(b)或(c)互补的核酸。在优选的实施方案中，本发明涉及包含选自SEQ ID NO：10和12-14的氨基酸序列的蛋白质或多肽或肽，或其部分或其衍生物。

[0058] 在另外一个方面，本发明涉及根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原的免疫原性片段。所述的片段优选地与人类HLA受体或人类抗体结合。本发明的片段优选地包含至少6个，尤其是至少8个，至少10个，至少12个，至少15个，至少20个，至少30个或至少50个氨基酸的序列。

[0059] 在这方面，本发明尤其是涉及具有或包含选自SEQ ID NO：17-19、90-97、100-102、105、106、111-116、120、123、124和135-137的肽，其部分或其衍生物。

[0060] 在另外一个方面，本发明涉及结合根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分的试剂。在优选的实施方案中，所述试剂是抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体是嵌合或人源化抗体或重组技术生产的抗体或是抗体的片段。此外，本发明涉及一种抗体，所述抗体选择性结合(1)根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分与(2)根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或所述其部分结合的MHC分子之间的复合物，所述抗体不单独与(1)或(2)结合。本发明的抗体可以是单克隆抗体。在进一步的实施例中，所述抗体是嵌合或人源化的抗体或者天然抗体的片段。

[0061] 尤其是，本发明涉及尤其是抗体这样的试剂，其特异性结合具有或包含选自SEQ ID NO：17-19、90-97、100-102、105、106、111-116、120、123、124和135-137的序列的肽，其部分或其衍生物。

[0062] 本发明此外还涉及结合根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原或其部分的本发明的试剂或本发明的抗体与治疗或诊断试剂之间形成的结合物(conjugate)。在一个实施方案中，所述治疗或诊断试剂是毒素。

[0063] 在另外一个方面，本发明涉及用于检测根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原的表达或异常表达的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测(1)编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸，(2)肿瘤相关抗原或其部分，(3)结合肿瘤相关抗原或其部分的抗体，和/或(4)特异于肿瘤相关抗原或其部分和MHC分子之间的复合物的T细胞之试剂。在一个实施方案中，用于检测核酸或其部分的试剂是用于选择性扩增所述核酸的核酸分子，其包含尤其是所述核酸的10-30个，15-30个和20-30个连续核苷酸的序列。

[0064] 发明详述

[0065] 根据本发明，基因被描述为在肿瘤细胞中选择性表达或异常表达的并且是肿瘤相关的抗原。

[0066] 根据本发明，这些基因和/或它们的基因产物和/或它们的衍生物和/或部分是优选的治疗手段的靶结构。从概念上说，所述治疗手段旨在抑制选择性表达的肿瘤相关基因产物的活性。如果所述异常的各自选择性的表达对于肿瘤的致病性有功能上的重要性，并且如果其连接同时伴有相应细胞的选择性损伤，这种治疗手段就很有用。其它的治疗概念企图将肿瘤相关抗原作为标记，以招募具有选择性损伤肿瘤细胞的潜能的效应物装置。这里，靶分子自己的功能及其在肿瘤发展中的作用完全无关。

[0067] 核酸的“衍生物”根据本发明意思是存在于所述核酸中的一个或多个核苷酸的替代、缺失和/或增加。此外，术语“衍生物”也包含在核苷酸碱基上、在糖基上或在磷酸基上核酸的化学衍生化反应。术语“衍生物”也包含含有核苷酸和天然并不存在的核苷酸类似物的核酸。

[0068] 根据本发明，核酸优选地是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。所述核酸根据本发明包含基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。根据本发明，所述核酸可以作为单链或双链以及线性或共价环形封闭分子而存在。

[0069] 根据本发明描述的核酸优选地已经被分离。术语“分离的核酸”根据本发明意思是指核酸是(1)例如通过多聚酶链式反应(PCR)而体外扩增，(2)通过克隆而重组产生，(3)例如通过切割和凝胶电泳而分离纯化，或(4)例如通过化学合成法而合成。分离的核酸是可通过重组DNA技术进行操作的核酸。

[0070] 如果两个核酸序列能够杂交并且互相形成稳定的双链体，那么一个核酸互补于另一个核酸，所述杂交优选地在允许多聚核苷酸之间特异性杂交的条件下(严格条件)进行。严格条件在例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等人，编，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人，编，John Wiley&Sons，Inc.，New York中有描述，并且指的是，例如，在65℃杂交缓冲液(3.5x SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中的杂交。
SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH7。杂交后，已转入DNA的膜，例如在室温用2×SSC然后在高达68℃的温度下用0.1-0.5×SSC/0.1×SDS进行清洗。

[0071] 根据本发明，互补的核酸具有至少40％，尤其是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％以及优选地至少95％、至少98％或至少99％相同的核苷酸。

[0072] 编码肿瘤相关抗原的核酸根据本发明可以单独存在或与其它核酸，尤其是异源性核酸联合存在。在优选的实施方案中，所述核酸功能性地连接于与所述核酸同源或异源的表达控制序列或调节序列。如果编码序列和调节序列以所述编码序列的表达或转录在所述调节序列的控制之下或影响之下的方式互相共价连接，那么它们就“功能性”地互相连接。如果编码序列被翻译成功能蛋白质，那么由于功能性连接于所述编码序列的调节序列，所述调节序列的诱导导致所述编码序列的转录，而不会造成编码序列的移码或者所述编码序列不能被翻译成期望的蛋白质或肽。

[0073] 术语“表达控制序列”或者“调节序列”根据本发明包含启动子、增强子和其他调节基因表达的控制元素。在本发明特定的实施方案中，表达控制序列能被调节。调节序列的精确结构因物种或细胞类型可不同，但一般地包含分别参与转录和翻译的起始的5’端非转录和5’端非翻译序列，例如TATA盒、帽序列、CAAT序列等等。更加特异性地，5’端非转录调节序列包含启动子区域，所述启动子区域包括为了控制功能性连接的基因转录之启动子序列。

[0074] 因而，一方面，此处阐述的肿瘤相关抗原可以与任何表达控制序列和启动子相组合。另一方面，然而，此处阐述的肿瘤相关基因产物的启动子，根据本发明，可以与任何其它的基因相组合。这允许这些启动子的选择性活性被利用。

[0075] 根据本发明，核酸此外还可以与编码多肽的另一个核酸联合存在，所述多肽控制蛋白质或来自宿主细胞的所述核酸编码多肽的分泌。根据本发明，核酸也可与编码多肽的另一个核酸联合存在，所述多肽造成编码的蛋白质或多肽被锚定在宿主细胞膜上或被分隔在所述细胞特定的细胞器内。相似地，与如下核酸联合是可能的，其代表了报告基因或任何“标签”。

[0076] 在优选的实施方案中，重组DNA分子根据本发明是载体，在合适的情况下有启动子，所述载体控制核酸的表达，例如编码本发明的肿瘤相关抗原的核酸。这里使用的术语“载体”是指最一般意义的载体，并且包含任何的核酸的中间媒介物，使得所述核酸，例如可被引入原核和/或真核细胞，并且在合适的情况下被整合进基因组中。此类载体优选地可被复制和/或表达在细胞内。中间媒介物适合，例如用于电传孔，用于微粒轰击，用于脂质体给予，用于借助于农杆菌的转移或用于通过DNA或RNA病毒的插入。载体包含质粒、噬菌粒或病毒基因组。

[0077] 编码根据本发明鉴别的肿瘤相关抗原的核酸可以用于宿主细胞的转染。核酸这里意思是重组DNA和RNA。重组RNA可以通过DNA模板的体外转录进行制备。此外，它在应用前可以通过稳定化序列、加帽和多乙酰化进行修饰。

[0078] 根据本发明，术语“宿主细胞”涉及任何能被外源性核酸转化或转染的细胞。术语“宿主细胞”根据本发明包含原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人类、小鼠、仓鼠、猪、山羊、猿类的细胞。细胞可以来源于多种多样的组织细胞，并且包含原代细胞和细胞系。特异性样品包含角质细胞、外周血白细胞、骨髓的干细胞和胚胎干细胞。在进一步的实施方案中，宿主细胞是抗原递呈细胞，尤其是树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。核酸可以以单拷贝或两个或两个以上拷贝的形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，所述核酸表达在宿主细胞中。

[0079] 根据本发明，术语“表达”是指最一般意义的表达，并且包含RNA或者RNA和蛋白质的生产。它还包含核酸的部分表达。此外，可以进行瞬间或稳定表达。哺乳动物细胞中优选的表达系统包含pcDNA3.1和pRc/CMV(Invitrogen，Carlsbad，CA)，所述表达系统含有选择性标志物例如授予G418抗性的基因(并且因而使得稳定转染的细胞系被选择)和巨细胞病毒(CMV)的增强子-启动子序列。

[0080] 在本发明的HLA分子递呈肿瘤相关抗原或其部分的那些情况下，表达载体还可以包含编码所述HLA分子的核酸序列。编码HLA分子的核酸序列和编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸可以存在于同一个表达载体上，或两个核酸可以存在于不同的表达载体上。在后一种情况下，这两个表达载体可以被共转染进细胞内。如果宿主细胞既不表达肿瘤相关抗原或其部分也不表达HLA分子，编码它们的两个核酸或者在同一个表达载体或者在不同的表达载体上而被转染入细胞。如果细胞已经表达HLA分子，那么只有编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸序列被转染进细胞。

[0081] 本发明还包含用于扩增编码肿瘤相关抗原的核酸之试剂盒。这样的试剂盒包含，例如杂交编码肿瘤相关抗原的核酸的一对扩增引物。为了避免引物二聚体的形成，引物优选地包含核酸的6-50个，尤其是10-30个，15-30个以及20-30个连续核苷酸之序列，并且是不相互重叠的。一个引物将与编码肿瘤相关抗原的核酸中的一条链杂交，另一个引物则与互补链杂交，这样的设计允许编码肿瘤相关抗原的核酸的扩增。

[0082] “反义”分子或“反义”核酸可以用于调节，尤其是降低，核酸的表达。术语“反义分子”或“反义核酸”根据本发明指的是寡聚核苷酸，所述寡聚核苷酸是寡聚核糖核苷酸、寡聚脱氧核糖核苷酸、被修饰的寡聚核糖核苷酸或被修饰的寡聚脱氧核糖核苷酸，并且所述寡聚核苷酸在生理条件下杂交于包含特定基因的DNA或者杂交于所述基因的mRNA，因此抑制所述基因的转录和/或所述mRNA的翻译。根据本发明，“反义分子”还包含构建体，所述构建体含有与其天然启动子方向相反的核酸或其部分。核酸或其部分的反义转录产物可以和天然发生的指定酶的mRNA形成二联体，并且因而阻止mRNA的蓄积或mRNA翻译成活性酶。另一个可能性是核酶用于失活核酸。根据本发明优选的反义寡聚核苷酸具有靶核酸的6-50个，尤其是10-30个，15-30个以及20-30个连续的核苷酸之序列，并且优选地是与靶核酸或其部分完全互补的。

[0083] 在优选的实施方案中，反义寡聚核苷酸杂交于氨基端位点或5’端上游位点例如翻译起始位点、转录起始位点或启动子位点。在进一步的实施方案中，反义寡聚核苷酸杂交于3’端非翻译区域或mRNA剪接位点。

[0084] 在一个实施方案中，本发明的寡聚核苷酸由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或它们的组合组成，一个核苷酸的5’末端与另一个核苷酸的3’末端通过磷酸二酯键互相连接。这些寡聚核苷酸可以用传统方法进行合成或重组生产。

[0085] 在优选的实施方案中，本发明的寡聚核苷酸是“被修饰的”寡聚核苷酸。这里，为了增加寡聚核苷酸的例如稳定性或治疗效果，寡聚核苷酸可以用非常不同的方法来修饰，而并不削弱结合于其靶点的能力。根据本发明，术语“被修饰的寡聚核苷酸”意思是一种寡聚核苷酸，所述寡聚核苷酸中(1)至少它的两个核苷酸通过合成的核苷酸之间的键互相连接(例如不是磷酸二酯键的核苷酸之间的键)和/或(2)通常在核酸中找不到的化学基团共价连接于寡聚核苷酸。优选的合成的核苷酸之间的键是硫代磷酸酯、烷基磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸酯基、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯和肽。

[0086] 术语“被修饰的寡聚核苷酸”还包含具有共价修饰的碱基和/或糖的寡聚核苷酸。“被修饰的寡聚核苷酸”包含，例如带有共价结合于3’位置低分子量的有机基团(不是羟基)和5’位置磷酸酯基团的糖残基的寡聚核苷酸。被修饰的寡聚核苷酸可以包含，例如
2’-氧-烷基化核糖残基，或非核糖的另一种糖，例如阿拉伯糖。

[0087] 优选地，根据本发明描述的蛋白质和多肽已被分离。术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”意思是蛋白质或多肽已经从其天然环境中分离。已被分离的蛋白质或多肽可以是基本上已经纯化的状态。术语“基本上已经纯化”意思是蛋白质或多肽基本上没有与之在自然界或体内相关的其它物质。

[0088] 这样的蛋白质和多肽可以，例如，用于生产抗体和用于免疫学或诊断学试验或用作治疗剂。根据本发明描述的蛋白质和多肽可以从生物样品中分离出来，例如组织或细胞匀浆，并且也可以重组表达于多种多样的原核或真核表达系统。

[0089] 为了本发明的目的，蛋白质或多肽的衍生物或者氨基酸序列的衍生

[0090] 为了本发明的目的，蛋白质或多肽的衍生物或者氨基酸序列的衍生物包含氨基酸插入变异体，氨基酸缺失变异体和/或氨基酸替代变异体。

[0091] 氨基酸插入变异体包含氨基端和/或羧基端融合以及特定的氨基酸序列中单个或两个或两个以上氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸变异体的情况下，一个或多个氨基酸残基被插入氨基酸序列中特定的位点，尽管随机的插入和合适筛选得到的产物也是可能的。氨基酸缺失变异体特征在于一个或多个氨基酸从序列中的去除。氨基酸取代变异体特征在于序列中至少一个残基被去除并且在它的位置上插入另外一个残基。优先选择修饰在同源蛋白质或多肽之间非保守的氨基酸序列的位置。优选选择用其它具有相同特性例如疏水性、亲水性、电负性、侧链的体积等等的氨基酸去取代(保守替代)的氨基酸。保守替代，例如，涉及一个氨基酸与另一个如下列出的与被替代的氨基酸一组的氨基酸进行交换：

[0092] 1.小脂肪族、非极性或者有点极性的残基：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸(脯氨酸、甘氨酸)

[0093] 2.带负电的残基和它们的酰胺：天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺[0094] 3.带正电的残基：组氨酸、精氨酸、赖氨酸

[0095] 4.大脂肪族、非极性残基：甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸(半胱氨酸)[0096] 5.大芳香族残基：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。

[0097] 由于它们在蛋白质体系结构中的特定角色，三个残基显示在括号内。甘氨酸是唯一没有侧链的残基并且因而授予碳链柔性。脯氨酸具有与众不同的大大限制碳链的几何结构。半胱氨酸能形成二硫键桥。

[0098] 上述氨基酸变异体借助于已知肽合成技术可以很容易地进行制备，例如通过固相合成(Merrifield，1964)以及相似的方法或者通过重组DNA操作。用于将预先确定位点的替代突变引入具有已知或部分已知序列的DNA是众所周知的，并且包含例如M13突变形成。用于制备具有替代、插入或缺失突变的蛋白质之DNA序列的操作在例如Sambrook等人，(1989)中有详细描述。

[0099] 根据本发明，蛋白质、多肽或肽的“衍生物”也包含与酶相关的任何分子的单个或多个替代、缺失和/或添加，例如碳水化合物、脂肪和/或蛋白质、多肽或肽。术语“衍生物”也延伸到所述蛋白质、多肽或肽的所有功能性化学等同物。

[0100] 根据本发明，肿瘤相关抗原的一部分或片段从多肽衍生而来，具有多肽的功能特性。这样的功能特性包含与抗体的相互作用，与其它多肽或蛋白质的相互作用，与核酸的选择性结合以及酶活性。一个特定的特性是与HLA形成复合物的能力，并且在合适的情况下产生免疫反应。此免疫反应以刺激细胞毒性或T辅助细胞为基础。本发明的肿瘤相关抗原的一部分或片段优选地包含肿瘤相关抗原的至少6个，尤其是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸。

