调控植物木质素含量的一种方法转让专利
申请号 : CN200410070592.0
文献号 : CN1733924B
文献日 : 2010-05-05
发明人 : 蒋湘宁 , 陆海 , 赵艳玲 , 陈雪梅 , 曾庆银 , 杨雪萍
申请人 : 北京林业大学
摘要 :
本发明公开了一种调控植物木质素含量的方法。本发明所提供的调控植物木质素含量的方法，调控植物木质素含量的一种方法，是将含有毛白杨4-香豆酸辅酶A连接酶1启动子-4-香豆酸辅酶A连接酶1融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物。本发明通过在植物细胞中引入毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因来生产木质素含量升高的转基因植物，特别是转基因树木，为培育木质素含量升高的植物以及改良树木材性提供了一条重要的途径。
权利要求 :
1.调控植物木质素含量的一种方法，是将含有毛白杨4-香豆酸辅酶A连接酶1启动子-4-香豆酸辅酶A连接酶1融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述毛白杨4-香豆酸辅酶A连接酶1启动子-4-香豆酸辅酶A连接酶1融合基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：用于构建所述含有毛白杨4-香豆酸辅酶A连接酶1启动子-4-香豆酸辅酶A连接酶1融合基因的表达载体的出发载体为Ti类质粒载体或病毒载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述出发载体为Ti类质粒载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述Ti类质粒载体为双元载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述双元载体为pBI121或pBI101。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述含有毛白杨4-香豆酸辅酶A连接酶1启动子-4-香豆酸辅酶A连接酶1融合基因的表达载体为如图1所示的PB|4C|p-4C|1。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述植物为草本植物或木本植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述草本植物为烟草，所述木本植物为杨树。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述转化植物的方法为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述转化植物的方法为农杆菌介导转化法。
说明书 :
技术领域
本发明涉及生物工程领域中调控植物木质素含量的一种方法。
背景技术
植物进化形成一个有效的维管组织对于陆生植物的出现是至关重要的。特别对于多年生木本植物，由于它的多年生和特异性形成木材的特点，维管组织显得更为重要。植物维管组织包括韧皮部与木质部。木质部和韧皮部都是在植物发育过程中由形成层细胞分化和薄璧细胞的再分化而形成的。细胞分化的关键是细胞按照一定程序发生差别基因表达。差别基因表达的关键环节是合成专一性的mRNA。现在通常认为基因的差别表达是该基因的特异调节元件如启动子等来调控的。最新研究认为组织特异性基因的启动子对该基因的组织特异性表达起重要作用。为了研究植物维管组织发育和分化过程中的分子机理，近年来对维管组织特异性启动子的研究成为热点。
反义技术是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成地特定互补的DNA或RNA片断(或化学修饰产物)抑制或封闭基因表达的技术。主要包括反义寡聚核苷酸技术、反义RNA技术和核酶(Ribozyme)技术等。
