分解难分解性蛋白质的方法

摘要

本发明公开了难分解性蛋白质的分解剂，该分解剂含有具备以下特性且以对难分解蛋白质具有分解活性的酶作为有效成分：(a)活性和底物专一性：水解难分解性蛋白质的肽键；(b)分子量：31,000(使用凝胶浓度为12％的均匀凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)；(c)等电点：pI9.3(聚丙烯酰胺凝胶等电点电泳)；(d)最适pH：pH9.0-10.0；(e)活性最适温度：60-70℃。

权利要求

1.具备难分解蛋白质分解活性且具有以下特性的、来源于地衣芽孢杆菌MSK-103菌株FERM BP-08487的酶在制备病原性朊病毒蛋白分解剂中的用途：(a)活性和底物专一性：水解难分解性蛋白质的肽键；

(b)分子量：31,000，通过使用凝胶浓度为12％的均匀凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定；

(c)等电点：pI 9.3，经聚丙烯酰胺凝胶等电点电泳测定；

(d)最适pH：pH 9.0-10.0，以角蛋白天青分解活性为指标测定；

(e)活性最适温度：60-70℃，以角蛋白天青分解活性为指标测定；

(f)稳定pH：pH 7.0-12.0，

其中所述难分解蛋白质为在37℃条件下与1μg/mL浓度的蛋白酶K反应1小时仍未被完全分解的蛋白质，所述酶的N末端氨基酸序列为AQTVPYGIPLI，

所述酶通过以下程序获得：

保藏号为FERM BP-08487的地衣芽孢杆菌MSK-103菌株的培养上清用截留分子量为

5,000的超滤膜浓缩至20倍，用孔径0.45μm的精密滤膜将培养上清浓缩液过滤除菌，添加硫酸铵至终浓度为1mol/L，再用Tris-盐酸缓冲液配制，使终浓度为50mmol/L和pH 8.5，使上述制备液吸附于苯基·琼脂糖柱，以含有1mol/L-0mol/L浓度硫酸铵的Tris-盐酸缓冲液进行线性浓度梯度洗脱，收获含有所述酶的组分，和将该组分用截留分子量5,000的超滤膜浓缩至20倍，然后采用Sephadex 75凝胶进行凝胶过滤色谱，以含有0.1mol/L氯化钠的磷酸缓冲液0.025mol/L，pH 7.0作为洗脱液，使上述浓缩液通过该凝胶，收获所述酶。

2.权利要求1的用途，其中所述酶还具有下述(g)的特性：(g)难分解性蛋白质分解活性表现为2单位/g或以上的活性，以角蛋白天青分解活性为指标测定。

3.分解病原性朊病毒蛋白的方法，该方法包括使权利要求1或2中记载的酶或病原性朊病毒蛋白分解剂与病原性朊病毒蛋白接触的步骤。

4.权利要求1或2中记载的酶在制备病原性朊病毒蛋白解毒剂中的用途。

5.使病原性朊病毒蛋白解毒的方法，该方法包括使有被病原性朊病毒蛋白污染的可能性的处理对象物与权利要求1或2中记载的酶或权利要求4的病原性朊病毒蛋白解毒剂接触的步骤。

6.使病原性朊病毒蛋白解毒的方法，该方法包括在无需预先加热处理有被病原性朊病毒蛋白污染的可能性的处理对象物的情况下，使上述处理对象物与权利要求1或2中记载的酶或权利要求4的病原性朊病毒蛋白解毒剂接触的步骤。

7.使病原性朊病毒蛋白解毒的方法，该方法包括在无需预先对有被病原性朊病毒蛋白污染的可能性的处理对象物进行90℃或以上的加热处理的情况下，使上述处理对象物与权利要求1或2中记载的酶或权利要求4的病原性朊病毒蛋白解毒剂接触的步骤。

说明书

分解难分解性蛋白质的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)的分解剂和分解上述难分解性蛋白质的方法。

背景技术

[0002] 绵羊或小鼠的羊搔痒病、人的克雅病[Cretzfeldt-Jakobdisease(CJD)]或牛的牛海绵状脑病[Bovine.SpongiformEncephalopathy(BSE)；俗称疯牛病]等疾病都表现为站立、行走困难等等神经症状，这可能与病原性朊病毒蛋白有关。目前有人指出：人食用了被病原性朊病毒蛋白污染的牛肉后被感染，有可能患上变异型克雅病[wariant Creutzfeldt-Jakobdisease(vCJD)]。因此，从保障供应安全的食用肉的角度看，BSE是极为严重的疾病。

[0003] 有人认为这些疾病是由于由体外深入到体内的病原性朊病毒蛋白使通常存在于脑内的正常型朊病毒蛋白的立体结构发生改变[“Nature”，(英国)，1994年，第370卷，471页(非专利文献1)]而导致发病的。因此，为防止因病原性朊病毒蛋白感染而导致患上这些疾病，需要将作为病因的病原性朊病毒蛋白降解为不致发病的程度，使其解毒。 [0004] 但是，病原性朊病毒蛋白是对于通常的灭菌处理(例如煮沸等)极稳定的蛋白质，这些灭菌处理几乎不能使其感染能力下降。另外，虽然病原体是蛋白质，但纵使用蛋白酶分解，以往的蛋白酶也难以将其完全分解。因此，人们期待发明一种有效地分解病原性朊病毒蛋白、降低其感染发病的方法。

[0005] 关于分解像病原性朊病毒蛋白这样的难分解性蛋白质的方法，日本特开平6-46871号公报(专利文献1)中提出了使用一种来自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)PWD-1菌株的角蛋白酶作为分解以往的蛋白酶难以分解的含角蛋白的蛋白质的酶的方法。但是，上述公报中，上述角蛋白酶是用于分解含角蛋白的蛋白质(例如动物毛、人毛发或鸟羽毛等)的，对于病原性朊病毒蛋白是否有效并未提及。

[0006] 目前已经获得了来自地衣芽胞杆菌PWD-1菌株的角蛋白酶的DNA[日本特表平10-500863号(专利文献2)]。

[0007] 还有人提出：采用来自地衣芽胞杆菌PWD-1菌株的上述角蛋白酶来分解难分解性病原性朊病毒蛋白[美国专利第6,613,505号说明书(专利文献3)]。但是，上述专利说明书所记载的方法中，为了降低或分解病原性朊病毒蛋白，需要进行以加热处理为前处理，然后通过酶进行处理这样两个等级的处理。这种情况需要进行加热处理的设备，因此假如不具备这些设施，就难以进行上述专利说明书中所记载的方法。另外，由于必须进行两步处理，也有操作性不佳的问题。

[0008] 国际公开第02/053723号手册(专利文献4)中提出了采用耐热性蛋白酶分解病原性朊病毒蛋白。但是，该手册中记载：使用上述国际公开手册实施例中记载的来自Bacillus thermoproteolyticus Rokko菌株的蛋白酶分解病原性朊病毒蛋白时，单独使用上述酶是不能充分分解的，只有十二烷基硫酸钠存在于反应混合液中时才可充分分解。另外，为了活化上述酶，需要中性盐，并且该酶有需要金属离子的性质，因此当其与具有螯合作用的物质共存时，存在酶活性显著降低等问题。

[0009] (非专利文献1)“Nature”，(英国)，1994年，第370卷，471页

[0010] (专利文献1)日本特开平6-46871号公报

[0011] (专利文献2)日本特表平10-500863号公报

[0012] (专利文献3)美国专利第6,613,505号说明书

[0013] (专利文献4)国际公开第02/053723号手册

发明内容

[0014] 本发明的目的在于提供与公知的蛋白酶相比，显示出对高度难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)具有分解活性，且可以低成本生产的酶；以及以该酶作为有效成分的难分解性蛋白质分解剂和病原性朊病毒蛋白解毒剂，还提供用它们分解难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)的方法和使病原性朊病毒蛋白解毒的方法。 [0015] 本发明人从芽孢杆菌属的微生物中发现了一种酶，其与已报道可分解难分解性蛋白质的公知的酶相比，对难分解性蛋白质(特别是病原性 朊病毒蛋白)具有极高的分解活性。

[0016] 如后述实施例所示，与已报道的用于分解病原性朊病毒蛋白的下述酶相比较，本发明的酶具有远远优于它们的特性，所述的已报道的酶，例如美国专利第6,613,505号说明书中所报道的由地衣芽胞杆菌PWD-1菌株制备的酶(角蛋白酶)、以及国际公开第02/053723号手册中报道的由Bacillus thermoproteolyticus Rokko菌株制备的酶。 [0017] 特别发现：与由地衣芽胞杆菌PWD-1菌株制备的酶相比，本发明所使用的酶具有高得多的病原性朊病毒蛋白分解活性(参照实施例7和8)。更为令人吃惊的是，还发现可以无需进行上述专利说明书中所述的加热处理即可进行处理(参照实施例7和8)。 [0018] 与由Bacillus thermoproteolyticus Rokko菌株制备的酶进行比较，结果发现：
本发明所使用的酶具有高得多的病原性朊病毒蛋白分解活性(参照实施例9-11)。更为令人吃惊的是发现：不管是否存在十二烷基硫酸钠，本发明所使用的酶都具有优异的病原性朊病毒蛋白分解活性(参照实施例9-11).