[0101] 编码肿瘤相关抗原的核酸的一部分或片段根据本发明涉及核酸的一部分，所述核酸的一部分如上定义地，编码至少肿瘤相关抗原和/或肿瘤相关抗原的一部分或片段。

[0102] 编码肿瘤相关抗原的基因的分离和鉴别也使特征在于一个或多个肿瘤相关抗原的表达之疾病的诊断成为可能。这些方法包含测定编码肿瘤相关抗原的一个或多个核酸和/或测定编码的肿瘤相关抗原和/或从它们那里衍生的肽。核酸还可以以传统的方法进行测定，包括通过多聚酶链式反应或用标记探针的杂交。肿瘤相关抗原或从它们那里衍生来的肽也可以通过筛选识别抗原和/或肽的患者抗血清进行测定。它们也可以通过筛选患者的T细胞对相应的肿瘤相关抗原的特异性进行测定。

[0103] 本发明还使得可结合此处描述的肿瘤相关抗原的蛋白质被分离，包括抗体和所述肿瘤相关抗原的细胞内结合伴侣。

[0104] 根据本发明，特定的实施方案应该涉及提供源自肿瘤相关抗原的“显性失活”多肽。显性失活多肽是非活性的蛋白质变异体，所述显性失活多肽经由与细胞内机器相互作用，将活性蛋白质从其与细胞内机器(cellular machinery)的相互作用取代，或者所述显性失活多肽与活性蛋白质竞争，因此减少所述活性蛋白质的作用。例如，结合于配体但对结合于配体不产生任何信号作为应答的显性失活受体能够减少所述配体的生物学作用。相似地，通常与靶蛋白质相互作用但不磷酸化所述靶蛋白质的显性失活催化的非活性激酶减少所述靶蛋白质的磷酸化，作为对细胞信号的反应。相似地，结合于基因控制区域中的启动子位点但不增加所述基因的转录的显性失活转录因子可通过占据启动子位点但不增加转录来减少正常转录因子的作用。

[0105] 细胞中显性失活多肽表达的结果是活性蛋白质功能的降低。技术工人可制备蛋白质的显性失活变异体，例如通过传统的突变方法以及通过评价变异体多肽的显性失活作用。

[0106] 本发明还包含如下物质：例如结合肿瘤相关抗原的多肽。这样的结合物质可用于，例如，为了检测肿瘤相关抗原以及肿瘤相关抗原和其结合伴侣的复合物的筛选试验，以及用于肿瘤相关抗原的纯化和其与结合伴侣的复合物的纯化。这样的物质还用于抑制肿瘤相关抗原的活性，例如通过与这样的抗原结合。

[0107] 所以本发明包含结合的物质，例如，抗体或抗体片段，所述的结合物质能选择性地结合于肿瘤相关抗原。抗体包含用传统方式生产的多克隆和单克隆抗体。

[0108] 这样的抗体能够识别天然和/或变性状态的蛋白质(Anderson等人，J.Immunol.143：1899-1904，1989；Gardsvoll，J.Immunol.Methods 234：107-116，2000；
Kayyem等 人，Eur.J.Biochem.208：1-8，1992；Spiller等 人，J.Immunol.Methods 224：
51-60，1999)。

[0109] 含有特异性结合于靶蛋白质的特异性抗体之抗血清能够通过不同的标准方法进行制备；见，例如“Monoclonal Antibodies：A PracticalApproach”Philip Shepherd，Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9；“Antibodies：A Laboratory Manual”Harlow，David Lane 编，ISBN：0879693142 以 及“Using Antibodies：A Laboratory Manual：PortableProtocol NO”Edward Harlow，David Lane，编Harlow ISBN0879695447。因此也可能产生识别天然形式的复合物膜蛋白质的姻亲(affine)和特异性抗体(Azorsa等人，J.Immunol.Methods 229：35-48，1999；Anderson等人，J.Immunol.143：1899-1904，1989；
Gardsvoll，J.Immunol.Methods 234：107-116，2000)。这尤其与用于治疗的抗体的制备相关，也与许多诊断应用相关。在这个方面，用全蛋白质，用细胞外部分序列以及用表达生理折叠形式的靶分子的细胞进行免疫是可能的。

[0110] 单克隆抗体传统上用杂交瘤技术进行制备。(技术细节见：“Monoclonal Antibodies：A Practical Approach”Philip Shepherd，Christopher Dean ISBN0-19-963722-9；“Antibodies：A LaboratoryManual”Harlow，David Lane 编 ISBN：
0879693142；“UsingAntibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol
NO”EdwardHarlow，David Lane，编Harlow ISBN：0879695447)

[0111] 已知只有抗体分子的小部分，抗体决定簇，参与抗体与其抗原决定簇的结合( 参 看 Clark，W.R.(1986)，The Experimental Foundationsof Modern Immunology，Wiley&Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)，Essential Immunology，第7版，Blackwell ScientificPublications，Oxford)。pFc’和Fc区域是，例如，补体级联的效应物，但不参与抗原结合。其pFc’区域已经用酶去除或者生产的抗体没有pFc’区域的抗体，被提及为F(ab’)片段，携带一个完全抗体的两个抗原结合位点。相似地，其Fc区域已经被酶去除或生产的抗体没有所述的Fc区域的抗体，被提及为Fab片段，携带一个完整抗体分子的一个抗原结合位点。此外，Fab片段由抗体的共价结合轻链和所述抗体的部分重链组成，被提及为Fd。Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(单个Fd片段能够与高达10个不同的轻链相联，不改变抗体的特异性)并且Fd片段当被分离时保留结合于抗原决定簇的能力。

[0112] 位于抗体的抗原结合部分内的是互补决定区域(CDR)，所述互补决定区域与抗原的抗原决定簇和维持抗体决定簇三级结构的框架区域(FRs)直接相互作用。重链的Fd片段和I gG免疫球蛋白的轻链都含有四个框架区域(FR1至FR4)，所述框架区域在每种情况下被三个补体决定区域(CDR1至CDR3)分开。CDR并且尤其是CDR3区域，并且更加尤其是重链的CDR3区域很大程度上负责抗体的特异性。

[0113] 已知哺乳动物抗体的非CDR区域能够被有相同或不同特异性的抗体的相似区域替代，保留原先抗体对抗原的特异性。这就有可能开发“人源化”抗体，在所述抗体内，非人类CDR与人类FR和/或Fc/pFc’区域共价连接而产生功能性抗体。

[0114] 这被用在所谓的“SLAM”技术之中，其中来自全血的B细胞被分离并且细胞被单克隆。然后，对单个B细胞的上清液的抗体特异性进行分析。与杂交瘤技术相比，抗体基因的可变区域使用单细胞PCR进行扩增，并将其克隆进合适的载体中。这样，单克隆抗体的供应被加快了(deWildt等人，J.Immunol.Methods 207：61-67，1997)。

[0115] 与另一个实施例一样，WO 92/04381描述了人源化的鼠RSV抗体的生产和使用，所述抗体中至少鼠FR区域的部分被人源FR区域取代。此类抗体，包括有抗原结合能力的完整抗体的片段，被经常提及为“嵌合”抗体。

[0116] 本发明还提供抗体的F(ab’)2、Fab、Fv和Fd片段，Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链-CDR3区域被同源的人类或非人类序列取代的嵌合抗体，FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链-CDR3区域被同源的人类或非人类序列取代的嵌合F(ab’)2-片段抗体，FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链-CDR3区域被同源的人类或非人类序列取代的嵌合Fab片段抗体，以及FR和/或CDR1和/或CDR2区域被同源的人类或非人类序列取代的嵌合Fd片段抗体。本发明也包含“单链”抗体。

[0117] 本发明还包括特异性结合肿瘤相关抗原的多肽。此类多肽结合物质，例如，可由简并性肽库(degenerate peptide libraries)来提供，所述简并性肽库简单地在溶液中被制备为固定的形态或被制备为噬菌体展示库(phage-display libraries)。也可能制备有一个或多个氨基酸的肽之组合库。类肽(Peptoid)和非肽的合成残基的库也可被制备。

[0118] 噬菌体展示在鉴别本发明的结合肽尤其有效。就此而论，例如，呈现长度从4到大约80个氨基酸残基的插入物的噬菌体库被制备(使用，例如，M13、fd或lamda噬菌体)。然后携带结合于肿瘤相关抗原的插入体的噬菌体被挑选。这个方法可通过两个或两个以上循环的结合于肿瘤相关抗原的噬菌体的再挑选而被重复。重复的回合导致携带指定序列的噬菌体的集中。为了鉴别表达多肽的序列可进行DNA序列的分析。结合于肿瘤相关抗原的序列的最小线性部分可被确定。酵母“双杂交系统”也用于鉴别结合于肿瘤相关抗原的多肽。为了鉴别和选择肿瘤相关抗原的肽结合伴侣，根据本发明描述的肿瘤相关抗原或其片段可用于筛选肽库，包括噬菌体陈列库。这样的分子，例如，可以用于筛选试验、纯化试验方案，用于肿瘤相关抗原功能的干扰以及用于其他技术工人已知的用途。

[0119] 上述抗体和其它结合分子可以用于，例如，鉴别表达肿瘤相关抗原的组织。为了陈列表达肿瘤相关抗原细胞和组织，抗体也可以偶联于特异性的诊断物质。它们也可以偶联于在治疗上有用的物质。诊断物质以非限制性的方式包含硫酸钡、碘西他酸、碘番酸、碘泊酸钙、泛影酸钠、泛影葡胺、甲泛影酰胺、酪泮酸钠以及放射性诊断试剂，包括正电子放射18 11 123 99 131 111
物质例如氟 、碳 ，γ-放射物质例如碘 、锝 m、碘 和铟 ，用于核磁共振的核素，例如氟和钆。根据本发明，术语“治疗上有用的物质”意思是任何治疗分子，如期望地，选择地被指引到表达一个或多个肿瘤相关抗原的细胞，包括抗癌剂、放射活性碘标记的化合物、毒素、细胞抑制或细胞溶解剂等等。所述抗癌剂包括，例如，氨鲁米特、硫唑嘌呤、博来霉素硫酸盐、白消安、卡氮芥、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环孢霉素、cytarabidine、达卡巴嗪、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、紫杉醇、依托泊甙、氟尿嘧啶、干扰素-α、洛莫司汀、巯嘌呤、氨甲蝶呤、米托坦、甲苄肼盐酸盐、硫鸟嘌呤、长春碱硫酸盐和长春新碱硫酸盐。其它的抗癌剂在例如Goodman和Gilman，“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，第8版，1990，McGraw-Hill，Inc.，尤其是第52章(Antineoplastic Agents(Paul Calabresi和BruceA.Chabner)，有描述。所述毒素可以是蛋白质，例如美洲商陆抗病毒蛋白质、霍乱毒素、百日咳毒素、蓖麻毒素、gelonin、相思豆毒素、白喉外毒素或假单胞菌外毒素。毒素残基也可以是
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高能量放射的放射性核素，例如钴 。

[0120] 术语“患者”根据本发明意思是人类、非人灵长类或者其它的动物，尤其是哺乳动物例如母牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物例如小鼠和大鼠。在特别优选的实施方案中，患者是人类。

[0121] 根据本发明，术语“疾病”指的是表达或异常表达肿瘤相关抗原的任何病理状态。“异常表达”根据本发明意思是表达发生改变，优选地和健康个体的状态相比表达增加。表达增加指的是增加至少10％，尤其是至少20％、至少50％或至少100％。在一个实施方案中，肿瘤相关抗原仅表达在患病个体的组织中，然而在健康个体其表达被抑制。这样的疾病的一个实施例是癌症，其中术语“癌症”根据本发明包含白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、神经胶质瘤、肾脏癌症、肾上腺癌症、甲状腺癌症、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、胃肠道癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳、鼻和喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫的癌症、卵巢癌和肺癌以及它们的转移灶。

[0122] 根据本发明，生物样品可以是组织样品和/或细胞样品，并且可用传统方式获得，例如通过组织活检，包括打孔组织活检，以及通过采集血样、支气管吸出物、唾液、尿液、粪便或其它体液，以用于此处所述的各种方法。

[0123] 根据本发明，术语“免疫活性细胞”意思是在合适的刺激下能成熟分化成免疫细胞+(例如B细胞、T辅助细胞或溶细胞性T细胞)。免疫活性细胞包括CD34 造血干细胞、不成熟和成熟T细胞以及不成熟和成熟B细胞。如果识别肿瘤相关抗原的溶细胞性T细胞或T辅助细胞的生产是期望的，那么在支持溶细胞性T细胞和T辅助细胞的生产、分化和/或选择的条件下将免疫活性细胞与表达肿瘤相关抗原的细胞接触。当暴露于抗原时，T细胞的前体分化成溶细胞性T细胞与免疫系统的克隆选择相似。

[0124] 一些治疗方法以患者免疫系统的反应为基础，导致抗原递呈细胞例如递呈一个或多个肿瘤相关抗原的癌细胞的溶解。就此而论，例如特异于肿瘤相关抗原和MHC分子的复合物之自体同源的细胞毒性T淋巴细胞被给予具有细胞异常的患者。这样的细胞毒性T淋巴细胞体外的生产是已知的。使T细胞分化的方法的实施例能在WO-A-9633265中找到。一般地，含有细胞例如血细胞的样品从患者采集，并且将细胞与递呈复合物并导致细胞毒性T淋巴细胞(例如树突细胞)增殖(propagation)的细胞接触。靶细胞可以是被转染的细胞例如COS细胞。这些被转染的细胞在它们表面上递呈期望的复合物，并且当与细胞毒性T淋巴细胞接触时，可刺激淋巴细胞的增殖。然后克隆扩增的自体同源细胞毒性T淋巴细胞被给予患者。

[0125] 在另一个选择抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的方法中，MHC I型分子/肽复合物的荧光四聚体被用于检测细胞毒性T淋巴细胞的特异性克隆(Altman等人，Science274：94-96，1996；Dunbar等人，Curr.Biol.8：413-416，1998)。可溶性MHC I型分子体外在β2微球蛋白和结合于所述I型分子的肽抗原存在下是折叠的。MHC/肽的复合物被纯化并且用生物素对其进行标记。四聚体通过4∶1的分子比例混合生物素化肽-MHC的复合物和标记的抗生物素蛋白(例如，藻红蛋白)而形成。然后四聚体与细胞毒性T淋巴细胞例如外周血或淋巴结接触。所述四聚体结合于识别肽抗原/MHC I型复合物的细胞毒性T淋巴细胞。结合于所述四聚体的细胞可以通过荧光控制的细胞分拣器进行分拣以分离反应的细胞毒性T淋巴细胞。被分离的细胞毒性T淋巴细胞然后可体外增殖。

[0126] 在被提及为过继性转移的治疗方法中(Greenberg，J.Immunol.136(5)：1917，1986；Riddel等人，Science 257：238，1992；Lynch等人，Eur.J.Immunol.21：1403-1410，
1991；Kast等人，Cell59：603-614，1989)，递呈期望的复合物的细胞(例如树突细胞)联合于要接受治疗的患者的细胞毒性T淋巴细胞，导致特异性细胞毒性T淋巴细胞的增殖。增殖的细胞毒性T淋巴细胞然后被给予具有特征在于递呈特异性复合物的指定异常细胞的细胞异常之患者。然后细胞毒性T淋巴细胞溶解异常细胞，因此达到期望的治疗作用。

[0127] 经常，在患者的T细胞库中，只有对此类特异性复合物有低亲和力的T细胞能被增殖，因为那些有高亲和力的细胞由于耐受性的发展已经被消灭了。这里可选的是T细胞受体自身的转移。也为了这个，递呈期望复合物的细胞(例如树突细胞)联合于健康的人或另一个物种(例如鼠)的细胞毒性T淋巴细胞。如果T淋巴细胞源自以前未接触过特异性复合物的供体生物体，这就会导致有高亲和力的特异性细胞毒性T淋巴细胞的增殖。这些增殖的特异性T淋巴细胞的高亲和力T细胞受体被克隆。如果高亲和力T细胞受体从另一个物种克隆而来，它们能被不同程度的人源化。这样的T细胞受体然后通过基因转移，例如使用逆转录载体如期望地被转入患者的T细胞。然后过继性转移用这些基因改变的T淋巴细胞进行(Stanislawski等人，Nat Immunol.2：962-70，2001；Kessels等人，Nat Immunol.2：957-61，2001)。

[0128] 上面的治疗方面从至少患者一些异常细胞递呈肿瘤相关抗原和HLA分子的复合物的事实出发。这样的细胞可用本身已知的方式进行鉴别。一旦递呈复合物的细胞被鉴别，它们就可以联合来自患者的样品。如果细胞毒性T淋巴细胞溶解递呈复合物的细胞，就能假设肿瘤相关抗原被递呈。

