不溶性酶促生物催化剂的保护方法,其获得的生物催化剂以及带有固定化生物催化剂的生物反应器转让专利
申请号 : CN200380107752.8
文献号 : CN1732256B
文献日 : 2010-11-10
发明人 : R·D·C·乔达诺 , R·D·L·C·乔达诺 , A·L·D·O·费雷里亚
申请人 : 圣卡洛斯联合大学基金会 , 圣保罗国情研究援助基金会
摘要 :
本发明目的在于提供一种用于保护酶促生物催化剂的方法，所述酶促生物催化剂由初级支持物构成，其被次级基质包裹。更具体的，本发明由具有如下构造的生物反应器体现，其在长期运行后保持生物催化剂的物理完整性和催化活性，同时，允许受保护的生物催化剂从固体中容易的分离，在反应过程中沉淀。更具体的，本发明涉及使用所述生物反应器用于β-内酰胺抗生素的酶促合成，包括不可溶性酶促催化剂，其具有用于固定化的初级基质，所述基质被次级基质包围，其能够保持100％的催化物理完整性和大约100％的催化活性。
权利要求 :
1.一种制备不可溶性生物催化剂的方法，所述生物催化剂由酶、能被活化的初级支持物以及由聚合物溶液制成的次级基质构成，所述活化提供了酶的共价固定化，其中酶包含羟基、氨基、羧基和/或巯基，初级支持物包含醛基、环氧基和/或环亚氨碳酸酯基团，其中初级支持物被次级基质包围，初级支持物和次级基质之间的比例根据希望的每克生物催化剂的最终酶活性在1∶5-1∶20之间变化，并且其中由包含事先固定化的酶的初级支持物和聚合物悬浮液形成的悬浮液被挤出呈球形，其终粒径范围为0.5±0.1mm-2.0±0.1mm。
2.权利要求1的方法，其中次级基质选自果胶、藻酸盐和角叉胶。
3.权利要求1的方法，其中初级支持物和次级基质之间的比例为1∶10。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中由包含事先固定化的酶的初级支持物和聚合物悬浮液形成的悬浮液滴与含有至少一种二价阳离子的盐溶液接触。
5.权利要求4的方法，其中二价阳离子选自钙、镁、锌或过渡金属。
6.权利要求5的方法，其中溶液是0.2M CaCl2，固化时间等于2小时。
7.按照权利要求1-6中任一项的方法获得的生物催化剂。
8.带有固定化的权利要求7的生物催化剂的生物反应器，其中搅拌由Taylor-Couette涡流促进，以便均一化培养液并消除或降低对物质传递的颗粒外阻力。
9.带有固定化的权利要求7的生物催化剂的生物反应器，其中搅拌通过惰性气体鼓泡来增强。
10.权利要求8的生物反应器，包含一个保持平衡状态的内部圆柱体，仅在其顶部端点有支持。
11.权利要求10的生物反应器，在反应器的顶部具有小的顶部的空气或惰性气体存在于液体表面的上方。
12.权利要求10的生物反应器，其中内部圆柱体的转动范围为200-2000rpm。
13.权利要求10的生物反应器，其中颗粒被包裹在内部转动圆柱体和外部固定体之间的环状间隙中，其中内径和外径的比例范围为0.20-0.60。
14.权利要求13的生物反应器，其中其他几何形状代替内部转动圆柱体，其选自圆锥截面或其他回转表面。
15.权利要求9的生物反应器，其中混合通过反应器底部的分布器促进，且任选地，通过添加内部圆柱体促进。
16.权利要求8-15任一项所述的生物反应器用于β-内酰胺抗生素合成的用途，其中所述生物催化剂能够保留其100％的物理完整性和约100％的催化完整性。
17.权利要求16的用途，其中β-内酰胺抗生素选自由酯或胺与β-内酰胺核反应获得的那些。
18.权利要求17的用途，其中固相中的产物在反应器的底部、顶部或侧面排出，任选地通过部分或完全的液相回流。
19.权利要求17的用途，其中在大约100小时的运转后，生物催化剂保留了100％活性以及完全的物理完整性。
说明书 :
发明领域
本发明涉及一种用于制备生物催化剂的方法，所述催化剂由活化的初级支持物(primary support)制成，该支持物与酶相连。所述初级支持物反过来由次级基质包裹，其能够提供机械性保护，并增加颗粒体积，使得在加工中结晶的反应产物之分离特别容易。本发明还涉及一种促进高效搅拌但不损坏生物催化剂的反应器，其使用Taylor-Couette涡流和/或惰性气体注射。
发明背景
生物技术加工工业中全世界范围的竞争提出了数项挑战。其中之一就是涉及控制环境压力的政府性组织的不断增长的需求。因此，寻找新的可持续的同时经济上有竞争力的生物化学方法是该工业中的主要推动力。
本文中，工业中酶的使用日益增加。与传统方法相比，酶促催化具有如下优点：
(i)反应在室温和常压下发生；
(ii)特定反应(反应特异性)在特定位点(位点特异性)发生。因此，可以高产率获得希望的产物；
(iii)由于底物特异性高，仅仅希望的化合物选择性的反应，即使在同一环境中存在其他物种。
但是，酶促催化也存在缺点，即
(i)如果使用游离酶，其在连续批次中的再利用或在连续反应器中的循环不经济，因为其可溶于水，且以低浓度存在；
(ii)另一方面，如果酶被固定化于不溶性支持物，使得其可在长的运行(重复的批次或连续的方法)中使用，支持物基质(通常来说，具有微米级的半径)不是不降低孔扩散效应。在许多情况中，这些生物催化剂(此处理解为支持物-酶组装物)具有低剪切力抗性；
(iii)这样的低尺寸生物催化剂难以从沉淀的产物中分离，无论何时其存在于方法中。
此外，酶活性可被如下因素降低(有时是不可逆的)：热、有机溶剂、酸或碱、或甚至是反应产物。然而，恰当的生物催化剂(酶-支持物)工程可在催化剂寿命中提供重要的收获。
固定化生物催化剂的研究自50年代中期业已开展。目前，下列方法可用于酶固定化：(i)共价结合、吸附或离子连接至支持物；(ii)交联，当酶分子被聚合功能性反应剂相互交联且变得不溶；(iii)包封，例如在聚合凝胶、微胶囊或脂质液体膜中，和(d)前述方法的组合。
上述方法中，凝胶包封更普通，应用于数种生物催化剂的固定化中。
美国专利4,975,375描述了一种制备生物催化剂的方法，由如下步骤组成(i)降低网状聚合物凝胶的温度，所述凝胶具有特定的相转换温度，且能够可逆性扩张或收缩，在低于其相转换温度时扩张；(ii)将在上述扩张状态的凝胶加入含有酶的液体介质中，使所述酶迁移入其中；且(iii)将至少一部分上述凝胶加热至其相转换温度或高于其相转换温度，从而引起其收缩并因此使酶包埋。