[0019] 本发明还提供以所发现的酶为有效成分的难分解性蛋白质分解剂和病原性朊病毒蛋白解毒剂，并发现了使用它们分解难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)的方法和使病原性朊病毒蛋白解毒的方法。

[0020] 即，本发明包括以下的发明。

[0021] 难分解性蛋白质分解剂，该分解剂以具备以下特性，且具有难分解蛋白质分解活性的酶为有效成分，所述特性指：

[0022] (a)活性和底物专一性：水解难分解性蛋白质的肽键；

[0023] (b)分子量：31,000(使用凝胶浓度为12％的均匀凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)；

[0024] (c)等电点：pI9.3(聚丙烯酰胺凝胶等电点电泳)；

[0025] (d)最适pH：pH9.0-10.0；

[0026] (e)活性最适温度：60-70℃。

[0027] 上述[1]的难分解性蛋白质分解剂，其中上述酶还具有下述(g)的特性： [0028] (g)难分解性蛋白质分解活性表现为2单位/g或以上的活性(以角蛋白天青分解活性为指标)。

[0029] 上述[1]或[2]的难分解性蛋白质分解剂，其中上述酶还具有下述(h)的特性： [0030] (h)来自芽孢杆菌属的微生物。

[0031] 难分解性蛋白质分解剂，该分解剂含有选自下述的酶作为有效成分： [0032] (X)含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶；

[0033] (Y)含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列，且具有难分解性蛋白质分解活性的修饰酶；以及

[0034] (Z)含有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有85％或以上的同源性的氨基酸序列，且具有难分解性蛋白质分解活性的同源酶。

[0035] [1]-[4]的难分解性蛋白质分解剂，其中难分解性蛋白质是病原性朊病毒蛋白。 [0036] 分解难分解性蛋白质的方法，该方法包括使[1]-[5]的酶或难分解性蛋白质分解剂与难分解性蛋白质接触的步骤。

[0037] [1]-[5]的酶在制备难分解性蛋白质分解剂中的应用。

[0038] 针对有被病原性朊病毒蛋白污染可能性的处理对象物的病原性朊病毒蛋白解毒剂，该解毒剂含有[1]-[5]的酶作为有效成分。

[0039] 使病原性朊病毒蛋白解毒的方法，该方法包括使有被病原性朊病毒蛋白污染可能性的处理对象物与[1]-[5]的酶或[8]的病原性朊病毒蛋白解毒剂接触的步骤。 [0040] 使病原性朊病毒蛋白解毒的方法，该方法包括在无需预先加热处理有被病原性朊病毒蛋白污染可能性的处理对象物的情况下，使上述处理对象物与[1]-[5]的酶或[8]的病原性朊病毒蛋白解毒剂接触的步骤。

[0041] 使病原性朊病毒蛋白解毒的方法，该方法包括在无需预先对有被病原性朊病毒蛋白污染可能性的处理对象物进行90℃或以上的加热处理的情况下，使上述处理对象物与[1]-[5]的酶或[8]的病原性朊病毒蛋白解毒剂接触的步骤。

[0042] [1]-[5]的酶在制备病原性朊病毒蛋白解毒剂中的应用。

[0043] 附图简述

[0044] 图1是表示本发明所使用的纯化酶在37℃下的最适pH和稳定pH范围的图表。 [0045] 图2是表示本发明所使用的纯化酶在pH9.0下的最适温度范围的图表。 [0046] 图3是表示本发明所使用的纯化酶分解来自小鼠的病原性朊病毒蛋白的图。 [0047] 图4是表示本发明所使用的酶组合物A分解来自小鼠的病原性朊病毒蛋白的图。 [0048] 图5是表示本发明所使用的酶组合物A分解来自绵羊的病原性朊病毒蛋白的图。 [0049] 图6是表示本发明所使用的酶组合物A分解来自小鼠的病原性朊病毒蛋白的图。 [0050] 图7是表示本发明所使用的酶组合物A’或用于比较的thermoase分解来自仓鼠的病原性朊病毒蛋白(Sc237菌株)的图。

[0051] 图8是表示在SDS存在下，用本发明所使用的酶组合物A’或用于比较的thermoase分解来自仓鼠的病原性朊病毒蛋白(Sc237菌株)的图。

[0052] 图9是表示用本发明所使用的酶组合物A’或用于比较的thermoase分解固定于聚苯乙烯上的、来自仓鼠的病原性朊病毒蛋白(Sc237菌株)的图。

[0053] 实施发明的最佳方式

[0054] 以下详细说明本发明。

[0055] 本发明所使用的酶具有难分解性蛋白质分解活性，即具有水解难分解性蛋白质的肽键的活性。

[0056] 本说明书中，“难分解性蛋白质”是指不容易被通常的蛋白酶(例如蛋白酶K或胰蛋白酶等)分解的蛋白质，更具体地说，是指在37℃条件下与1μg/mL浓度的蛋白酶K反应1小时仍未被完全分解的蛋白质。上述难分解性蛋白质的例子有病原性朊病毒蛋白、角蛋白、胶原蛋白或弹性蛋白等。

[0057] 本说明书中，“病原性朊病毒蛋白”是指与羊搔痒病、CJD或BSE等的发病有关的蛋白质，具体来说，是指通常存在于脑内的正常型朊 病毒蛋白的立体结构发生改变的朊病毒蛋白。其来源例如有人、仓鼠、小鼠、牛或绵羊等。

[0058] 虽然正常型朊病毒蛋白和病原性朊病毒蛋白的氨基酸序列相同，但蛋白质的立体结构不同。具体来说，正常型朊病毒蛋白中，朊病毒蛋白中的多肽呈螺旋形状的α-螺旋含有率高，多肽呈平面折叠状的β-折叠的含有率少。而病原性朊病毒蛋白中，β-折叠的含量高(Pan，PNAS，90，10962，1993)。另外，上述来自动物的各朊病毒蛋白的氨基酸序列同源性高，它们的通过正常型朊病毒蛋白的立体结构改变而变为难分解性的病原性朊病毒蛋白的特性也相同。

[0059] 被认为是上述疾病的病原体的病原性朊病毒蛋白是在煮沸等通常的灭菌处理后仍极为稳定的蛋白质，其感染能力几乎并不因灭菌处理而降低。另外，正常型朊病毒蛋白容易被分解，体内的半衰期约为2小时，而病原性朊病毒蛋白的体内半衰期需要24小时或以上，是非常难分解的蛋白质。实际上，如果用市售的蛋白酶K等已有的蛋白酶进行分解性评价，则表明：正常型朊病毒蛋白容易被分解、是感受性的，而病原性朊病毒蛋白为分解性低的难分解性，是抵抗性的(Prusiner，Science，252，1515，1991)。其被分解的难易程度不同的原因在于前述立体结构的不同。

[0060] 判别正常朊病毒蛋白和病原性朊病毒蛋白的方法例如有前述的利用蛋白酶分解性差异的方法。即，将来自可能被病原性朊病毒蛋白感染的动物的组织磨碎，匀浆，制成悬浮液，用通常的蛋白酶(例如蛋白酶K等)处理，然后通过蛋白质印迹法(Burnette，Anal.Biochem.，112，195，1981)检测朊病毒蛋白的存在。此时，如未检测出任何蛋白，则表明只有正常型朊病毒蛋白存在，如果检测出显示蛋白酶抵抗性的蛋白质条带，则表明存在病原性朊病毒蛋白。