[0129] 过继性转移不是根据本发明能够应用的唯一的治疗形式。细胞毒性T淋巴细胞也可用本身已知的方式产生。一种方法使用表达复合物的非增殖细胞。这里使用的细胞将使那些通常表达复合物的细胞，例如经照射的肿瘤细胞或被转染了一个或两个递呈复合物(即抗原性肽和递呈HLA分子的复合物)必须的基因的细胞。各种的细胞类型可被使用。此外，可能使用携带一个或两个目的基因的载体。特别优选病毒或细菌载体。例如，编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸功能性地连接于控制所述肿瘤相关抗原或其片段在指定的组织或细胞类型中表达的启动子和增强子序列。核酸可被整合进表达载体。表达载体可以是外源核酸可被插入其中的非修饰的染色体外核酸、质粒或病毒基因组。编码肿瘤相关抗原的核酸也可被插入逆转录病毒基因组，因此使得核酸能被整合进靶组织或靶细胞的基因组内。在这些系统中，微生物例如疫苗病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒或腺病毒携带目的基因并且实际地“感染”宿主细胞。另一个优选的形式是重组RNA形式的肿瘤相关抗原的引入，所述重组RNA可例如通过脂质体转移或通过电传孔被引入细胞。得到的细胞递呈目的复合物并且被后来增殖的自体同源细胞毒性T淋巴细胞识别。

[0130] 为了使体内整合进抗原递呈细胞成为可能，相似的作用可通过将肿瘤相关抗原或其片段联合佐剂而获得。肿瘤相关抗原或其片段可被递呈为蛋白质、DNA(例如在载体内)或RNA。为了产生HLA分子的肽伴侣，肿瘤相关抗原被加工，但是其片段不需要进一步加工就可递呈。后者如果能结合于HLA分子尤其可行。优先选择完整抗原被树突细胞体内加工的给予形式，因为这也可生产有效的免疫反应必需的T辅助细胞反应(Ossendorp等人，Immunol Lett.74：75-9，2000；Ossendorp等人，J.Exp.Med.187：693-702，1998)。一般而言，可能例如通过皮内注射将有效量的肿瘤相关抗原给予患者。然而，也可进行淋巴内注射(Maloy等人，Proc Natl Acad Sci USA 98：3299-303，2001)。给药也可联合促进树突细胞摄入的试剂而进行。优选的肿瘤相关抗原包含与同种异体癌症抗血清或与许多癌症患者的T细胞反应的那些肿瘤相关抗原。尤其引人注目的，然而，是抗预先存在的非自发性免疫反应的那些。明显地，有可能诱导抗能够溶解肿瘤的这些免疫反应(Keogh等人，J.Immunol.167：787-96，2001；Appella等人，Biomed Pept ProteinsNucleic Acids 1：177-84，1995；Wentworth等人，Mol Immunol.32：603-12，1995)。

[0131] 根据本发明描述的药用组合物也可用作用于免疫的疫苗。根据本发明，术语“免疫”或“疫苗接种”意思是对抗原的免疫反应的激活或增加。为了测试使用肿瘤相关抗原或编码肿瘤相关抗原的核酸的对癌症的免疫作用，有可能使用动物模型。例如，人类癌症细胞可被引入小鼠以产生肿瘤，并且编码肿瘤相关抗原的一个或多个核酸可被给予。可测量对癌症细胞的作用(例如肿瘤体积的减小)作为测量用核酸免疫的有效性的手段。

[0132] 为了诱导免疫反应或增加免疫反应，一个或多个肿瘤相关抗原或其刺激片段，作为用于免疫的组合物的一部分，可与一个或多个佐剂一起给予。佐剂是被整合进抗原或与抗原一起给予并增强免疫反应的物质。佐剂通过提供抗原库(细胞之外地或在巨噬细胞内地)、激活巨噬细胞和/或刺激特定的巨噬细胞来增强免疫反应。佐剂是已知的，并且以非限制性的方法包含单磷酰脂A(MPL，SmithKline Beecham)、皂甙例如QS21(SmithKline Beecham)、DQS21(SmithKline Beecham；WO 96/33739)、QS7、QS17、QS18和QS-L1(So等人，Mol.Cells7：178-186，1997)、弗氏不完全辅佐剂、弗氏完全辅佐剂、维生素E、montanide、明矾、CpG寡聚核苷酸(参见Kreig等人，Nature 374：546-9，1995)以及由生物可降解油例如角鲨烯和/或生育酚制备而来的各种油包水型乳剂。优选地，肽以与DQS21/MPL混合物的形式被给予。DQS21与MPL的比例一般是大约1∶10至10∶1，优选的是大约1∶5至5∶1，并且尤其是1∶1。给予人类时，疫苗制剂一般含有大约1μg至大约100μg的DQS21和MPL。

[0133] 刺激患者免疫反应的其它物质也可被给予。由于细胞因子对淋巴细胞的调节特性，有可能例如在疫苗接种中使用细胞因子。这样的细胞因子包含，例如显示能增加疫苗的保护作用的白细胞介素-12(IL-12)(参见Science 268：1432-1434，1995)，粒细胞巨噬细胞-克隆刺激因子以及IL-18。

[0134] 有很多增强免疫反应所以可以用于疫苗接种的化合物。所述的化合物包含以蛋白质或核酸形式提供的共刺激分子。这样的共刺激分子的实施例是表达于树突细胞(DC)上并与表达于T细胞上的CD28分子相互作用的B7-1和B7-2(分别是CD80和CD86)。这种相互作用给抗原/MHC/TCR刺激(信号1)的T细胞提供了共刺激(信号2)，因此增强所述T细胞的增殖和效应物功能。B7也与T细胞上的CTLA4(CD152)相互作用，并且涉及CTLA4和B7配体的研究证明了B7-CTLA4的相互作用能增强抗肿瘤的免疫性和CTL的增殖(Zheng，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(11)：6284-6289(1998))。

[0135] B7一般不在肿瘤细胞上表达，所以这些对T细胞来说不是有效的抗原递呈细胞(APC)。B7表达的诱导使肿瘤细胞能刺激细胞毒性T淋巴细胞更加有效的增殖以及效应物的功能。通过B7/IL-6/IL-12联合的共刺激揭露T细胞群中IFN-γ和Th1细胞因子曲线(profile)的诱导，导致T细胞活性的进一步增强(Gajewski等人，J.Immunol.154：5637-5648(1995))。

[0136] 细胞毒性T淋巴细胞的完全激活和完全的效应物功能需要T辅助细胞通过所述T辅助细胞上的CD配体和树突细胞表达的CD40分子的相互作用的参与(Ri dge等人，Nature393：474(1998)，Bennett等人，Nature 393：478(1998)， 等人，Nature
393：480(1998))。这个共刺激信号的机制很可能涉及由所述树突细胞(抗原递呈细胞)产生的B7以及产生的相关的IL-6/IL-12的增加。CD40-CD40L相互作用因而补足了信号1(抗原/MHC-TCR)和信号2(B7-CD28)。

[0137] 抗CD40抗体用于刺激树突细胞被期望能直接增强对肿瘤抗原的反应，通常所述肿瘤抗原在炎症反应的范围之外或由非专业的抗原递呈细胞(肿瘤细胞)递呈。在这些情况下，T辅助细胞和B7共刺激信号未被提供。这个机制可与基于抗原刺激的(antigen-pulsed)树突细胞的治疗连接起来使用。

[0138] 本发明还提供了核酸、多肽或肽的给予方式。多肽和肽可用本身就已知的方式被给予。在一个实施方案中，核酸可通过离体(ex vivo)方法被给予，即通过将细胞从患者拿去，为了整合肿瘤相关抗原对所述细胞的基因修饰，并且将改变的细胞再引入患者。这一般包含体外将基因的功能性拷贝引入患者的细胞内并且将基因改变的细胞重新引入患者。基因的功能性拷贝在调节元件的功能性控制之下，所述调节元件允许基因表达于基因改变的细胞中。转染和转导的方法是技术工人已知的。本发明还提供使用例如病毒和靶点控制的脂质体的载体体内给予核酸。

[0139] 在优选的实施方案中，用于给予编码肿瘤相关抗原的核酸的病毒载体选自腺病毒、腺伴随病毒、痘病毒包括痘苗病毒和减毒痘病毒、圣基利森林(Semliki Forest)病毒、逆转录病毒、辛德必斯(Sindbis)病毒和Ty病毒样颗粒。尤其优选腺病毒和逆转录病毒。逆转录病毒一般是复制缺陷的(即它们不能产生有感染力的颗粒)。

[0140] 为了根据本发明将核酸体外或体内引入细胞内可使用各种方法。此类方法包含磷酸钙沉淀核酸的转染、与DEAE相关的核酸的转染、用上面携带目的核酸的病毒的转染或感染、脂质体介导的转染等等。在特定的实施方案中，优先选择将核酸指引至特定的细胞的方法。在这样的实施方案中，用于将核酸给予到细胞的载体(例如逆转录病毒或脂质体)具有结合靶点的控制分子。例如，分子例如特异于靶细胞上表面膜蛋白的抗体或者特异于靶细胞上受体的配体可以被整合进或附着于核酸载体。优选的抗体包含与肿瘤相关抗原选择性结合的抗体。如果通过脂质体给予核酸是期望的，结合于细胞内吞相关的表面膜蛋白的蛋白质可被整合进脂质体制剂中使得靶控制和/或摄取成为可能。这样的蛋白质包含特异于特定的细胞类型的衣壳蛋白或其片段，抗内化蛋白质的抗体，定位于细胞内位点的蛋白质等等。

[0141] 本发明的治疗组合物可以以药物相容性制剂的形式给予。这样的制剂通常含有药物相容浓度的盐、缓冲物质、防腐剂、载体、补充免疫增强物质例如辅佐剂、CpG和细胞因子，以及在合适的情况下其它的治疗活性化合物。

[0142] 本发明的治疗活性化合物可以通过任何传统途径给予，包括注射或输入(infusion)。给药方式可采用例如口服、静脉、腹腔、肌肉内、皮下或经皮地。优选地，抗体经由肺气雾剂被治疗性的给予。反义核酸优选地通过缓慢静脉给药方式被给予。

[0143] 本发明的组合物以有效的量被给予。“有效量”指的是自身或者与更多的剂量一起获得期望的反应或期望的作用的量。在治疗以表达一个或多个肿瘤相关抗原为特征的特定疾病或特定状态的情况下，期望的反应涉及疾病过程的抑制。这包含减慢疾病的发展，并且尤其是打断疾病的发展。在治疗疾病或不适中期望的反应也可以是所述疾病或所述不适的发作被延期或发作被阻止。

[0144] 本发明组合物的有效量将依赖于要治疗的不适、疾病的严重程度、患者的个人参数，包括年龄、生理状态、体积和体重，治疗的持续时间、伴随治疗的类型(如果有的话)，给药的特异性途径以及相似的因素。

[0145] 本发明药物组合物优选地是无菌的并且含有有效量的治疗活性物质以产生期望的反应或期望的作用。

[0146] 本发明组合物给予的剂量依赖于各种参数，例如给药形式、患者的状态、期望的给药时程等等。在初始剂量不足以引起患者的反应的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的更加局部化的给药途径以获得有效地更高的剂量)。

[0147] 一般，为了治疗或为了产生或增加免疫反应，从1ng至1mg，优选地从10ng至100μg剂量的肿瘤相关抗原被制成制剂并被给予。如果编码肿瘤相关抗原的核酸(DNA和RNA)的给予是所期望的，从1ng至0.1mg的剂量被制成制剂并被给予。

[0148] 本发明的药物组合物一般以药物相容的量并且以药物相容的组合物被给予。术语“药物相容的”指的是不与药物组合物中活性成分的作用相互作用的非毒性物质。此类制剂通常含有盐、缓冲物质、防腐剂、载体，以及合适情况下的其它治疗活性物质。当用于医疗时，盐应当是药物相容的。然而，药物不相容的盐可以用于制备药物相容的盐并且包括在本发明中。此类药理和药物相容的盐以非限制性的方法包含那些从下列酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、柠檬酸、蚁酸、丙二酸、琥珀酸等等。药物相容盐还可以被制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。

[0149] 本发明的药物组合物包含药物相容性载体。根据本发明，术语“药物相容性载体”指的是适合给予人类的一个或多个相容的固体或液体填充剂、稀释剂或做成胶囊的物质。术语“载体”指的是天然或合成的有机或无机组分，其中活性组分被联合为应用提供方便。
本发明药物组合物的组分通常是不会发生基本上削弱期望的药物效应相互作用的这些组分。

[0150] 本发明的药用组合物可以含有合适的缓冲物质例如醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。

[0151] 药物组合物，在合适的情况下，也含有合适的防腐剂例如苯扎氯铵、三氯叔丁醇、paraben和硫柳汞。

[0152] 药物组合物通常以统一的剂量形式提供，并且以本身已知的方式被制备。本发明的药物组合物是例如胶囊、片剂、锭剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂的形式或者是乳剂的形式。

[0153] 适合胃肠外给药的组合物通常包含活性化合物的无菌水或非水制剂，所述组合物优选地是与受者的血液等渗的。相容载体和溶剂的实施例是林格(Ringer)溶液和等渗的氯化钠溶液。另外，通常无菌的不易挥发的油类被用作溶液或悬浮液的介质。

[0154] 本发明通过下面的用于例证的目的并不是意在限定的插图和实例被详细地描述。由于这些叙述和实施例，同样包括在本发明中的进一步的实施方案很容易被本领域技术人员理解。

附图说明

[0155] 图1.GPR35在结肠癌活检组织中mRNA的表达

[0156] 对无DNA的RNA的RT-PCR调查显示，GPR35在多数结肠癌活检组织中的表达。相反，在正常组织中没有检测到表达。(1-乳腺，2-肺，3-淋巴结，4-胸腺，5-结肠，6-15结肠癌，16-阴性对照)

[0157] 图2.定量PCR分析GUCY2C在正常和肿瘤组织中mRNA的表达

[0158] 用GUCY2C特异性引物(SEQ ID NO：22-23)的实时PCR调查显示GUCY2C在正常回肠、结肠和所有结肠癌活检组织中选择性mRNA的表达。对结肠癌的肝脏转移灶中GUCY2C转录产物的不同的量也进行检测。

[0159] 图3.肿瘤特异性的GUCY2C剪接变异体的鉴别

[0160] 来自正常结肠组织和结肠癌的PCR产物被克隆，并且对两组的克隆通过限制性分析(EcoR I)进行检查并且进行测序。

[0161] 图4.正常肺和肺癌中选择性SCGB3A表达

[0162] 用基因特异性SCGB3A2引物(SEQ ID NO：37，38)的RT-PCR分析显示只在正常肺(8道，14-15道)以及肺癌(16-24道)的活检组织中有cDNA扩增。(1-肝-正常，2-外周血单核细胞-正常，3-淋巴结-正常，4-胃-正常，5-睾丸-正常，6-乳腺-正常，
7-肾-正常，8-肺-正常，9-胸腺-正常，10-卵巢-正常，11-肾上腺-正常，12-脾-正常，14-15-肺-正常，16-24-肺癌，25-阴性对照)

[0163] 图5.Claudin-18A2.1在胃、食管、胃癌和胰腺癌中的表达

[0164] 用claudin-18A2.1特异性引物(SEQ ID NO：39，40)的RT-PCR分析显示根据本发明在8/10胃癌活检组织和3/6胰腺癌活检组织有claudin-18A2.1显著的表达。明显的表达还可在胃和正常食管组织中检测到。相反，表达没有在卵巢和卵巢癌中检测到。

[0165] 图6.SLC13A1在肾和肾细胞癌中的表达

[0166] 用SCL13A1特异性引物(SEQ ID NO：49，50)的RT-PCR分析显示在7/8肾细胞癌的样品中有表达。另外的，转录产物正常组织中只有在肾可检测到。(1-2肾，3-10-肾细胞癌，11-乳腺，12-肺，13-肝，14-结肠，15-淋巴，16-脾，17-食管，18-胸腺，19-甲状腺，20-外周血单核细胞，21-卵巢，22-睾丸。)

[0167] 图7.CLCA1在结肠、结肠癌和胃癌中的表达

[0168] 用CLCA1特异性引物(SEQ ID NO：67，68)的RT-PCR调查证实在结肠中的选择性表达并且显示在3/7被调查的结肠癌和1/3被调查的胃癌样品中的高表达。其它的正常组织(NT)显示无表达或仅有很弱的表达。

