用于检测蛋白质加工的探测蛋白质转让专利
申请号 : CN200380106005.2
文献号 : CN1726228B
文献日 : 2010-05-26
发明人 : 近江谷克裕 , 芦高惠美子 , 伊藤诚二
申请人 : 独立行政法人科学技术振兴机构
摘要 :
本发明涉及一种可测定蛋白质加工的探测蛋白质，其含有可被加工的氨基酸残基或氨基酸残基序列的加工区域，以及一种分泌型嵌合蛋白质，该嵌合蛋白质含有至少一个经加工形成的加工区域，并由于蛋白质的三维结构改变，造成了发光和荧光能量特性的改变。
权利要求 :
1.一种可测定蛋白质加工的探测蛋白质，其包括
(i)一个或多个加工切割区域SEQKQLQKRFGGFTGG，含有由加工酶PC1切割的切割位点Lys-Arg，以及(ii)包括分泌型荧光素酶和黄色荧光蛋白质的一个或者多个特性可变区域，其中加工切割区域位于分泌型荧光素酶和黄色荧光蛋白质之间。
2.根据权利要求1所述的探测蛋白质，其中的探测蛋白质是分泌型蛋白质。
3.根据权利要求1所述的探测蛋白质，其具有以下a)和b)中任一氨基酸序列：a)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列所表示的探测蛋白质；
b)在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸的置换、添加、缺失或插入的探测蛋白质，其中，分泌型荧光素酶和黄色荧光蛋白质之间的能量传递特性，以及在加工切割区域加工酶的酶切活性得以保持。
4.编码权利要求1-3任一项中所述探测蛋白质的DNA。
5.根据权利要求4所述的DNA，其具有以下c)和d)中任一项的DNA序列：c)以SEQ ID NO：1的碱基序列表示的DNA；
d)与SEQ ID NO：1的碱基序列表示的DNA或其互补DNA在严紧条件下杂交的DNA，其中由该DNA编码的蛋白质保持了分泌型荧光素酶和黄色荧光蛋白质之间的能量传递特性并且保持了在加工切割区域加工酶的酶切活性。
6.含有权利要求4中所述DNA的表达载体。
7.检测特定细胞的加工能力的方法，其特征在于将权利要求4-5所述DNA以及权利要求6中所述的表达载体中的任一个导入到该细胞中，以及定量评估探测蛋白的能量传递特性变化。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞是来自人类的细胞。
9.检测被检测蛋白质的加工能力的方法，包括使被检测蛋白质与权利要求1-3中任一项所述探测蛋白质发生反应，以及测定该探测蛋白质的能量传递特性变化的步骤。
10.筛选加工酶的方法，包括使被检测蛋白质与权利要求1-3中任一项所述探测蛋白质发生反应的步骤，以及通过检测与被检测蛋白质反应前后该探测蛋白质的能量传递特性的变化，选择使该探测蛋白质特性发生变化的被检测蛋白质的步骤。
11.筛选促进或抑制加工的化合物的方法，包括使被测试样与加工酶以及权利要求1-3中任一项中所述探测蛋白质接触的步骤，以及通过在与被测试样接触前后检测该探测蛋白质能量传递特性的变化，选择促进或抑制该特性的试样的步骤。
12.筛选促进或抑制加工酶活性的化合物的方法，包括制备导入有权利要求1-3中任一项中所述探测蛋白质、权利要求4-5所述DNA序列以及权利要求6中所述表达载体中的任一个的细胞的步骤，以及在有和没有被测试样存在条件下，通过检测该细胞中所表达的探测蛋白质的能量传递特性变化，选择促进或抑制该特性变化的试样的步骤。
说明书 :
技术领域
本发明涉及包含经加工可被切割的蛋白质区域以及由于切割导致能量传递特性发生变化的可变区域的探测蛋白质、编码该探测蛋白质的基因、采用所制备的探测蛋白质加工细胞或蛋白质、或者一种筛选能够促进或抑制加工的化合物的方法。
背景技术
基因的转录产物蛋白质有时直接具有功能，但在多数情况下，翻译后的蛋白质产物要经历糖基化、磷酸化等加工修饰过程才被活化。在这种加工过程中，从前体蛋白质的特定部位可以切下有活性的肽。
以前是借助对切下的活性肽具有特异性的抗体，或者利用电泳法或质谱法直接检测分子量的变化，来检测从前体蛋白质切下的有活性的肽的加工过程。但是，这并不是一种简便的方法，不是一种可直接观察到加工过程的手段。
发光酶类是一种对细胞内基因转录活性进行直接观察的有效手段，并且已经利用探测蛋白质来检测基因表达。同时，荧光蛋白质表现荧光活性与其在细胞内表达几乎同时发生，不需要补助因子。这种蛋白质以细胞内的荧光活性为指标可以作为一种探测蛋白质，来定位细胞内的蛋白质。
正在开发一种追踪分子间或分子内相互作用的变化的方法，它以荧光蛋白质和荧光蛋白质之间，或发光酶与荧光蛋白质之间的能量传递作为指标。也正在构建了以荧光蛋白质与荧光蛋白质间的能量传递为指标分析细胞内钙离子的变化的探测蛋白质，或是以发光酶与荧光蛋白质间的能量传递为指标分析蛋白质磷酸化的探测蛋白质。但是，还没有能使得以上述能量传递为指标的加工过程实现可视化和定量化的探测蛋白质。
本发明的目的在于，制备能够将加工过程可视化的探测蛋白质，并使其最佳化，进而开发将此探测蛋白质用于加工酶的筛选的方法，以及对抑制或促进加工酶活性药剂进行筛选的方法，并将这些方法应用于疾病的治疗、检查以及新药的开发。
附图简要说明
图1：表示能够传递能量的分泌型嵌合蛋白质上插入了加工部位(A)、及该部位发生变异(B)或缺失(C)的区域的构建体。
图2：表示能够传递能量的分泌型嵌合蛋白质上的加工部位区域(A)、该部位发生变异(B)或缺失(C)的区域的DNA序列。
图3：表示已导进插入了加工序列的分泌型嵌合蛋白质的细胞内和细胞外的蛋白印迹分析，以及导入了加工酶时切割效率变化的检测结果。
图4：表示将加工酶导入已表达插入了加工序列的分泌型嵌合蛋白质的细胞时，能量的传递效率、光谱变化。(a)只有Vluc-NST/Nco-EYFP、(b)在Vluc-NST/Nco-EYFP中表达PC1、(c)在Vluc-NST/Nco-EYFP中表达PC2、(d)Vluc。
图5：表示插入了加工序列的分泌型嵌合蛋白质的能量传递效率由于切割酶PC1的作用而大幅度减少，同样根据蛋白印迹的结果定量切割效率的结果。
发明的公开
若构建出插有在发光酶与荧光蛋白质间可能发生能量传递的加工区域的探测蛋白质构建体，加工前后能量传递就会发生变化，随之而来的是发光光谱也会发生变化。由于以这种光谱变化为指标，就有可能实现加工后活性肽的定量化、加工酶活性的定量化以及加工部位的定位分析，并进而能够筛选调控加工酶活性的基因或蛋白质，并可能用于开发以加工为指标的各种疾病的治疗方法和新药(即开发出对加工有促进或抑制作用的药物)。
本发明人为解决上述课题反复专心研究的结果是，制备出一种探测蛋白质，该蛋白质含有通过加工能被切割的加工切割区域以及经加工显示出发光荧光能量特性变化的特性可变区域。
本发明涉及以下探测蛋白质、编码这些蛋白质的基因、采用制备成的该探测蛋白质加工的细胞或蛋白质、以及筛选促进或抑制加工的化合物的方法。
1.一种可测定蛋白质加工的探测蛋白质，其包括至少1个切割区域和至少1个特性可变区域，所述切割区域含有可被加工的氨基酸残基或氨基酸残基序列，所述特性可变区域由于受到加工而表现出能量传递特性变化。
2.根据第1项所述的探测蛋白质，其中特性可变区域含有发光蛋白质和荧光蛋白质。
3.根据第1项所述的探测蛋白质，所述探测蛋白质为分泌蛋白质。
4.根据第1项所述的探测蛋白质，其中，切割加工切割区域的加工酶为选自PC1、PC2、成对碱性氨基酸蛋白酶、蛋白酶体、组织蛋白酶及凝血酶的任一种。
5.根据第4项所述的探测蛋白质，其中加工酶为PC1。
6.根据第1项所述的探测蛋白质，其中加工切割区域位于构成特性可变区域的发光蛋白质与荧光蛋白质之间。
7.根据第1项所述的探测蛋白质，其中发光蛋白质是来源于从夜光海萤、绯虾、発光昆虫(萤火虫、桅灯甲虫等)、发光性涡鞭毛藻、发光蠕虫、帽贝(Latia neritoides)、肾海鳃(Renilla)及多管水母属(水母发光蛋白)中选择的任一种的荧光素酶。
8.根据第1项所述的探测蛋白质，其中荧光蛋白质是来源于从绿色荧光蛋白质(GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、蓝色荧光蛋白质(BFP)、蓝绿色荧光蛋白质(CFP)、DsRED及红色荧光蛋白质(RFP)中选择的任一种的蛋白质。
9.根据第2项所述的探测蛋白质，其特征在于，特性可变区域的发光蛋白质是分泌型夜光海萤(Cypridina noctiluca)发光酶，特性可变区域的荧光蛋白质是来源于凯旋发光水母(luminescent Aequoreavictoria)的突变体的黄色荧光蛋白。
10.根据第1项所述的探测蛋白质，其中加工切割区域由含有加工酶酶切位点的6-100个氨基酸序列构成。
11.根据第1项所述的探测蛋白质，其含有以下a)和b)中任一氨基酸序列：
a)由序列2中记载的氨基酸序列所表示的探测蛋白质；
b)序列2记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、添加、缺失或插入，但仍然保持发光蛋白质与荧光蛋白质之间的能量传递特性，并且保持加工切割区域中由加工酶酶切活性的探测蛋白质。
12.根据第1项所述的探测蛋白质，其中加工切割区域为SEQKQLQKRFGGFTGG。
13.编码第1-12中的任一项所述探测蛋白质的DNA。
14.根据第13项所述的DNA，其含有以下c)-d)中任一项的DNA序列：
c)以序列1记载的碱基序列表示的DNA；
d)以序列1记载的碱基序列表示的DNA或与其在严紧条件下杂交的互补DNA，该DNA编码的蛋白质保持了发光蛋白质与荧光蛋白质之间的能量传递特性并且保持加工切割区域中加工酶的酶切活性。
15.含有第13项中所述DNA的表达载体。
16.检测细胞的加工能力的方法，其特征在于将第1-12任一项中所述探测蛋白质、第13-14项中所述DNA以及第15项中所述的表达载体的任一个导入到某种特定细胞中，定量评估探测蛋白的能量传递特性变化。
17.根据第16项所记载的方法，其中所述细胞是来自人类的细胞。
18.检测被检测蛋白质的加工能力的方法，包括使被检测蛋白质与第1-12项中任一项所述探测蛋白质发生反应，测定该探测蛋白质的能量传递特性变化的步骤。
19.筛选加工酶的方法，包括使被检测蛋白质与第1-12项中任一项所述探测蛋白质之间发生反应的步骤；检测与被检测蛋白质反应前后该探测蛋白质的能量传递特性之变化，选择使该探测蛋白质特性发生变化的被检测蛋白质的步骤。
20.筛选促进或抑制加工的化合物的方法，包括使被测试样与加工酶以及第1-12项中任一项中所述探测蛋白质接触的步骤；在与被测试样接触前后检测该探测蛋白质能量传递特性的变化，选择促进或抑制该特性的试样的步骤。
21.筛选促进或抑制加工(酶活性)的化合物的方法，包括制备导入有第1-12项中任一项中所述探测蛋白质、第13-14项所述DNA序列以及第15项中所述表达载体中的任一个的细胞的步骤；在有和没有被测试样存在条件下检测该细胞中所表达的探测蛋白质的能量传递特性变化，选择促进或抑制该特性变化的试样的步骤。
此外，本申请说明书还公开了以下发明：
1.下列1)-4)所示蛋白质
1)由序列2中记载的氨基酸序列表示的探测蛋白质；
2)序列2记载的氨基酸序列中，通过加工被切割的区域以及伴随产生的特性可变区域(发光蛋白质与荧光蛋白质)其中之一的序列或位点发生变化的探测蛋白质；