由于植物体细胞全能性和组培体系的建立，外源反义RNA在真核细胞中的生物学意义的研究进展较快。第一个应用于植物的反义RNA系统是将细菌的CAT基因接上农杆菌的Nos启动子和3’末端之后连在pUC18载体上，转化胡萝卜的原生质体，发现CAT基因的表达受到了抑制。荷兰学者将查尔酮(CHS)的cDNA与CaMV的35S启动子反向连接，转化矮牵牛后再生的转基因植株，其花色从原来的紫红色变为粉红色并夹杂有白色，有些植株花朵完全成白色。一系列检测表明，转基因矮牵牛内源CHS mRNA以及酶蛋白含量降低，从而减少了类黄酮的生物合成。回交试验还表明这一性状是由染色体稳定遗传给后代的。这是首次利用人工反义RNA系统调节植物基因组的活动取得了成功，为园艺学育种开辟了一个新的领域。
木质素是由三种醇单体或单木质酚(对香豆醇、松柏醇、芥子醇)合成的一种复杂的酚类聚合物。在细胞壁的木质化过程中，木质素渗入到细胞壁中，填充于纤维素构架内，如导管和管胞细胞的形成。由于木质素的渗入，加大了细胞壁的硬度，增强了细胞的机械支持力或抗压强度，促进机械组织的形成，以有利于巩固和支持植物体及水分输道等作用，同时由于木质素的化学特性，如不可溶性和复杂的酚类聚合物，使得木质部具有细胞壁疏水性，也增强了抗病能力。
树木的次生木质部有纤维素(β-1-4-糖苷)木质素(苯基多聚物)和半纤维素(异型多糖)，比例约为2∶1∶1。在树木生长时，纤维素微纤丝为细胞壁提供张力，木质素增加纤维素微纤丝的硬度。木质素含量高的木材由于硬度高而广泛用于建筑和家具领域。但在造纸过程中却需要清除木质素。目前去除木浆中的木质素一般需借助毒性较高的化学物质，这道工序是造纸工业中最耗费能源、对环境危害最大的一个环节。无论是提高树木的木质素含量还是降低木质素含量都将有益于生产。
从策略上说，可以从多个方面进行木质素含量控制：(1)控制木质素合成途径中的各种酶系的合成是一个重要途径，如对从PAL酶到过氧化物酶/漆酶等进行反义基因转化有可能达到目的；(2)改变木质素的结构组成和化学性质。由于研究木质素含量遗传变异的重要目的之一就是为工业造纸服务，在难以直接降低木质素含量情况下，改变木质素的结构组成有可能间接地达到同样的效果；(3)必须认识到木质素的前体是在细胞质内合成的，然后转移到细胞壁并进行脱氢聚合形成木质素，因此木质素的合成调控也需注意涉及到一些非酶化学分子的作用，即传递运输过程的控制，但这方面的研究至今却很少见报道研究。单个酶的作用及多个酶间的相互作用对于探索木质素的合成机理有重要意义，因此木质素合成酶的分子生物学特性及作用机理研究日益受重视。
目前直接应用基因工程的方法来改变木质素含量的研究已有报道。Piquemal等从冈尼桉(Eucalyptus)分离出来的CCR(羟基肉桂酰辅酶A还原酶)(EC1.2.1.44)酶的cDNA的反义构建载体，通过农杆菌(Agrobacerium)转化到烟草(Nicotianatabacum L.)上，结果显示出在稳态时CCR mRNA含量和CCR活性下降，且含量下降的植株木质部细胞壁呈橙棕色，紫丁香基与愈创木基的比率提高，且出现不正常细胞壁酚类物质。然而CCR活性严重下降的植物除了表现出木质素下降外，还表现出形体小、叶形异常和绉缩导管等特征。通常认为CAD(羟基肉桂醇脱氢酶)是催化木质素前体合成的最后一步的酶，因此降低CAD活性有可能减少木质素前体的合成。Baucher等研究将从毛果杨×美洲黑杨(P.trichocarpa Torr.EtGroy×P.deltoides Marsh.)分离出来的CAD酶的cDNA通过农杆菌进行正义和反义转化到欧洲山杨×银白杨(P.tremula L.×P.alba L.)中，结果表明3个反义转化和2个共抑制的品系的木质部组织CAD活性下降70％，在CAD活性少于60％的品系中，可检测到红色的木质部，但木质素含量和组成与对照品系相似，并未下降。