[0061] 本说明书中，“难分解性蛋白质分解活性”是指水解难分解性蛋白质的肽键的活性。本说明书中，“难分解性蛋白质分解活性”的单位使用2种单位。第1种单位是在pH8.0和60℃的条件下，使酶与终浓度为0.5％的角蛋白粉末[来自人毛发；Nacalai Tesque]悬浮液作用1小时，将在该测定系统中，每1分钟生成相当于1μmol甘氨酸的分解物的酶量定义为“1单位”。第2种单位是在pH 8.0和37℃的条件下，使酶与终浓度为0.8％的角蛋白天青[Sigma]悬浮液作用16小时， 在该测定系统中，测定595nm下的吸光度，将每1分钟游离到反应混合液中的染料量导致的0.001吸光度变化量定义为“1单位”。 [0062] 角蛋白天青例如是来自羊毛的角蛋白上结合有偶氮染料的化合物，由于角蛋白的肽键被切断而游离出来的结合有偶氮染料的氨基酸或结合有偶氮染料的肽可通过分光光学进行定量，因此，它常用作测定难分解性蛋白质之一的角蛋白的分解活性(即角蛋白酶活性)的底物的化合物。

[0063] 本说明书中，“病原性朊病毒蛋白分解活性”是指水解病原朊病毒蛋白的肽键的活性。“病原性朊病毒蛋白分解活性”例如可以以1％的感染了羊搔痒病的小鼠的脑组织悬浮液中所含的病原性朊病毒蛋白的分解为指标，判定其活性程度(强弱)。

[0064] 更具体地说，将来自感染了病原性朊病毒蛋白的小鼠的脑组织磨碎、匀浆，制备悬浮液，用要判定的酶或酶组合物进行处理。通过电泳分离该处理物中所含的蛋白质，用蛋白质印迹法检测朊病毒蛋白的存在。此时，如未检测出任何蛋白，则表明要判定的酶或酶组合物具有非常强的病原性朊病毒蛋白分解活性。同样地，当检测出显示蛋白酶抵抗性的蛋白质条带时，如果该蛋白质带浅，则表明具有一定程度的病原性朊病毒蛋白分解活性；如果蛋白质带深，则表明病原性朊病毒蛋白分解活性弱。

[0065] 具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性的蛋白质[0066] 本发明所使用的酶例如可以使用具有以下理化性质的酶。

[0067] (a)活性及底物专一性

[0068] 水解蛋白质的肽键、特别是难分解性蛋白质(例如病原性朊病毒蛋白等)的肽键。关于底物专一性，除病原性朊病毒蛋白之外，对酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白具有高的分解活性。

[0069] (b)分子量

[0070] 使用12％均匀凝胶(即聚丙烯酰胺的浓度为12％的均匀凝胶)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，测得分子量为约31,000。

[0071] 使用15％均匀凝胶(即聚丙烯酰胺的浓度为15％的均匀凝胶；例如ATTO公司制)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，测得分子量为约26,000。

[0072] (c)等电点

[0073] 聚丙烯酰胺凝胶等电点电泳测得的等电点(p I)约为9.3。

[0074] (d)最适pH和稳定pH

[0075] 以角蛋白天青分解活性为指标进行评价的最适pH约为9.0-10.0。pH在约7.0-12.0的范围内时具有稳定的活性，pH在约8.0-10.5范围内时具有高活性。 [0076] (e)活性最适温度

[0077] 以角蛋白天青分解活性为指标进行评价的活性最适温度约为60-70℃。 [0078] (f)失活pH

[0079] 在以角蛋白天青分解活性为指标进行的评价中，pH在约5或以下时失活。 [0080] 将本发明所使用的酶的这些性质与具有难分解性蛋白分解活性的公知的蛋白酶(来自地衣芽孢杆菌PWD-1菌株的角蛋白酶)进行比较，结果如表1所示。

[0081] 表1

[0082]

[0083] 本发明的另一方案中，可以使用含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶及其修饰酶或其同源酶。

[0084] “含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的酶”包括由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的酶；在由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列形成的多肽的N末端和/或C末端附加有适当的标记序列等氨基酸序列的，并且具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性的融合酶；由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的多肽与融合对象构成的融合多肽组成的，且具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性的融合酶；或者SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的N末端附加有前序列(信号序列)或其一部分的氨基酸序列所形成的酶等。并且，在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的N末端附加有前序列的氨基酸序列上进一步附加有适当的标记序列和/或融合对象所形成的融合酶也包括在“含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶”的范围内。

[0085] 上述前序列可以使用天然的前序列或人工设计的前序列。上述天然的前序列不仅可以使用来自地衣芽孢杆菌的前序列(特别是来自地衣芽孢杆菌的难分解性蛋白质分解酶的前序列)，还可以使用来自地衣芽孢杆菌以外的生物的前序列。

[0086] 上述标记序列例如可以使用确认多肽表达、确认存在于细胞内、或为了便于纯化等的序列，例如可以使用FLAG标记、六组氨酸标记、血凝素标记或myc表位等。 [0087] 上述融合对象例如可以使用纯化用多肽[例如谷胱甘肽S-转移酶(GST)的全部或部分]、检测用多肽[例如血凝素或β-半乳糖苷酶α肽(LacZα)的全部或部分]、或者表达用多肽(例如信号肽)等。

[0088] 上述融合多肽中，在含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽与上述标记序列或融合对象之间，可以适当引入可用蛋白酶(例如凝血酶或Xa因子)特异消化的氨基酸序列。

[0089] 本说明书中的“修饰酶”是含有在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中有1或多个(例如1个或几个)氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列，且具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性的蛋白质。其中，涉及到“缺失、取代或添加”等涉及变异的氨基酸数量优选1-30个，更有选1-10个，进一步优选1-6个。

[0090] 上述修饰酶还包括含有在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中有1或多个(例如1个或几个)氨基酸残基被保守性取代的氨基酸序列，且具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性的蛋白质。其 中，“保守性取代”是指基本上未改变蛋白质的活性，1或数个氨基酸残基被另外的化学性质类似的氨基酸取代。例如或是疏水性残基被另外的疏水性残基取代的情况，或是极性残基被具有相同电荷的另外的极性残基取代的情况等。关于彼此间可以进行这样的保守性取代的功能相近的氨基酸是本技术领域内公知的。 [0091] 具体来说，非极性(疏水性)氨基酸例如有丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸等。极性(中性)氨基酸例如有甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺或半胱氨酸等。带正电荷(碱性)的氨基酸例如有天冬酰胺、组氨酸或赖氨酸等。带负电荷(酸性)的氨基酸例如有天冬氨酸或谷氨酸等。 [0092] 本发明中的“同源蛋白质”是指含有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有85％或以上(优选90％或以上、更优选95％或以上，进一步优选98％或以上、特别优选99％或以上)的同源性的氨基酸序列，且具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性的蛋白质。这里所示的同源性数值是采用本领域技术人员公知的同源性检索程序BLAST法(Basic local alignment search tool；Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.，215，403-410，1990；购自National Center forBiotechnology Information)计算的数值。 [0093] 含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶或其修饰酶或其同源酶具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性，以角蛋白天青分解活性为指标，优选具有2单位/g或以上(更优选2-500单位/g、进一步优选10-500单位/g、特别优选20-500单位/g)的难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性。以角蛋白粉末分解活性为指标时，优选具有1单位/g或以上(更优选1-5000单位/g、进一步优选5-3000单位/g)的难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性。

[0094] 本发明所使用的酶只要是表现出上述的各种理化性质的酶，或者含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶、或其修饰酶或其同源酶即可，对于其起源并没有特别限定，例如，可以是来自动物、植物或微生物的酶。其来源优选由芽孢杆菌属的微生物生产的酶，具体来说，更优选由地衣芽孢杆菌生产的酶，特别优选由地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)生产的酶。另外，也可以是其突变株。

[0095] 微生物保藏

[0096] 地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)于2002年10月16日国内保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址：305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，于2003年9月16日转为国际保藏。国际保藏号(国际保藏号后[]内为国内保藏号)为FERM BP-08487[FERM P-19068].