3)序列2中记载的氨基酸序列中以下划线表示的加工切割区域(含有疼痛传导肽前体蛋白质的切割位点的由18个氨基酸残基组成的序列)，含有加工切割部位前后10-100个氨基酸残基，最佳是20-40个氨基酸残基被替换后所构成的探测蛋白质；以及
4)一种最佳探测蛋白质，其特性可变区域是由于加工切割区域之前和之后三维结构变化而导致特性可以变化的区域。由于发光蛋白质和荧光蛋白质插入到探测蛋白质中加工区域前后两侧，无法实现从发光蛋白质向荧光蛋白质的能量传递，因此发光颜色发生了变化。
在理想的实施方式中，在探测蛋白质的特性可变区域两端分别插入发光蛋白质和荧光蛋白质。在该探测蛋白质中，任何一个都可以存在于N末端，但从N末端开始按发光蛋白质，荧光蛋白质的顺序安排更为理想。在含有发光蛋白质和荧光蛋白质的探测蛋白质中，在不发生加工的情况下，发光蛋白质【分泌型夜光海萤(Cypridina noctiluca)发光酶】所发蓝光能量传递到荧光蛋白质突变体(EYFP)上，该探测蛋白质发出黄绿色光，发生加工情况而未实现能量传递，则探测蛋白质中仅发出蓝光。以这种特性可变区域中的发光颜色变化为指标可以分析加工过程。
虽然已有能够观察细胞内磷酸化和钙的动态的探测蛋白质，而能对加工过程可视化定量化的探测蛋白质是本发明人首次证实的。本发明人还研究了以荧光蛋白质和荧光蛋白质间，或发光蛋白质和荧光蛋白质间能量传递的变化为指标分析细胞机能的系统，并首次利用于分析加工过程的系统。
下面，对本发明进行更详细的说明。
本发明的探测蛋白质的特征在于含有加工切割区域和特性可变区域。
所谓加工切割区域就是受加工酶切割的含有2个以上氨基酸的区域，作为探测对象的加工酶，其种类不同，氨基酸序列也不同。
本发明中，所谓加工切割区域就是指含有加工酶可以识别和切割的氨基酸酸序列的区域，其含有1个以上氨基酸，作为探测对象的加工酶，其氨基酸序列随加工酶的种类不同而不同。例如，在序列2所示探测蛋白质中，加工酶PC1识别并切割位点[KR]，尽管序列2中有4个[KR](荧光素酶部分两个，加工切割区域一个，YFP中一个)，但切割只发生在加工切割区域。因此，切割加工区域不仅含有切割位点(KR)，还含有使酶得以识别并切割该切割位点的辅助部分，也可以含有基本不影响或完全不影响切割的附加序列。加工切割区域的一个例子，是和加工酶(PC1)相应的区域[SEQKQLQKRFGGFTGG]。
下面以加工酶PC1为例对加工切割区域进行说明。
PC1的切割识别序列为Lys-Arg，加工切割区域含有Lys-Arg，而且可将由其C末端侧及N末端侧开始的3-50个，更佳为4-40个，最佳是5-20个氨基酸连接起来构成加工切割区域。加工切割区域所采用的氨基酸可以是Gly，Ala，His，Arg，Lys，Ser，Cys(包括胱氨酸)，Thr，Met，Phe，Tyr，Trp，Leu，Lle，Val，Glu，Asp，Gln，Asp，Pro等构成蛋白质的常见氨基酸，也可以是Sar，β-丙氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、磺基丙氨酸等其它天然或合成氨基酸。
上面说明了加工酶PC1的情况，也可以同样设计出与其它加工酶相应的加工切割区域。
切割区域的氨基酸总数约6-100个，较合适是约8-50个，更佳约为10--40个。
加工酶并没有特殊限制，只要是限制性分解生物体内合成的蛋白质前体并将其转换为成熟蛋白质的酶即可，例如PC1，PC2，成对碱性氨基酸蛋白酶、蛋白酶体、组织蛋白酶及凝血酶。
下表列出了PC1和其它加工酶及其切割区域。
表1
加工酶 加工切割位点的氨基酸序列实例 PC1 KR
加工酶 加工切割位点的氨基酸序列实例 PC2 KR 成对碱性氨基酸蛋白酶 RRKR 蛋白酶体 KM 组织蛋白酶 KM 凝血酶 LVPR
例如，PC1，PC2，成对碱性氨基酸蛋白酶这三种加工酶中，无论哪种都是切割KR的C末端蛋白质，由于KR前后的序列或整个蛋白质的结构发生变化，从而使得被特定加工酶切割成为可能。
作为探测对象的加工酶为1种时，含有1个切割识别序列即可，同时探测多种加工酶时，对应于两种以上加工酶，可在切割区域导入的各自不同的切割识别序列。此外，通过构建仅含有加工酶特定的切割识别序列，而没有其它加工酶的切割识别序列的切割区域，能够筛选出仅对特定加工酶活性进行调节的化合物。而且，以对多种底物发生作用的1种加工酶为对象时，通过适当选择切割识别序列及其前后序列，例如和特定的底物的序列相适配，可筛选出仅对特定底物的加工起促进或抑制作用的化合物。
当特性可变区域被加工酶切割时，只要其能量传递特性发生变化即可，例如可以是含有组合了发光蛋白质与荧光蛋白质，或荧光蛋白质与着色蛋白质等的区域。
在通过加工切割区域连接发光蛋白质与荧光蛋白质时，在切割加工切割区域之前，会发生由发光蛋白质向荧光蛋白质的能量传递，但在切割后不发生这种能量的传递。其优点是可容易地通过测定能量传递来定量是否发生了切割。发光蛋白质和荧光蛋白质以及加工切割区域最好是按发光蛋白质-加工切割区域-荧光蛋白质的顺序连接，只要加工酶切割会产生发光荧光特性变化，也可以按荧光蛋白质-加工切割区域-发光蛋白质的顺序连接。
此外，也可以在不对发光蛋白质的发光特性产生重大影响的部位导入加工切割区域。这种情况下，发光蛋白质在加工后可能失去发光特性。
同样，也可以在不对荧光蛋白质的荧光特性产生重大影响的部位导入加工切断区域。这种情况下，荧光蛋白质在加工后可能失去荧光特性。
发光蛋白质可以是来自各种发光生物，例如夜光海萤、绯虾、発光昆虫(萤火虫、桅灯甲虫等)、发光性涡鞭毛藻、发光蠕虫、帽贝(Latianeritoides)、肾海鳃(Renilla)及多管水母属(水母发光蛋白)等的荧光素酶。由于海萤虫·荧光素酶是分泌型的，如果采用它，探测蛋白质最好也是分泌型的。如果使用分泌型探测蛋白质，不破碎细胞就能够对活细胞内加工过程发生的程度进行评价。在采用非分泌型荧光素酶，例如来自肾海鳃属的荧光素酶时，也可以在N末端导入分泌型蛋白质而制备成分泌型发光蛋白质使用。
荧光蛋白质，有如绿色荧光蛋白质(GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、蓝色荧光蛋白质(BFP)、蓝绿色荧光蛋白质(CFP)、DsRED、红色荧光蛋白质(RFP)等等。着色蛋白质则可举蓝色着色蛋白质(藻蓝蛋白)、红色着色蛋白质(藻红蛋白)为例。藻蓝蛋白和藻红蛋白能够吸收萤荧光素酶发出的光。
本发明所选择的荧光蛋白质，是从生物发光蛋白质放出的光能成为荧光蛋白质的激发波长。这种组合的例子如下所示。
表2
生物发光蛋白质 荧光蛋白质或着色蛋白质 夜光海萤荧光素酶 GFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、RFP 萤火虫荧光素酶 DsRED、藻蓝蛋白、藻红蛋白 发光性涡鞭毛藻荧光素酶 GFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、RFP 桅灯甲虫荧光素酶 DsRED 肾海鳃荧光素酶 GFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、RFP 水母发光蛋白 GFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、RFP
在一个最佳的实施方式中，本发明的探测蛋白质用以下1)-3)所示的蛋白质为例来说明。
1)序列2记载的氨基酸序列表示的探测蛋白质。
2)序列2记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、被替换或添加而组成的氨基酸序列，并且有发光酶活性、荧光蛋白质活性和能量传递活性的探测蛋白质。
3)序列1记载的碱基序列表示的DNA或者与其在严紧条件下杂交的互补DNA编码的蛋白质，并有发光蛋白质活性，荧光蛋白质活性以及能量传递活性的探测蛋白质。
2)所示的蛋白质是在1)的蛋白质中导入了不会造成发光蛋白质活性丧失的变异而所产生的蛋白质。这种变异除了在自然界中会发生外，还包含人工诱变。进行人工诱变的手段，可以是定点诱变法(NucleicAcids Res.10，6487-6500，1982)等，但并不限于这些方法。变异的氨基酸数目以不丧失分泌、发光、荧光活性以及能量传递活性为准，不限定具体数目，通常为20个氨基酸以内，15个氨基酸亦可，更佳是10个氨基酸以内，最好是5个氨基酸以内。导入变异的蛋白质是否保留了发光和荧光活性，可根据检测该种蛋白质的发光和荧光活性进行判断。
3)所示的蛋白质是通过DNA相互杂交获得的具有分泌型发光酶活性、荧光蛋白质活性以及能量传递活性的探测蛋白质。3)所示的蛋白质中所谓“严紧杂交条件”是指只会发生特异性杂交，而不会发生非特异性杂交的条件。这种条件通常是指“1×SSC，0.1％SDS，37℃”，较好的条件是“0.5×SSC，0.1％SDS，42℃”，更好的条件是“0.2×SSC，0.1％SDS，65℃”。通过杂交所获得的DNA的序列与序列1记载的碱基序列所表示的DNA通常有高度同源性。所谓高度同源性是指60％以上同源，较好是75％以上同源，更好是90％以上同源。
本发明的蛋白质可通过将下述本发明的基因重组到表达载体中，在适当的宿主细胞中表达而获得。表达载体可采用例如pBT-VL-b-YFP等，宿主细胞可采用大肠杆菌BL21菌株等。
本发明的基因包含以下1)-2)所示基因。
1)序列1记载的碱基序列表示的基因。
2)序列1记载的碱基序列表示的DNA或与其互补DNA在严紧条件下杂交的DNA编码的DNA序列。
上述DNA编码的蛋白质是利用DNA相互杂交获得的含有分泌型发光酶活性、荧光蛋白质活性以及能量传递活性的探测蛋白质。
在本说明书中所称“严紧杂交条件”是指使之仅发生特异性杂交，而不发生非特异性杂交的条件。这种条件通常是指“1×SSC，0.1％SDS，37℃”，较好的条件是“0.5×SSC，0.1％SDS，42℃”，更好的条件是“0.2×SSC，0.1％SDS，65℃”。通过杂交所获得的DNA的序列与序列1记载的碱基序列所表示的DNA通常有高度同源性。所谓高度同源性是指60％以上同源，较好是75％以上同源，更好是90％以上同源。
本发明的蛋白质可通过将下述本发明的基因重组到表达载体中，在适当的宿主细胞中表达而获得。表达载体可采用例如pBT-VL-mp-YFP(VL表示夜光海萤荧光素酶，mp表示探测肽，YFP表示黄色荧光蛋白质)等作为表达载体，宿主细胞可采用哺乳动物细胞、酵母菌等的真核生物细胞、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、藻类、真菌类等的原核生物细胞等。以上各种细胞都可以采用，最佳的宿主细胞为哺乳动物细胞培养物COS7细胞系(关键是该细胞系中贯穿了哺乳类细胞系统的蛋白质合成，蛋白质修饰加工过程，即这个过程是要被探测的)等。
编码本发明最佳嵌合蛋白质的基因(多聚核苷酸)为：
1)有序列1记载的碱基序列的基因。
2)有用序列1记载的碱基序列表示的DNA或在严紧条件下和与其互补DNA杂交而成的DNA的基因的。
(筛选方法I)
在特定细胞中导入本发明的探测蛋白质、DNA序列或表达载体其中之一，定量评定探测蛋白质的能量传递特性的变化。
(筛选方法II)