但是细胞壁的化学特性不同，应用间苯三酚染色后，正常品系的木质部呈典型的淡红色，而CAD活性下降的品系染色后呈棕红色。用NaOH处理后，通过将细胞壁中具有碱溶性的部分进行酸化处理后，具有红色木质部的品系的木质素可沉淀，而白色木质部的品系的木质素不沉淀。光谱分析显示出红色木质部的杨树香兰素和紫丁香基醛含量提高。纸浆试验证明CAD活性下降的品系只有少量的木质素存于纸浆中。类似的报道还有Higuchi等，CAD反义转化的植株木质素含量并不下降，但木质素的组成和化学性质发生了改变。CAD反义转化后木质素含量不下降，这与自然界中火炬松CAD突变体的结果不一致。OMT是重要的控制木质素合成酶，Dwivedi等将美洲山杨中编码bi-OMT(EC2.1.1.68)酶的反义序列与Ca MV35S基因的增强子、启动子和终止子组装后转化到烟草基因组内后，转基因植株表现出正常的表现型。在4个转基因植株的茎部中，OMT(咖啡酸O-甲基转移酶)酶的活性平均下降29％。茎部木材化学分析结果显示出紫丁香基单位含量下降，木质素含量下降水平与bi-OMT酶活性程度相关。Doorsselaere等应用反义COMT(咖啡酸甲基转移酶)转化欧洲山杨×银白杨后，COMT活性下降为正常的5％，但木质素含量并不下降。根据应用转化单酶基因方法改造烟草木质素含量的研究报道，降低单个酶OMT、CAD、POD(过氧化物酶)、COMT和F5H(阿魏酸5-羟基化酶)等酶活性，并不影响木质素含量变化，而降低酶系PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸4-羟基化酶)和CCR(羟基肉桂酰辅酶A还原酶)等酶活性，则可以降低木质素含量。
通过鉴定树木与草本植物中木质素合成途径的酶和基因，以往努力减少树木中木质素的含量，通过下调编码咖啡酸O-甲基转移酶或肉桂醇脱氢酶含量没有获得成功，只是修饰了木质素的结构.在转基因烟草中降低这些酶的含量显示没有减少木质素的含量.然而通过在转基因烟草中降低苯丙氨酸脱氨酶含量，显著减少了木质素的含量，该酶催化木质素合成途径中进入苯丙基衍生物的途径导致了一系列表型不正常.同样在转基因拟南芥和烟草中通过降低肉桂酸辅酶A还原酶的含量也降低了(25％-40％)木质素的含量，但导致了细胞壁的委缩和矮化.这些草木系统清晰地表明了修饰次生代谢和木质素质量的可能性.因此，树木生物技术的问题是能否降低木质素含量而不影响结构的硬度和树木的生长.
杨树的4CL(4-香豆酸辅酶A连接酶)蛋白Pt4CL1、Pt4CL2催化羟基肉桂酸与CoA的连接反应，为木质素和类黄酮的生物合成提供酚类前体。Pt4CL2在茎和叶的表皮细胞中表达，与类黄酮合成相关。Pt4CL1是在发育的木质部中表达，和木质素的合成相关。
发明创造内容
本发明的目的是提供调控植物木质素含量的一种方法。
本发明所提供的调控植物木质素含量的方法，是将含有毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物；将含有毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。
所述毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中的序列1由2893个碱基组成，4CL1基因的开放阅读框架为自5′端第1150位-2772位核苷酸序列。
所述毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。
序列表中的序列2由2770个碱基组成。
用于构建所述含有毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因的表达载体或含有毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因的表达载体的出发载体可为Ti类质粒载体和病毒载体，优选为Ti类质粒载体。