[0097] 本发明所使用的酶的具体例子有枯草杆菌蛋白酶类，特别优选枯草杆菌蛋白酶DY(国际公开第98/30682号手册)。

[0098] 本发明所使用的酶例如可像实施例1所记载的那样，通过从微生物中分离和纯化来获得。另外，如后所述，也可以通过基因重组技术，使编码本发明所使用的蛋白质的多核苷酸在适当的宿主中表达，再通过分离和纯化所生产的蛋白质来获得。

[0099] 为了从生产本发明所使用的酶的微生物中获得本发明所使用的酶，可以在适合该微生物的条件下进行培养，采用公知的蛋白质纯化方法，从含有本发明所使用的酶的上清、菌体或培养物(培养液)中制备本发明所使用的酶。以下，作为生产本发明所使用的酶的微生物，以地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)为例，对微生物的培养和蛋白质纯化步骤进行说明。

[0100] 按照常规方法，将含有1％聚胨、0.2％酵母提取物和0.1％硫酸镁·7水合物(pH7.0)的培养基加热灭菌，然后在该培养基上接种地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)，在37-50℃，边通气搅拌边培养24-72小时。用离心机将所得培养液离心(约3000G)，得到含有本发明所使用的酶的培养上清。接着根据需要，用截留分子量为5,000-30,000的超滤膜浓缩至2-50倍，得到含有本发明所使用的酶的培养上清浓缩液。 [0101] 上述培养上清或培养上清浓缩液中除本发明所使用的酶外，还含有很多杂质，因此例如可通过以下的步骤来纯化本发明所使用的酶。

[0102] 用孔径约为0.45μm的精密滤膜将上述培养上清或培养上清浓缩液过滤除菌。向该除菌滤液中添加硫酸铵使终浓度为1mol/L，同时用缓冲剂(Tris-盐酸缓冲液)配制，使终浓度为50mmol/L、pH8.5。接着，为进行疏水层析，使上述制备液吸附于苯基·琼脂糖柱，含1 mol/L-0mol/L浓度的硫酸铵的Tris-盐酸缓冲液进行线性浓度梯度洗脱，收获含有本发明所使用的酶的组分。将该组分用截留分子量5,000-10,000的超滤膜浓缩至20-30倍，然后进行凝胶过滤色谱，进一步纯化。凝胶过滤色谱可以使用例如Sephadex75(Pharmacia)凝胶。以含有0.1mol/L氯化钠的磷酸缓冲液(0.025mol/L，pH7.0)作为洗脱液，使上述浓缩液通过该凝胶，收获本发明所使用的酶。通过以上的纯化操作，可以纯化至电泳中的一条带。

[0103] 编码具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性的蛋白质的多核苷酸

[0104] 编码本发明所使用的酶的多核苷酸例如可通过以下步骤获得。如果确定了蛋白质的氨基酸序列，则编码该氨基酸序列的碱基序列也容易确定，从而可以选择编码本发明所使用的酶的各种碱基序列。本说明书中，术语“多核苷酸”包括DNA和RNA两者，优选DNA。 [0105] 典型的编码本发明所使用的酶的多核苷酸可选自以下：

[0106] (i)含有SEQ ID NO.1所示碱基序列的多核苷酸(优选SEQ ID NO.1所示碱基序列的多核苷酸)；

[0107] (ii)含有在SEQ ID NO.1所示碱基序列中有1或多个(1个或几个)碱基缺失、取代或添加的碱基序列，且编码具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性的蛋白质的多核苷酸；或者

[0108] (iii)与含有SEQ ID NO.1所示碱基序列的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性的蛋白质的多核苷酸。 [0109] 上述(ii)的多核苷酸中，可缺失、取代或添加的碱基数量具体来说有1-50个，优选1-30个，更优选1-18个，进一步优选1-9个。

[0110] 其中，上述(iii)中的“严谨条件下”是指控制为含有SEQ ID NO.1所示碱基序列的探针与编码同源蛋白质的多核苷酸杂交，但该探针不与来自地衣芽胞杆菌PWD-1菌株的角蛋白酶(美国专利第6,613,505号说明书)或来自Bacillus thermoproteolyticus Rokko的蛋白酶[例如Thermoase]杂交的条件。

[0111] 更具体地说，例如有以下条件：例如使用具有标记的SEQ ID NO.1所示碱基序列全长作为探针，按照ECL直接DNA/RNA标记检测系统 (Amersham)所附的操作方法说明，在42℃预杂交1小时，然后掺入上述探针，在42℃杂交15小时，在42℃下用添加有0.4％SDS和6mol/L尿素的0.4倍或以下浓度的SSC(1倍浓度的SSC；15mmol/L柠檬酸三钠、150mmol/L氯化钠)洗涤20分钟，重复2次，接着在室温下用5倍浓度的SSC洗涤10分钟，进行2次。

[0112] 编码本发明所使用的酶的多核苷酸可以是来自天然的，也可以是完全合成的，还可以是利用来自天然的多核苷酸的一部分进行合成的。获得上述多核苷酸的典型的方法是采用基因工程领域常用的方法，例如使用以部分氨基酸序列信息为基础制备的适当的DNA探针，从地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)的基因组文库中进行筛选的方法等。 [0113] 表达载体和转化微生物

[0114] 本发明所使用的含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶或其修饰酶或同源酶可通过表达载体制备，该表达载体可以使编码上述酶的碱基序列在宿主微生物内复制，且可以以可表达的状态含有该碱基序列所编码的蛋白质。上述表达载体可以以自我复制载体，即作为染色体以外的独立体存在、其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒为基础构建。此外，上述表达载体引入宿主微生物时，整合到该宿主微生物的基因组中，其可以与被整合的染色体一起复制。上述表达载体的构建步骤和方法可以采用基因工程领域中常用的步骤和方法。

[0115] 为了使上述表达载体实际引入宿主微生物，并表达具有所需活性的蛋白质，除编码本发明所使用的酶的多核苷酸之外，还优选含有控制其表达的碱基序列或用于选择转化体的基因标记等。控制表达的碱基序列包括启动子、终止子或编码信号肽的碱基序列等。启动子只要是在宿主微生物中显示转录活性的即可，并没有特别限定，可以是任意的与宿主微生物同种或不同种的微生物中、控制编码蛋白质的基因表达的碱基序列。另外，上述基因标记可以根据选择转化体的方法适当选择，例如可以利用编码抗药性的基因、或与营养缺陷型互补的基因。

[0116] 本发明所使用的酶可通过由上述表达载体转化的微生物来制备。对于该宿主-载体系统并没有特别限定，例如可以使用采用了大肠杆菌、放线菌、酵母或丝状菌等的系统，或者与使用上述微生物表达与其他 蛋白质融合的融合蛋白的表达系统等。另外，该表达载体对微生物的转化也可以按照本领域常用的方法实施。

[0117] 将该转化体在适当的培养基上培养，可由其宿主细胞或培养物中分离得到本发明所使用的酶。转化体的培养及其条件可以与所使用的微生物所常用的条件基本相同。培养转化体后回收目标酶的方法可以采用本领域所常用的方法。

[0118] 本发明所使用的酶的最佳制备方法优选为使用芽孢杆菌属微生物的方法，具体来说，更优选使用地衣芽孢杆菌的方法，特别优选使用地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)及其突变株的方法。

[0119] 酶组合物以及难分解性蛋白质分解剂和病原性朊病毒蛋白解毒剂

[0120] 本发明所使用的酶制剂包括具有上述理化性质的酶、通过培养微生物得到的酶、含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶或其修饰酶或同源酶、或者通过培养上述宿主细胞得到的酶(以下将其中之一或多种酶称为“本发明所使用的酶”)的任意一种或多种。 [0121] 本发明所使用的酶组合物只要含有本发明所使用的酶作为有效成分即可，对其没有特别限定，制备酶组合物时，可以与通常可使用的载体和/或稀释剂例如赋型剂(例如乳糖、氯化钠或山梨醇等)、表面活性剂或防腐剂等一起混合来制备。另外，本发明所使用的酶组合物可以根据需要适当制备成适当的形状，例如粉末状或液体等。