使被检测蛋白质与本发明的探测蛋白质反应，检测该探测蛋白质的能量传递特性变化，从而检测被检测蛋白质的加工能力。
该方法中，通常探测蛋白质要准备多种，通过对每个探测蛋白质的能量传递特性变化进行检测，可以定量检测被检测蛋白质，是何种加工酶，以及何种加工酶活性更强。
(筛选方法III)
通过以下步骤能够筛选出新的加工酶：使被检蛋白质与本发明探测蛋白质进行反应；在与被测蛋白质反应前后测定该探测蛋白质的能量传递特性变化并选择出使该探测蛋白质特性发生变化的被测蛋白质。
(筛选方法IV)
在无细胞系统中筛选促进或抑制加工过程的化合物的方法包括以下步骤：使被测试样与加工酶以及本发明中的探测蛋白质接触；在与被测试样的接触前后测定该探测蛋白质能量传递特性变化，并选择出促进或抑制该特性的试样。
通过该方法，不用考虑向细胞内移动等因素，就可以筛选出促进或抑制加工过程的化合物。
筛选促进或抑制加工(酶活性)的化合物的方法包括以下步骤：制备导入了本发明的探测蛋白质、编码该探测蛋白质的DNA序列以及含有该DNA序列的表达载体三者之一的细胞；在有无被测试样存在条件下测定在该细胞中表达的探测蛋白质的能量传递特性变化，选择出促进或抑制该特性的试样。
通过该方法，可以筛选出口服等方式经血液转移发挥药效的化合物。
本发明提供了一种新的能够对加工过程定量化的探测蛋白质以及编码该蛋白质的基因和调节该酶表达的基因。使用该探测蛋白质，不破碎细胞就可以实现细胞内发生的加工过程的可视化。这就使得其在疾病的治疗，检查以及新药开发中的应用成为可能。
下面，列举实施例对本发明进行详细的说明。
为实施发明的最佳方式
下面，通过实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
已知疼痛传导肽和痛敏肽是同一种蛋白质前体在加工过程中经切割酶切出的激素肽，它们在生物体内传递痛觉时，有调节相互激活的效果。将经过加工的疼痛传导肽(图中表示为NST)和痛敏肽(图中表示为Noc)的肽序列(图1(A))插入到一种发光蛋白质和荧光蛋白质间可发生能量传递的分泌型嵌合蛋白质的插入部分，制备成探测蛋白质，并且使其肽序列中对识别切割所必需的Lys-Arg变异成Gly-Gly(图1(B))或发生缺失(图1(C))。这些肽类分别称为Vluc-NST/Noc-EYFP、mut-Vluc-NST/Noc-EYFP和del-Vluc-NST/Noc-EYFP。制备方法是，切除探测蛋白质的插入限制性酶切位点BamH I位点后，通过连接酶反应将化学合成的图2所示的DNA序列与其连接。插入的部分已通过DNA序列得以确认。
实施例2
用市售的导入试样将含有三种探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP、mut-Vluc-NST/Noc-EYFP和del-Vluc-NST/Noc-EYFP基因的载体导入到神经细胞来源的NG108-15中。用蛋白印迹法分析分泌到培养液中的蛋白质(图3)。以没有插入序列的Vluc-EYFP作为对照。抗夜光海萤荧光素酶抗体(抗-Vluc)是一种能够识别探测蛋白质N末端的发光酶的抗体，四种探测蛋白质的分子量均为95kDa。此外，抗绿色荧光蛋白质抗体(抗-GFP)是能够识别蛋白质C末端发光酶的抗体，因此四个探测蛋白质的主要蛋白质分子量均为95kDa。但是，与95kDa相比在Vluc-NST/Noc-EYFP探测蛋白质中能够确认的条带很小，大小为27kDa。由于加工酶在神经细胞来源的NG108-15中表达，该条带是在探测蛋白质被切割后，抗体识别切割后的C末端的EYFP产生的条带。此外，发生变异及缺失的mut-Vluc-NST/Noc-EYFP、del-Vluc-NST/Noc-EYFP中则不能够检出该27kDa条带，显然插入了加工酶的氨基酸序列是能够精确识别的。但是，可以认为被抗-GFP抗体识别的68kDa条带是人为赝像。此外，为了了解在Vluc-NST/Noc-EYFP的探测蛋白质中发生的切割时，这些在胰岛素，吗啡肽等物质的切割和产生中有代表性的加工酶PC1、PC2究竟是怎样的作用，将PC1和PC2导入探测蛋白质的细胞中并强制它们表达。结果表明PC1中27kDa的条带，比95kDa条带显著增强，PC2则几乎没有变化。该结果首次在世界上证明疼痛传导肽和痛敏肽(NST/Noc)之间发生的加工过程是由PC1进行的。
实施例3
用市售的导入试样将含有探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP及EYFP基因的载体导入到神经细胞来源的NG108-15中。并在表达了探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP基因的细胞中强制表达了加工酶PC1和PC2。测定从这4种细胞分泌的培养液的发光光谱(图4)。在探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP中，观测到与单独由Vluc产生的发光光谱一致460nm处的峰，以及探测蛋白质中发生能量传递导致的525nm峰。在这种探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP中表达了加工酶PC1或PC2的细胞的培养液中，表达PC2时光谱没有变化，表达PC1时，525nm的峰减小。这个结果和western blot法的结果所证明的一样，表明加工酶PC1切割探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP，探测蛋白质内不发生能量传递。也就是说，通过检测培养液的发光光谱，能够不破坏细胞就对活细胞内发生的加工水平进行评定。
实施例4
通过western blot法检测了导入神经细胞来源的NG108-15中的探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP的切断效率，用图像分析对未切断蛋白质的质量进行了定量化(图5B)。此外，通过比较探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP与Vlu单独发光光谱求出光谱差异(图4内图)，以光谱的面积来评定能量传递效果(Bret信号)(图5A)。证明将PC2导入探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP以及探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP时，未切割蛋白质的质量和Bret信号都不发生切割；另一方面，将PC1导入探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP时，未切割蛋白质的质量和Bret信号都显示探测蛋白质约60％被切割。细胞内发生的加工过程的效率尽管无法通过直接进行电泳等方法定量，却可通过测定培养液的发光光谱进行瞬时评价。
序列表
<110>独立行政法人产业技术综合研究所
(NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY)
<110>独立行政法人科学技术振兴机构
(JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY)
<120>用于检测蛋白质加工的探测蛋白质
(Monitor protein for measuring protein processing)
<130>SCT051938-25
<150>JP2002-360744
<151>2002-12-12
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2052
<212>DNA
<213>mammalian
<400>1
atgaagataa taattctgtc tgttatattg gcctactgtg tcaccgacaa ctgtcaagat 60
gcatgtcctg tagaagcgga accgccatca agtacaccaa cagttccaac ttcttgtgaa 120
gctaaagaag gagaatgtat agataccaga tgcgcaacat gtaaacgaga tatactatca 180
gatggactgt gtgaaaataa accagggaag acatgctgta gaatgtgcca gtatgtgatt 240
gaatgcagag tagaagcagc tggttatttt agaacgtttt acggcaaaag atttaatttt 300
caggaacctg gtaaatatgt gctggctagg ggaaccaagg gtggcgattg gtctgtaacc 360
ctcaccatgg agaatctaga tggacagaag ggagctgtgc tgactaagac aacactggag 420
gttgcaggag acgtaataga cattactcaa gctactgcag atcctatcac agttaacgga 480
ggagctgacc cagttatcgc taacccgttc acaattggtg aggtgaccat tgctgttgtt 540
gaaataccgg gcttcaatat cacagtcatc gaattcttta aactaatcgt gattgatatt 600
ctgggaggaa gatctgtgag aattgctcca gacacagcaa acaaaggact gatatctggt 660
atctgtggta atctggagat gaatgacgct gatgacttta ctacagatgc agatcagctg 720
gcgatccaac ccaacataaa caaagagttc gacggctgcc cattctatgg caatccttct 780
gatatcgaat actgcaaagg tctgatggag ccatacagag ctgtatgtcg taacaatatc 840
aacttctact attacactct atcctgtgcc ttcgcttact gtatgggagg agaagaaaga 900
gctaaacacg tccttttcga ctatgttgag acatgcgctg cgccggaaac gagaggaacg 960
tgtgttttat caggacatac tttctatgac acattcgaca aagcaagata tcaattccag 1020
ggcccatgca aggagattct gatggccgca gactgttact ggaacacatg ggatgtaaag 1080
gtttcacata gagacgtcga atcatacact gaggtagaga aagtaacaat caggaaacag 1140
tcaactgtag tagatctcat tgtggatggc aagcaggtca aggttggagg agtggatgta 1200
tctatcccgt acagctctga gaacacttcc atatactggc aggatggaga catcctgacg 1260