所述Ti类质粒载体优选为双元载体，如pBI101或pBI121。所述含有毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因的表达载体优选为PBI4Clp-4Cl1；所述含有毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因的表达载体优选为PBMZFA2。
所述转化方法可为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法，优选为农杆菌介导转化法。
本发明方法中，所述植物可为草本植物或木本植物，其中，所述草本植物优选为烟草，所述木本植物优选为杨树。
本发明通过在植物细胞中引入毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因或毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因，来生产木质素含量升高或降低的转基因植物特别是转基因树木，为培育木质素含量降低或升高的植物以及改良树木材性提供了一条重要的途径。
反义技术是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成地特定互补的DNA或RNA片断(或化学修饰产物)抑制或封闭基因表达的技术。主要包括反义寡聚核苷酸技术、反义RNA技术和核酶(Ribozyme)技术等。
由于植物体细胞全能性和组培体系的建立，外源反义RNA在真核细胞中的生物学意义的研究进展较快。第一个应用于植物的反义RNA系统是将细菌的CAT基因接上农杆菌的Nos启动子和3’末端之后连在pUC18载体上，转化胡萝卜的原生质体，发现CAT基因的表达受到了抑制。荷兰学者将查尔酮(CHS)的cDNA与CaMV的35S启动子反向连接，转化矮牵牛后再生的转基因植株，其花色从原来的紫红色变为粉红色并夹杂有白色，有些植株花朵完全成白色。一系列检测表明，转基因矮牵牛内源CHS mRNA以及酶蛋白含量降低，从而减少了类黄酮的生物合成。回交试验还表明这一性状是由染色体稳定遗传给后代的。这是首次利用人工反义RNA系统调节植物基因组的活动取得了成功，为园艺学育种开辟了一个新的领域。
木质素是由三种醇单体或单木质酚(对香豆醇、松柏醇、芥子醇)合成的一种复杂的酚类聚合物。在细胞壁的木质化过程中，木质素渗入到细胞壁中，填充于纤维素构架内，如导管和管胞细胞的形成。由于木质素的渗入，加大了细胞壁的硬度，增强了细胞的机械支持力或抗压强度，促进机械组织的形成，以有利于巩固和支持植物体及水分输道等作用，同时由于木质素的化学特性，如不可溶性和复杂的酚类聚合物，使得木质部具有细胞壁疏水性，也增强了抗病能力。
树木的次生木质部有纤维素(β-1-4-糖苷)木质素(苯基多聚物)和半纤维素(异型多糖)，比例约为2∶1∶1。在树木生长时，纤维素微纤丝为细胞壁提供张力，木质素增加纤维素微纤丝的硬度。木质素含量高的木材由于硬度高而广泛用于建筑和家具领域。但在造纸过程中却需要清除木质素。目前去除木浆中的木质素一般需借助毒性较高的化学物质，这道工序是造纸工业中最耗费能源、对环境危害最大的一个环节。无论是提高树木的木质素含量还是降低木质素含量都将有益于生产。
从策略上说，可以从多个方面进行木质素含量控制：(1)控制木质素合成途径中的各种酶系的合成是一个重要途径，如对从PAL酶到过氧化物酶/漆酶等进行反义基因转化有可能达到目的；(2)改变木质素的结构组成和化学性质。由于研究木质素含量遗传变异的重要目的之一就是为工业造纸服务，在难以直接降低木质素含量情况下，改变木质素的结构组成有可能间接地达到同样的效果；(3)必须认识到木质素的前体是在细胞质内合成的，然后转移到细胞壁并进行脱氢聚合形成木质素，因此木质素的合成调控也需注意涉及到一些非酶化学分子的作用，即传递运输过程的控制，但这方面的研究至今却很少见报道研究。单个酶的作用及多个酶间的相互作用对于探索木质素的合成机理有重要意义，因此木质素合成酶的分子生物学特性及作用机理研究日益受重视。