尽管如此，应当指出的是，传统方法具有缺点，诸如：(i)在固定化后酶活性降低；(ii)在固定化过程中缺乏稳定性，使得至少部分分子变性或改变其构象，仍在支持物之外；(iii)催化剂难以活化；(iv)与固定化反应相关的额外的复杂性，其可能难以控制或需要毒性反应剂，难以处理，且(v)在支持物目标位点上酶的正确空间方向和精确定位方面的困难。
酶固定化的新方法与整体生物反应器的新构造之间的结合对于使酶促方法可施行、顺应降低环境压力的趋势、以及与此同时实现高产率都是至关重要的。
生物反应器应当优选的在同一装置中整合期望的生化反应以及期望产物的分离和纯化，诸如其结晶。
对于半合成β-内酰胺抗生素的情形，酶法途径最大的缺点是其低选择性，这是由于能够与β-内酰胺核反应的前体(酯或酰胺)的竞争性水解以及由于抗生素自身的水解。促进合成的酶同时也催化不希望的反应。
第一个半合成β-内酰胺抗生素(衍生自青霉素G的侧链取代)是氨苄青霉素(由Beecham于1961年获得专利)，后来是阿莫西林(Beecham专利，1972)以及半合成头孢菌素IV(头孢菌素IV，Lilly，1970；头孢唑啉，Fujisawa，1974；头孢羟氨苄，BMS，1977等)。全球市场对所述药物的演变是令人难忘的，从1970年的1,000吨/年至2000年的45,000吨/年(Moody H，Hogenboom A，Lange B，Heemskerk D，Dooren TV，Boesten W，Roos E.，Cephadroxyl的酶法生产，口头交流与摘要，第十届欧洲议会关于生物技术书的文集，CAT 12，Madrid，西班牙，2001年7月8-11)。这些方法中使用化学途径用于侧链合成以及抗生素的缩合，连接侧链至合适的β-内酰胺核(6-APA，现在从青霉素G酶法获得；7-ACA从头孢菌素C，且7-ADCA在6-APA的噻唑烷环扩环后产生，也通过化学途径)。所有这些常规方法是稳固的，但是在该领域(包括工业中和研究中)的研究十分激烈，以建立有效的酶促途径。
为增强反应的选择性，应当采用整合的反应器，其带有由固定化酶构成的生物催化剂。在这些反应器中，抗生物浓度超过其溶解性限制了加工条件。由此，希望的产物(在此情况中为抗生素)在受到酶攻击之前将沉淀。
在传统反应器中，所述方法存在一系列缺点。在充分混合的反应器中，搅拌对于生物催化剂的脆弱颗粒而言过于剧烈。流化床反应器需要高循环流速，以维持流态化。固定床反应器在外颗粒膜中有严重的物质传递限制，降低了表观反应速率，因此，降低了该方法的生产率。
因此需要开发制备固定化酶的方法，其与整合的生物反应器相关，以克服上述困难。
发明概述
本发明的目的是提供一种保护酶促生物催化剂的方法，所述生物催化剂由初级支持物构成，其被次级基质包被。
本发明体现为一种保护具有1-4mm半径的酶促生物催化剂的系统。
更具体的，本发明体现为一种具有如下构造的生物反应器，其在长期运行后保持生物催化剂的物理完整性和催化活性，且同时允许被保护的生物催化剂从固体中方便的分离，在反应过程中沉淀。
更具体的是，本发明涉及此处所述的生物反应器用于酶促合成β-内酰胺抗生素的用途，包括不可溶性酶促催化剂，其具有用于固定化的初级基质，所述初级基质被包围在次级基质中，其能够保持100％的催化剂物理完整性和大约100％的催化活性。
附图描述
图1：显示涡流反应器的示意图。
图2：显示气升式反应器的示意图。
图3：显示用苯基氨基乙酸(PG)和AMP结晶合成氨苄青霉素(AMP)，25℃，pH 6.5。酶荷载＝10000IU/L反应器。在每一次运行时连续饲喂一种底物(PGME)。
图4：显示用PG和AMP结晶合成氨苄青霉素，25℃，pH 6.5。酶荷载＝10000IU/L反应器。在每一次运行时连续饲喂两种底物(PGME和6-APA)。
发明详述
本发明在此旨在定义一种包封活性生物催化剂的新方法，使其在长期运转后保持完整性，同时，描述了一种反应器构造，其允许温和(保持生物催化剂的颗粒)以及有效的搅拌(使颗粒悬液均一且避免颗粒外物质传递阻力)。
解决前述困难的一种替代的方式是使用Taylor-Couette涡流反应器，其在两个圆柱体之间的间隙存在环形的涡流(当内部圆柱体转动高于临界速度时)。这种流动模式具有一些优点。反应器的流态可在几乎为活塞流(对于连续反应器)到完全混合反应器之间改变，而不改变驻留时间。温和但有效的搅拌使其可用于需要低剪切力的情形(诸如在酶支持物由二氧化硅(silica)或凝胶制备的情形)。内部圆柱体的转动速率为反应器的操作提供了额外的自由度，允许颗粒流态化而不改变轴流。
整合反应器的另一重要方面是酶载体的保护。当期望的产物沉淀时，支持物必须具有合适的大小，使其易于从产物结晶中分离。同时，支持物必须是柔韧的，以承受这些晶体的生长而不随时间降解。合适的机械以及物化特征的组合是该方法的关键步骤。
在化学和生物化学反应器中应用Taylor-Couette-Poiseuille流早在Kataoka等人的著作中被报道(Kataoka K，Doi HE，Hongo T，Taylor涡流的理想的活塞流性质，Journal of Chemical Engineering Japan，8，472-476，1977)。
Taylor涡流是一种次级流模式，其出现在两个圆柱体(内部转动，外部一般为固定的)之间的环形间隙中(Taylor GI.两个转动圆柱体之间的粘性液体的稳定性，Philosophy Transactions of the Royal Society A，223，289-343，1923；Koschmieder EL.二元室和Taylor涡流，New York：Cambridge University Press，1993)。当轴向Poiseuille流叠加到该模式中，可以连续操作该反应器。在临界转动之上时，从初始的Couette流出现环形涡流。