acggccatcc tacctgaagc tcttgtcgtt aagttcaact ttaagcagct ccttgtagtt 1320
catatcagag atccattcga tggaaagaca tgcggcatat gtggtaacta taatcaagat 1380
tcaactgatg atttctttga cgcagaagga gcatgcgctc taacccccaa ccccccagga 1440
tgtacagagg aacagaaacc agaagctgag cgactttgca ataatctctt tgattcttct 1500
atcgacgaga aatgtaatgt ctgctacaag cctgaccgga ttgcccgatg tatgtacgag 1560
tattgcctga ggggacaaca aggattttgt gaccatgctt gggagttcaa gaaagaatgc 1620
tacataaaac atggagacac tctagaagta ccacctgaat gtcaaggatc cacagagccc 1680
ggcctggagg aggtggggga gattgagcag aaacagctgc agaagcggtt cgggggcttc 1740
accggggccc ggaagtcggc ccggaagttg gccaaccagg gatccgtgag caagggcgag 1800
gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 1860
aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 1920
ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccttcggc 1980
tacggcctgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 2040
tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 2100
tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 2160
aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 2220
aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 2280
aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 2340
acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag ctaccagtcc 2400
gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 2460
gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aa 2502
<210>2
<211>833
<212>PRT
<213>mammalian
<400>2
Met Lys Ile Ile Ile Leu Ser Val Ile Leu Ala Tyr Cys Val Thr Asp
1 5 10 15
Asn Cys Gln Asp Ala Cys Pro Val Glu Ala Glu Pro Pro Ser Ser Thr
20 25 30
Pro Thr Val Pro Thr Ser Cys Glu Ala Lys Glu Gly Glu Cys Ile Asp
35 40 45
Thr Arg Cys Ala Thr Cys Lys Arg Asp Ile Leu Ser Asp Gly Leu Cys
50 55 60
Glu Asn Lys Pro Gly Lys Thr Cys Cys Arg Met Cys Gln Tyr Val Ile
65 70 75 80
Glu Cys Arg Val Glu Ala Ala Gly Tyr Phe Arg Thr Phe Tyr Gly Lys
85 90 95
Arg Phe Asn Phe Gln Glu Pro Gly Lys Tyr Val Leu Ala Arg Gly Thr
100 105 110
Lys Gly Gly Asp Trp Ser Val Thr Leu Thr Met Glu Asn Leu Asp Gly
115 120 125
Gln Lys Gly Ala Val Leu Thr Lys Thr Thr Leu Glu Val Ala Gly Asp
130 135 140
Val Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Ala Asp Pro Ile Thr Val Asn Gly
145 150 155 160
Gly Ala Asp Pro Val Ile Ala Asn Pro Phe Thr Ile Gly Glu Val Thr
165 170 175
Ile Ala Val Val Glu Ile Pro Gly Phe Asn Ile Thr Val Ile Glu Phe
180 185 190
Phe Lys Leu Ile Val Ile Asp Ile Leu Gly Gly Arg Ser Val Arg Ile
195 200 205
Ala Pro Asp Thr Ala Asn Lys Gly Leu Ile Ser Gly Ile Cys Gly Asn
210 215 220
Leu Glu Met Asn Asp Ala Asp Asp Phe Thr Thr Asp Ala Asp Gln Leu
225 230 235 240
Ala Ile Gln Pro Asn Ile Asn Lys Glu Phe Asp Gly Cys Pro Phe Tyr
245 250 255
Gly Asn Pro Ser Asp Ile Glu Tyr Cys Lys Gly Leu Met Glu Pro Tyr
260 265 270
Arg Ala Val Cys Arg Asn Asn Ile Asn Phe Tyr Tyr Tyr Thr Leu Ser
275 280 285
Cys Ala Phe Ala Tyr Cys Met Gly Gly Glu Glu Arg Ala Lys His Val
290 295 300
Leu Phe Asp Tyr Val Glu Thr Cys Ala Ala Pro Glu Thr Arg Gly Thr
305 310 315 320
Cys Val Leu Ser Gly His Thr Phe Tyr Asp Thr Phe Asp Lys Ala Arg
325 330 335
Tyr Gln Phe Gln Gly Pro Cys Lys Glu Ile Leu Met Ala Ala Asp Cys
340 345 350
Tyr Trp Asn Thr Trp Asp Val Lys Val Ser His Arg Asp Val Glu Ser
355 360 365
Tyr Thr Glu Val Glu Lys Val Thr Ile Arg Lys Gln Ser Thr Val Val
370 375 380
Asp Leu Ile Val Asp Gly Lys Gln Val Lys Val Gly Gly Val Asp Val
385 390 395 400
Ser Ile Pro Tyr Ser Ser Glu Asn Thr Ser Ile Tyr Trp Gln Asp Gly
405 410 415
Asp Ile Leu Thr Thr Ala Ile Leu Pro Glu Ala Leu Val Val Lys Phe
420 425 430
Asn Phe Lys Gln Leu Leu Val Val His Ile Arg Asp Pro Phe Asp Gly
435 440 445
Lys Thr Cys Gly Ile Cys Gly Asn Tyr Asn Gln Asp Ser Thr Asp Asp
450 455 460
Phe Phe Asp Ala Glu Gly Ala Cys Ala Leu Thr Pro Asn Pro Pro Gly
465 470 475 480
Cys Thr Glu Glu Gln Lys Pro Glu Ala Glu Arg Leu Cys Asn Asn Leu
485 490 495
Phe Asp Ser Ser Ile Asp Glu Lys Cys Asn Val Cys Tyr Lys Pro Asp
500 505 510
Arg Ile Ala Arg Cys Met Tyr Glu Tyr Cys Leu Arg Gly Gln Gln Gly
515 520 525
Phe Cys Asp His Ala Trp Glu Phe Lys Lys Glu Cys Tyr Ile Lys His
530 535 540
Gly Asp Thr Leu Glu Val Pro Pro Glu Cys Gln Gly Ser Thr Glu Pro
545 550 555 560
Gly Leu Glu Glu Val Gly Glu Ile Glu Gln Lys Gln Leu Gln Lys Arg
565 570 575
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Asn
580 585 590
Gln Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
595 600 605
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val
610 615 620
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
625 630 635 640
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
645 650 655
Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His
660 665 670
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
675 680 685
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
690 695 700
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
705 710 715 720