目前直接应用基因工程的方法来改变木质素含量的研究已有报道。Piquemal等从冈尼桉(Eucalyptus)分离出来的CCR(羟基肉桂酰辅酶A还原酶)(EC1.2.1.44)酶的cDNA的反义构建载体，通过农杆菌(Agrobacerium)转化到烟草(Nicotianatabacum L.)上，结果显示出在稳态时CCR mRNA含量和CCR活性下降，且含量下降的植株木质部细胞壁呈橙棕色，紫丁香基与愈创木基的比率提高，且出现不正常细胞壁酚类物质。然而CCR活性严重下降的植物除了表现出木质素下降外，还表现出形体小、叶形异常和绉缩导管等特征。通常认为CAD(羟基肉桂醇脱氢酶)是催化木质素前体合成的最后一步的酶，因此降低CAD活性有可能减少木质素前体的合成。Baucher等研究将从毛果杨×美洲黑杨(P.trichocarpa Torr.EtGroy×P.deltoides Marsh.)分离出来的CAD酶的cDNA通过农杆菌进行正义和反义转化到欧洲山杨×银白杨(P.tremula L.×P.alba L.)中，结果表明3个反义转化和2个共抑制的品系的木质部组织CAD活性下降70％，在CAD活性少于60％的品系中，可检测到红色的木质部，但木质素含量和组成与对照品系相似，并未下降。但是细胞壁的化学特性不同，应用间苯三酚染色后，正常品系的木质部呈典型的淡红色，而CAD活性下降的品系染色后呈棕红色。用NaOH处理后，通过将细胞壁中具有碱溶性的部分进行酸化处理后，具有红色木质部的品系的木质素可沉淀，而白色木质部的品系的木质素不沉淀。光谱分析显示出红色木质部的杨树香兰素和紫丁香基醛含量提高。纸浆试验证明CAD活性下降的品系只有少量的木质素存于纸浆中。类似的报道还有Higuchi等，CAD反义转化的植株木质素含量并不下降，但木质素的组成和化学性质发生了改变。CAD反义转化后木质素含量不下降，这与自然界中火炬松CAD突变体的结果不一致。OMT是重要的控制木质素合成酶，Dwivedi等将美洲山杨中编码bi-OMT(EC2.1.1.68)酶的反义序列与Ca MV35S基因的增强子、启动子和终止子组装后转化到烟草基因组内后，转基因植株表现出正常的表现型。在4个转基因植株的茎部中，OMT(咖啡酸O-甲基转移酶)酶的活性平均下降29％。茎部木材化学分析结果显示出紫丁香基单位含量下降，木质素含量下降水平与bi-OMT酶活性程度相关。Doorsselaere等应用反义COMT(咖啡酸甲基转移酶)转化欧洲山杨×银白杨后，COMT活性下降为正常的5％，但木质素含量并不下降。根据应用转化单酶基因方法改造烟草木质素含量的研究报道，降低单个酶OMT、CAD、POD(过氧化物酶)、COMT和F5H(阿魏酸5-羟基化酶)等酶活性，并不影响木质素含量变化，而降低酶系PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸4-羟基化酶)和CCR(羟基肉桂酰辅酶A还原酶)等酶活性，则可以降低木质素含量。
通过鉴定树木与草本植物中木质素合成途径的酶和基因，以往努力减少树木中木质素的含量，通过下调编码咖啡酸O-甲基转移酶或肉桂醇脱氢酶含量没有获得成功，只是修饰了木质素的结构.在转基因烟草中降低这些酶的含量显示没有减少木质素的含量.然而通过在转基因烟草中降低苯丙氨酸脱氨酶含量，显著减少了木质素的含量，该酶催化木质素合成途径中进入苯丙基衍生物的途径导致了一系列表型不正常.同样在转基因拟南芥和烟草中通过降低肉桂酸辅酶A还原酶的含量也降低了(25％-40％)木质素的含量，但导致了细胞壁的委缩和矮化.这些草木系统清晰地表明了修饰次生代谢和木质素质量的可能性.因此，树木生物技术的问题是能否降低木质素含量而不影响结构的硬度和树木的生长.