[0122] 酶组合物中的酶含量只要根据其使用目的。可发挥足够的酶活性即可，对其没有特别限定，例如可以含有0.01-99重量％，优选0.1-80重量％的量。

[0123] 有关对难分解性蛋白质的分解活性，优选含有以表现为2单位/g或以上(更优选2-500单位/g、进一步优选10-500单位/g、特别优选20-500单位/g)的活性(以角蛋白天青分解活性为指标)的量，或者以表现为1单位/g或以上(更优选1-5000单位/g、进一步优选5-3000单位/g)的活性(以角蛋白粉末分解活性为指标)的量本发明所使用的酶。
该酶量是足够用于分解1mL1％感染羊搔痒病的小鼠脑组织悬浮液中所含的病原性朊病毒蛋白的量。

[0124] 本发明所使用的酶组合物除本发明所使用的酶之外，还可以含有本发明所使用的酶以外的酶，例如蛋白酶(例如角蛋白酶)、脂肪酶、纤 维二糖酶或木聚糖酶的至少一种。与单独含有本发明所使用的酶的酶组合物相比，通过结合使用本发明所使用的酶以外的酶有望更进一步提高病原性朊病毒蛋白质的分解效率。

[0125] 本发明所使用的酶具有分解难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)的活性。因此，本发明所使用的酶、或含有该酶的本发明所使用的酶组合物可作为难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解剂的有效成分、或作为针对有被病原性朊病毒蛋白污染可能性的处理对象物的病原性朊病毒蛋白解毒剂的有效成分。

[0126] 本发明的分解剂或解毒剂可以单独含有作为有效成分的本发明所使用的酶，或含有作为有效成分的本发明所使用的酶的同时，还含有适当的载体和/或稀释剂。上述载体或稀释剂只要不抑制或阻碍作为有效成分的本发明所使用的酶的酶活性即可，作为蛋白质分解剂或解毒剂的载体或稀释剂可以使用通常所使用的载体或稀释剂，例如赋型剂(例如乳糖、氯化钠、硫酸钠或山梨醇等)、表面活性剂或防腐剂。

[0127] 本发明的分解剂或解毒剂的形状并没有特别限定，优选将本制剂投入水中时可一边发泡一边迅速溶解的发泡制剂。发泡制剂的混合和制法并没有特别限定，可以使用已知的方法。例如可以使用在碳酸氢钠或过碳酸钠等中混合有柠檬酸、苹果酸或琥珀酸等酸的制剂，或者再在这些混合原料中混合有硅酸酐等流动剂或其他粘合剂的制剂。 [0128] 分解难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)的方法

[0129] 单独或以本发明的分解剂或解毒剂的形式使用本发明所使用的酶或酶组合物，可以分解难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)，或者在有可能被病原性朊病毒蛋白污染的处理对象物中，使病原性朊病毒蛋白解毒。

[0130] 即，使用本发明所使用的酶或酶组合物分解难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)的方法、以及使用本发明所使用的酶或酶组合物使有可能被病原性朊病毒蛋白污染的处理对象物中的病原性朊病毒蛋白解毒的方法均包含在本发明中。

[0131] 本发明的分解方法至少包括使本发明所使用的酶或酶组合物与难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)或可能含有该蛋白的分解处理对象物接触的步骤。另外，本发明的解毒方法也至少包括使本发明 所使用的酶或酶组合物与可能被病原性朊病毒蛋白污染的解毒处理对象物接触的步骤。

[0132] 上述分解处理对象物或解毒处理对象物(以下合并简称为“处理对象物”)例如可以是可能含有病原性朊病毒蛋白的饲料(例如肉骨粉或堆肥等)、病原性朊病毒蛋白可能附着于表面的器具(例如屠宰器具、检查用具或手术用具等)、或者病原性朊病毒蛋白可能存在的场所(例如屠宰场、发生了BSE的牛舍或感染实验设施等)。

[0133] 上述处理对象物在与本发明所使用的酶接触之前无需进行加热处理(例如约100℃或以上、优选95℃或以上、更优选90℃或以上、特别优选80℃或以上)即可使用，或者也可以在加热处理之后使用。本发明的方法中，即使不实施加热处理，也可以实现充分的分解或解毒，因此优选在与本发明所使用的酶接触之前，不对处理对象物进行加热处理(例如约100℃或以上、95℃或以上、90℃或以上、80℃或以上)即使用。不实施加热处理，则不需要特别的加热处理设备，可使操作过程简化。

[0134] 关于使本发明所使用的酶或酶组合物与处理对象物接触的方法，只要是通过本发明所使用的酶的难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)分解活性，可分解处理对象物中可能含有的难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)的方法即可，对其并没有特别限定，可以根据处理对象物适当选择。

[0135] 例如，处理对象物为可能含有病原性朊病毒蛋白的饲料时，例如可通过将本发明所使用的酶或酶组合物与饲料均匀混合，或者将含有本发明所使用的酶的水溶液撒在饲料中来实现接触。

[0136] 处理对象物为可能有病原性朊病毒蛋白附着在其表面的器具时，例如，将上述器具浸渍于含有本发明所使用的酶的水溶液中的方法，将含有本发明所使用的酶的水溶液散布在上述器具上的方法，或者用含有包含本发明所使用的酶的水溶液的洗涤用具(例如布、抹布或刷子等)擦拭上述器具的表面的方法。

[0137] 处理对象物为有可能存在病原性朊病毒蛋白的场所时，例如可以采取散布含有本发明所使用的酶的水溶液的方法等。

[0138] 本发明的方法中，使本发明所使用的酶或酶组合物与处理对象物接触时，优选在本发明所使用的酶可充分发挥其难分解性蛋白质(特别是 病原性朊病毒蛋白)分解活性的条件下接触。例如优选pH在7-12范围内接触。优选温度在20-80℃，更优选40-80℃的范围内接触。

[0139] 其使用量也可根据处理对象物中所含的难分解性蛋白质(特别是病原性朊病毒蛋白)的量适当确定。例如为了分解1mL1％感染羊搔痒病的小鼠脑组织液中所含的病原性朊病毒蛋白，优选使用0.5-10μg本发明所使用的酶，或者对于难分解性蛋白质分解活性，优选使用具有2单位/g或以上(更优选2-500单位/g、进一步优选10-500单位/g、特别优选20-500单位/g)的活性(以角蛋白天青分解活性为指标)或者1单位/g或以上(更优选1-5000单位/g、进一步优选5-3000单位/g)的活性(以角蛋白粉末分解活性为指标)的本发明所使用的酶组合物。本发明所使用的酶量小于0.5μg，或本发明所使用的酶组合物中所含有的难分解性蛋白质分解活性小于2单位/g(以角蛋白天青分解活性为指标)或小于1单位/g(以角蛋白粉末分解活性为指标)时，可能难以完全分解上述含量的病原性朊病毒蛋白。另外，为了完全分解上述含量的病原性朊病毒蛋白，如果使用超过10μg酶的量或难分解性蛋白质分解活性超过500单位/g的量(以角蛋白天青分解活性为指标)或超过5000单位/g的量(以角蛋白粉末分解活性为指标)的酶组合物，从生产成本上考虑是不现实的。

[0140] 实施例

[0141] 以下通过实施例具体说明本发明，但这并不构成对本发明的限定。 [0142] 实施例1：纯化酶的制备

[0143] 本实施例中，为了获得本发明所使用的纯化酶，按照以下步骤进行培养和纯化。 [0144] 首先，按照常规方法对培养基A[1％聚胨(和光纯药工业)、0.2％酵母提取物(Difco)以及0.1％硫酸镁·7水合物(和光纯药工业)(pH7.0)]加热灭菌，然后在该培养基A(200mL)中接种地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)，在37℃，边通气搅拌边培养72小时。用离心机将所得培养液离心(约3000G、20分钟)，得到含有本发明所使用的酶的培养上清。

[0145] 接着，用截留分子量为5,000的超滤膜浓缩至20倍，得到含有本 发明所使用的酶的培养上清浓缩液。用孔径0.45μm的精密滤膜将上述培养上清浓缩液过滤除菌。向该除菌滤液中添加硫酸铵至终浓度为1mol/L，再用缓冲剂(Tris-盐酸缓冲液)配制，使终浓度为50mmol/L和pH8.5。接着，为进行疏水层析，使上述制备液吸附于苯基·琼脂糖柱，含有1mol/L-0mol/L浓度硫酸铵的Tris-盐酸缓冲液进行线性浓度梯度洗脱，收获含有本发明所使用的酶的组分。将该组分用截留分子量5,000的超滤膜浓缩至20倍，然后进行凝胶过滤色谱。凝胶过滤色谱可以采用Sephadex75(Pharmacia)凝胶。以含有0.1mol/L氯化钠的磷酸缓冲液(0.025mol/L，pH7.0)作为洗脱液，使上述浓缩液通过该凝胶，收获本发明所使用的酶。通过以上的纯化操作，获得了本发明所使用的纯化酶(20μg)。 [0146] 实施例2：酶的理化学性质的验证