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu GLy His Lys Leu
725 730 735
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
740 745 750
Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp
755 760 765
Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly
770 775 780
Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser
785 790 795 800
Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu
805 810 815
Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr
820 825 830
Lys
<210>3
<211>16
<212>PRT
<213>mammalian
<400>3
Ser Glu Gln Lys Gln Leu Gln Lys Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Gly
1 5 10 15
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>mammalian
<400>4
Ser Glu Gln Lys Gln Leu Gln Gly Gly Phe Gly Gly Phe Thr Gly Gly
1 5 10 15
<210>5
<211>14
<212>PRT
<213>mammalian
<400>5
Ser Glu Gln Lys Gln Leu Gln Phe Gly Gly Phe Thr Gly Gly
1 5 10
以前是借助对切下的活性肽具有特异性的抗体，或者利用电泳法或质谱法直接检测分子量的变化，来检测从前体蛋白质切下的有活性的肽的加工过程。但是，这并不是一种简便的方法，不是一种可直接观察到加工过程的手段。
发光酶类是一种对细胞内基因转录活性进行直接观察的有效手段，并且已经利用探测蛋白质来检测基因表达。同时，荧光蛋白质表现荧光活性与其在细胞内表达几乎同时发生，不需要补助因子。这种蛋白质以细胞内的荧光活性为指标可以作为一种探测蛋白质，来定位细胞内的蛋白质。
正在开发一种追踪分子间或分子内相互作用的变化的方法，它以荧光蛋白质和荧光蛋白质之间，或发光酶与荧光蛋白质之间的能量传递作为指标。也正在构建了以荧光蛋白质与荧光蛋白质间的能量传递为指标分析细胞内钙离子的变化的探测蛋白质，或是以发光酶与荧光蛋白质间的能量传递为指标分析蛋白质磷酸化的探测蛋白质。但是，还没有能使得以上述能量传递为指标的加工过程实现可视化和定量化的探测蛋白质。
本发明的目的在于，制备能够将加工过程可视化的探测蛋白质，并使其最佳化，进而开发将此探测蛋白质用于加工酶的筛选的方法，以及对抑制或促进加工酶活性药剂进行筛选的方法，并将这些方法应用于疾病的治疗、检查以及新药的开发。
附图简要说明
图1：表示能够传递能量的分泌型嵌合蛋白质上插入了加工部位(A)、及该部位发生变异(B)或缺失(C)的区域的构建体。
图2：表示能够传递能量的分泌型嵌合蛋白质上的加工部位区域(A)、该部位发生变异(B)或缺失(C)的区域的DNA序列。
图3：表示已导进插入了加工序列的分泌型嵌合蛋白质的细胞内和细胞外的蛋白印迹分析，以及导入了加工酶时切割效率变化的检测结果。
图4：表示将加工酶导入已表达插入了加工序列的分泌型嵌合蛋白质的细胞时，能量的传递效率、光谱变化。(a)只有Vluc-NST/Nco-EYFP、(b)在Vluc-NST/Nco-EYFP中表达PC1、(c)在Vluc-NST/Nco-EYFP中表达PC2、(d)Vluc。
图5：表示插入了加工序列的分泌型嵌合蛋白质的能量传递效率由于切割酶PC1的作用而大幅度减少，同样根据蛋白印迹的结果定量切割效率的结果。
发明的公开
若构建出插有在发光酶与荧光蛋白质间可能发生能量传递的加工区域的探测蛋白质构建体，加工前后能量传递就会发生变化，随之而来的是发光光谱也会发生变化。由于以这种光谱变化为指标，就有可能实现加工后活性肽的定量化、加工酶活性的定量化以及加工部位的定位分析，并进而能够筛选调控加工酶活性的基因或蛋白质，并可能用于开发以加工为指标的各种疾病的治疗方法和新药(即开发出对加工有促进或抑制作用的药物)。
本发明人为解决上述课题反复专心研究的结果是，制备出一种探测蛋白质，该蛋白质含有通过加工能被切割的加工切割区域以及经加工显示出发光荧光能量特性变化的特性可变区域。
本发明涉及以下探测蛋白质、编码这些蛋白质的基因、采用制备成的该探测蛋白质加工的细胞或蛋白质、以及筛选促进或抑制加工的化合物的方法。
1.一种可测定蛋白质加工的探测蛋白质，其包括至少1个切割区域和至少1个特性可变区域，所述切割区域含有可被加工的氨基酸残基或氨基酸残基序列，所述特性可变区域由于受到加工而表现出能量传递特性变化。
2.根据第1项所述的探测蛋白质，其中特性可变区域含有发光蛋白质和荧光蛋白质。
3.根据第1项所述的探测蛋白质，所述探测蛋白质为分泌蛋白质。
4.根据第1项所述的探测蛋白质，其中，切割加工切割区域的加工酶为选自PC1、PC2、成对碱性氨基酸蛋白酶、蛋白酶体、组织蛋白酶及凝血酶的任一种。
5.根据第4项所述的探测蛋白质，其中加工酶为PC1。
6.根据第1项所述的探测蛋白质，其中加工切割区域位于构成特性可变区域的发光蛋白质与荧光蛋白质之间。
7.根据第1项所述的探测蛋白质，其中发光蛋白质是来源于从夜光海萤、绯虾、発光昆虫(萤火虫、桅灯甲虫等)、发光性涡鞭毛藻、发光蠕虫、帽贝(Latia neritoides)、肾海鳃(Renilla)及多管水母属(水母发光蛋白)中选择的任一种的荧光素酶。
8.根据第1项所述的探测蛋白质，其中荧光蛋白质是来源于从绿色荧光蛋白质(GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、蓝色荧光蛋白质(BFP)、蓝绿色荧光蛋白质(CFP)、DsRED及红色荧光蛋白质(RFP)中选择的任一种的蛋白质。
9.根据第2项所述的探测蛋白质，其特征在于，特性可变区域的发光蛋白质是分泌型夜光海萤(Cypridina noctiluca)发光酶，特性可变区域的荧光蛋白质是来源于凯旋发光水母(luminescent Aequoreavictoria)的突变体的黄色荧光蛋白。
10.根据第1项所述的探测蛋白质，其中加工切割区域由含有加工酶酶切位点的6-100个氨基酸序列构成。
11.根据第1项所述的探测蛋白质，其含有以下a)和b)中任一氨基酸序列：
a)由序列2中记载的氨基酸序列所表示的探测蛋白质；
b)序列2记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、添加、缺失或插入，但仍然保持发光蛋白质与荧光蛋白质之间的能量传递特性，并且保持加工切割区域中由加工酶酶切活性的探测蛋白质。
12.根据第1项所述的探测蛋白质，其中加工切割区域为SEQKQLQKRFGGFTGG。
13.编码第1-12中的任一项所述探测蛋白质的DNA。
14.根据第13项所述的DNA，其含有以下c)-d)中任一项的DNA序列：
c)以序列1记载的碱基序列表示的DNA；
d)以序列1记载的碱基序列表示的DNA或与其在严紧条件下杂交的互补DNA，该DNA编码的蛋白质保持了发光蛋白质与荧光蛋白质之间的能量传递特性并且保持加工切割区域中加工酶的酶切活性。
15.含有第13项中所述DNA的表达载体。
16.检测细胞的加工能力的方法，其特征在于将第1-12任一项中所述探测蛋白质、第13-14项中所述DNA以及第15项中所述的表达载体的任一个导入到某种特定细胞中，定量评估探测蛋白的能量传递特性变化。
17.根据第16项所记载的方法，其中所述细胞是来自人类的细胞。
18.检测被检测蛋白质的加工能力的方法，包括使被检测蛋白质与第1-12项中任一项所述探测蛋白质发生反应，测定该探测蛋白质的能量传递特性变化的步骤。
19.筛选加工酶的方法，包括使被检测蛋白质与第1-12项中任一项所述探测蛋白质之间发生反应的步骤；检测与被检测蛋白质反应前后该探测蛋白质的能量传递特性之变化，选择使该探测蛋白质特性发生变化的被检测蛋白质的步骤。
20.筛选促进或抑制加工的化合物的方法，包括使被测试样与加工酶以及第1-12项中任一项中所述探测蛋白质接触的步骤；在与被测试样接触前后检测该探测蛋白质能量传递特性的变化，选择促进或抑制该特性的试样的步骤。
21.筛选促进或抑制加工(酶活性)的化合物的方法，包括制备导入有第1-12项中任一项中所述探测蛋白质、第13-14项所述DNA序列以及第15项中所述表达载体中的任一个的细胞的步骤；在有和没有被测试样存在条件下检测该细胞中所表达的探测蛋白质的能量传递特性变化，选择促进或抑制该特性变化的试样的步骤。
此外，本申请说明书还公开了以下发明：
1.下列1)-4)所示蛋白质
1)由序列2中记载的氨基酸序列表示的探测蛋白质；
2)序列2记载的氨基酸序列中，通过加工被切割的区域以及伴随产生的特性可变区域(发光蛋白质与荧光蛋白质)其中之一的序列或位点发生变化的探测蛋白质；
3)序列2中记载的氨基酸序列中以下划线表示的加工切割区域(含有疼痛传导肽前体蛋白质的切割位点的由18个氨基酸残基组成的序列)，含有加工切割部位前后10-100个氨基酸残基，最佳是20-40个氨基酸残基被替换后所构成的探测蛋白质；以及
4)一种最佳探测蛋白质，其特性可变区域是由于加工切割区域之前和之后三维结构变化而导致特性可以变化的区域。由于发光蛋白质和荧光蛋白质插入到探测蛋白质中加工区域前后两侧，无法实现从发光蛋白质向荧光蛋白质的能量传递，因此发光颜色发生了变化。
在理想的实施方式中，在探测蛋白质的特性可变区域两端分别插入发光蛋白质和荧光蛋白质。在该探测蛋白质中，任何一个都可以存在于N末端，但从N末端开始按发光蛋白质，荧光蛋白质的顺序安排更为理想。在含有发光蛋白质和荧光蛋白质的探测蛋白质中，在不发生加工的情况下，发光蛋白质【分泌型夜光海萤(Cypridina noctiluca)发光酶】所发蓝光能量传递到荧光蛋白质突变体(EYFP)上，该探测蛋白质发出黄绿色光，发生加工情况而未实现能量传递，则探测蛋白质中仅发出蓝光。以这种特性可变区域中的发光颜色变化为指标可以分析加工过程。
虽然已有能够观察细胞内磷酸化和钙的动态的探测蛋白质，而能对加工过程可视化定量化的探测蛋白质是本发明人首次证实的。本发明人还研究了以荧光蛋白质和荧光蛋白质间，或发光蛋白质和荧光蛋白质间能量传递的变化为指标分析细胞机能的系统，并首次利用于分析加工过程的系统。
下面，对本发明进行更详细的说明。
本发明的探测蛋白质的特征在于含有加工切割区域和特性可变区域。
所谓加工切割区域就是受加工酶切割的含有2个以上氨基酸的区域，作为探测对象的加工酶，其种类不同，氨基酸序列也不同。