业已报道台式涡流反应器(VFR)的使用(Cohen S，Maron DM，涡流流态中转动环形反应器的分析，Chemical Engineering Science，46，123-134，1991；Kataoka K，Ohmura N，Kouzu M，Simamura YE，Okubo M，连续Taylor涡流反应器中苯乙烯的乳液聚合，ChemicalEngineering Science，50，1409-1416，1995；Sczechowski JG，Koval CAE，Noble RDF.Taylor涡流反应器用于非均一光催化，ChemicalEngineering Science，50，3163-3173，1995；Leitner NKV，Le Bras E，Foulcault E，Bousgarbiès J-L，用于吸收溶液处理的新光化学反应器设计，Water Science and Technology，35，215-222，1997；Ameer GA，Harmon W，Sasisekharan R，Langer，R.，全血流态化床Taylor-Couette流装置用于酶促肝素中和的研究，Biotechnology and Bioengineering，62，602-608，1999)。Giordano，R.L.C.；Giordano，R.C.；Prazeres，D.M.F.；Cooney，C.L.-Taylor-Poiseuille流反应器分析II：“利用葡萄糖-果糖异构化作为测试反应的反应器建模和操作评估”，Chem.Eng.Science，V.55，F18，p.3611-26，2000；Giordano，R.L.C.；Giordano，R.C.；Cooney，C.L.带有悬浮颗粒的连续Taylor-Couette-Poiseuille涡流酶促反应器的操作″-Process Biochemistry，v.35，F10，p.1093-1011，2000)。
尽管如此，VFR的工业应用仍不普及。
VFR的特殊的一个特征是其用作生物反应器的原因：其流态具有高可变性。改变内部圆柱体的转动，同一装置即可跨越从完美的混合至活塞流反应器的全部范围。该特征使其尤其适用于多种目的的工厂。
当关注不均一体系时，(例如，对于固定化在凝胶基质上的酶或锚定于颗粒上的组织细胞)，内部圆柱体的转动是一个额外的操作变量，其可促进颗粒流态化(Moore CMV.，Taylor-Couette涡流反应器的表征，博士论文，Massachusetts Institute of Technology，Cambridge，EUA，1994)。另一方面，Taylor流的低剪切力对生物方法的应用特别有吸引力。
本发明利用柠檬酸果胶、藻酸盐、角叉胶等包裹另一基质，其可为琼脂糖、几丁质、二氧化硅、微生物(灭活的或未灭活的)等等。例如，果胶凝胶的球形颗粒可被尤其是构型成比琼脂糖凝胶更小，其反过来以特定酶能够被固定化与其上的方式被活化。
按照这种方式，意在保护固定化支持物。同时，获得具有高直径的颗粒，其
(i)避免内部颗粒扩散效应；
(ii)抵抗由机械搅拌引起的剪切力；
(iii)当一种或多种产物沉淀时保持其完整性，以允许反应和分离(通过结晶)步骤在相同装置中的整合；(iv)具有足够的大小，使其在运行终末容易从生物催化剂中分离产物结晶。
这些颗粒反过来通过充分的搅拌系统(诸如Taylor-Couette涡流和/或反应器底部的惰性气体注入)将保留在反应器内的悬液中。通过这种方法，其旨在：
(i)实现颗粒的均一流态化而不暴露于过度剪切力，保持其长期操作的完整性；
(ii)降低颗粒外液体膜中的扩散迟滞；以及
(iii)允许反应器的灵活操作，其根据方法的需要可用于分批、半分批或连续模式。
目标酶事先固定化在活化的不溶性支持物上，允许活性基团的共价连接。例如，固定化可通过在事先活化后的支持物上产生的醛基与酶的氨基连接；或支持物的环氧基与酶的不同活化基团连接，如氨基、羟基、羧基和巯基；或者支持物的环亚氨碳酸酯基团(在用CNBr活化后产生)与酶的氨基连接，以及其它可能的固定化。活化的支持物可以是：孔隙度受控的二氧化硅，其用缩水甘油氧基乙基三甲氧基硅烷或用戊二醛活化；琼脂糖凝胶，其用乙醛酰基(glyoxil)或戊二醛基活化；几丁质凝胶，其用戊二醛活化；环氧支持物，等等。该体系(与酶反应的活化的支持物)此处称为初级基质。
例如，初级基质可以是琼脂糖凝胶，范围从6％-10％(w/w)，交联的，事先用乙醛酰基活化，其促进与酶青霉素G酰化酶之赖氨酸残基上的氨基多重交联。颗粒直径范围可从60μm e 300μm。酶荷载范围可从250IU/(克琼脂糖凝胶)-600IU/(克琼脂糖凝胶)，其中1IU对应于在pH8和37℃下每分钟水解1μmol青霉素G的酶量。
根据本发明，事先制备的初级基质被第二种凝胶包裹，如与钙、藻酸钙或其他二价阳离子如锌或镁或过度金属离子如铁等交联的柠檬酸果胶(次级基质)。果胶或藻酸钙的水溶液(聚合物与总物质的物质比可以在0.5-3％(对于藻酸盐)和2-6％(对于果胶)之间变化)与初级基质以不同的比例混合，这取决于希望的最终酶荷载。一般的，比值为1∶5-1∶20(初级基质物质/次级基质物质)。所得悬液借助于蠕动泵挤出呈球形。球体直径是挤出流的函数，是出口管直径的函数，或用于滴流悬浮液的针头直径的函数，以及平行于管或针头的气流的函数，其用于促进挤出尖液滴的落下。通常，直径在约0.5±0.1mm和2.0+0.1mm。由聚合物溶液和初级基质形成的悬浮液液滴与二价阳离子的盐(如钙离子、镁离子或过度金属离子如铁)相接触。聚合物的链(例如，果胶或藻酸盐)溶于水，大约通过与阳离子交联产生水不溶性的凝胶。起初，只有球体的外面变得坚硬。使凝胶的内部变硬(凝固)之反应速率以及交联阳离子-聚合物的最终数目取决于阳离子和聚合物的浓度、凝固的时间以及反应的温度。例如，0.2M CaCl2溶液与2％(w/w)藻酸盐或6％(w/w)果胶在室温下必须凝固至少2小时。
在酶促反应器中保持果胶或藻酸盐凝胶的完整性需要介质中阳离子的存在，或者，在每批次之间使用再活化循环。在下面的实施例中，钙的比例于24小时运行后重置。在反应器的两次运行之间，将生物催化剂浸于0.2M的CaCl2中2小时。生物催化剂的最终密度可有很大的变化，取决于初级基质和(酶促衍生物/聚合物溶液)的比例。可制造密度高或低于介质的颗粒。在下面的实施例中，颗粒在水中的表观密度为1.01g/mL。