[0147] (1)活性和底物专一性

[0148] 研究实施例1中所得的纯化酶对于各种底物(酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白)的活性。结果如表2所示。

[0149] 如表2所示，对任何底物都表现了高的分解活性，特别对角蛋白表现了高的分解活性。表2中的分解活性是在底物浓度0.5％、pH9.0和60℃的条件下，以每1分钟具有相当于1μmol甘氨酸的茚三酮显色能力的酶量作为1单位(U)进行比较的。

[0150] 表2

[0151]

[0152] (2)分子量

[0153] 为了确定实施例1中所得的纯化酶的分子量，进行了使用12％均匀凝胶(Tefco)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果计算出病原性朊病毒蛋白分解酶的分子量约为31,000。

[0154] 另外，使用其它凝胶(15％均匀凝胶；ATTO)进行实施例1所得的纯 化酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，计算出病原性朊病毒蛋白分解酶的分子量约为26,000.本实验中所用的标准标记采用了蛋白质标准(Bio-Rad)。

[0155] (3)等电点

[0156] 为了确定实施例1所得的纯化酶的等电点(pI)，采用LKB两性等电点电泳装置进行聚丙烯酰胺凝胶等电点电泳。结果计算出病原性朊病毒蛋白分解酶的等电点为9.3。该实验所采用的标准样品的等电点如表3所示。

[0157] 表3

[0158]

[0159] (4)最适pH和稳定pH

[0160] 以角蛋白天青(Sigma)分解活性为指标，对实施例1所得的纯化酶在37℃下的最适pH进行了测定，结果如图1所示，pH为9.0-10.0。另外，37℃下的稳定pH如图1所示，为pH7.0-12.0，优选8.0-10.5。

[0161] (5)最适温度

[0162] 关于实施例1所得的纯化酶的最适温度，以角蛋白天青分解活性为指标，用最适pH9.0进行测定，结果如图2所示，最适温度为60-70℃。

[0163] 实施例3：酶基因的克隆和氨基酸序列的确定

[0164] 本实施例中，为了确定实施例1所得的纯化酶的氨基酸序列，对编 码上述酶的基因进行克隆，通过确定其碱基序列来确认氨基酸序列。

[0165] 为了纯化上述酶，将地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERMBP-08487)接种于培养基A(参照实施例1)，在37℃下培养3天，离心获得培养上清。将该上清用pelliconXL(截流5000；Millipore)浓缩至约20倍，制成含1mol/L的硫酸镁以及0.05mol/L的Tris-盐酸(pH8.5)溶液。将其过苯基琼脂糖凝胶柱(Phenyl Sepharose FF；sub，26×300mm；Amersham Bioscience)，在含1mol/L-0mol/L的线性浓度梯度硫酸铵的0.05mol/L Tris-盐酸(pH8.5)中洗脱，回收用0mol/L硫酸铵浓度洗脱的组分。该组分用pellicon XL(截留
5000)、再用Ultrafree-15(截留5000；Millipore)浓缩，过Superdex(Superdex75pg；
16×600mm；Amersham Bioscience)柱，用含0.1mol/L氯化钠的0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱，回收分子量约为31kDa的组分。该组分进行SDS-PAGE，结果单一含有分子量约为31kDa的蛋白质。

[0166] 将纯化的蛋白质进行SDS-PAGE，转印聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon PSQ；Millipore)，水洗，风干。用型号492的蛋白质测序仪(Applied Biosystems)对其进行氨基酸序列分析。结果获得了以下所示的氨基酸序列。

[0167] N末端氨基酸序列：AQTVPYGIPLI(SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中1号-11号氨基酸的序列)

[0168] 证实该序列与来自地衣芽胞杆菌PWD-1的角蛋白酶[Lin，X.等.，Appl.Environ.Microbiol(1995)61，1469-1474]和来自地衣芽胞杆菌的枯草菌溶素Carlsberg[Jacobs，M.等.，Nucleic Acid Res.(1985)13，8913-8926]的序列相同。通过PCR扩增部分片断，以其为探针克隆基因。

[0169] 地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)的基因组DNA可按照Wilson等人的方法(Wilson，C.R.，J.Bacteriol.(1985)163，445-453)制备。以该基因组DNA为模板，使用含有以下序列的引物组合，通过PCR扩增异常朊病毒蛋白分解酶基因的部分片断。PCR用的酶采用Takara Taq(Takara Taq；Takara Bio)，在94℃热变性1分钟，然后以94℃30秒、48℃30秒和68℃2分钟的步骤循环30个周期，扩增目标DNA。

[0170] 用于扩增部分片断的引物PDE-2：5’-agagcggcggaaaagtggac-3’(SEQ ID NO.3) [0171] 用于扩增部分片断的引物PDE-5：5’-cctgcgccaggagccatgac-3’(SEQ ID NO.4) [0172] 结果扩增了约700bp的片断。以该片断为探针，从地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)的基因组文库中克隆全长目标基因。

[0173] 首先，将地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)的基因组DNA用限制酶SauIIIA1进行部分消化，然后将消化片段与EMBLIII载体(Stratagene)连接，用市售的包装试剂盒(MaxPlax Lambdapackaging extract；Epicentre technologies)形成噬菌体颗粒。用市售的筛选试剂盒(DIG高级引物DNA标记和检测引物试剂盒；罗氏)，从该噬菌体文库中进行筛选，从约10000个噬菌斑中得到100种阳性克隆。其中，从10种阳性噬菌体中纯化DNA，将4个阳性克隆所共同含有的约4.1kb SphI片断亚克隆到pUC119(以下称为pUC-PDE4)上。该SphI片断的大小与以PCR产物为探针对地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)的DNA印迹分析所得结果一致。使用该质粒pUC-PDE4，使用型号3730XL(Applied Biosystems)DNA测序仪，通过鸟枪测序法确定序列。结果，含有异常朊病毒蛋白分解酶基因的全长，其翻译区的碱基序列如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

[0174] 结果证实：实施例1所得的纯化酶的氨基酸序列与枯草杆菌蛋白酶DY(国际公开第98/30682号手册)完全一致。除此之外，与其同源性最高的是来自地衣芽孢杆菌的kerA基因，为81％(通过BLAST检索)。

[0175] 实施例4：酶组合物的制备

[0176] 为了获得本发明所使用的酶组合物，在实施例1所记载的培养基A(200mL)中接种地衣芽孢杆菌MSK-103菌株(FERM BP-08487)，在37℃边通气搅拌边培养48小时。用离心机将所得培养液离心(约3000G、30分钟)，得到含有本发明所使用的酶的培养上清。接着，用截留分子量为5,000的超滤膜浓缩至30倍，得到培养上清浓缩液。用孔径0.45μm的精密滤膜将该培养上清浓缩液过滤除菌，得到含有本发明所使用的酶的酶组合物溶液A。该酶组合物A的角蛋白天青分解活性为285单位/g。接着，将酶组合物溶液A冷冻干燥，得到酶组合物粉末A’。

[0177] 另一方面，将培养基B[0.01％酵母提取物(Difco)、1％鱼粉(伊藤忠饲料)、0.01％氯化镁(和光纯药工业)、0.04％磷酸氢二钾(和光纯药工业)、0.03％磷酸二氢钾(和光纯药工业)、0.05％氯化钠(和光纯药工业)和0.05％氯化铵(和光纯药工业)(pH7.0)]加热灭菌，然后在该培养基B(40mL)中接种地衣芽孢杆菌PWD-1菌株(ATCC-53757)，在37℃，边通气搅拌边培养48小时。用离心机将所得培养液离心(约
3000G、30分钟)，得到培养上清。接着，用截留分子量为5,000的超滤膜浓缩至18倍，得到培养上清浓缩液。用孔径0.45μm的精密滤膜将该培养上清浓缩液过滤除菌，得到用于比较的酶组合物溶液B。