本发明中，所谓加工切割区域就是指含有加工酶可以识别和切割的氨基酸酸序列的区域，其含有1个以上氨基酸，作为探测对象的加工酶，其氨基酸序列随加工酶的种类不同而不同。例如，在序列2所示探测蛋白质中，加工酶PC1识别并切割位点[KR]，尽管序列2中有4个[KR](荧光素酶部分两个，加工切割区域一个，YFP中一个)，但切割只发生在加工切割区域。因此，切割加工区域不仅含有切割位点(KR)，还含有使酶得以识别并切割该切割位点的辅助部分，也可以含有基本不影响或完全不影响切割的附加序列。加工切割区域的一个例子，是和加工酶(PC1)相应的区域[SEQKQLQKRFGGFTGG]。
下面以加工酶PC1为例对加工切割区域进行说明。
PC1的切割识别序列为Lys-Arg，加工切割区域含有Lys-Arg，而且可将由其C末端侧及N末端侧开始的3-50个，更佳为4-40个，最佳是5-20个氨基酸连接起来构成加工切割区域。加工切割区域所采用的氨基酸可以是Gly，Ala，His，Arg，Lys，Ser，Cys(包括胱氨酸)，Thr，Met，Phe，Tyr，Trp，Leu，Lle，Val，Glu，Asp，Gln，Asp，Pro等构成蛋白质的常见氨基酸，也可以是Sar，β-丙氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、磺基丙氨酸等其它天然或合成氨基酸。
上面说明了加工酶PC1的情况，也可以同样设计出与其它加工酶相应的加工切割区域。
切割区域的氨基酸总数约6-100个，较合适是约8-50个，更佳约为10--40个。
加工酶并没有特殊限制，只要是限制性分解生物体内合成的蛋白质前体并将其转换为成熟蛋白质的酶即可，例如PC1，PC2，成对碱性氨基酸蛋白酶、蛋白酶体、组织蛋白酶及凝血酶。
下表列出了PC1和其它加工酶及其切割区域。
表1
加工酶 加工切割位点的氨基酸序列实例 PC1 KR
加工酶 加工切割位点的氨基酸序列实例 PC2 KR 成对碱性氨基酸蛋白酶 RRKR 蛋白酶体 KM 组织蛋白酶 KM 凝血酶 LVPR
例如，PC1，PC2，成对碱性氨基酸蛋白酶这三种加工酶中，无论哪种都是切割KR的C末端蛋白质，由于KR前后的序列或整个蛋白质的结构发生变化，从而使得被特定加工酶切割成为可能。
作为探测对象的加工酶为1种时，含有1个切割识别序列即可，同时探测多种加工酶时，对应于两种以上加工酶，可在切割区域导入的各自不同的切割识别序列。此外，通过构建仅含有加工酶特定的切割识别序列，而没有其它加工酶的切割识别序列的切割区域，能够筛选出仅对特定加工酶活性进行调节的化合物。而且，以对多种底物发生作用的1种加工酶为对象时，通过适当选择切割识别序列及其前后序列，例如和特定的底物的序列相适配，可筛选出仅对特定底物的加工起促进或抑制作用的化合物。
当特性可变区域被加工酶切割时，只要其能量传递特性发生变化即可，例如可以是含有组合了发光蛋白质与荧光蛋白质，或荧光蛋白质与着色蛋白质等的区域。
在通过加工切割区域连接发光蛋白质与荧光蛋白质时，在切割加工切割区域之前，会发生由发光蛋白质向荧光蛋白质的能量传递，但在切割后不发生这种能量的传递。其优点是可容易地通过测定能量传递来定量是否发生了切割。发光蛋白质和荧光蛋白质以及加工切割区域最好是按发光蛋白质-加工切割区域-荧光蛋白质的顺序连接，只要加工酶切割会产生发光荧光特性变化，也可以按荧光蛋白质-加工切割区域-发光蛋白质的顺序连接。
此外，也可以在不对发光蛋白质的发光特性产生重大影响的部位导入加工切割区域。这种情况下，发光蛋白质在加工后可能失去发光特性。
同样，也可以在不对荧光蛋白质的荧光特性产生重大影响的部位导入加工切断区域。这种情况下，荧光蛋白质在加工后可能失去荧光特性。
发光蛋白质可以是来自各种发光生物，例如夜光海萤、绯虾、発光昆虫(萤火虫、桅灯甲虫等)、发光性涡鞭毛藻、发光蠕虫、帽贝(Latianeritoides)、肾海鳃(Renilla)及多管水母属(水母发光蛋白)等的荧光素酶。由于海萤虫·荧光素酶是分泌型的，如果采用它，探测蛋白质最好也是分泌型的。如果使用分泌型探测蛋白质，不破碎细胞就能够对活细胞内加工过程发生的程度进行评价。在采用非分泌型荧光素酶，例如来自肾海鳃属的荧光素酶时，也可以在N末端导入分泌型蛋白质而制备成分泌型发光蛋白质使用。
荧光蛋白质，有如绿色荧光蛋白质(GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、蓝色荧光蛋白质(BFP)、蓝绿色荧光蛋白质(CFP)、DsRED、红色荧光蛋白质(RFP)等等。着色蛋白质则可举蓝色着色蛋白质(藻蓝蛋白)、红色着色蛋白质(藻红蛋白)为例。藻蓝蛋白和藻红蛋白能够吸收萤荧光素酶发出的光。
本发明所选择的荧光蛋白质，是从生物发光蛋白质放出的光能成为荧光蛋白质的激发波长。这种组合的例子如下所示。
表2
生物发光蛋白质 荧光蛋白质或着色蛋白质 夜光海萤荧光素酶 GFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、RFP 萤火虫荧光素酶 DsRED、藻蓝蛋白、藻红蛋白 发光性涡鞭毛藻荧光素酶 GFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、RFP 桅灯甲虫荧光素酶 DsRED 肾海鳃荧光素酶 GFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、RFP 水母发光蛋白 GFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、RFP
在一个最佳的实施方式中，本发明的探测蛋白质用以下1)-3)所示的蛋白质为例来说明。
1)序列2记载的氨基酸序列表示的探测蛋白质。
2)序列2记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、被替换或添加而组成的氨基酸序列，并且有发光酶活性、荧光蛋白质活性和能量传递活性的探测蛋白质。
3)序列1记载的碱基序列表示的DNA或者与其在严紧条件下杂交的互补DNA编码的蛋白质，并有发光蛋白质活性，荧光蛋白质活性以及能量传递活性的探测蛋白质。
2)所示的蛋白质是在1)的蛋白质中导入了不会造成发光蛋白质活性丧失的变异而所产生的蛋白质。这种变异除了在自然界中会发生外，还包含人工诱变。进行人工诱变的手段，可以是定点诱变法(NucleicAcids Res.10，6487-6500，1982)等，但并不限于这些方法。变异的氨基酸数目以不丧失分泌、发光、荧光活性以及能量传递活性为准，不限定具体数目，通常为20个氨基酸以内，15个氨基酸亦可，更佳是10个氨基酸以内，最好是5个氨基酸以内。导入变异的蛋白质是否保留了发光和荧光活性，可根据检测该种蛋白质的发光和荧光活性进行判断。
3)所示的蛋白质是通过DNA相互杂交获得的具有分泌型发光酶活性、荧光蛋白质活性以及能量传递活性的探测蛋白质。3)所示的蛋白质中所谓“严紧杂交条件”是指只会发生特异性杂交，而不会发生非特异性杂交的条件。这种条件通常是指“1×SSC，0.1％SDS，37℃”，较好的条件是“0.5×SSC，0.1％SDS，42℃”，更好的条件是“0.2×SSC，0.1％SDS，65℃”。通过杂交所获得的DNA的序列与序列1记载的碱基序列所表示的DNA通常有高度同源性。所谓高度同源性是指60％以上同源，较好是75％以上同源，更好是90％以上同源。
本发明的蛋白质可通过将下述本发明的基因重组到表达载体中，在适当的宿主细胞中表达而获得。表达载体可采用例如pBT-VL-b-YFP等，宿主细胞可采用大肠杆菌BL21菌株等。
本发明的基因包含以下1)-2)所示基因。
1)序列1记载的碱基序列表示的基因。
2)序列1记载的碱基序列表示的DNA或与其互补DNA在严紧条件下杂交的DNA编码的DNA序列。
上述DNA编码的蛋白质是利用DNA相互杂交获得的含有分泌型发光酶活性、荧光蛋白质活性以及能量传递活性的探测蛋白质。
在本说明书中所称“严紧杂交条件”是指使之仅发生特异性杂交，而不发生非特异性杂交的条件。这种条件通常是指“1×SSC，0.1％SDS，37℃”，较好的条件是“0.5×SSC，0.1％SDS，42℃”，更好的条件是“0.2×SSC，0.1％SDS，65℃”。通过杂交所获得的DNA的序列与序列1记载的碱基序列所表示的DNA通常有高度同源性。所谓高度同源性是指60％以上同源，较好是75％以上同源，更好是90％以上同源。
本发明的蛋白质可通过将下述本发明的基因重组到表达载体中，在适当的宿主细胞中表达而获得。表达载体可采用例如pBT-VL-mp-YFP(VL表示夜光海萤荧光素酶，mp表示探测肽，YFP表示黄色荧光蛋白质)等作为表达载体，宿主细胞可采用哺乳动物细胞、酵母菌等的真核生物细胞、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、藻类、真菌类等的原核生物细胞等。以上各种细胞都可以采用，最佳的宿主细胞为哺乳动物细胞培养物COS7细胞系(关键是该细胞系中贯穿了哺乳类细胞系统的蛋白质合成，蛋白质修饰加工过程，即这个过程是要被探测的)等。
编码本发明最佳嵌合蛋白质的基因(多聚核苷酸)为：
1)有序列1记载的碱基序列的基因。
2)有用序列1记载的碱基序列表示的DNA或在严紧条件下和与其互补DNA杂交而成的DNA的基因的。
(筛选方法I)
在特定细胞中导入本发明的探测蛋白质、DNA序列或表达载体其中之一，定量评定探测蛋白质的能量传递特性的变化。
(筛选方法II)
使被检测蛋白质与本发明的探测蛋白质反应，检测该探测蛋白质的能量传递特性变化，从而检测被检测蛋白质的加工能力。
该方法中，通常探测蛋白质要准备多种，通过对每个探测蛋白质的能量传递特性变化进行检测，可以定量检测被检测蛋白质，是何种加工酶，以及何种加工酶活性更强。
(筛选方法III)
通过以下步骤能够筛选出新的加工酶：使被检蛋白质与本发明探测蛋白质进行反应；在与被测蛋白质反应前后测定该探测蛋白质的能量传递特性变化并选择出使该探测蛋白质特性发生变化的被测蛋白质。
(筛选方法IV)
在无细胞系统中筛选促进或抑制加工过程的化合物的方法包括以下步骤：使被测试样与加工酶以及本发明中的探测蛋白质接触；在与被测试样的接触前后测定该探测蛋白质能量传递特性变化，并选择出促进或抑制该特性的试样。
通过该方法，不用考虑向细胞内移动等因素，就可以筛选出促进或抑制加工过程的化合物。
筛选促进或抑制加工(酶活性)的化合物的方法包括以下步骤：制备导入了本发明的探测蛋白质、编码该探测蛋白质的DNA序列以及含有该DNA序列的表达载体三者之一的细胞；在有无被测试样存在条件下测定在该细胞中表达的探测蛋白质的能量传递特性变化，选择出促进或抑制该特性的试样。
通过该方法，可以筛选出口服等方式经血液转移发挥药效的化合物。
本发明提供了一种新的能够对加工过程定量化的探测蛋白质以及编码该蛋白质的基因和调节该酶表达的基因。使用该探测蛋白质，不破碎细胞就可以实现细胞内发生的加工过程的可视化。这就使得其在疾病的治疗，检查以及新药开发中的应用成为可能。
下面，列举实施例对本发明进行详细的说明。
为实施发明的最佳方式
下面，通过实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