[0169] 图8.FLJ21477在结肠和结肠癌中的表达

[0170] 用FLJ21477特异性引物(SEQ ID NO：69，70)的RT-PCR调查显示在结肠中的选择性表达，并且另外在7/12被调查的结肠癌样本中的不同水平的表达。其它的正常组织(NT)未显示有表达。

[0171] 图9.FLJ20694在结肠和结肠癌中的表达

[0172] 用FLJ20694特异性引物(SEQ ID NO：71，72)的RT-PCR调查显示在结肠中的选择性表达，并且另外在(5/9)被调查的结肠癌样本中的不同水平的表达。其它的正常组织(NT)未显示有表达。

[0173] 图10.von Ebner在胃、肺和肺癌中的表达

[0174] 用von Ebner特异性引物(SEQ ID NO：73，74)的RT-PCR调查显示在胃中、在肺中以及在5/10被调查的胃癌样本中的选择性表达。其它的正常组织(NT)未显示有表达。

[0175] 图11.Plunc在胸腺、肺和肺癌中的表达

[0176] 用Plunc特异性引物(SEQ ID NO：75，76)的RT-PCR调查显示在胸腺中、在肺中以及在(6/10)被调查的肺癌样品中的选择性表达。其它的正常组织未显示有表达。

[0177] 图12.SLC26A9在肺、肺癌和甲状腺中的表达

[0178] 用SLC26A9特异性引物(SEQ ID NO：77，78)的RT-PCR调查显示在肺中以及在所有(13/13)被调查的胃癌样本中的选择性表达。其它的正常组织(NT)除甲状腺外未显示有表达。

[0179] 图13.THC1005163在胃、卵巢、肺和肺癌中的表达

[0180] 用THC1005163特异性引物(SEQ ID NO：79)和非特异性寡聚dT标签引物的RT-PCR调查显示在胃、卵巢、肺中以及在(5/9)被调查的肺癌活检组织中的选择性表达。其它的正常组织(NT)未显示有表达。

[0181] 图14.LOC134288在肾和肾细胞癌中的表达

[0182] LOC134288特异性引物(SEQ ID NO：80，81)的RT-PCR调查显示在肾中以及在(5/8)被调查的肾细胞癌活检组织中的选择性表达。

[0183] 图15.THC943866在肾和肾细胞癌中的表达

[0184] 用THC943866特异性引物(SEQ ID NO：82，83)的RT-PCR调查显示在肾中以及在(4/8)被调查的肾细胞癌活检组织中的选择性表达。

[0185] 图16.FLJ21458在结肠和结肠癌中的表达

[0186] 用FLJ21458特异性引物(SEQ ID NO：86，87)的RT-PCR调查显示在结肠中以及在(7/10)被调查的结肠癌活检组织中的选择性表达。(1-2-结肠，3-肝，4-外周血单核细胞，5-脾，6-前列腺，7-肾，8-卵巢，9-皮肤，10-回肠，11-肺，12-睾丸，13-22结肠癌，23-阴性对照。)

[0187] 图17.GPR35的细胞定位

[0188] 免疫荧光法用于检测在转染表达GPR35-GPP融合蛋白质的质粒之后的GPR35细胞定位。箭头鉴别了荧光GFP的膜相关荧光。

[0189] 图18.GPR35的定量表达

[0190] A.用GPR35特异性引物(SEQ ID NO：88，89)的定量RT-PCR显示在肠道中、在结肠肿瘤样品中以及在来自肠道肿瘤的转移灶中的选择性表达。对下列正常组织进行分析：肝、肺、淋巴结、胃、脾、肾上腺、肾、食管、卵巢、睾丸、胸腺、皮肤、乳腺、胰腺、淋巴细胞、激活的淋巴细胞、前列腺、甲状腺、输卵管、子宫内膜、小脑、脑。

[0191] B.结肠肿瘤及其转移灶中GPR35的流行。GPR35在肿瘤和转移灶多于90％的案例都有表达。

[0192] 图19.GUCY2C的定量表达

[0193] 用GUCY2C特异性引物(SEQ ID NO：98，99)的定量RT-PCR显示在正常结肠和胃组织中的高水平并且选择性的表达(A)以及结肠和胃肿瘤样本中GUCY2C的特异性表达(B)。GUCY2C在11/12结肠癌中和7/10胃癌中可检测到。

[0194] 图20.SCGB3A2的定量表达

[0195] 用SCGB3A2特异性的引物(SEQ ID NO：103，104)的定量RT-PCR显示在肺样品和肺肿瘤样品中的选择性表达。19/20肺肿瘤样品是SCGB3A2阳性的，并且SCGB3A2在多于50％的样品中有至少10倍的过度表达。对下列正常组织进行分析：肝、肺、淋巴结、胃、脾、肾上腺、肾、食管、卵巢、睾丸、胸腺、皮肤、乳腺、胰腺、淋巴细胞、激活的淋巴细胞、前列腺、甲状腺、输卵管、子宫内膜、小脑、脑。

[0196] 图21.用SCGB3A2特异性抗体的免疫荧光法

[0197] COS7细胞被转染了编码SCGB3A2-GFP融合蛋白质的质粒。A.用SCGB3A2特异性的兔抗血清的转染的融合蛋白质之检测(用SEQ ID NO：105免疫)。B.通过GFP荧光的转染的融合蛋白质之检测。C.从A和B得到的两个荧光的叠加。在两个荧光叠加的点产生黄色，并且因而证明SCGB3A2抗血清的特异性。

[0198] 图22.claudin-18剪接变异体的图表叙述

[0199] 两个claudin-18的剪接变异体A1和A2在氨基端不同并且显示了不同的潜在糖基化位点。

[0200] 图23.claudin-18变异体A1的定量表达

[0201] Claudin-A1在大量的肿瘤组织中被高度激活。特别强的表达在胃肿瘤、肺肿瘤、胰腺癌和食管癌中可以找到。

[0202] 图24.claudin-18变异体A2的定量表达

[0203] 变异体A2(如同变异体A1)在许多肿瘤中被激活。

[0204] 图25.claudin-18A2特异性抗体(细胞外结构域)的使用

[0205] (上)通过用肽(SEQ ID NO：17)的免疫产生的抗体对claudin-18A2阳性的胃癌细胞(SNU-16)的染色。膜染色似乎在细胞/细胞相互作用的区域特别强。A-免疫前，MeOH；B-免疫血清MeOH，5μg/ml；(下)通过claudin-18A2-GFP转染的293T细胞的共定位分析对抗体特异性的证明。A-Claudin-18A2GFP；B-抗claudin-A2；C-叠加。

[0206] 图26.claudin-18A2特异性抗体(细胞外结构域)的使用

[0207] 通过用肽(SEQ ID NO：113，位于氨基端的细胞外结构域)的免疫产生的抗体对claud in-18A2阳性的胃癌细胞(SNU-16)的膜染色。抗E-cadherin的单克隆抗体被用于复染。A-抗体；B-复染；C-叠加。

[0208] 图27.抗claudin-18羧基端细胞外结构域的抗体的使用

[0209] (左，上和下)通过用肽(SEQ ID NO：116，位于羧基端的细胞外结构域)的免疫生产的抗体对claudin-18A2阳性的胃癌细胞(SNU-16)的膜染色。抗E-cadherin的单克隆抗体被用于复染(右上，下)。

[0210] 图28.claudin-18A1特异性抗体的使用

[0211] (上)用claudin-18A1特异性肽(SEQ ID NO：115)的免疫产生的抗体对胃癌细胞(SNU-16；claudin18A2阳性)的弱或无染色。A-抗E-cadherin；B-抗claudin-18A1；C-叠加。

[0212] (下)通过转染了claudin-18A1-GFP的293T细胞的共定位分析对抗体特异性的证明。A-GFP-Claudin-18A1；B-抗claudin-18A1；C-叠加。

[0213] 图29.Western印迹中claudin-18A2的检测。

[0214] 用抗有SEQ ID NO：17之抗原决定簇的claudin-18A2特异性抗体对来自各种健康组织的溶解物进行Western印迹。1-胃；2-睾丸；3-皮肤；4-乳腺；5-肝；6-结肠；7-肺；8-肾；9-淋巴结。

[0215] 图30.对来自胃和胃癌样品进行的Claudin-18A2的Western印迹

[0216] 使用抗具有SEQ ID NO：17的抗原的claudin-18A2特异性抗体对来自胃和胃肿瘤的溶解物进行Western印迹并且进行测试。胃肿瘤显示了较低糖基化形式的claudin-18A2。对胃溶解物的肽N-糖苷酶F(PNGase F)处理导致了低糖基化形式的形成。

[0217] 左：1-胃No#A；2-胃Tu#A；3-胃No#B；4-胃Tu#B

[0218] 右：1-胃No#A；2-胃No#B；3-胃No#B+PNGase F；4-胃Tu#C；5-胃Tu#D；6-胃Tu#D+PNGa se F

[0219] 图31.肺肿瘤中claudin-18的表达

[0220] 与图30一致，低糖基化的claudin-18A2变异体在肺肿瘤中被检测到。1-胃No；2-胃Tu；3-9-肺Tu。

[0221] 图32.使用claudin-18A2特异性抗体对胃肿瘤组织中claudin-18的免疫组织化学分析

[0222] 图33.用claudin-18特异性多克隆抗血清对胃特异性Snu16细胞的间接免疫荧光

[0223] A.用免疫前产生的免疫前血清的染色；B.用claudin-18特异性血清的染色。

[0224] 图34.SLC13A1的定量表达

[0225] 用SLC13A1特异性引物(SEQ ID NO：121，122)的定量RT-PCR显示在正常肾组织中高水平并且选择性的表达(A)以及SCL13A1在肾细胞癌中的特异性表达(B)。SLC13A1的转录在5/8肾细胞癌中可检测到。

[0226] 图35.SLC13A1的细胞定位

[0227] 免疫荧光法证明在提供SLC13A1-GFP融合蛋白质的质粒的转染之后SLC13A1的细胞定位。SLC13A1融合蛋白质的膜相关荧光清晰可见(为环绕转染细胞的环)。

[0228] 图36.CLCA1的定量表达

[0229] 用CLCA1特异性引物(SEQ ID NO：125，126)的定量RT-PCR在显示正常结肠组织和胃组织中高水平并且选择性的表达(A)以及CLCA1在结肠和胃肿瘤样品中的特异性表达(B)。CLCA1在6/12结肠癌中和在7/10胃癌中可检测到。

[0230] 图37.FLJ21477的定量表达

[0231] 用FLJ21477特异性引物(SEQ ID NO：127，128)的定量RT-PCR显示在正常结肠和胃组织中高水平并且选择性的表达以及在胸腺、食管和脑中的微弱表达(A)以及FLJ21477在结肠肿瘤样品中的特异性表达(B)。FLJ21477在11/12结肠癌中可检测到。

[0232] 图38.FLJ20694的定量表达

[0233] 用FLJ20694特异性引物(SEQ ID NO：129，130)的定量RT-PCR显示在正常结肠和胃组织中高水平并且选择性的表达(A)以及FLJ21477在结肠和胃肿瘤样本中的特异性过度表达(B)。FLJ 20694在11/12结肠癌中和在7/10胃癌中可检测到。

[0234] 图39.FLJ21458的定量表达

[0235] 用FLJ21458特异性引物(SEQ ID NO：133，134)的定量RT-PCR显示在睾丸、胃和肠道组织中的选择性表达。另外，FLJ21458特异性转录产物在20/20结肠肿瘤中和在7/11结肠转移灶中可检测到。对下列正常组织进行分析：肝、肺、淋巴结、脾、肾上腺、肾、食管、卵巢、睾丸、胸腺、皮肤、乳腺、胰腺、淋巴细胞、激活的淋巴细胞、前列腺、甲状腺、输卵管、子宫内膜、小脑、大脑。

[0236] 图40.用FLJ21458特异性抗体的免疫荧光法

[0237] (上)293细胞被转染了编码FLJ21458-GFP融合蛋白质的质粒。A：用FLJ21458特异性兔抗血清(用SEQ ID NO：136免疫化)对转染的融合蛋白质的检测。B：通过GFP荧光对转染的融合蛋白质的检测。C：来自A和B的两个荧光的叠加。在两个荧光叠加的地方产生黄色并且因此证明了FLJ21458抗血清的特异性。

[0238] (下)对内源性合成FLJ21458的Snu16细胞的分析。A：使用FLJ21458特异性兔抗血清(用SEQ ID NO：136免疫)的蛋白质检测。B：膜蛋白质E-钙粘蛋白的检测。C：来自A和B的两个荧光的叠加。在两个荧光叠加的地方产生黄色，并且证明了FLJ21458的膜定位。

[0239] 图41.序列

[0240] 在此处显示了涉及的序列。

[0241] 实施例：

[0242] 材料和方法

[0243] 术语“在芯片上”、“电子的”和“虚拟克隆”仅仅指的是基于数据库的方法的使用，并且还可用于刺激实验室试验方法。

[0244] 除非有不同表达性的定义，所有其它的术语和表达方法被使用以使得技术工人都可以理解。提到的技术和方法以本身已知的方式进行并且在例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.中有描述。所用的方法包括试剂盒和试剂的使用根据厂家的信息进行。

[0245] 用于测定新的肿瘤相关基因的基于数据采集(datamining)的策略

[0246] 两个“在芯片上”的策略，名为基因库(GenBank)关键词搜索和cDNAxProfiler被联合。利用NCBI ENTREZ搜索和重获系统(RetrievalSystem)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)，为被注解为在特异性的组织中特异性表达的候选基因可进行基因库搜索(Wheeler等人，Nucleic Acids Research28：10-14，2000)

[0247] 用例如“结肠特异性基因”、“胃特异性基因”或“肾特异性基因”的关键词进行查询，候选基因(GOI，目的基因)从数据库中被摘录出。通过对于有机体使用限定词“人类”，对于分子类型使用mRNA，使得搜索被限定为这些数据库全部信息的一部分。

[0248] 找到的GOI清单通过确定相同序列的不同名字以及消除这样的多余而被整理。

[0249] 对关键词搜索得到的所有候选基因通过“电子Northern杂交”(eNorthern)法依次研究它们的组织分布。eNorthern以将GOI的序列与EST(表达序列标记)数据库进行排列比较为基础(Adams等人，Science 252：1651，1991)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。每个发现与插入的GOI同源的EST之组织来源能够被确定并且这样所有EST的总和得到对GOI组织分布的初步评价。只对那些与来自非器官特异性正常组织的EST无同源性的GOI作进一步的研究。这个评价也考虑公共网域含有错误注解的cDNA库(Scheurle等人，Cancer Res.60：4037-4043，2000)(www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm)。

[0250] 利 用 的 第 二 个 数 据 采 集 方 法 是NCBI癌 症 基 因 组 解 剖 计 划 的cDNAxProfiler(Hillier 等 人，Genome Research 6：807-828，1996；Pennisi，Science276：1023-1024，1997)。这个允许转录物组群在通过逻辑操作系统互相有关联的数据库中存放。我们已经定义了一个群A，将例如从结肠的正常组织中制备的所有表达文库都分配于其中，把混合的文库排除在外。从除结肠外的正常组织制备的所有cDNA文库被分配到群B。一般，所有的cDNA文库不依赖于潜在的制备方法而被利用，但是只有大小＞1000的那些被承认。群B依靠BUT NOT操作系统从群A中被电子减除。对如此找到的一套GOI也进行eNorthern研究并通过文献研究进行验证。

[0251] 这种联合的数据采集包括所有在公共网域中大约13,000个全长基因，并且预言了这些基因具有可能的器官特异性的表达。

[0252] 所有其它的基因首先依靠特异性PT-PCR在正常组织中被评价。所有已经被证实在非器官特异性的正常组织中表达的GOI必须被认作假阳性，并且不对其作进一步的研究。在大量的各种各样的肿瘤组织中对剩下来的那些GIO进行研究。下面叙述的抗原这里被证实在肿瘤细胞中是被激活的。

[0253] RNA的提取、用多聚d(T)作引物的cDNA的制备和传统的RT-PCR分析

[0254] 通过使用总RNA异硫氰酸胍作为离液试剂(chaotropic agent)从天然组织材料中提取总RNA(Chomczynski&Sacchi，Anal.Biochem.162：156-9，1987)。用酸性苯酚提取和用异丙醇沉淀后，将所述的RNA溶于DEPC处理的水。

[0255] 依靠Superscript II(Invitrogen)，根据厂商的信息，在20μl反应混合液中从2-4μg总RNA进行第一链cDNA的合成。使用的引物是dT(18)寡聚核苷酸。cDNA的完整性和质量通过30个循环的PCR扩增p53(正义CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG，反义CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG，杂交温度67℃)来检查。