至于反应器，其必须提供足够的搅拌：足以匀浆化介质并消除或降低对物质传递的颗粒外阻力。涡流反应器(VFR)示意图见图1。其可以连续、分批补料或分批模式操作。对于连续操作，补料在反应器的底部或顶部的出口处。
根据本发明，对于内部圆柱体转动在200-2000RPM之间时，颗粒不受剪切力的影响。重要的特征是保持内部圆柱体在垂直位置的平衡。在内部圆柱体的底物的轴承需要在内部圆柱体中的密封(如果反应器的底部是不固定的)，或需要在外壁上密封(如果转动的底部用作容器)。在任何情况下，接近装置底部端的涡旋的转动会将颗粒拽向密封，引起其机械性碾磨。因此，本发明使用保持平衡状态的内部圆柱体，其仅在顶部端点被支持。为避免颗粒与上密封接触，在反应器顶部液体上方的间隙是填充空气(或惰性气体)的小顶部空间。生物催化剂颗粒保持在圆柱体之间的间隙，圆柱体半径比的范围为0.20-0.60(大约)。内部转动圆柱体也可使用其他几何形状。例如，圆锥形截面或其他回转表面可改善整合反应器(产物在其中沉淀)中的晶体分离，其与生物催化剂颗粒分离。
小流量气体(例如空气)的注入也可用于帮助颗粒匀浆化。
不同的方案可用于分离晶体和催化剂。一种是通过具有大格(例如0.2-1.0mm)的筛使反应器沥干。本发明所述的生物催化剂具有毫米数量级的直径，而固体沉淀的直径小于100μm。由此避免了通常在其他构型的整合反应器中的堵塞问题。移出沉淀的另一种方式是利用晶体大小之间的差异以分离两种类型的固体，促使通过带有内圆柱体(或圆锥截面等其它几何结构)缓慢转动的VFR的上升流。反应器用期望产物的过饱和溶液洗涤，例如抗生素，在顶部收集结晶。也可在反应器的顶部使用大格筛以保留生物催化剂而取出沉淀的产物。在此情形中，反应器的操作可以是连续的。
该反应器的可变性可扩展到一系列应用中。根据生物催化剂中使用的支持物密度、产物结晶的大小、反应介质的粘度、以及其他因素，可选择最适合的溶液。也可使用数种操作方案用于不同的过程：分批、半连续以及连续。
本发明所述的反应器的另一选择是使用气升式构造，见图2。
在此情形中，在反应器底部的分布器促进混合。可在装置中放入内部圆柱体，因此规范颗粒运动(气升式反应器)。本发明所述的生物催化剂，具有两个支持基质和固定化酶，将降低由于气体疏水性引起的可能的灭活。气体可以是空气、氮气、CO2或任何其他本领域专家已知对于具体方法足够的气体。在此情形中，气体的适当注入也会促进介质的均一化而不影响此前描述的生物催化剂。在固相中的产物收集在反应器的底部，通过等于VFR所述之一的筛从生物催化剂中分离。对于连续操作，在反应器顶部出口的筛允许在移出晶体的同时保留生物催化剂。
本发明的优选实施方案如下：
1.一种制备不可溶性生物催化剂的方法，所述生物催化剂由可被活化的初级支持物构成，所述活化提供了酶的共价固定化，其中初级支持物被由聚合溶液制成的次级基质包围，初级基质和次级基质之间的比例根据希望的每克生物催化剂的最终酶活性而变化。
2.实施方案1的方法，其中次级基质选自柠檬果胶、藻酸盐、角叉胶等。
3.实施方案1的方法，其中初级和次级物质之间的比例范围为1∶5-1∶20。
4.实施方案1的方法，其中初级和次级物质之间的比例应当为优选的1∶10。
5.实施方案1-4的方法，其中所得的悬浮液被挤出呈球形，其终粒径范围为0.5±0.1mm-2.0±0.1mm。
6.实施方案5的方法，其中用初级基质和聚合物悬浮液形成的悬浮液滴与含有至少一种二价阳离子的盐溶液接触。
7.实施方案6的方法，其中二价阳离子选自钙、镁、锌或过渡金属。
8.实施方案7的方法，其中溶液是0.2M CaCl2，固化时间等于2小时。
9.按照实施方案1-8的方法获得的生物催化剂。
10.带有固定化生物催化剂的生物反应器，其具有促进足够的搅拌、足以均一化培养液并消除或降低对物质传递的颗粒外阻力的构造。
11.实施方案10的生物反应器，其中搅拌由Taylor-Couette涡流和/或通过惰性气体鼓泡来促进。
12.实施方案11的生物反应器，其中搅拌由Taylor-Couette涡流促进。
13.实施方案12的生物反应器，包含一个保持平衡状态的内部圆柱体，仅在其顶部端点有支持。
14.实施方案13的生物反应器，在反应器的顶部具有小的顶部的空气或惰性气体存在于液体表面的上方。
15.实施方案13的生物反应器，其中内部圆柱体的转动范围为200-2000rpm。
16.实施方案13的生物反应器，其中颗粒被包裹在内部转动圆柱体和外部固定体之间的环状间隙中，其中内径和外径的比例范围为大约0.20-0.60。
17.实施方案12的生物反应器，其中其他几何形状可代替内部转动圆柱体，其可被选择为圆锥截面或其他回转表面。
18.实施方案11的生物反应器，其中搅拌可通过惰性气体鼓泡提供。
19.实施方案18的生物反应器，其中混合通过反应器底部的分布器促进，且任选地，通过添加内部圆柱体促进。
20.实施方案10-19所述的生物反应器用于β-内酰胺抗生素合成的用途，包括：不溶性酶促催化剂，其具有被次级基质包围的初级固定化基质，能够保留其100％的物理完整性和约100％的催化完整性。
21.实施方案20的生物反应器的用途，其中β-内酰胺抗生素选自由酯或胺与β-内酰胺核如6-APA、7-ADCA、7-ACA反应获得的那些，产生抗生素如氨苄青霉素、阿莫西林、头孢菌素IV、头孢羟氨苄等。
22.实施方案21的生物反应器的用途，其中固相中的产物在反应器的底部、顶部或侧面排出，任选地通过部分或完全的液相回流。
23.实施方案21的生物反应器的用途，其中在大约100小时的运转后，生物催化剂保留了100％活性以及完全的物理完整性。
如下实施例显示本发明和代表性的优选实施方案。本领域专家能够依据常规实验实施以采用其他材料、技术或适当的构造。
实施例1：定义和分析方法
支持物-初级基质：琼脂糖10％(w/w)，交联的，Hispanagar S/A.(西班牙)。
支持物-次级基质：低metoxilation的柠檬果胶，8002型，Braspectina do Brasil。
酶：来自大肠杆菌的青霉素G酰化酶(PGA)[EC 3.5.1.11]，Antibiticos S/A，Leon，西班牙。