已知疼痛传导肽和痛敏肽是同一种蛋白质前体在加工过程中经切割酶切出的激素肽，它们在生物体内传递痛觉时，有调节相互激活的效果。将经过加工的疼痛传导肽(图中表示为NST)和痛敏肽(图中表示为Noc)的肽序列(图1(A))插入到一种发光蛋白质和荧光蛋白质间可发生能量传递的分泌型嵌合蛋白质的插入部分，制备成探测蛋白质，并且使其肽序列中对识别切割所必需的Lys-Arg变异成Gly-Gly(图1(B))或发生缺失(图1(C))。这些肽类分别称为Vluc-NST/Noc-EYFP、mut-Vluc-NST/Noc-EYFP和del-Vluc-NST/Noc-EYFP。制备方法是，切除探测蛋白质的插入限制性酶切位点BamH I位点后，通过连接酶反应将化学合成的图2所示的DNA序列与其连接。插入的部分已通过DNA序列得以确认。
实施例2
用市售的导入试样将含有三种探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP、mut-Vluc-NST/Noc-EYFP和del-Vluc-NST/Noc-EYFP基因的载体导入到神经细胞来源的NG108-15中。用蛋白印迹法分析分泌到培养液中的蛋白质(图3)。以没有插入序列的Vluc-EYFP作为对照。抗夜光海萤荧光素酶抗体(抗-Vluc)是一种能够识别探测蛋白质N末端的发光酶的抗体，四种探测蛋白质的分子量均为95kDa。此外，抗绿色荧光蛋白质抗体(抗-GFP)是能够识别蛋白质C末端发光酶的抗体，因此四个探测蛋白质的主要蛋白质分子量均为95kDa。但是，与95kDa相比在Vluc-NST/Noc-EYFP探测蛋白质中能够确认的条带很小，大小为27kDa。由于加工酶在神经细胞来源的NG108-15中表达，该条带是在探测蛋白质被切割后，抗体识别切割后的C末端的EYFP产生的条带。此外，发生变异及缺失的mut-Vluc-NST/Noc-EYFP、del-Vluc-NST/Noc-EYFP中则不能够检出该27kDa条带，显然插入了加工酶的氨基酸序列是能够精确识别的。但是，可以认为被抗-GFP抗体识别的68kDa条带是人为赝像。此外，为了了解在Vluc-NST/Noc-EYFP的探测蛋白质中发生的切割时，这些在胰岛素，吗啡肽等物质的切割和产生中有代表性的加工酶PC1、PC2究竟是怎样的作用，将PC1和PC2导入探测蛋白质的细胞中并强制它们表达。结果表明PC1中27kDa的条带，比95kDa条带显著增强，PC2则几乎没有变化。该结果首次在世界上证明疼痛传导肽和痛敏肽(NST/Noc)之间发生的加工过程是由PC1进行的。
实施例3
用市售的导入试样将含有探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP及EYFP基因的载体导入到神经细胞来源的NG108-15中。并在表达了探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP基因的细胞中强制表达了加工酶PC1和PC2。测定从这4种细胞分泌的培养液的发光光谱(图4)。在探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP中，观测到与单独由Vluc产生的发光光谱一致460nm处的峰，以及探测蛋白质中发生能量传递导致的525nm峰。在这种探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP中表达了加工酶PC1或PC2的细胞的培养液中，表达PC2时光谱没有变化，表达PC1时，525nm的峰减小。这个结果和western blot法的结果所证明的一样，表明加工酶PC1切割探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP，探测蛋白质内不发生能量传递。也就是说，通过检测培养液的发光光谱，能够不破坏细胞就对活细胞内发生的加工水平进行评定。
实施例4
通过western blot法检测了导入神经细胞来源的NG108-15中的探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP的切断效率，用图像分析对未切断蛋白质的质量进行了定量化(图5B)。此外，通过比较探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP与Vlu单独发光光谱求出光谱差异(图4内图)，以光谱的面积来评定能量传递效果(Bret信号)(图5A)。证明将PC2导入探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP以及探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP时，未切割蛋白质的质量和Bret信号都不发生切割；另一方面，将PC1导入探测蛋白质Vluc-NST/Noc-EYFP时，未切割蛋白质的质量和Bret信号都显示探测蛋白质约60％被切割。细胞内发生的加工过程的效率尽管无法通过直接进行电泳等方法定量，却可通过测定培养液的发光光谱进行瞬时评价。
序列表
<110>独立行政法人产业技术综合研究所
(NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY)
<110>独立行政法人科学技术振兴机构
(JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY)
<120>用于检测蛋白质加工的探测蛋白质
(Monitor protein for measuring protein processing)
<130>SCT051938-25
<150>JP2002-360744
<151>2002-12-12
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2052
<212>DNA
<213>mammalian
<400>1
atgaagataa taattctgtc tgttatattg gcctactgtg tcaccgacaa ctgtcaagat 60
gcatgtcctg tagaagcgga accgccatca agtacaccaa cagttccaac ttcttgtgaa 120
gctaaagaag gagaatgtat agataccaga tgcgcaacat gtaaacgaga tatactatca 180
gatggactgt gtgaaaataa accagggaag acatgctgta gaatgtgcca gtatgtgatt 240
gaatgcagag tagaagcagc tggttatttt agaacgtttt acggcaaaag atttaatttt 300
caggaacctg gtaaatatgt gctggctagg ggaaccaagg gtggcgattg gtctgtaacc 360
ctcaccatgg agaatctaga tggacagaag ggagctgtgc tgactaagac aacactggag 420
gttgcaggag acgtaataga cattactcaa gctactgcag atcctatcac agttaacgga 480
ggagctgacc cagttatcgc taacccgttc acaattggtg aggtgaccat tgctgttgtt 540
gaaataccgg gcttcaatat cacagtcatc gaattcttta aactaatcgt gattgatatt 600
ctgggaggaa gatctgtgag aattgctcca gacacagcaa acaaaggact gatatctggt 660
atctgtggta atctggagat gaatgacgct gatgacttta ctacagatgc agatcagctg 720
gcgatccaac ccaacataaa caaagagttc gacggctgcc cattctatgg caatccttct 780
gatatcgaat actgcaaagg tctgatggag ccatacagag ctgtatgtcg taacaatatc 840
aacttctact attacactct atcctgtgcc ttcgcttact gtatgggagg agaagaaaga 900
gctaaacacg tccttttcga ctatgttgag acatgcgctg cgccggaaac gagaggaacg 960
tgtgttttat caggacatac tttctatgac acattcgaca aagcaagata tcaattccag 1020
ggcccatgca aggagattct gatggccgca gactgttact ggaacacatg ggatgtaaag 1080
gtttcacata gagacgtcga atcatacact gaggtagaga aagtaacaat caggaaacag 1140
tcaactgtag tagatctcat tgtggatggc aagcaggtca aggttggagg agtggatgta 1200
tctatcccgt acagctctga gaacacttcc atatactggc aggatggaga catcctgacg 1260
acggccatcc tacctgaagc tcttgtcgtt aagttcaact ttaagcagct ccttgtagtt 1320
catatcagag atccattcga tggaaagaca tgcggcatat gtggtaacta taatcaagat 1380
tcaactgatg atttctttga cgcagaagga gcatgcgctc taacccccaa ccccccagga 1440
tgtacagagg aacagaaacc agaagctgag cgactttgca ataatctctt tgattcttct 1500
atcgacgaga aatgtaatgt ctgctacaag cctgaccgga ttgcccgatg tatgtacgag 1560
tattgcctga ggggacaaca aggattttgt gaccatgctt gggagttcaa gaaagaatgc 1620
tacataaaac atggagacac tctagaagta ccacctgaat gtcaaggatc cacagagccc 1680
ggcctggagg aggtggggga gattgagcag aaacagctgc agaagcggtt cgggggcttc 1740
accggggccc ggaagtcggc ccggaagttg gccaaccagg gatccgtgag caagggcgag 1800
gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 1860
aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 1920
ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccttcggc 1980
tacggcctgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 2040
tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 2100
tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 2160
aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 2220
aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 2280
aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 2340
acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag ctaccagtcc 2400
gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 2460
gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aa 2502
<210>2
<211>833
<212>PRT
<213>mammalian
<400>2
Met Lys Ile Ile Ile Leu Ser Val Ile Leu Ala Tyr Cys Val Thr Asp
1 5 10 15
Asn Cys Gln Asp Ala Cys Pro Val Glu Ala Glu Pro Pro Ser Ser Thr
20 25 30
Pro Thr Val Pro Thr Ser Cys Glu Ala Lys Glu Gly Glu Cys Ile Asp
35 40 45
Thr Arg Cys Ala Thr Cys Lys Arg Asp Ile Leu Ser Asp Gly Leu Cys
50 55 60
Glu Asn Lys Pro Gly Lys Thr Cys Cys Arg Met Cys Gln Tyr Val Ile
65 70 75 80
Glu Cys Arg Val Glu Ala Ala Gly Tyr Phe Arg Thr Phe Tyr Gly Lys
85 90 95
Arg Phe Asn Phe Gln Glu Pro Gly Lys Tyr Val Leu Ala Arg Gly Thr
100 105 110
Lys Gly Gly Asp Trp Ser Val Thr Leu Thr Met Glu Asn Leu Asp Gly
115 120 125
Gln Lys Gly Ala Val Leu Thr Lys Thr Thr Leu Glu Val Ala Gly Asp
130 135 140
Val Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Ala Asp Pro Ile Thr Val Asn Gly
145 150 155 160
Gly Ala Asp Pro Val Ile Ala Asn Pro Phe Thr Ile Gly Glu Val Thr
165 170 175
Ile Ala Val Val Glu Ile Pro Gly Phe Asn Ile Thr Val Ile Glu Phe
180 185 190
Phe Lys Leu Ile Val Ile Asp Ile Leu Gly Gly Arg Ser Val Arg Ile
195 200 205
Ala Pro Asp Thr Ala Asn Lys Gly Leu Ile Ser Gly Ile Cys Gly Asn
210 215 220
Leu Glu Met Asn Asp Ala Asp Asp Phe Thr Thr Asp Ala Asp Gln Leu
225 230 235 240
Ala Ile Gln Pro Asn Ile Asn Lys Glu Phe Asp Gly Cys Pro Phe Tyr
245 250 255
Gly Asn Pro Ser Asp Ile Glu Tyr Cys Lys Gly Leu Met Glu Pro Tyr
260 265 270
Arg Ala Val Cys Arg Asn Asn Ile Asn Phe Tyr Tyr Tyr Thr Leu Ser
275 280 285
Cys Ala Phe Ala Tyr Cys Met Gly Gly Glu Glu Arg Ala Lys His Val
290 295 300
Leu Phe Asp Tyr Val Glu Thr Cys Ala Ala Pro Glu Thr Arg Gly Thr
305 310 315 320
Cys Val Leu Ser Gly His Thr Phe Tyr Asp Thr Phe Asp Lys Ala Arg
325 330 335
Tyr Gln Phe Gln Gly Pro Cys Lys Glu Ile Leu Met Ala Ala Asp Cys
340 345 350
Tyr Trp Asn Thr Trp Asp Val Lys Val Ser His Arg Asp Val Glu Ser
355 360 365
Tyr Thr Glu Val Glu Lys Val Thr Ile Arg Lys Gln Ser Thr Val Val
370 375 380
Asp Leu Ile Val Asp Gly Lys Gln Val Lys Val Gly Gly Val Asp Val
385 390 395 400
Ser Ile Pro Tyr Ser Ser Glu Asn Thr Ser Ile Tyr Trp Gln Asp Gly
405 410 415
Asp Ile Leu Thr Thr Ala Ile Leu Pro Glu Ala Leu Val Val Lys Phe
420 425 430
Asn Phe Lys Gln Leu Leu Val Val His Ile Arg Asp Pro Phe Asp Gly
435 440 445
Lys Thr Cys Gly Ile Cys Gly Asn Tyr Asn Gln Asp Ser Thr Asp Asp
450 455 460
Phe Phe Asp Ala Glu Gly Ala Cys Ala Leu Thr Pro Asn Pro Pro Gly
465 470 475 480
Cys Thr Glu Glu Gln Lys Pro Glu Ala Glu Arg Leu Cys Asn Asn Leu
485 490 495
Phe Asp Ser Ser Ile Asp Glu Lys Cys Asn Val Cys Tyr Lys Pro Asp
500 505 510
Arg Ile Ala Arg Cys Met Tyr Glu Tyr Cys Leu Arg Gly Gln Gln Gly
515 520 525
Phe Cys Asp His Ala Trp Glu Phe Lys Lys Glu Cys Tyr Ile Lys His
530 535 540
Gly Asp Thr Leu Glu Val Pro Pro Glu Cys Gln Gly Ser Thr Glu Pro
545 550 555 560
Gly Leu Glu Glu Val Gly Glu Ile Glu Gln Lys Gln Leu Gln Lys Arg
565 570 575
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Asn
580 585 590
Gln Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
595 600 605
Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val
610 615 620
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
625 630 635 640
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
645 650 655
Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His
660 665 670
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val
675 680 685
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
690 695 700
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
705 710 715 720
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu GLy His Lys Leu
725 730 735
Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
740 745 750
Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp
755 760 765
Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly
770 775 780
Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser
785 790 795 800
Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu
805 810 815
Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr
820 825 830
Lys
<210>3
<211>16
<212>PRT
<213>mammalian
<400>3
Ser Glu Gln Lys Gln Leu Gln Lys Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Gly
1 5 10 15
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>mammalian
<400>4
Ser Glu Gln Lys Gln Leu Gln Gly Gly Phe Gly Gly Phe Thr Gly Gly
1 5 10 15
<210>5
<211>14
<212>PRT
<213>mammalian
<400>5
Ser Glu Gln Lys Gln Leu Gln Phe Gly Gly Phe Thr Gly Gly
1 5 10