[0256] 第一链cDNA的档案从许多正常组织和肿瘤实体制备而来。为了表达研究，使用GOI特异性的引物(见下)和1U HotStarTaq DNA多聚酶(Qiagen)，对0.5μl的这些cDNA在30μl反应混合液中进行扩增。每个反应混合液含有0.3mM脱氧核糖核苷酸、0.3μM的每个引物和3μl的10×反应缓冲液。对引物进行选择要使其定位在两个不同的外显子，并且由于污染基因组DNA的干扰是假阳性结果的原因，通过测试作为模板的非逆转录的DNA来证实干扰的消除。95℃激活HotStarTaq DNA多聚酶15分钟后，进行35个循环的PCR(94℃1分钟，特定的杂交温度1分钟，72℃2分钟，以及72℃终末延长6分钟)。

[0257] 20μl的此反应物被分装并且在溴化乙啶染色的琼脂糖胶上进行分析。

[0258] 下列引物用于在指定的杂交温度下相应抗原的表达分析

[0259] GPR35(65℃)

[0260] 正义：5′-AGGTACATGAGCATCAGCCTG-3′

[0261] 反义：5′-GCAGCAGTTGGCATCTGAGAG-3′

[0262] GUCY2C(62℃)

[0263] 正义：5-GCAATAGACATTGCCAAGATG-3

[0264] 反义：5-AACGCTGTTGATTCTCCACAG-3

[0265] SCGB3A2(66℃)

[0266] 正义：5’-CAGCCTTTGTAGTTACTCTGC-3’

[0267] 反义：5’-TGTCACACCAAGTGTGATAGC-3’

[0268] Claudin18A2(68℃)

[0269] 正义1：5-GGTTCGTGGTTTCACTGATTGGGATTGC-3

[0270] 反义1：5-CGGCTTTGTAGTTGGTTTCTTCTGGTG-3

[0271] 正义2：5-TGTTTTCAACTACCAGGGGC-3

[0272] 反义2：5-TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3

[0273] Claudin18A1(64℃)

[0274] 正义：5-GAGGCAGAGTTCAGGCTTCACCGA-3

[0275] 反义：5-TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3

[0276] SLC13A1(64℃)

[0277] 正义：5’CAGATGGTTGTGAGGAGTCTG-3

[0278] 反义：5’-CCAGCTTTAACCATGTCAATG-3

[0279] CLCA1(62℃)

[0280] 正义：5’-ACACGAATGGTAGATACAGTG-3

[0281] 反义：5’ATACTTGTGAGCTGTTCCATG-3

[0282] FLJ21477(68℃)

[0283] 正义：5’-ACTGTTACCTTGCATGGACTG-3

[0284] 反义：5’-CAATGAGAACACATGGACATG-3

[0285] FLJ20694(64℃)

[0286] 正义：5’-CCATGAAAGCTCCATGTCTA-3

[0287] 反义：5’-AGAGATGGCACATATTCTGTC

[0288] Ebner(70℃)

[0289] 正义：5’-ATCGGCTGAAGTCAAGCATCG-3

[0290] 反义：5’-TGGTCAGTGAGGACTCAGCTG-3

[0291] Plunc(55℃)

[0292] 正义：5’-TTTCTCTGCTTGATGCACTTG-3

[0293] 反义：5’-GTGAGCACTGGGAAGCAGCTC-3

[0294] SLC26A9(67℃)

[0295] 正义：5’-GGCAAATGCTAGAGACGTGA-3

[0296] 反义：5’-AGGTGTCCTTCAGCTGCCAAG-3

[0297] THC1005163(60℃)

[0298] 正义：5’-GTTAAGTGCTCTCTGGATTTG-3

[0299] LOC134288(64℃)

[0300] 正义：5’-ATCCTGATTGCTGTGTGCAAG-3

[0301] 反义：5’-CTCTTCTAGCTGGTCAACATC-3

[0302] THC943866(59℃)

[0303] 正义：5’-CCAGCAACAACTTACGTGGTC-3

[0304] 反义：5’-CCTTTATTCACCCAATCACTC-3

[0305] FLJ21458(62℃)

[0306] 正义：5’-ATTCATGGTTCCAGCAGGGAC-3′

[0307] 反义：5’-GGGAGACAAAGTCACGTACTC-3′

[0308] 随机六聚体作引物的cDNA的制备和定量实时PCR

[0309] 一些基因的表达用实时PCR定量。PCR产物使用SYBR绿作为内嵌(intercalating)报告染料进行检测。SYBR绿的报告荧光在溶液中被抑制，并且只有在结合于双链DNA片段后染料有活性。SYBR绿荧光的上升作为用GOI特异性引物的特异性扩增的结果被用来进行定量分析。靶基因的表达通过绝对或相对于要调查的组织中恒量表达的对照基因的表达来定量分析。表达在使用ΔΔ-Ct法(PE Biosystems，USA)将样品用所谓看家基因的18sRNA标准化后进行测量。反应进行双复样并且测定三复样。Quanti Tect SYBR绿PCR试剂盒(Qiagen，Hilden)依照厂商的说明书使用。使用高容量cDNA档案库试剂盒(PE Biosystems，USA)并依照厂商的说明书使用六聚体引物合成cDNA。每5μl的稀释的cDNA被用于总体积为25μl的PCR：正义引物300nM，反义引物300nM；初始变性95℃15分钟；95℃30秒；退火30秒；72℃30秒；40个循环。使用的引物的序列在各自的实施例中有指出。

[0310] 克隆和序列分析

[0311] 通过传统的方法进行全长基因和基因片段的克隆。为了确定序列，使用校正多聚酶pfu(Stratagene)来扩增相应的抗原。为了将片段依照厂家的说明书克隆进TOPO-TA载体，在完成PCR之后，腺苷依靠HotStarTap DNA多聚酶结于扩增子(amplicon)的末端。测序由商业服务商进行。使用传统预言程序和逻辑来分析序列。

[0312] Western印迹

[0313] 来自细胞培养(编码靶蛋白质的表达载体转染后靶基因的内源性表达或者靶蛋白质的合成)或含有靶蛋白质的组织样品用1％SDS溶液裂解。SDS使存在于裂解液中的蛋白质变性。试验混合物的裂解液通过在8-15％变性聚丙烯酰胺凝胶(含1％SDS)上的电泳根据大小被分离(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE)，胶的浓度依赖于期望的蛋白质的大小。然后蛋白质通过半干电转印法(Biorad)被转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher&Schüll)，在膜上面期望的蛋白质能被检测到。为了这个目的，膜先被封闭(例如，用奶粉)，然后与稀释度为1∶20-1∶200的特异性抗体孵育(依赖于抗体的特异性)60分钟。清洗步骤后，膜与偶联于识别第一抗体的标志物(例如酶例如过氧化物酶或碱性磷酸酶)的第二抗体孵育。在进一步的清洗步骤之后，随后靶蛋白质显现出颜色或依靠酶反应在膜上(例如ECL，Amersham Bioscience)化学发光反应显现出来。结果用合适的相机照相做成文件。

[0314] 蛋白质修饰的分析通常用Western印迹进行。通常有几个kDa大小的糖基化修饰导致靶更大总质量的蛋白质，这可以用SDS-PAGE分离。为了检测特异性O-和N-糖苷联结，来自组织或细胞的蛋白质裂解物在用SDS变性之前与O-或N-糖苷酶(依照它们各自厂商的说明书，例如PNgase、内糖苷酶F、内糖苷酶H，Roche Diagnostics)孵育。这之后就是如上所述的Western印迹。因而，如果与糖苷酶孵育后靶蛋白质的大小减少了，就有可能检测到特异性的糖基化，并且这样，还可能分析修饰的肿瘤特异性。被糖基化的氨基酸的确切位置能用逻辑和预报程序被预报。

[0315] 免疫荧光法

[0316] 使用已经建立细胞系的细胞，所述细胞内源性合成靶蛋白质(RT-PCR中RNA的检测或者Western印迹中蛋白质的检测)或者在IF之前已经被转染了质粒DNA。将DNA转染进细胞系的各种各样的方法(例如电穿孔、基于脂质体的转染、钙磷酸盐沉淀)已经完善建立(例如Lemoine et al.Methods Mol.Biol.1997；75：441-7)。免疫荧光法中转染的质粒编码未修饰的蛋白质或者不同的氨基酸标志物被偶联于靶蛋白质。最重要的标志物是例如有各种差异荧光形式的发荧光的“绿荧光蛋白”(GFP)以及其高亲和力和特异性抗体可得到的6-12个氨基酸的短肽序列。合成靶蛋白质的细胞用多聚甲醛、皂甙或甲醇固定。然后如果需要通过与去污剂(例如0.2％Triton X-100)孵育通透细胞。固定/通透之后，细胞与抗靶蛋白或抗偶联标志物之一的第一抗体孵育。清洗步骤之后，混合物与偶联于与第一抗体结合的荧光标志物(例如荧光蛋白、Texas Red、Dako)的第二抗体孵育。这样标记的细胞用一层甘油覆盖，并且根据厂商的说明书借助于荧光显微镜进行分析。在这种情况下特异性的荧光发射通过依赖于采用的物质的特异性的激发而获得。所述分析通常允许可靠的靶蛋白的定位、抗体的质量以及靶蛋白质在双染色法中被证实，所述双染色法除染色靶蛋白质外也染色其定位已经在文献中有描述的偶联氨基酸标志物或其它标志物蛋白质。GFP及其衍生物代表了能被直接激活并且自身会发荧光的一个特殊情况，所以不需要抗体来检测。

[0317] 免疫组织化学法

[0318] IHC特异性地用于(1)能够估计肿瘤和正常组织中靶蛋白质的量，(2)分析肿瘤和健康组织中有多少细胞合成靶基因，和/或(3)定义可检测到靶蛋白质的组织中的细胞类型(肿瘤、健康的细胞)。必须依赖于各自的抗体而使用不同的试验方案(例如“DiagnosticImmunohistochemistry，David J.，MD Dabbs ISBN：0443065667” 或“Microscopy，Immunohistochemistry，and Antigen RetrievalMethods：For Light and Electron Microscopy，ISBN：0306467704”)。

[0319] 对特异性组织样品的免疫组织化学法(IHC)用于检测相应组织中的蛋白质。这个方法的目的是鉴别功能性完整的组织聚集体中蛋白质的定位。IHC特异性的用于(1)能够估计肿瘤和正常组织中靶蛋白质的量，(2)分析肿瘤和健康组织中有多少细胞合成靶基因，和(3)定义可检测到靶蛋白质的组织中的细胞类型(肿瘤、健康的细胞)。或者，靶基因的蛋白质的量可用数码相机和合适的软件(例如Tillvision，Till-photonics，Germany)通过组织免疫荧光法来进行定量分析。这个技术很频繁地被发表，并且因此染色和显微镜使用的细节，例如在“Diagnostic Immunohistochemistry”，David J.，MD Dabbs ISBN：0443065667或“Microscopy，Immunohistochemistry，and AntigenRetrieval Methods：For Light and Electron Microscopy”ISBN：0306467704之中都能找到。应该注意的是因为抗体的特性，为了得到有效的结果必须使用不同的实验方案(下面描述了一个实施例)。

[0320] 平常地，组织学定义的肿瘤组织以及作为参照的可比较的健康组织被用于IHC中。还可能使用作为阳性或阴性对照的细胞系，其中靶基因的存在通过RT-PCR分析是已知的。通常必须包括背景对照。

[0321] 将固定的组织(例如用含乙醛的物质、甲醛、多聚甲醛或在乙醇溶液中固定)或者1-10μm厚的快速冷冻的组织碎片敷于玻璃支持物上。石蜡包埋的样品用例如二甲苯去除石蜡。样品用TBS-T清洗并且用血清封闭。这之后与第一抗体孵育(稀释度：1∶2至1∶2000)1-18个小时，通常使用亲和纯化的抗体。清洗步骤之后与偶联于碱性磷酸酶(或者，例如过氧化物酶)并且抗第一抗体的第二抗体孵育大约30-60分钟。这之后是使用可被结合的酶转化的颜色底物的颜色反应(参见例如Shi等人，J.Histochem.Cytochem.39：
741-748，1991；Shin等人，Lab.Invest.64：693-702，1991)。为了证明抗体的特异性，反应通过免疫原的预先加入能被阻断。

[0322] 免疫

[0323] ( 也 见 Monoclonal Antibodies：A Practical Approach，PhilipShepherd，Christopher Dean isbn 0-19-963722-9；Antibodies：ALaboratory Manual，Harlow，David Lane 编 ISBN：0879693142；UsingAntibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.EdwardHarlow，David Lane，Harlow编ISBN：0879695447)。

[0324] 用于制备抗体的方法简述如下，并且细节能在引用的文献中找到。首先，动物(例如兔)用第一次注射期望的靶蛋白质进行免疫。动物对免疫原的免疫反应能通过在规定的期间内(在前面的免疫之后大约2-4周)第二或第三次免疫被增强。此外在各种规定期间后(4周后第一次采血，然后大约每两周共5次采血)从动物采集血样，并且从那里获得免疫血清。

[0325] 其它的方法也可以利用，但动物通常用四个已经完善建立的方法中的一个来免疫。还可能用特异于靶蛋白质的肽、用完整的蛋白质或用能通过试验或预报程序鉴别的蛋白质的细胞外部分序列来免疫。

[0326] (1)在第一种情况下，结合于KLH(匙孔 血蓝蛋白)的肽(长度：8-12个氨基酸)通过标准化的体外方法进行合成，并且这些肽用于免疫。通常，进行3次免疫，每次免疫肽的浓度为5-1000μg。还能请服务供应商以服务的形式来进行免疫。

[0327] (2)或者，能用重组蛋白质进行免疫。为了这个目的，靶基因的克隆的DNA被克隆进表达载体，并且靶蛋白质用与特定厂商提供的条件(例如Roche Diagnostics，Invitrogen，Clontech，Qiagen)类似的条件，例如无细胞的体外、在细菌中(例如大肠杆菌)、在酵母中(例如裂变酵母)、在昆虫细胞中或在哺乳动物细胞中进行合成。在这些系统之一中合成后，靶蛋白质被纯化，在这种情况下的纯化通常通过标准化的色谱方法来进行。也可能在这点上，为了免疫使用具有辅助纯化的分子锚(例如Hia标签，Qiagen；FLAG标签，Roche Diagnostics；Gst融合蛋白质)的蛋白质。大量的试验方案可以在例如“Current Protocolsin Molecular Biology”，John Wiley&Sons Ltd.，Wiley Interscience中找到。

[0328] (3)如果有内源性合成期望蛋白质的细胞可被利用，这个细胞系也能用于生产特7
异性的抗血清。在这种情况下，通过1-3次注射免疫，每次用大约1-5×10 细胞进行免疫。

[0329] (4)免疫还能通过DNA的注射进行(DNA免疫)。为了这个目的，靶基因最初被克隆进表达载体，所以靶序列在强的真核启动子的控制之下(例如CMV启动子)。随后，5-100μg的DNA作为免疫原用“基因枪”被转移到生物体(例如鼠、兔)内有强血流的毛细血管区域。转移的DNA被动物的细胞摄取，靶基因被表达，并且动物最终产生对靶基因的免疫反应(Jung等人，Mol Cells 12：41-49，2001；Kasinrerk等人，Hybrid Hybridomics 21：
287-293，2002)。

[0330] 多克隆血清或抗体的质量控制

[0331] 基于细胞培养及其后Western印迹的试验最适合用来证明特异性(各种变异在例如“Current Protocols in Protein Chemis try”，JohnWiley&Sons Ltd.，Wiley InterScience中有描述)。为了证明，细胞被转染了在强的真核启动子(例如巨细胞病毒启动子)控制下的编码靶蛋白的cDNA。用于将DNA转染进细胞系的各种各样的方法(例如电穿孔、基于脂质体的转染、磷酸钙沉淀)都已经完善建立(例如Lemoine等人，Methods Mol.Biol.75：441-7，1997)。或者也可能使用内源性表达靶基因的细胞系(通过靶基因特异性的RT-PCR来证明)。为了能够证明在接下来的Western blot中分析的抗体的特异性，作为对照，理想的情况下同源基因在试验中也被转染。