[0178] 实施例5：使用纯化酶分解来自小鼠的病原性朊病毒蛋白

[0179] 本实施例中，使用按照实施例1所述的方法制备的、本发明所使用的纯化酶以及市售的蛋白酶[枯草菌溶素(Subtillisin Carlsberg)；Aigma]，以酶标准品[蛋白酶K；和光纯药]的分解能力为基准，评价本发明所使用的酶的病原性朊病毒蛋白的分解能力。 [0180] 本实施例中，从感染了病原性朊病毒蛋白的小鼠[“CLINICAL ANDDIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY，(USA)America Society forMicrobiology(Asm)，1995.3，172-176页]的脑中制备5％匀浆[2％N-月桂基肌氨酸钠、10mol/L-Tris-HCl缓冲液(pH7.5)]，将该匀浆用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.3)稀释，使其终浓度为1％。

[0181] 酶促反应如下进行：将上述1％的脑匀浆与等容量的纯化酶溶液、市售蛋白酶溶液或酶标准品溶液混合，在37℃孵育1小时。纯化酶、市售蛋白酶和酶标准品的浓度按照酶促反应时反应混合液的终浓度衡量，分为1μg/mL和0.2μg/mL两个等级。 [0182] 使用电泳装置(ATTO公司)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10％凝胶；ATTO公司)，将酶促反应结束后的反应混合液的一部分进行电泳[十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)]。通过转印装置(ATTO公司)，按照所附说明，将SDS-PAGE后的聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转印聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Milipore)。以兔抗朊病毒蛋白抗体为第一抗体，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG-抗体(Zymed)为第二抗体，通过抗原抗体法对与该膜结合的病原性朊病毒蛋白进行标记。之后，通过市售的标记和检测系统(ECL+Plus蛋白质印迹检测系统； Amersham Bioscience)，按照所附说明，进行病原性朊病毒蛋白的检测。

[0183] 作为第一抗体使用的兔抗朊病毒蛋白抗体可如下制备：合成肽(PrP94-112)，该肽含有20个氨基酸，其中在绵羊羊搔痒病朊病毒蛋白核心片段P27-30N末端序列上附加有甘氨酸(Cys)，以该肽上附加有匙孔血蓝蛋白(KLH)的肽作为免疫原，对兔进行免疫，使用蛋白质A柱纯化所得抗血清。所得抗体不仅与绵羊朊病毒蛋白反应，还与仓鼠、小鼠和牛的各种朊病毒蛋白反应。

[0184] 结果如图3所示。如图3所示，作为基准的蛋白质K或市售蛋白酶枯草菌溶素在1μg/mL的浓度下检测出显示病原性朊病毒蛋白存在的蛋白酶抵抗性条带。关于这些条带的分子量，完全未被分解的条带的分子量为32kDa，部分被分解的条带(3条)分别为30kDa、25-26kDa和20-21kDa。而本发明所使用的纯化酶中，在0.2μg/mL下检测出条带，但在1μg/mL的浓度下，1％脑匀浆中所含的几乎所有病原性朊病毒蛋白都被分解掉。 [0185] 实施例6：使用酶组合物分解来自小鼠的病原性朊病毒蛋白

[0186] 评价使用按照实施例4中所述的方法制备的、本发明所使用的酶组合物溶液A，对来自小鼠的病原性朊病毒蛋白的分解能力。此时，以酶标准品(蛋白酶K；和光纯药)的分解能力为基准。另外，使用与实施例5中所用的相同的底物(即来自感染了病原性朊病毒蛋白的小鼠的1％脑匀浆)。

[0187] 酶促反应如下进行：将上述1％脑匀浆与等容量的酶组合物溶液或酶标准品溶液混合，在37℃孵育1小时。酶标准品的浓度分为50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL和6.25μg/mL四个等级，酶组合物A使用将上述组合物溶液稀释为1、1/2、1/4、1/8和1/16的溶液。上述组合物的各稀释物对于角蛋白天青的分解活性分别为285单位/g、143单位/g、
71单位/g、36单位/g和18单位/g.

[0188] 按照实施例5所述的方法，对酶促反应结束后反应混合液的一部分实施病原性朊病毒蛋白检测。

[0189] 结果如图4所示。如图4所示，作为基准的蛋白酶K中，即使在50μg/mL的高浓度下也检测出显示病原性朊病毒蛋白存在的蛋白酶抵 抗性蛋白质的条带。而在本发明所使用的酶组合物中，在具有18单位/g角蛋白天青分解活性的酶组合物(1/16稀释物；培养上清的1.875倍浓缩液)中检测出少许条带，在具有36单位/g(1/8稀释物；培养上清的3.75倍浓缩液)或以上的角蛋白天青分解活性的酶组合物中，病原性朊病毒蛋白被完全分解。

[0190] 实施例7：使用酶组合物分解来自绵羊的病原性朊病毒蛋白

[0191] 使用按照实施例4中所述的方法制备的本发明所使用的酶组合物溶液A和用于比较的酶组合物溶液B(含有来自地衣芽孢杆菌PWD-1的角蛋白酶)，以酶标准品(蛋白酶K；和光纯药)的分解能力作为基准，评价对来自绵羊的病原性朊病毒蛋白的分解能力。 [0192] 本实施例中，从感染了病原性朊病毒蛋白的绵羊脑中制备5％匀浆[2％N-月桂基肌氨酸钠、10mol/L-Tris-HCl缓冲液(pH7.5)]，以此作为底物，将该匀浆用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.3)稀释，使该匀浆终浓度为1％.

[0193] 酶促反应如下进行：将上述1％脑匀浆与等容量的酶组合物溶液或酶标准品溶液混合，在37℃孵育1小时。酶标准品的浓度按终浓度分为50μg/mL、10μg/mL、2μg/mL和0.4μg/mL。另一方面，本发明所使用的酶组合物A使用对角蛋白天青的分解活性为285单位/g、143单位/g、71单位/g和36单位/g的溶液(稀释倍率为1、1/2、1/4和1/8)；用于比较的酶组合物溶液B使用对角蛋白天青的分解活性为37单位/g、19单位/g、9单位/g和5单位/g的溶液(稀释倍率为1、1/2、1/4和1/8)。

[0194] 按照实施例5所述的方法，对酶促反应结束后反应混合液的一部分实施病原性朊病毒蛋白检测。

[0195] 结果如图5所示。如图5所示，作为基准的蛋白酶K中，在10μg/mL或以下的浓度中检测出显示病原性朊病毒蛋白存在的蛋白酶抵抗性蛋白质条带。用于比较的酶组合物溶液B在任何浓度下都不分解病原性朊病毒蛋白。而在本发明所使用的酶组合物A中，在任何浓度下都几乎使病原性朊病毒蛋白完全分解。另外当病原性朊病毒蛋白的来源不同，氨基酸序列有一些不同时，该酶也具有分解病原性朊病毒蛋白的能力。

[0196] 实施例8：使用酶组合物分解来自小鼠的病原性朊病毒蛋白

[0197] 按照与实施例4记载的、与制备本发明所使用的酶组合物A同样的方法(即使用培养基A)培养地衣芽孢杆菌PWD-1菌株，然后按照与实施例4记载的制备酶组合物A同样的方法制备用于比较的酶组合物C。

[0198] 按照与实施例4记载的、与制备本发明所使用的酶组合物A同样的方法(即使用培养基A)培养地衣芽孢杆菌DSM-8782菌株，然后按照与实施例4记载的制备酶组合物A同样的方法制备用于比较的酶组合物D。

[0199] 按照与实施例4记载的、与制备用于比较的酶组合物B同样的方法(即使用培养基B)培养地衣芽孢杆菌DSM-8782菌株，然后按照与实施例4记载的制备酶组合物B同样的方法制备用于比较的酶组合物E。

[0200] 表4表示各酶组合物和菌株以及培养基的关系。培养基B为角蛋白酶诱导培养基(日本特开平6-46871号公报)。

[0201] 表4

[0202]

[0203] 除使各酶组合物的终浓度为将培养上清浓缩18倍之外，按照实施例7的步骤，比较对于如上制备的本发明所使用的酶组合物A和用于比较的4种酶组合物B-E对来自小鼠的病原性朊病毒蛋白的分解能力。