底物：苯基氨基乙酸甲基酯PGME(Aldrich Chemical Co.)；6-氨基青霉烷酸，6-APA(Winlab，获自青霉素G的酶促水解)，氨苄青霉素(Winlab)和苯基氨基乙酸(Aldrich ChemicalCo.)。
PGA固定化：方法如专利ES 2.005.883-A6中所述。
酶促活性：1IU(国际单位)酶促活性定义为在pH8和37℃下每分钟水解1μmol青霉素G的酶的量。
分析：PGME、6-APA、氨苄青霉素和PG的浓度使用HPLC。柱为Waters C18：Nova-Pak，60A，直径4μm，3.9×150mm。流动相：35％乙腈，20％SDS(十二烷基硫酸钠)，10mM H3PO4，5mM K2H2PO4，pH4.6和25℃，225nm，流量1mL/min。
合成实验：25℃，pH6.5，由自动添加NaOH控制。夹套玻璃涡流反应器，不锈钢316内部圆柱体。反应体积，50mL。反应器内径，36mm。转动圆柱体直径，10mm(半径比0.28)。生物催化剂体积，20mL。酶荷载，10IU/(mL反应器)。
实施例2
涡流反应器，25℃，pH6.5，酶荷载10000IU/L反应器。初始浓度：6-APA＝300mM；PGME＝25mM。重复分批投料操作，加入PGME。每次运行的时间间隔＝10小时。图3显示了三个连续阶段的典型结果。沥干时间未显示。
在本实施例中，比生产率达到约4.5×10-5mmol/(IU.min)，绝对生产率为0.45mM/min。每次上样终末时的选择性为3.6mol抗生素/mol PG。每一操作阶段的瞬时选择性的范围为3-6。生物催化剂的酶促活性和物理完整性保持不变。
实施例3
涡流反应器，25℃，pH6.5，酶荷载10000IU/L反应器。初始浓度：6-APA＝300mM；PGME＝25mM。重复分批投料操作，加入PGME和6-APA。每次运行的时间间隔＝10小时。图4显示了一个阶段的典型结果。
在本实施例中，比生产率达到约3.5×10-5mmol/(IU.min)，绝对生产率为0.44mM/min。每次上样终末时的选择性为2.4mol抗生素/molPG。每一操作阶段的瞬时选择性的范围为2-6。生物催化剂的酶促活性和物理完整性保持不变。
本文中，工业中酶的使用日益增加。与传统方法相比，酶促催化具有如下优点：
(i)反应在室温和常压下发生；
(ii)特定反应(反应特异性)在特定位点(位点特异性)发生。因此，可以高产率获得希望的产物；
(iii)由于底物特异性高，仅仅希望的化合物选择性的反应，即使在同一环境中存在其他物种。
但是，酶促催化也存在缺点，即
(i)如果使用游离酶，其在连续批次中的再利用或在连续反应器中的循环不经济，因为其可溶于水，且以低浓度存在；
(ii)另一方面，如果酶被固定化于不溶性支持物，使得其可在长的运行(重复的批次或连续的方法)中使用，支持物基质(通常来说，具有微米级的半径)不是不降低孔扩散效应。在许多情况中，这些生物催化剂(此处理解为支持物-酶组装物)具有低剪切力抗性；
(iii)这样的低尺寸生物催化剂难以从沉淀的产物中分离，无论何时其存在于方法中。
此外，酶活性可被如下因素降低(有时是不可逆的)：热、有机溶剂、酸或碱、或甚至是反应产物。然而，恰当的生物催化剂(酶-支持物)工程可在催化剂寿命中提供重要的收获。
固定化生物催化剂的研究自50年代中期业已开展。目前，下列方法可用于酶固定化：(i)共价结合、吸附或离子连接至支持物；(ii)交联，当酶分子被聚合功能性反应剂相互交联且变得不溶；(iii)包封，例如在聚合凝胶、微胶囊或脂质液体膜中，和(d)前述方法的组合。
上述方法中，凝胶包封更普通，应用于数种生物催化剂的固定化中。
美国专利4,975,375描述了一种制备生物催化剂的方法，由如下步骤组成(i)降低网状聚合物凝胶的温度，所述凝胶具有特定的相转换温度，且能够可逆性扩张或收缩，在低于其相转换温度时扩张；(ii)将在上述扩张状态的凝胶加入含有酶的液体介质中，使所述酶迁移入其中；且(iii)将至少一部分上述凝胶加热至其相转换温度或高于其相转换温度，从而引起其收缩并因此使酶包埋。
尽管如此，应当指出的是，传统方法具有缺点，诸如：(i)在固定化后酶活性降低；(ii)在固定化过程中缺乏稳定性，使得至少部分分子变性或改变其构象，仍在支持物之外；(iii)催化剂难以活化；(iv)与固定化反应相关的额外的复杂性，其可能难以控制或需要毒性反应剂，难以处理，且(v)在支持物目标位点上酶的正确空间方向和精确定位方面的困难。
酶固定化的新方法与整体生物反应器的新构造之间的结合对于使酶促方法可施行、顺应降低环境压力的趋势、以及与此同时实现高产率都是至关重要的。
生物反应器应当优选的在同一装置中整合期望的生化反应以及期望产物的分离和纯化，诸如其结晶。
对于半合成β-内酰胺抗生素的情形，酶法途径最大的缺点是其低选择性，这是由于能够与β-内酰胺核反应的前体(酯或酰胺)的竞争性水解以及由于抗生素自身的水解。促进合成的酶同时也催化不希望的反应。
第一个半合成β-内酰胺抗生素(衍生自青霉素G的侧链取代)是氨苄青霉素(由Beecham于1961年获得专利)，后来是阿莫西林(Beecham专利，1972)以及半合成头孢菌素IV(头孢菌素IV，Lilly，1970；头孢唑啉，Fujisawa，1974；头孢羟氨苄，BMS，1977等)。全球市场对所述药物的演变是令人难忘的，从1970年的1,000吨/年至2000年的45,000吨/年(Moody H，Hogenboom A，Lange B，Heemskerk D，Dooren TV，Boesten W，Roos E.，Cephadroxyl的酶法生产，口头交流与摘要，第十届欧洲议会关于生物技术书的文集，CAT 12，Madrid，西班牙，2001年7月8-11)。这些方法中使用化学途径用于侧链合成以及抗生素的缩合，连接侧链至合适的β-内酰胺核(6-APA，现在从青霉素G酶法获得；7-ACA从头孢菌素C，且7-ADCA在6-APA的噻唑烷环扩环后产生，也通过化学途径)。所有这些常规方法是稳固的，但是在该领域(包括工业中和研究中)的研究十分激烈，以建立有效的酶促途径。