[0332] 在随后的Western印迹中，来自细胞培养或组织样品的可能含有靶基因的细胞用1％SDS溶液裂解，并且因此使蛋白质变性。裂解液根据大小在8-15％变性聚丙烯酰胺凝胶(含1％SDS)上通过电泳分离(SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE)。蛋白质然后通过多数的转印方法(例如半干电转印；Biorad)中的一个转移到特异性膜上(例如硝酸纤维素，Schleicher&Schüll)。期望的蛋白质能在这个膜上显示出来。为了这个目的，膜先与识别靶蛋白质的抗体(稀释度大约1∶20-1∶200，依赖于抗体的特异性)孵育60分钟。
清洗步骤之后，膜与偶联于标志物(例如酶例如过氧化物或碱性磷酸酶)并且识别第一抗体的第二抗体孵育。然后有可能通过颜色或化学发光反应使靶蛋白质在膜上显现出来(例如ECL，Amersham Bioscience)。对靶蛋白质有高特异性的抗体在理想情况下只识别期望的蛋白质本身。

[0333] 各种方法被用来证实“在芯片上”的方法鉴别的靶蛋白质的膜定位。使用上述抗体一个重要的并且完善建立的方法就是免疫荧光法(IF)。为此，合成靶蛋白质(RT-PCR中RNA的检测或Western印迹中蛋白质的检测)或者已经转染了质粒DNA的已经建立的细胞系的细胞被使用。用于将DNA转染进细胞的各种各样的方法(例如电穿孔、基因脂质体的转染、磷酸钙沉淀)已经完善建立(例如Lemoine等人，Methods Mol.Biol.75：441-7，1997)。转染进细胞的质粒在免疫荧光法中编码非修饰的蛋白质或者将各种氨基酸标志物偶联于靶蛋白质。主要的标志物是例如有其各种差异荧光形式的有荧光的“绿荧光蛋白”(GFP)，其高亲和力和特异性抗体可得到的6-12个氨基酸的短肽序列，或者能通过其半胱氨酸特异性荧光物质而结合的短氨基酸序列Cys-Cys-X-X-Cys-Cys(Invitrogen)。合成靶蛋白质的细胞用例如多聚甲醛或甲醇固定。然后如果需要，通过与去污剂(例如0.2％TritonX-100)孵育通透细胞。细胞再与抗靶蛋白质的或抗偶联的标志物之一的第一抗体孵育。清洗步骤后，混合物与偶联于荧光标志物(例如荧光素，Texas Red，Dako)并且结合于第一抗体的第二抗体孵育。这样标记的细胞再盖上一层甘油，并且根据厂商的说明书借助于荧光显微镜进行分析。特异性的荧光发射在这种情况下通过依赖于采用的物质的特异性激发而获得。所述分析通常允许可靠的靶蛋白的定位、抗体的质量以及靶蛋白质在双染色法中被证实，所述双染色法除染色靶蛋白质外也染色其定位已经在文献中有描述的偶联氨基酸标志物或其它标志物蛋白质。GFP及其衍生物代表了能被直接激活并且自身会发荧光的一个特殊情况。能通过去污剂的使用来控制的膜通透性允许在免疫荧光法中证明一个免疫原性抗原是位于细胞内还是细胞外。所选蛋白质的预报因而有试验的支持。另外一个可能性是依靠流式细胞仪检测细胞外结构域。为了这个目的，细胞在非通透化的条件下被固定(例如，用PBS/叠氮钠/0.2％胎牛血清/5mM EDTA)并且依照厂商的说明书用流式细胞仪进行分析。
只有细胞外的抗原决定簇才能通过这个分析方法被抗体识别。免疫荧光的不同就是有可能使用例如碘化丙锭或台盼蓝区别死或活细胞，并且因而避免假阳性结果。

[0334] 亲和纯化

[0335] 多克隆血清的纯化在肽抗体的情况下完全或者在抗重组蛋白质的情况下部分由合同公司提供服务来进行。为了这个目的，在两种情况下，合适的肽或重组蛋白质共价结合到基质上，并且后者在偶联后用天然缓冲液(native buffer)(PBS：磷酸盐缓冲液)平衡，然后与粗制血清孵育。PBS进一步清洗步骤后，抗体用100mM甘氨酸pH 2.7洗脱，并且立即用2M TRIS，pH8中和洗脱液。这样纯化的抗体然后能用于通过Western印迹和免疫荧光法的靶蛋白质的特异性检测。

[0336] EGFP转染体的制备

[0337] 为了免疫荧光显微镜检测异源性表达的肿瘤相关抗原，抗原的完全ORF被克隆进pEGFP-C1和pEGFP-N3载体(Clontech)中。培养在玻片上的CHO和NIH3T3细胞用Fugene转染试剂(Roche)依照厂商的说明书被转染了合适的质粒构建体，并且12-24小时后，用免疫荧光显微镜进行分析。

[0338] 实施例1：GPR35作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0339] GPR35(SEQ ID NO：1)及其翻译产物(SEQ ID NO：9)被描述为推测的G蛋白偶联受体。其序列发表在基因库登记号(accession No.)为AF089087之下。该转录体编码一个309个氨基酸分子量为34kDa的蛋白质。预报GPR 35属于有7个跨膜结构域的G蛋白质偶联受体超家族(O’Dowd等人，Genomics 47：310-13，1998)。为了证实预报的GPR 35细胞内定位，蛋白质与作为报告分子的eGFP相融合，并且在合适的质粒转染后异源性地在293细胞中表达。然后荧光显微镜下分析其定位。根据本发明证实GPR35是整合跨膜分子(图17)。目前对人类GPR35的调查(参见，尤其是Horikawa Y，Oda N，Cox NJ，Li X，Orho-MelanderM，Hara M，Hinokio Y，Lindner TH，Mashima H，Schwarz PE，delBosque-Plata L，Horikawa Y，Oda Y，Yoshiuchi I，Colilla S，Polonsky KS，Wei S，Concannon P，Iwasaki N，Schulze J，Baier LJ，Bogardus C，Groop L，Boerwinkle E，Hanis CL，Bell GI Nat Genet.2000Oct；26(2)：163-75)提示GPR35在许多健康组织中是被激活的。基因的阅读框包含一个外显子。
根据本发明，为了分析以扩增结肠中和结肠癌(13/26)中的cDNA，GPR35的基因特异性引物对(SEQ ID NO：20，21)被用于RT-PCR。相反，在其它的正常组织中未检测到显著表达。
因为GPR 35由一个外显子组成的特定的事实，基因组DNA杂质不能用跨内含子的引物来检测。为了排除RNA样品中基因组的污染，所以所有的RNA用DNAse处理。使用无DNA的RNA，GPR35转录物根据本发明只有在结肠、在直肠、在睾丸和在结肠癌中检测的到。

[0340] 表1.GPR 35在正常组织中的表达

[0341]正常组织 表达
脑 -
小脑 -
心肌 -
骨骼肌 -
直肠 ++
胃 -
结肠 ++
胰腺 -
肾 -
睾丸 -
胸腺 -
乳腺 -
卵巢 -
子宫 未测定
皮肤 -
肺 -
甲状腺 -
淋巴结 -
脾 -
外周血单核细胞 -
肾上腺 -
食道 -
小肠 +
前列腺 -

[0342] GPR35转录物在正常结肠组织和在结肠癌活检组织中选择性和高水平的表达(图1)以前并不为人所知，并且根据本发明能用于分子诊断方法例如RT-PCR，以用来检测血清和骨髓中播散的肿瘤细胞以及检测其它组织中的转移灶。用特异性引物(SEQ ID NO：88和
89)的定量RT-PCR也证实GPR35是高选择性的肠道特异性分化抗原，在肠道肿瘤和肠道肿瘤转移灶中也含有GPR 35。与正常肠道相比，在一些肠道肿瘤中，它实际上过度表达一个对数数量级(图18)。抗体通过免疫兔生产，用于检测GPR35蛋白质。下列肽被用于生产(propagate)这些抗体：

[0343] SEQ ID NO：90GSSDLTWPPAIKLGC(氨基酸9-23)

[0344] SEQ ID NO：91：DRYVAVRHPLRARGLR(氨基酸112-127)

[0345] SEQ ID NO：92：VAPRAKAHKSQDSLC(羧基端)

[0346] SEQ ID NO：93CFRSTRHNFNSMR(细胞外，结构域2)

[0347] 例如在Western印迹中用这些抗体染色证实了肿瘤中的表达。GPR 35的所有4个细胞外结构域(预报的细胞外结构域的位置在序列SEQ ID NO：9之中氨基酸1-22(SEQ ID NO：94)；氨基酸81-94(SEQ ID NO：95)；氨基酸156-176(SEQ ID NO：96)；氨基酸280-309(SEQ ID NO：97))根据本发明可被用作单克隆抗体的靶结构。这些抗体与肿瘤细胞的细胞表面特异性结合，并且既可被用于诊断方法也可被用于治疗方法。GPR35在肿瘤中的过度表达为这样的用途提供了额外的支持。另外，编码蛋白质的序列根据本发明能被用作疫苗(RNA、DNA、肽、蛋白质)，用来诱导肿瘤特异性的免疫反应(T细胞和B细胞介导的免疫反应)。另外，还很惊人的发现在一般已知的起始密码子5’端前还有一个起始密码子，并且表达一个氨基端延长的蛋白质。

[0348] 因而根据本发明发现GPR 35，一个以前被描述为广泛表达的蛋白质，是肿瘤相关过度表达的，选择性地在胃肠道肿瘤中过度表达，尤其是结肠的肿瘤。GPR35所以适合作为尤其是用于诊断和治疗这些肿瘤的分子靶结构。目前对人类GPR35的调查，参见例如Horikawa Y，Oda N，CoxNJ，Li X，Orho-Melander M，Hara M，Hinokio Y，Lindner TH，MashimaH，Schwarz PE，del Bosque-Plata L，Horikawa Y，Oda Y，YoshiuchiI，Colilla S，Polonsky KS，Wei S，Concannon P，Iwasaki N，SchulzeJ，Baier LJ，Bogardus C，Groop L，Boerwinkle E，Hanis CL，BellGI Nat Genet.2000Oct；26(2)：163-75提示GPR 35在许多健康组织中是被激活的。相反，根据本发明的调查显示GPR35惊人地在多数正常组织中并不能明显地检测到，并且与此相反，在原发和转移性的结肠肿瘤被高度激活。另外，除了所述的GPR35序列，根据本发明发现了一个使用另外一个起始密码子的全新的翻译变异体(SEQ ID NO：10)。

[0349] GPR35是G偶联受体(GPCR)组的一员，GPCR是一个非常大的蛋白质家族，其结构和功能已经被非常详尽地调查。GPCR显著地适合作为靶结构来开发药物活性物质，因为为此必须的方法(例如受体表达、纯化、配体筛选、诱变处理、功能性抑制、激动剂配体和拮抗剂配体的选择、配体的放射性标记)都已经发展得非常好并且有详细的描述，参见例如，“G Protein-Coupled Receptors”，Tatsuya Haga，Gabriel Berstein和Gabriel Bernstein ISBN：0849333849和“Identification andExpression of G-Protein Coupled Receptors Receptor Biochemistryand Methodology”，Kevin R.Lynch ASIN：0471183105。根据本发明对GPR35在多数健康组织中不能被检测到，但是在细胞表面有肿瘤相关表达的认识，使其能够被用作例如药物活性配体的肿瘤相关靶结构，尤其是与例如放射活性分子相结合被用作药物物质。在特定的实施方案中，有可能使用结合于GPR35的放射标记的配体用来检测肿瘤细胞或者用来体内治疗结肠肿瘤。

[0350] 实施例2：GUCY2C在肝和卵巢肿瘤中的鉴别以及新型GUCY2C剪接变异体作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0351] 鸟苷酸环化酶2C(SEQ ID NO：2；翻译产物：SEQ ID NO：11)-一种I型跨膜蛋白-属于利钠尿肽受体家族。序列发表在基因库注册号NM_004963之下。肽类鸟苷蛋白和尿鸟苷蛋白(uroguanylin)或者热稳定性肠毒素(STa)的结合增加细胞内cGMP的浓度，因而诱导细胞内的信号转导过程。

[0352] 最近的调查指出GUCY2C的表达也延伸到肠外区域，例如胃和食道的原发性和转移性腺癌(Park等人，Cancer Epidemiol BiomarkersPrev.11：739-44，2002)。在正常和转化的肠道组织中都发现的GUCYC剪接变异体包含了外显子1中一个142bp的缺失，因而阻止了GUCY2C样产物的翻译(Pearlman等人，Dig.Dis.Sci.45：298-05，2000)。至今描述的唯一剪接变异体导致没有翻译产物。

[0353] 根据本发明目的是鉴别能被用于诊断和被用于治疗的GUCY2C的肿瘤相关剪接变异体。

[0354] 用GUCY2C特异性引物对(SEQ ID NO：22，23，98，99)的RT-PCR调查显示GUCY2C转录物在正常结肠和胃的显著表达，以及在肝、睾丸、卵巢、胸腺、脾、脑和肺中的微弱表达(表2，图19)。在结肠和胃中的表达比所有其它正常组织高至少50倍。显著的GUCY2C转录物水平在结肠癌和胃癌中能检测到(表2)。这些结果通过定量PCR分析被阐述，并且显示在正常结肠、回肠和几乎所有被调查的结肠癌样品中有显著的GUCY2C表达(图2，19B)。整块的过度表达在一些结肠癌样品中可检测到。另外，在7/10胃肿瘤中发现有表达。我们还惊讶地发现在很多其它以前未描述的肿瘤中，其中有卵巢、乳腺、肝和前列腺的肿瘤中，所述基因被激活(图19B，表2)。

[0355] 表2：GUC2C在正常和肿瘤组织中的表达

[0356]正常组织 表达
脑 +
小脑
心肌
骨骼肌 -
心肌
胃 +++
结肠 +++
胰腺 -
肾 -
肝 +
睾丸 ++
胸腺 +
乳腺 -
卵巢 +
子宫 +
皮肤
肺 +
甲状腺
淋巴结 -
脾 +
外周血单核细胞 -
前列腺 -

[0357]肿瘤类型 表达
结肠癌 +++
胰腺癌 -
食道癌 -
胃癌 +++
支气管癌 -
乳腺癌 -+
卵巢癌 +
子宫内膜癌
耳鼻喉肿瘤
肾细胞癌
前列腺癌 +
肝癌 +

[0358] 下列的引物对被用于检测结肠组织和结肠癌组织中的剪接变异体：

[0359] GUCY2C-118s/GUCY2C-498如(SEQ ID NO：24，29)；

[0360] GUCY2C-621s/GUCY2C-1140如(SEQ ID NO：25，30)；

[0361] GUCY2C-1450s/GUCY2C-1790如(SEQ ID NO：26，31)；

[0362] GUCY2C-1993s/GUCY2C-2366如(SEQ ID NO：27，32)；

[0363] GUCY2C-2717s/GUCY2C-3200如(SEQ ID NO：28，33)；

[0364] GUCY2C-118s/GUCY2C-1140如(SEQ ID NO：24，30)；

[0365] GUCY2C-621s/GUCY2C-1790如(SEQ ID NO：25，31)；

[0366] GUCY2C-1450s/GUCY2C-2366如(SEQ ID NO：26，32)；

[0367] GUCY2C-1993s/GUCY2C-3200如(SEQ ID NO：27，33)。

[0368] 在调查结肠癌组织中剪接变异体的时候，三个以前未知的形式根据本发明被鉴别出来。

[0369] a)外显子3(SEQ ID NO：3)的缺失，导致GUCY2C的变异体只有111个氨基酸长，并且在其111位置的天冬氨酸被替换为脯氨酸。

[0370] b)外显子6(SEQ ID NO：4)的缺失，产生一个258个氨基酸长的表达产物。这将产生包含13个氨基酸的羧基端新抗原决定簇。

[0371] c)一个变异体，其中位置在1606-1614的核苷酸以及相应的氨基酸L(536)、L(537)和Q(538)被缺失(SEQ ID NO：5)。

[0372] 根据本发明分别在外显子3和外显子6(SEQ ID NO：3，4)缺失的剪接变异体尤其由于翻译产物没有跨膜结构域而有区别。在外显子6缺失的情况下，得到一个13个氨基酸的羧基端新抗原决定簇，它与任何以前已知的蛋白质无同源性。这个新抗原决定簇因而注定是免疫治疗的靶结构。在位置1606-1614有碱基缺失(SEQ ID NO：5)的本发明的剪接变异体及其翻译产物(SEQ ID NO：14)同样地包含新抗原决定簇。用于检测GUCY2C蛋白质的抗体通过免疫兔来生产。下列肽用于生产这些抗体：