[0204] 结果如图6所示。如图6所示，用于比较的酶组合物B-E不能分解病原性朊病毒蛋白。但是，本发明所使用的酶组合物A则可将其完全分解。

[0205] 实施例9：与thermoase的比较试验(1)

[0206] 评价使用根据实施例4所述的方法制备的本发明所使用的酶组合 物A’、以及作为用于比较的酶的国际公开第02/053723号手册记载的菌株——来自Bacillus thermoproteolyticus Rokko菌株的酶thermoase(大和化成株式会社)，对来自仓鼠的病原性朊病毒蛋白(Sc237菌株)的分解能力。

[0207] 用感染了仓鼠型病原性朊病毒蛋白(Sc237菌株)、脑内蓄积有Sc237菌株型病原性朊病毒蛋白的小鼠脑制备1％脑匀浆[50mmol/L-Tris-HCl缓冲液(pH8.3)]，以此作为底物。

[0208] 酶溶液是分别将上述酶组合物A’和thermoase溶解于50mmol/L-Tris-HCl缓冲液(pH8.3)来制备。酶组合物溶液或酶溶液的浓度都是以角蛋白粉末分解活性为指标，终浓度为4、8、16或32单位/mL。

[0209] 酶促反应如下进行：将上述1％脑匀浆与等容量的酶组合物溶液或酶溶液混合，在37℃孵育20小时。

[0210] 按照实施例5所述的方法，对酶促反应结束后反应混合液的一部分实施病原性朊病毒蛋白检测。

[0211] 结果如图7所示。如图7所示，thermoase酶溶液中，在任何酶浓度下都检测出显示病原性朊病毒蛋白存在的蛋白酶抵抗性蛋白质条带。而在本发明所使用的酶组合物中，可知在所有浓度下，病原性朊病毒蛋白都被完全分解至蛋白质印迹法无法检测的水平。 [0212] 实施例10：与thermoase的比较试验(2)

[0213] 国际公开第02/053723号手册中记载：在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下，thermoase对于蛋白质(来自BSE的病原性朊病毒蛋白)的分解活性提高，因此在这样的条件下对分解来自仓鼠的病原性朊病毒蛋白(Sc237菌株)的能力进行评价。

[0214] 评价使用按照实施例4所述的方法制备的本发明所使用的酶组合物A’、与实施例9中使用的相同thermoase溶液，对来自仓鼠的病原性朊病毒蛋白(Sc237菌株)的分解能力。

[0215] 用感染了仓鼠型病原性朊病毒蛋白(Sc237菌株)、脑内蓄积有Sc237菌株型病原性朊病毒蛋白的小鼠脑中制备1％脑匀浆[按照0.1、1或4％的比例添加含SDS的50mmol/L-Tris-HCl缓冲液(pH8.3)(SDS终浓度＝0.05、0.5或2％)]，以此作为底物。

[0216] 酶促反应如下进行：将上述1％脑匀浆与等容量的酶组合物溶液或酶溶液混合，在37℃孵育20小时。酶组合物溶液或酶溶液的浓度都是以角蛋白粉末分解活性为指标，终浓度为4单位/mL。

[0217] 按照实施例5所述的方法，对酶促反应结束后反应混合液的一部分实施病原性朊病毒蛋白检测。

[0218] 结果如图8所示。图8中，泳道1是thermoase(4U/mL；0.05％SDS)的结果，泳道2是thermoase(4U/mL；0.5％SDS)的结果，泳道3是thermoase(4U/mL；2％SDS)的结果，泳道4是酶组合物A’溶液(4U/mL；2％SDS)的结果。

[0219] 如图8所示，thermoase酶溶液在SDS终浓度为2％、4单位/mL酶浓度下检测出显示病原性朊病毒蛋白存在的蛋白酶抵抗性蛋白质条带。而本发明所使用的酶组合物在所有浓度下，病原性朊病毒蛋白都被完全分解至蛋白质印迹法无法检测出的水平。 [0220] 以上可知：在SDS存在下，该酶对于病原性朊病毒蛋白的分解作用比thermoase优异。

[0221] 实施例11：使用微量滴定板进行洗涤模型试验

[0222] 为了研究对被病原性朊病毒蛋白污染的器具的洗涤效果，设定模型试验系统，实施以下的实验。

[0223] 对使用按照实施例4所述的方法制备的、本发明所使用的酶组合物A’溶液和与实施例9中使用的相同的thermoase溶液，分解牢固结合在聚苯乙烯上的来自仓鼠的病原性蛋白质(Sc237菌株)的能力进行评价。

[0224] 用感染了仓鼠型病原性朊病毒蛋白(Sc237菌株)、脑内蓄积有Sc237菌株型病原性朊病毒蛋白的小鼠脑制备1％脑匀浆[50mmol/L-Tris-HCl缓冲液(pH8.3)]，以此作为底物。另外未感染异常朊病毒蛋白的正常脑制备1％脑匀浆[50mmol/L-Tris-HCl缓冲液(pH8.3)]，以此作为对照。

[0225] 将这样制备的正常或感染Sc237的仓鼠1％脑匀浆以各25μL/孔加到聚苯乙烯制的微孔板(IMMUNO MODULE；Nunc)中，在室温下干燥一天，使其完全干燥。 [0226] 为了用酶溶液对如上准备的微孔板进行洗涤处理，以角蛋白粉末分 解活性为指标，用50mmol/L-Tris-HCl缓冲液(pH8.3)稀释酶组合物A’和thermoase，使其为7.5和15单位/mL，分别制成洗涤溶液A(7.5单位/mL)和洗涤溶液B(15单位/mL).

[0227] 为了进行酶促反应，以100μL/孔的比例分别注入洗涤溶液，以100rpm振荡，在37℃孵育1小时。之后，除去洗涤溶液，用约300μL的PBS洗涤2次。

[0228] 以100μL/孔注入6mol/L盐酸胍(和光纯药)，在室温下静置1小时，进行变性处理。之后用约300μL的PBS洗涤3次以除去盐酸胍。接着，以300μL/孔的比例注入5％脱脂乳(Amersham)，在室温下静置1小时，进行封闭。然后用约300μL0.05％吐温20-PBS洗涤2次。

[0229] 以小鼠抗朊病毒蛋白抗体(3F4；chemicon International)为第一抗体，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG-抗体(Zymed)为第二抗体，通过抗原抗体法对与该膜微孔板结合的病原性朊病毒蛋白进行标记。之后，通过市售的标记和检测系统(Super Signal West Dura；Amersham Bioscience)，按照所附说明，使微孔板孔内残存的朊病毒蛋白进行发光反应。该发光量用摄影装置(light capture AE-6962型；ATTO)摄影，用图像分析软件(CS Analuzer；ATTO)进行图像分析。

[0230] 结果表示在图9中。如图9所示，本发明所使用的酶组合物在7.5单位/mL浓度下，病原性朊病毒蛋白的残存率小于10％；在15单位/mL浓度下，病原性朊病毒蛋白的残存率约小于1％。而thermoase在任何浓度下，原性朊病毒蛋白的残存率都为40％或以上，表明本发明的病原性朊病毒蛋白洗涤能力高。

[0231] 产业实用性

[0232] 本发明所使用的酶与公知的蛋白酶相比，具有对难分解性蛋白质、特别是病原性朊病毒蛋白的高的分解活性。因此，本发明所使用的酶或含有该酶的本发明所使用的酶组合物可有效分解病原性朊病毒蛋白。本发明所使用的酶还可以低成本生产。 [0233] 因此，通过使用上述酶或酶组合物，可以将可能被病原性朊病毒蛋白污染的处理对象物中的污染除去。另外，上述酶可有效地作为本发明的病原性朊病毒蛋白分解剂或污染去除剂的有效成分。

[0234] 序列表独立文本

[0235] 以下序列表的数字标记“223”中记载了“人工序列”的说明。具体地讲，序列表SEQ ID NO.3所表示的碱基序列是引物-PDE-2，序列表的SEQ ID NO.4所表示的碱基序列是引物-PDE-5。

[0236] 以上，根据特定的方案对本发明进行了说明，本领域人员可推知的变形或改良也包括在本发明的范围内。