为增强反应的选择性，应当采用整合的反应器，其带有由固定化酶构成的生物催化剂。在这些反应器中，抗生物浓度超过其溶解性限制了加工条件。由此，希望的产物(在此情况中为抗生素)在受到酶攻击之前将沉淀。
在传统反应器中，所述方法存在一系列缺点。在充分混合的反应器中，搅拌对于生物催化剂的脆弱颗粒而言过于剧烈。流化床反应器需要高循环流速，以维持流态化。固定床反应器在外颗粒膜中有严重的物质传递限制，降低了表观反应速率，因此，降低了该方法的生产率。
因此需要开发制备固定化酶的方法，其与整合的生物反应器相关，以克服上述困难。
发明概述
本发明的目的是提供一种保护酶促生物催化剂的方法，所述生物催化剂由初级支持物构成，其被次级基质包被。
本发明体现为一种保护具有1-4mm半径的酶促生物催化剂的系统。
更具体的，本发明体现为一种具有如下构造的生物反应器，其在长期运行后保持生物催化剂的物理完整性和催化活性，且同时允许被保护的生物催化剂从固体中方便的分离，在反应过程中沉淀。
更具体的是，本发明涉及此处所述的生物反应器用于酶促合成β-内酰胺抗生素的用途，包括不可溶性酶促催化剂，其具有用于固定化的初级基质，所述初级基质被包围在次级基质中，其能够保持100％的催化剂物理完整性和大约100％的催化活性。
附图描述
图1：显示涡流反应器的示意图。
图2：显示气升式反应器的示意图。
图3：显示用苯基氨基乙酸(PG)和AMP结晶合成氨苄青霉素(AMP)，25℃，pH 6.5。酶荷载＝10000IU/L反应器。在每一次运行时连续饲喂一种底物(PGME)。
图4：显示用PG和AMP结晶合成氨苄青霉素，25℃，pH 6.5。酶荷载＝10000IU/L反应器。在每一次运行时连续饲喂两种底物(PGME和6-APA)。
发明详述
本发明在此旨在定义一种包封活性生物催化剂的新方法，使其在长期运转后保持完整性，同时，描述了一种反应器构造，其允许温和(保持生物催化剂的颗粒)以及有效的搅拌(使颗粒悬液均一且避免颗粒外物质传递阻力)。
解决前述困难的一种替代的方式是使用Taylor-Couette涡流反应器，其在两个圆柱体之间的间隙存在环形的涡流(当内部圆柱体转动高于临界速度时)。这种流动模式具有一些优点。反应器的流态可在几乎为活塞流(对于连续反应器)到完全混合反应器之间改变，而不改变驻留时间。温和但有效的搅拌使其可用于需要低剪切力的情形(诸如在酶支持物由二氧化硅(silica)或凝胶制备的情形)。内部圆柱体的转动速率为反应器的操作提供了额外的自由度，允许颗粒流态化而不改变轴流。
整合反应器的另一重要方面是酶载体的保护。当期望的产物沉淀时，支持物必须具有合适的大小，使其易于从产物结晶中分离。同时，支持物必须是柔韧的，以承受这些晶体的生长而不随时间降解。合适的机械以及物化特征的组合是该方法的关键步骤。
在化学和生物化学反应器中应用Taylor-Couette-Poiseuille流早在Kataoka等人的著作中被报道(Kataoka K，Doi HE，Hongo T，Taylor涡流的理想的活塞流性质，Journal of Chemical Engineering Japan，8，472-476，1977)。
Taylor涡流是一种次级流模式，其出现在两个圆柱体(内部转动，外部一般为固定的)之间的环形间隙中(Taylor GI.两个转动圆柱体之间的粘性液体的稳定性，Philosophy Transactions of the Royal Society A，223，289-343，1923；Koschmieder EL.二元室和Taylor涡流，New York：Cambridge University Press，1993)。当轴向Poiseuille流叠加到该模式中，可以连续操作该反应器。在临界转动之上时，从初始的Couette流出现环形涡流。
业已报道台式涡流反应器(VFR)的使用(Cohen S，Maron DM，涡流流态中转动环形反应器的分析，Chemical Engineering Science，46，123-134，1991；Kataoka K，Ohmura N，Kouzu M，Simamura YE，Okubo M，连续Taylor涡流反应器中苯乙烯的乳液聚合，ChemicalEngineering Science，50，1409-1416，1995；Sczechowski JG，Koval CAE，Noble RDF.Taylor涡流反应器用于非均一光催化，ChemicalEngineering Science，50，3163-3173，1995；Leitner NKV，Le Bras E，Foulcault E，Bousgarbiès J-L，用于吸收溶液处理的新光化学反应器设计，Water Science and Technology，35，215-222，1997；Ameer GA，Harmon W，Sasisekharan R，Langer，R.，全血流态化床Taylor-Couette流装置用于酶促肝素中和的研究，Biotechnology and Bioengineering，62，602-608，1999)。Giordano，R.L.C.；Giordano，R.C.；Prazeres，D.M.F.；Cooney，C.L.-Taylor-Poiseuille流反应器分析II：“利用葡萄糖-果糖异构化作为测试反应的反应器建模和操作评估”，Chem.Eng.Science，V.55，F18，p.3611-26，2000；Giordano，R.L.C.；Giordano，R.C.；Cooney，C.L.带有悬浮颗粒的连续Taylor-Couette-Poiseuille涡流酶促反应器的操作″-Process Biochemistry，v.35，F10，p.1093-1011，2000)。
尽管如此，VFR的工业应用仍不普及。
VFR的特殊的一个特征是其用作生物反应器的原因：其流态具有高可变性。改变内部圆柱体的转动，同一装置即可跨越从完美的混合至活塞流反应器的全部范围。该特征使其尤其适用于多种目的的工厂。