[0373] SEQ ID NO：100：HNGSYEISVLMMGNS(氨基酸31-45)

[0374] SEQ ID NO：101：NLPTPPTVENQQRLA(氨基酸1009-1023)

[0375] 这样的抗体主要能用于诊断和治疗的目的。

[0376] 尤其是GUCY2C细胞外结构域(来自SEQ ID NO：11：氨基酸454-1073(SEQ ID NO：102)的序列的预报的细胞外结构域之位置)根据本发明能被用作单克隆抗体的靶结构。然而，结构预报有点不明确并且未被试验核实，所以其它的膜定向也是可以想象的。在这种情况下，氨基酸1-431将在细胞外并且适合作为单克隆抗体的出发点。这些抗体与肿瘤细胞的细胞表面特异性结合，并且能被用于诊断和用于治疗的方法。GUCY2C尤其在结肠肿瘤中的过度表达，给这样的用途提供了额外的支持。编码蛋白质的序列还能根据本发明被用作疫苗(RNA、DNA、肽、蛋白质)，用来诱导肿瘤特异性免疫反应(T细胞和B细胞介导的免疫反应)。

[0377] 还有可能依照GUCY2C分子的细胞功能根据本发明开发可调节肿瘤细胞上酶的功能的物质，尤其是小分子物质。酶反应的产物，cGMP，是有各种各样功能的已知的细胞信号分子(Tremblay等人.Mol CellBiochem 230，31)。

[0378] 实施例3：SCGB3A2作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0379] SCGB3A2(SEQ ID NO：6)( 翻 译 产 物：SEQ ID NO：15) 属 于 分 泌 球 蛋白(secretoglobin)基因家族。这个序列发表在基因库注册号NM_054023之下。SCGB3A2(UGPR1)是同源二聚体的分泌蛋白质，大小为17kDa，它只在肺中和气门中表达(Niimi等人，Am J Hum Genet 70：718-25，2002)。用引物对(SEQ ID NO：37，38)的RT-PCR调查证实在正常肺组织中的选择性表达。例如编码表面活性蛋白质的肺和气管特异性基因，在恶性肿瘤去分化过程中高度下调并且在肺肿瘤中通常检测不到。惊人地发现SCGB3A2在原发性和转移性肺肿瘤中有活性。根据本发明的调查显示SCGB3A2在支气管癌中有很强地并且频繁地表达(图4)。除了肺和支气管外，被检测的所有其它23个正常组织，未显示表达(参见图20)。

[0380] 这另外在特异性定量RT-PCR(SEQ ID NO：103，104)中被证实(图20)，它另外显示至少在超过50％的支气管癌中过度表达至少一个数量级。

[0381] SCGB3A2在正常肺组织中和肺癌活检组织中选择性并且高水平的表达根据本发明能被用于分子诊断方法，例如RT-PCR，用来检测在血和骨髓、唾液、支气管吸出物或灌洗物中散布的肿瘤细胞以及用来检测其它组织例如局部淋巴结中的转移灶。在健康肺中，SCGB3A2由专门的细胞只分泌到支气管中。相应地，不期望SCGB3A2蛋白质将在健康个体呼吸道外的体液中检测到。相反，尤其是转移的肿瘤细胞直接分泌它们的蛋白质产物到血流中。本发明的一个方面所以涉及通过特异性抗体试验检测患者的血清或血浆中SCGB3A2产物，作为肺肿瘤的诊断性发现。

[0382] 用于检测SCGB3A2蛋白质的抗体通过免疫兔来生产。下列肽被用于生产这些抗体：

[0383] SEQ ID NO：105：LINKVPLPVDKLAPL

[0384] SEQ ID NO：106：SEAVKKLLEALSHLV

[0385] SCGB3A2特异性的反应在免疫荧光法中可检测到(图21)。对于分泌的蛋白如期望的，SCGB3A2在细胞的分布被指定在内质网和分泌颗粒(图21A)。为了检查特异性，细胞被并列地转染了合成SCGB3A2-GFP融合蛋白质的质粒。在这个情况下，蛋白质的监测通过自发荧光的GFP(绿荧光蛋白)来进行(图21B)。两个荧光图的叠加清楚地显示免疫血清特异性地识别SCGB3A2蛋白质(图21C)。

[0386] 这样的抗体根据本发明能被用于例如用于诊断和治疗目的的免疫试验中。

[0387] 实施例4：claudin-18A1和claudin18A2剪接变异体作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0388] Claudin-18基因编码具有4个跨膜结构与和细胞内氨基端和羧基端的表面膜分子。Niimi和同事(Mol.Cell.Biol.21：7380-90，2001)描述了鼠和人类claudin-18的两个剪接变异体，所述变异体在已经被描述为分别在肺组织中(claudin-18A1)和胃组织中(claudin-18A2)有选择性的表达。这些变异体在氨基端不同(图22)。

[0389] 根据本发明调查了剪接变异体claudin-18A2(SEQ ID NO：7)和claudin-18A1(SEQ ID NO：117)以及他们各自的翻译产物(SEQ ID NO：16and 118)被用作肿瘤的标志物或肿瘤治疗的靶结构到何种程度。能区别两个变异体的定量PCR通过选择A1特异性(SEQ ID NO：109&110)和A2特异性(SEQ ID NO：107&108)的引物对被建立。A2剪接变异体还用第二对引物以传统PCR(SEQ ID NO：39&40)进行测试。A1变异体被描述为只在正常肺中有活性。然而，根据本发明惊人地发现A1变异体在胃粘膜中也有活性。胃和肺是唯一显示有显著激活的正常组织。所有其它的正常组织claudin-A1阴性。在调查肿瘤的时候，惊人地发现claudin-A1在大量的肿瘤组织中被高度激活。在胃肿瘤、肺肿瘤、胰腺癌、食道癌(图23)、耳鼻喉肿瘤和前列腺癌中发现了特别强的表达。Claudin-A1的表达水平在耳鼻喉、前列腺、胰腺和食道肿瘤中比相应的正常组织中的水平高100-10000倍。用于调查claudin-A2剪接变异体的寡聚核苷酸特异性地使这个转录物能被扩增(SEQ ID NO：39&40和107&108)。调查揭示A2变异剪接体在被调查的除胃粘膜外的20多个正常组织中无表达，并且还在睾丸组织中有少量表达。我们发现A2变异体还象A1变异体一样，在很多肿瘤中被激活(经由图24中的实施例有描绘)。这些包括胃肿瘤(8/10)、胰腺肿瘤(6/6)、食道癌(5/10)和肝癌。尽管claudi n-18A2的激活在健康肺中未检测到，却惊人地发现一些肺肿瘤表达A2.1剪接变异体。

[0390] 表3A.claudin-18A2在正常和肿瘤组织中的表达

[0391]正常组织 表达
脑 -
小脑 -
心肌 -
骨骼肌 -
子宫内膜 -
胃 +++
结肠 -
胰腺 -
肾 -
肝 -
睾丸 +
胸腺 -
乳腺 -
卵巢 -
子宫 -
皮肤 -
肺 -
甲状腺 -
淋巴结 -
脾 -
外周血单核细胞 -
食管 -

[0392]肿瘤类型 表达
结肠癌 -
胰腺癌 ++
食道癌 ++
胃癌 +++
支气管癌 ++
乳腺癌 -
卵巢癌 -
子宫内膜癌 n.i.
耳鼻喉肿瘤 ++
肾细胞癌 -
前列腺癌 -

[0393] 表3B.claudin-18A1在正常和肿瘤组织中的表达

[0394]正常组织 表达
脑 -
小脑 -
心肌 -
骨骼肌 -
子宫内膜 -
胃 +++
结肠 -
胰腺 -
肾 -
肝 -
睾丸 +
胸腺 -
乳腺 -
卵巢 -
子宫 -
皮肤 -
肺 +++
甲状腺 -
淋巴结 -
脾 -
外周血单核细胞 -
食管 -

[0395]肿瘤类型 表达
结肠癌 -
胰腺癌 ++
食道癌 ++
胃癌 +++
支气管癌 ++
乳腺癌 +
卵巢癌 n.i.
子宫内膜癌 n.i.
耳鼻喉肿瘤 ++
肾细胞癌 -
前列腺癌 ++

[0396] 作为独立的对照调查的传统PCR也证实了定量PCR的结果。用于传统PCR的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：39，40)允许A2剪接变异体的特异性扩增。根据本发明显示8/10的胃癌以及一半的被测试的胰腺癌显示了这个剪接变异体的强表达(图5)。相反，表达用传统PCR在其它组织中未检测到。尤其是，在肺、肝、血、淋巴结、乳腺组织和肾组织没有表达(表3)。

[0397] 剪接变异体因而根据本发明代表了高度特异性于上胃肠道肿瘤以及肺肿瘤、耳鼻喉肿瘤、前列腺癌和它们的转移灶的分子标志物。这些分子标志物根据本发明能被用于检测肿瘤细胞。根据本发明用所述的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：39，40，107-110)检测肿瘤是可能的。尤其合适的寡聚核苷酸是至少其中一个在严格条件下结合于转录物的片段的引物对，所述片段180个碱基对长并且特异于一个(SEQ ID NO：8)或另一个剪接变异体(SEQ ID NO：119)。

[0398] 为了在蛋白质水平证实这些数据，claudin特异性抗体和免疫血清通过免疫动物来产生。Claudin-18的浆膜定位和蛋白质的拓扑结构通过用生物信息工具(TMHMM，TMPRED)对跨膜结构域的分析以及表达附有增强的GFP标签的claudin-18融合蛋白质的细胞之免疫荧光调查而得到证实。Claudin-18具有两个细胞外结构域。两个剪接变异体中氨基端细胞外结构的序列不同(对于A1 SEQ ID NO：111以及对于A2SEQ ID NO：112)。两个变异体羧基端细胞外结构域一样(SEQ ID NO：137)。至今，未有结合于claudin-18细胞外结构域的抗体的描述。根据本发明，定位于细胞外并特异于变异体A1或A2的或出现在两个变异体中的肽抗原决定簇被选择用于免疫。Claudin-18的两个变异体没有传统的糖基化基序，所以并不期望有蛋白质的糖基化。然而，在抗原决定簇的选择中要考虑到包含天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸的抗原决定簇即便没有传统的糖基化位点在罕见的情况下有可能被糖基化。抗原决定簇的糖基化可以阻止特异于该抗原决定簇的抗体的结合。特别地，根据本发明选择抗原决定簇，所以由此产生的抗体允许抗原的糖基化状态可被区别出来。下列肽特别地被选择用于生产为了免疫的抗体：

[0399] SEQ ID NO：17：DQWSTQDLYN(氨基端细胞外结构域，A2特异性的，结合不依赖于糖基化)

[0400] SEQ ID NO：18：NNPVTAVFNYQ(氨基端细胞外结构域，A2特异性的，主要与非糖基化形式结合，N37)

[0401] SEQ ID NO：113：STQDLYNNPVTAVF(氨基端细胞外结构域，A2特异性的，只与非糖基化形式结合，N37)

[0402] SEQ ID NO：114：DMWSTQDLYDNP(氨基端细胞外结构域，A1特异性的)

[0403] SEQ ID NO：115：CRPYFTILGLPA(氨基端细胞外结构域，主要特异于A1的)[0404] SEQ ID NO：116：TNFWMSTANMYTG(羧基端细胞外结构域，识别A1和A2)。

[0405] 经由实施例显示了用SEQ ID NO：17免疫产生的A2特异性抗体的数据。特异性抗体在不同的固定条件能被用于免疫荧光调查。用RT-PCR阳性和阴性细胞系的比较染色，很容易检测到的量的相应的蛋白质在胃癌细胞系中能被特异性地检测到，代表阳性(图25)。内源性蛋白质是定位于膜的并且在膜上形成相对大的局灶聚集体(focal aggregates)。这个抗体又可用于Western印迹中蛋白质的检测。如期望地，蛋白质只在胃中而不在其它正常组织中可检测到，甚至在肺中也没有(图29)。来自患者的胃肿瘤和邻近的正常胃组织的比较染色惊人地揭示claudin-18A2在所有可检测到此种蛋白质的胃肿瘤中有较小的质量(图30左)。根据本发明在一系列试验中发现当正常胃组织的裂解物用去糖基试剂PNGaseF处理时，在该水平也出现一个条带(图30右)。尽管只有A2变异体的糖基化形式在所有正常胃组织中可检测到，A2在多于60％被调查的胃癌中可检测到，尤其是只有去糖基化形式的A2。虽然claudin-18的A2变异体甚至在蛋白质水平也没有在正常肺中检测到，但是和以前定量RT-PCR发现的一样，它在支气管癌中被发现。仍然只有去糖基化的变异体存在(图31)。识别claudin-18-A2剪接变异体的细胞外结构域的抗体根据本发明本已经被生产。另外，选择形识别claudin-18-A1剪接变异体的氨基端结构域的抗体(图28)以及结合于两个变异体羧基端细胞外结构域的区域的抗体(图27)已经被生产。有可能根据本发明为了诊断的目的例如免疫组织学(图32)，也为了上面解释的治疗目的使用这样的抗体。
深一层重要的方面涉及claudin-18差异糖基化的结构域。只与非糖基化抗原决定簇结合的抗体根据本发明被生产。Claudin-18本身是对胃组织(A2)和对肺和胃(A1)高选择性的分化抗原。因为它明显地受肿瘤内糖基化机器(machinery)改变的影响，所以A2的一个特定的去糖基化的变异体在肿瘤内产生。这能被用于诊断和治疗。免疫血清例如这里描述的一个(抗SEQ ID NO：17的肽)能被用于诊断例如用在Western印迹中。如例如用SEQ ID NO：113的肽免疫得到的完全不能结合于糖基化的抗原决定簇的抗体(图26)，能在结合上区别肿瘤组织和正常组织。因为它们的高度选择性，尤其有可能治疗性地采用这样的抗体。
产生的抗体还能直接用于产生嵌合的或人源化的重组抗体。这还能直接用得自于兔的抗体来进行(关于这个，见JBiol Chem.2000May 5；275(18)：13668-76，Rader C，Ritter G，NathanS，Elia M，Gout I，Jungbluth AA，Cohen LS，Welt S，Old LJ，BarbasCF 3rd.“The rabbit antibody repertoire as a novel source forthe generation of therapeutic human antibodies”)。为了这个目的，来自接受免疫的动物的淋巴细胞被保存。氨基酸
1-47(SEQ ID NO：19和120)也代表了用于免疫治疗方法例如疫苗和抗原特异性T淋巴细胞的过继性转移的抗原决定簇。

[0406] 实施例5：SLC13A1作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0407] SLC13A1属于钠硫酸盐共转运蛋白家族。与此基因的小鼠同源物相反，人类基因选择性地表达于肾(Lee等人，Genomics 70：354-63)。SLC13A1编码一个595个氨基酸的蛋白质并且包含13个推测的跨膜结构域。选择性的剪接导致4个不同的转录物(SEQ ID NO：41-44)及其相应的翻译产物(SEQ ID NO：45-48)。对SLC13A1是否能用作肾肿瘤的标志物进行了调查。能特异性扩增SLC13A1的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：49，50)被用于此目的。

[0408] 表4.SLC13A1在正常和肿瘤组织中的表达

[0409]正常组织 表达
脑 -
小脑 未测定
心肌 未测定
骨骼肌 未测定
子宫内膜 -
胃 -
结肠 -
胰腺 未测定
肾 +++
肝 -
睾丸 +
胸腺 -
乳腺 -
卵巢 -
子宫 未测定
皮肤 未测定
肺 -
甲状腺 -
淋巴结 -
脾 -
外周血单核细胞 -
乙状结肠 -
食管 -

[0410]肿瘤类型 表达
结肠癌 未测定
胰腺癌 未测定
食道癌 未测定
胃癌 未测定
支气管癌 未测定
乳腺癌 未测定
卵巢癌 未测定
子宫内膜癌 未测定
耳鼻喉肿瘤 未测定
肾细胞癌 +++
前列腺癌 未测定

[0411] 用SLC13A1特异性引物对的RT-PCR调查证实在肾中实际上选择性的表达，并且根据本发明显示了实际上在所有(7/8)被调查的肾细胞癌活检组织中的高表达(表4，图6)。用特异性引物(SEQ ID NO：121，122)的定量PCR也证实了这些数据(图34)。微弱的信号在下列正常组织中可检测到：结肠、胃、睾丸、乳腺、肝和脑。然而，在肾癌中的表达至少比在所有其它正常组织中高至少100倍。