当关注不均一体系时，(例如，对于固定化在凝胶基质上的酶或锚定于颗粒上的组织细胞)，内部圆柱体的转动是一个额外的操作变量，其可促进颗粒流态化(Moore CMV.，Taylor-Couette涡流反应器的表征，博士论文，Massachusetts Institute of Technology，Cambridge，EUA，1994)。另一方面，Taylor流的低剪切力对生物方法的应用特别有吸引力。
本发明利用柠檬酸果胶、藻酸盐、角叉胶等包裹另一基质，其可为琼脂糖、几丁质、二氧化硅、微生物(灭活的或未灭活的)等等。例如，果胶凝胶的球形颗粒可被尤其是构型成比琼脂糖凝胶更小，其反过来以特定酶能够被固定化与其上的方式被活化。
按照这种方式，意在保护固定化支持物。同时，获得具有高直径的颗粒，其
(i)避免内部颗粒扩散效应；
(ii)抵抗由机械搅拌引起的剪切力；
(iii)当一种或多种产物沉淀时保持其完整性，以允许反应和分离(通过结晶)步骤在相同装置中的整合；(iv)具有足够的大小，使其在运行终末容易从生物催化剂中分离产物结晶。
这些颗粒反过来通过充分的搅拌系统(诸如Taylor-Couette涡流和/或反应器底部的惰性气体注入)将保留在反应器内的悬液中。通过这种方法，其旨在：
(i)实现颗粒的均一流态化而不暴露于过度剪切力，保持其长期操作的完整性；
(ii)降低颗粒外液体膜中的扩散迟滞；以及
(iii)允许反应器的灵活操作，其根据方法的需要可用于分批、半分批或连续模式。
目标酶事先固定化在活化的不溶性支持物上，允许活性基团的共价连接。例如，固定化可通过在事先活化后的支持物上产生的醛基与酶的氨基连接；或支持物的环氧基与酶的不同活化基团连接，如氨基、羟基、羧基和巯基；或者支持物的环亚氨碳酸酯基团(在用CNBr活化后产生)与酶的氨基连接，以及其它可能的固定化。活化的支持物可以是：孔隙度受控的二氧化硅，其用缩水甘油氧基乙基三甲氧基硅烷或用戊二醛活化；琼脂糖凝胶，其用乙醛酰基(glyoxil)或戊二醛基活化；几丁质凝胶，其用戊二醛活化；环氧支持物，等等。该体系(与酶反应的活化的支持物)此处称为初级基质。
例如，初级基质可以是琼脂糖凝胶，范围从6％-10％(w/w)，交联的，事先用乙醛酰基活化，其促进与酶青霉素G酰化酶之赖氨酸残基上的氨基多重交联。颗粒直径范围可从60μm e 300μm。酶荷载范围可从250IU/(克琼脂糖凝胶)-600IU/(克琼脂糖凝胶)，其中1IU对应于在pH8和37℃下每分钟水解1μmol青霉素G的酶量。
根据本发明，事先制备的初级基质被第二种凝胶包裹，如与钙、藻酸钙或其他二价阳离子如锌或镁或过度金属离子如铁等交联的柠檬酸果胶(次级基质)。果胶或藻酸钙的水溶液(聚合物与总物质的物质比可以在0.5-3％(对于藻酸盐)和2-6％(对于果胶)之间变化)与初级基质以不同的比例混合，这取决于希望的最终酶荷载。一般的，比值为1∶5-1∶20(初级基质物质/次级基质物质)。所得悬液借助于蠕动泵挤出呈球形。球体直径是挤出流的函数，是出口管直径的函数，或用于滴流悬浮液的针头直径的函数，以及平行于管或针头的气流的函数，其用于促进挤出尖液滴的落下。通常，直径在约0.5±0.1mm和2.0+0.1mm。由聚合物溶液和初级基质形成的悬浮液液滴与二价阳离子的盐(如钙离子、镁离子或过度金属离子如铁)相接触。聚合物的链(例如，果胶或藻酸盐)溶于水，大约通过与阳离子交联产生水不溶性的凝胶。起初，只有球体的外面变得坚硬。使凝胶的内部变硬(凝固)之反应速率以及交联阳离子-聚合物的最终数目取决于阳离子和聚合物的浓度、凝固的时间以及反应的温度。例如，0.2M CaCl2溶液与2％(w/w)藻酸盐或6％(w/w)果胶在室温下必须凝固至少2小时。
在酶促反应器中保持果胶或藻酸盐凝胶的完整性需要介质中阳离子的存在，或者，在每批次之间使用再活化循环。在下面的实施例中，钙的比例于24小时运行后重置。在反应器的两次运行之间，将生物催化剂浸于0.2M的CaCl2中2小时。生物催化剂的最终密度可有很大的变化，取决于初级基质和(酶促衍生物/聚合物溶液)的比例。可制造密度高或低于介质的颗粒。在下面的实施例中，颗粒在水中的表观密度为1.01g/mL。
至于反应器，其必须提供足够的搅拌：足以匀浆化介质并消除或降低对物质传递的颗粒外阻力。涡流反应器(VFR)示意图见图1。其可以连续、分批补料或分批模式操作。对于连续操作，补料在反应器的底部或顶部的出口处。
根据本发明，对于内部圆柱体转动在200-2000RPM之间时，颗粒不受剪切力的影响。重要的特征是保持内部圆柱体在垂直位置的平衡。在内部圆柱体的底物的轴承需要在内部圆柱体中的密封(如果反应器的底部是不固定的)，或需要在外壁上密封(如果转动的底部用作容器)。在任何情况下，接近装置底部端的涡旋的转动会将颗粒拽向密封，引起其机械性碾磨。因此，本发明使用保持平衡状态的内部圆柱体，其仅在顶部端点被支持。为避免颗粒与上密封接触，在反应器顶部液体上方的间隙是填充空气(或惰性气体)的小顶部空间。生物催化剂颗粒保持在圆柱体之间的间隙，圆柱体半径比的范围为0.20-0.60(大约)。内部转动圆柱体也可使用其他几何形状。例如，圆锥形截面或其他回转表面可改善整合反应器(产物在其中沉淀)中的晶体分离，其与生物催化剂颗粒分离。
小流量气体(例如空气)的注入也可用于帮助颗粒匀浆化。
不同的方案可用于分离晶体和催化剂。一种是通过具有大格(例如0.2-1.0mm)的筛使反应器沥干。本发明所述的生物催化剂具有毫米数量级的直径，而固体沉淀的直径小于100μm。由此避免了通常在其他构型的整合反应器中的堵塞问题。移出沉淀的另一种方式是利用晶体大小之间的差异以分离两种类型的固体，促使通过带有内圆柱体(或圆锥截面等其它几何结构)缓慢转动的VFR的上升流。反应器用期望产物的过饱和溶液洗涤，例如抗生素，在顶部收集结晶。也可在反应器的顶部使用大格筛以保留生物催化剂而取出沉淀的产物。在此情形中，反应器的操作可以是连续的。
该反应器的可变性可扩展到一系列应用中。根据生物催化剂中使用的支持物密度、产物结晶的大小、反应介质的粘度、以及其他因素，可选择最适合的溶液。也可使用数种操作方案用于不同的过程：分批、半连续以及连续。
本发明所述的反应器的另一选择是使用气升式构造，见图2。