[0412] 为了分析SLC13A1在细胞内的亚细胞定位，将蛋白质与作为报告分子的eGFP融合，并且在合适质粒的转染后异源性地表达于293细胞中。其定位在荧光显微镜下进行分析。我们的数据令人印象深刻地证实了SLC13A1是一个整合跨膜分子(图35)。

[0413] 用于检测SLC13A1蛋白质的抗体通过免疫兔而产生。SEQ ID NO：123和124的肽被用于生产这些抗体。这样的抗体主要被用于诊断和治疗目的。

[0414] SLC13A1蛋白质具有13个跨膜结构域和7个细胞外区域。SLC13A1的这些细胞外结构域根据本发明尤其能被用作单克隆抗体的靶结构。SLC13A1作为通道蛋白质参与离子的转运。SLC13A1的细胞外结构域在健康肾中极性地被定向而朝着尿道的方向(腔膜方向地)。然而，用于治疗的高分子量的单克隆抗体不被分泌到尿道内，所以在健康肾中抗体不与SCL13A1结合。相反，肿瘤细胞内SLC13A1的极性被取消，通过血流直接就可得到为抗体靶点的蛋白质。SCL13A1在肾细胞癌中的显著表达和高发生率使得该蛋白质根据本发明成为高度引人注目的诊断和治疗标志物。这包括根据本发明依靠RT-PCR在血清、骨髓、尿中散布的肿瘤细胞的检测以及其他器官中转移灶的检测。还有可能根据本发明依靠单克隆抗体将SLC13A1的细胞外结构域用作免疫诊断和治疗的靶结构。SLC13A1根据本发明还能被用作疫苗(RNA、DNA、蛋白质、肽)以诱导肿瘤特异性的免疫反应(T和B细胞介导的免疫反应)。这根据本发明还包括调节SLC13A1生物活性并能用于治疗肾肿瘤的所谓小分子化合物的开发。

[0415] 实施例6：CLCA1作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0416] CLCA1(SEQ ID NO：51；翻译产物：SEQ ID NO：60)属于钙离子激活的氯通道家族。序列发表在基因库注册号NM-001285之下。CLCA1只表达在肠腺上皮中和杯状细胞中(Gruber等人，Genomics54：200-14，1998)。对CLCA1是否能被用作结肠和胃癌的标志物进行了调查。为了这个目的，使用了能使CLCA1特异性扩增的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：67，68)。用这个引物对的RT-PCR调查证实了在结肠中的选择性表达，并且根据本发明显示在(3/7)被调查的结肠和(1/3)被调查的胃癌样品中的高度表达(图7)。其它的正常组织未显示或仅有很微弱的表达。这还用特异性定量RT-PCR(SEQ ID NO：125，126)被证实，其中在被分析的正常组织中未能检测到CLCA1的表达(图36)。在该试验中调查的肿瘤样品中，
6/12结肠癌样品和5/10胃癌样品CLCA1阳性。总的说来，该基因在肿瘤中的表达似乎是失控的。除了有非常强表达的样品外，CLCA1在其它的样品中被显著下调。

[0417] 所述蛋白质被预报具有4个跨膜蛋白结构域，共有2个细胞外区域。CLCA1的这些细胞外结构域尤其根据本发明能被用作单克隆抗体的靶结构。

[0418] CLCA1在胃癌和结肠癌中的显著表达和高发生率使得该蛋白质根据本发明成为引人注目的诊断和治疗标志物。这根据本发明包括依靠RT-PCR对血清、骨髓、尿中散布肿瘤细胞的检测以及其他器官中转移灶的检测。还有可能根据本发明依靠单克隆抗体将CLCA1的细胞外结构域用作免疫诊断和治疗的靶结构。CLCA1还根据本发明能被用作疫苗(RNA、DNA、蛋白质、肽)以诱导肿瘤特异性的免疫反应(T和B细胞介导的免疫反应)。这根据本发明还包括调节CLCA1生物活性并能被用于治疗胃肠道肿瘤的所谓小分子化合物的开发[0419] 实施例7：FLJ21477作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0420] FLJ21477(SEQ ID NO：52)及其预报的翻译产物作为假设蛋白发表在基因库注册号NM_025153之下。它是一个整合膜蛋白质，具有ATPase活性和4个跨膜结构域，因此适合用与特异性抗体的治疗。用FLJ21477特异性引物(SEQ ID NO：69，70)的RT-PCR调查显示在结肠中的选择性表达，以及还在(7/12)被调查的结肠癌样品中不同水平的表达(图8)。其它正常组织未显示有表达。这还被特异性定量RT-PCR(SEQ ID NO：127，128)所证实。FLJ21477特异性的表达在结肠中(图37A)和11/12的结肠癌中都能检测到。除了在结肠组织有表达外，表达还可在胃组织中检测到。另外，在定量RT-PCR的条件下，脑、胸腺和食道中检测到的表达要显著弱于结肠和胃(图37A)。此外，还有可能在下列的肿瘤样品中检测FLJ21477的特异性表达：胃、胰腺、食道和肝。所述蛋白质被预报具有4个跨膜蛋白结构域，共有2个细胞外区域。FLJ21477的这些细胞外结构域尤其根据本发明能被用作单克隆抗体的靶结构。胃癌和结肠癌中FLJ21477的显著表达和高发生率使得该蛋白质根据本发明成为有价值的诊断和治疗标志物。这根据本发明包括依靠RT-PCR对血清、骨髓、尿中散布肿瘤细胞的检测以及其他器官中转移灶的检测。另外，CLCA1的细胞外结构域根据本发明依靠单克隆抗体能用作免疫诊断和治疗的靶结构。另外，FLJ21477的细胞外结构域根据本发明能被用作疫苗(RNA、DNA、蛋白质、肽)以诱导肿瘤特异性的免疫反应(T和B细胞介导的免疫反应)。

[0421] 实施例8：FLJ20694作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0422] FLJ20694(SEQ ID NO：53)及其翻译产物(SEQ ID NO：62)作为假设蛋白发表在基因库注册号NM_017928之下。该蛋白质是一个整合跨膜分子(跨膜结构域氨基酸33-54)，很可能具有硫氧化还原蛋白功能。用FLJ20694特异性引物(SEQ ID NO：71，72)的RT-PCR调查显示在结肠中的选择性表达，以及还在(5/9)被调查的结肠癌样品中不同水平的表达(图9)。其它正常组织未显示有表达。这还被特异性定量RT-PCR(SEQ ID NO：129，130)所证实(图38)。FLJ29694的表达在除结肠和胃以外的任何其它正常组织中未检测到(在第一个试验中未分析)。

[0423] 所述蛋白质被预报具有一个跨膜结构域，一个细胞外区域。FLJ20694的这些细胞外结构域尤其根据本发明能被用作单克隆抗体的靶结构。

[0424] 另外，FLJ20694根据本发明能被用作疫苗(RNA、DNA、蛋白质、肽)以诱导肿瘤特异性的免疫反应(T和B细胞介导的免疫反应)。这根据本发明还包括调节FLJ20694生物活性并能用于治疗胃肠道肿瘤的所谓小分子化合物的开发。

[0425] 实施例9：von Ebner蛋白(c20orf114)作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别[0426] Von Ebner蛋白(SEQ ID NO：54)及其翻译产物(SEQ ID NO：63)被当作上气道的和鼻咽上皮的Plunc相关蛋白发表在基因库注册号AF364078之下。根据本发明对von Ebner蛋白是否能被用作肺癌的标志物进行调查。为此目的使用了能使Ebner蛋白特异性扩增的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：73，74)。用这个引物对的RT-PCR调查显示在肺和在(5/10)被调查的肺癌样本中的选择性表达(图10)。在正常组织这组中，胃中也有表达。其它正常组织未显示有表达。

[0427] 实施例10：Plunc作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0428] Plunc(SEQ ID NO：55)及其翻译产物(SEQ ID NO：64)被发表在基因库注册号NM_016583之下。人类Plunc编码一个256个氨基酸的蛋白质，并且显示与鼠Plunc蛋白质有72％的同源性(Bingle和Bingle，BiochemBiophys Acta1493：363-7，2000)。Plunc的表达被限制在气管、上气道、鼻咽上皮和唾液腺。

[0429] 根据本发明对Plunc是否能被用作肺癌的标志物进行调查。为此目的使用了能使Plunc蛋白特异性扩增的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：76)。

[0430] 用这个引物对的RT-PCR调查显示在胸腺、在肺和在(6/10)被调查的肺癌样品中的选择性表达(图11)。其它正常组织未显示有表达。

[0431] 实施例11：SLC26A9作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0432] SLC6A9(SEQ ID NO：56)及其翻译产物(SEQ ID NO：65)被发表在基因库注册号NM_134325之下。SLC26A9属于阴离子交换蛋白家族。SLC26A9的表达被限制在肺的小支气管和肺泡上皮(Lohi等人，J Biol Chem277：14246-54，2002)。

[0433] 对SLC26A9是否能用作肺癌的标志物进行调查。为此目的使用能特异性扩增SLC26A9的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：77，78)。用SLC26A9特异性引物(SEQ ID NO：77，78)的RT-PCR调查显示在肺和在所有(13/13)被调查的肺癌样品中的选择性表达(图12)。除甲状腺外，其它的正常组织未显示有表达。在定量RT-PCR试验中用SEQ ID NO：131和132首次有可能证实这些结果，并且获得额外的信息。有可能在肺、结肠、胰腺和胃肿瘤的4-5个肿瘤组织的合并样品中检测到高表达水平的SLC26A9特异性RNA。SLC26A9是跨膜阴离子转运蛋白家族的一员。在健康肺中，所述蛋白质朝着气道的方向被定向于腔膜面，并且因而不能直接被来自血液中的IgG抗体利用。相反，蛋白质的极性在肿瘤中被取消。所以根据本发明可能在阐述的肿瘤中，其中包括肺肿瘤、胃癌、胰腺癌中，将SLC26A9称为使用单克隆抗体的治疗靶点。肺、胃、胰腺和食道癌SLC26A9显著地高表达和高发生率使得这个蛋白质根据本发明成为极好的诊断和治疗标志物。这根据本发明包括依靠RT-PCR对血清、骨髓、尿中散布肿瘤细胞的检测以及其他器官中转移灶的检测。另外，FLJ20694的这些细胞外结构域根据本发明依靠单克隆抗体能被用作免疫诊断和治疗的靶结构。SLC26A9根据本发明还可能被用作疫苗(RNA、DNA、蛋白质、肽)以诱导肿瘤特异性的免疫反应(T和B细胞介导的免疫反应)。这根据本发明还包括调节SLC26A9生物活性并能用于治疗肺肿瘤和胃肠道肿瘤的所谓小分子化合物的开发。

[0434] 实施例12：THC1005163作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0435] THC1005163(SEQ ID NO：57)是源自美国基因组研究所(TIGR)基因指标(geneindex)的一个基因片段。该基因只有在3’端有阐述，而ORF是缺乏的。用THC1005163特异性引物(SEQ ID NO：79)和寡聚dT18引物进行RT-PCR调查，所述dT18引物的5’端具有一个21个特异性碱基的特异性标签。用数据搜索程序搜索来检查这个标签与已知序列的同源性。为了排除基因组DNA的污染，这个特异性引物最初被用于cDNA合成。用这个引物对的RT-PCR调查显示在胃、卵巢、肺和(5/9)肺癌活检组织中的表达(图13)。其它的正常组织未显示有表达。

[0436] 实施例13：LOC134288作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0437] LOC134288(SEQ ID NO：58)及其预报的翻译产物(SEQ ID NO：66)被发表在基因库注册号XM_059703之下。

[0438] 根据本发明对LOC134288是否能被用作肾细胞癌的标志物进行调查。为此目的使用了能特异性扩增LOC134288的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：80，81)。RT-PCR调查显示在肾中和在(5/8)被调查的肾细胞癌活检组织中的选择性表达(图14)。

[0439] 实施例14：THC943866作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0440] THC 943866(SEQ ID NO：59)是来源于TIGR基因指标的一个基因片段。对THC943866是否能被用作肾细胞癌的标志物进行调查。为此目的使用了能特异性扩增THC943866的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：82，83)。

[0441] 用THC943866特异性引物(SEQ ID NO：82，83)的RT-PCR调查显示在肾中和在(4/8)被调查的肾细胞癌活检组织中的选择性表达(图15)。

[0442] 实施例15：FLJ21458作为诊断和治疗癌症的靶点的鉴别

[0443] FLJ21458(SEQ ID NO：84)及其预报的翻译产物(SEQ ID NO：85)被发表在基因库注册号NM_034850之下。序列分析揭示所述蛋白质代表了butyrophillin家族的新成员。结构分析揭示它代表了有一个细胞外免疫球蛋白结构域的I型跨膜蛋白质。能特异性扩增FLJ21458的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：86，87)被用于调查其表达。用FLJ21458特异性引物(SEQ ID NO：86，87)的RT-PCR调查显示在结肠和在(7/10)被调查的结肠癌活检组织中的选择性表达(图16，表5)。用特异性引物(SEQ ID NO：133，134)的定量RT-PCR证实这个选择性表达的轮廓(图39)。还有可能在试验中在结肠和在胃、在直肠和盲肠以及在睾丸中胃肠道特异性地检测FLJ21458。7/11结肠转移灶样品在定量PCR中也为阳性。FLJ21458特异性的表达还延伸到其它肿瘤，并且蛋白质特异性的表达在胃、胰腺和肝肿瘤中可检测到(表5)。用于检测FLJ21458蛋白质的抗体通过免疫兔产生。下列肽用于生产这些抗体：

[0444] SEQ ID NO：135：QWQVFGPDKPVQAL

[0445] SEQ ID NO：136：AKWKGPQGQDLSTDS

[0446] FLJ21458特异性的反应在免疫荧光法中可检测到(图40)。为了检查抗体的特异性，用编码FLJ21458-GFP融合蛋白质的质粒转染293细胞。特异性一方面通过使用FLJ21458特异性抗体的共定位调查，另一方面通过自发荧光的GFP而被证明。两个荧光图的叠加清楚地显示免疫血清特异性地识别FLJ21458蛋白质(图40a)。由于蛋白质的过度表达，得到的细胞染色是弥漫的，并且不允许有不清楚的蛋白质定位。为了这个原因，用内源性表达FLJ21458的胃肿瘤特异性的细胞系Snu16细胞进行进一步的免疫荧光试验(图41B)。细胞用FLJ21458特异性抗血清和用识别膜蛋白质E-钙粘蛋白的另一个抗体来染色。FLJ21458特异性抗体至少微弱地染色细胞膜并且因而FLJ21458很明显的定位于细胞膜上。

[0447] 生物信息调查显示由FLJ21458编码的蛋白质代表了一个细胞表面分子并且具有一个免疫球蛋白超分子结构域。这个表面分子的选择性表达使其成为开发检测肿瘤细胞的诊断方法以及清除肿瘤细胞的治疗方法的一个好的靶点。

[0448] 胃癌和结肠癌FLJ21458的显著表达和高发生率根据本发明使该蛋白质成为一个高度引人注目的诊断和治疗标志物。这根据本发明包括依靠RT-PCR对血清、骨髓、尿中散布肿瘤细胞的检测以及其他器官中转移灶的检测。还有可能根据本发明将FLJ21458的细胞外结构域用作免疫诊断和治疗的靶结构。根据本发明还可能将FLJ21458用作疫苗(RNA、DNA、蛋白质、肽)以诱导肿瘤特异性的免疫反应(T和B细胞介导的免疫反应)。这根据本发明还包括调节FLJ21458生物活性并能用于治疗胃肠道肿瘤的所谓小分子化合物的开发。

[0449] 表5FLJ21458在正常和肿瘤组中的表达

[0450]正常组织 表达
脑 -
小脑 -
心肌 未测定
骨骼肌 -
子宫内膜 -
胃 ++
结肠 +++
胰腺 -
肾 -
肝 -
睾丸 ++
胸腺 未测定
乳腺 未测定
卵巢 -
子宫 -
皮肤 -
肺 -
甲状腺 未测定
淋巴结 -
脾 -
外周血单核细胞 -
肾上腺 未测定
食道 -
小肠 -
前列腺 -

[0451]肿瘤类型 表达
结肠癌 7/10
胰腺癌 5/6
食道癌 未测定
胃癌 8/10
支气管癌 未测定
乳腺癌 未测定
卵巢癌 未测定
子宫内膜癌 未测定
耳鼻喉肿瘤 未测定
肾细胞癌 未测定
前列腺癌 未测定
结肠的转移灶 7/11
肝癌 5/8