在此情形中，在反应器底部的分布器促进混合。可在装置中放入内部圆柱体，因此规范颗粒运动(气升式反应器)。本发明所述的生物催化剂，具有两个支持基质和固定化酶，将降低由于气体疏水性引起的可能的灭活。气体可以是空气、氮气、CO2或任何其他本领域专家已知对于具体方法足够的气体。在此情形中，气体的适当注入也会促进介质的均一化而不影响此前描述的生物催化剂。在固相中的产物收集在反应器的底部，通过等于VFR所述之一的筛从生物催化剂中分离。对于连续操作，在反应器顶部出口的筛允许在移出晶体的同时保留生物催化剂。
本发明的优选实施方案如下：
1.一种制备不可溶性生物催化剂的方法，所述生物催化剂由可被活化的初级支持物构成，所述活化提供了酶的共价固定化，其中初级支持物被由聚合溶液制成的次级基质包围，初级基质和次级基质之间的比例根据希望的每克生物催化剂的最终酶活性而变化。
2.实施方案1的方法，其中次级基质选自柠檬果胶、藻酸盐、角叉胶等。
3.实施方案1的方法，其中初级和次级物质之间的比例范围为1∶5-1∶20。
4.实施方案1的方法，其中初级和次级物质之间的比例应当为优选的1∶10。
5.实施方案1-4的方法，其中所得的悬浮液被挤出呈球形，其终粒径范围为0.5±0.1mm-2.0±0.1mm。
6.实施方案5的方法，其中用初级基质和聚合物悬浮液形成的悬浮液滴与含有至少一种二价阳离子的盐溶液接触。
7.实施方案6的方法，其中二价阳离子选自钙、镁、锌或过渡金属。
8.实施方案7的方法，其中溶液是0.2M CaCl2，固化时间等于2小时。
9.按照实施方案1-8的方法获得的生物催化剂。
10.带有固定化生物催化剂的生物反应器，其具有促进足够的搅拌、足以均一化培养液并消除或降低对物质传递的颗粒外阻力的构造。
11.实施方案10的生物反应器，其中搅拌由Taylor-Couette涡流和/或通过惰性气体鼓泡来促进。
12.实施方案11的生物反应器，其中搅拌由Taylor-Couette涡流促进。
13.实施方案12的生物反应器，包含一个保持平衡状态的内部圆柱体，仅在其顶部端点有支持。
14.实施方案13的生物反应器，在反应器的顶部具有小的顶部的空气或惰性气体存在于液体表面的上方。
15.实施方案13的生物反应器，其中内部圆柱体的转动范围为200-2000rpm。
16.实施方案13的生物反应器，其中颗粒被包裹在内部转动圆柱体和外部固定体之间的环状间隙中，其中内径和外径的比例范围为大约0.20-0.60。
17.实施方案12的生物反应器，其中其他几何形状可代替内部转动圆柱体，其可被选择为圆锥截面或其他回转表面。
18.实施方案11的生物反应器，其中搅拌可通过惰性气体鼓泡提供。
19.实施方案18的生物反应器，其中混合通过反应器底部的分布器促进，且任选地，通过添加内部圆柱体促进。
20.实施方案10-19所述的生物反应器用于β-内酰胺抗生素合成的用途，包括：不溶性酶促催化剂，其具有被次级基质包围的初级固定化基质，能够保留其100％的物理完整性和约100％的催化完整性。
21.实施方案20的生物反应器的用途，其中β-内酰胺抗生素选自由酯或胺与β-内酰胺核如6-APA、7-ADCA、7-ACA反应获得的那些，产生抗生素如氨苄青霉素、阿莫西林、头孢菌素IV、头孢羟氨苄等。
22.实施方案21的生物反应器的用途，其中固相中的产物在反应器的底部、顶部或侧面排出，任选地通过部分或完全的液相回流。
23.实施方案21的生物反应器的用途，其中在大约100小时的运转后，生物催化剂保留了100％活性以及完全的物理完整性。
如下实施例显示本发明和代表性的优选实施方案。本领域专家能够依据常规实验实施以采用其他材料、技术或适当的构造。
实施例1：定义和分析方法
支持物-初级基质：琼脂糖10％(w/w)，交联的，Hispanagar S/A.(西班牙)。
支持物-次级基质：低metoxilation的柠檬果胶，8002型，Braspectina do Brasil。
酶：来自大肠杆菌的青霉素G酰化酶(PGA)[EC 3.5.1.11]，Antibiticos S/A，Leon，西班牙。
底物：苯基氨基乙酸甲基酯PGME(Aldrich Chemical Co.)；6-氨基青霉烷酸，6-APA(Winlab，获自青霉素G的酶促水解)，氨苄青霉素(Winlab)和苯基氨基乙酸(Aldrich ChemicalCo.)。
PGA固定化：方法如专利ES 2.005.883-A6中所述。
酶促活性：1IU(国际单位)酶促活性定义为在pH8和37℃下每分钟水解1μmol青霉素G的酶的量。
分析：PGME、6-APA、氨苄青霉素和PG的浓度使用HPLC。柱为Waters C18：Nova-Pak，60A，直径4μm，3.9×150mm。流动相：35％乙腈，20％SDS(十二烷基硫酸钠)，10mM H3PO4，5mM K2H2PO4，pH4.6和25℃，225nm，流量1mL/min。
合成实验：25℃，pH6.5，由自动添加NaOH控制。夹套玻璃涡流反应器，不锈钢316内部圆柱体。反应体积，50mL。反应器内径，36mm。转动圆柱体直径，10mm(半径比0.28)。生物催化剂体积，20mL。酶荷载，10IU/(mL反应器)。
实施例2
涡流反应器，25℃，pH6.5，酶荷载10000IU/L反应器。初始浓度：6-APA＝300mM；PGME＝25mM。重复分批投料操作，加入PGME。每次运行的时间间隔＝10小时。图3显示了三个连续阶段的典型结果。沥干时间未显示。
在本实施例中，比生产率达到约4.5×10-5mmol/(IU.min)，绝对生产率为0.45mM/min。每次上样终末时的选择性为3.6mol抗生素/mol PG。每一操作阶段的瞬时选择性的范围为3-6。生物催化剂的酶促活性和物理完整性保持不变。
实施例3
涡流反应器，25℃，pH6.5，酶荷载10000IU/L反应器。初始浓度：6-APA＝300mM；PGME＝25mM。重复分批投料操作，加入PGME和6-APA。每次运行的时间间隔＝10小时。图4显示了一个阶段的典型结果。
在本实施例中，比生产率达到约3.5×10-5mmol/(IU.min)，绝对生产率为0.44mM/min。每次上样终末时的选择性为2.4mol抗生素/molPG。每一操作阶段的瞬时选择性的范围为2-6。生物催化剂的酶促活性和物理完整性保持不变。