杨树的4CL(4-香豆酸辅酶A连接酶)蛋白Pt4CL1、Pt4CL2催化羟基肉桂酸与CoA的连接反应，为木质素和类黄酮的生物合成提供酚类前体。Pt4CL2在茎和叶的表皮细胞中表达，与类黄酮合成相关。Pt4CL1是在发育的木质部中表达，和木质素的合成相关。
发明创造内容
本发明的目的是提供调控植物木质素含量的一种方法。
本发明所提供的调控植物木质素含量的方法，是将含有毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物；将含有毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。
所述毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中的序列1由2893个碱基组成，4CL1基因的开放阅读框架为自5′端第1150位-2772位核苷酸序列。
所述毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。
序列表中的序列2由2770个碱基组成。
用于构建所述含有毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因的表达载体或含有毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因的表达载体的出发载体可为Ti类质粒载体和病毒载体，优选为Ti类质粒载体。
所述Ti类质粒载体优选为双元载体，如pBI101或pBI121。所述含有毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因的表达载体优选为PBI4Clp-4Cl1；所述含有毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因的表达载体优选为PBMZFA2。
所述转化方法可为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法，优选为农杆菌介导转化法。
本发明方法中，所述植物可为草本植物或木本植物，其中，所述草本植物优选为烟草，所述木本植物优选为杨树。
本发明通过在植物细胞中引入毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因或毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因，来生产木质素含量升高或降低的转基因植物特别是转基因树木，为培育木质素含量降低或升高的植物以及改良树木材性提供了一条重要的途径。
附图说明
图1为毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因表达载体PBI4Clp-4Cl1的构建过程示意图
图2为毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因表达载体PBI4Clp-4Cl1的PCR检测图谱
图3为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草再生苗的PCR检测图谱
图4为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草的southern杂交图谱
图5为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草的northern杂交图谱
图6a为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草叶中的4CL1酶活性分析柱状图
图6b为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草茎中的4CL1酶活性分析柱状图
图7为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草的木质素含量变化示意图
图8为转毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因烟草的木质素含量柱状图
图2为毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因表达载体PBI4Clp-4Cl1的PCR检测图谱
图3为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草再生苗的PCR检测图谱
图4为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草的southern杂交图谱
图5为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草的northern杂交图谱
图6a为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草叶中的4CL1酶活性分析柱状图
图6b为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草茎中的4CL1酶活性分析柱状图
图7为转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因烟草的木质素含量变化示意图
图8为转毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因烟草的木质素含量柱状图
具体实施方式
材料
限制性内切酶、dNTP和Tag DNA聚合酶购自上海生工公司(美国Premega产品，进口分装)。DNA回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒购自重庆博大科技公司(美国Premega产品，进口分装)。PCR引物合成和DNA测序由DNA测序仪377型测定完成(北京赛百盛公司)。
pBI121质粒(购自Clontech)，pUC18-T载体购自上海生工公司(美国BBI公司产品)。
实施例1、培育木质素含量提高的转基因烟草
本实施例所用的地高新试剂盒的货号为92445820，31 Oct 2003，Boehringer公司。
按常规方法提取毛白杨的总RNA，分离mRNA，反转录合成cDNA，在引物1：5-CGCAATGGACGCACAATGAAT-3和引物2：5-ANTGTCTTACGTTGGGTACG-3的引导下，以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化回收目的片段，与pUC18-T载体相连后转化大肠杆菌JM109，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到含有杨树4CL1基因的载体pt4CL。
以按照常规方法提取的毛白杨总DNA为模板，在引物1：5-ATGACGGTGGCATGAACAC-3和引物2：5-TGGCGAGTTTTAGGTGCTC-3的引导下常规PCR扩增，扩增产物纯化回收后与pUC18-T载体相连后转化大肠杆菌JM109，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到含有毛白杨4CL启动子的载体p4CL1p。
以pt4CL为模板，在引物1：CAAGCTT GCAATGGACGCCACAATGAATCC，引物2：CGGATCCCTGTCTTACGTTGGGTACG的引导下，按照如下循环程序：94℃5min；94℃30sec，55℃45sec，72℃90sec，30个循环；72℃10min进行PCR扩增，回收、纯化PCR扩增产物，得到4CL1基因片段，分别利用PstI和BamH I酶切纯化的PCR扩增产物和PUC18，然后进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到亚克隆载体p4CL1。
用同样方法，以p4CL1p为模板，在引物3：CAAGCTTGA CGGTGGCATGAACACAAAGC，引物4：CCTGCAGTGGCGAGTTTTAG GTGCTCT的引导下进行PCR扩增，回收、纯化PCR扩增产物，得到毛白杨4CL启动子基因片段，分别利用PstI和Hind III酶切纯化的PCR扩增产物和PUC18，然后进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到亚克隆载体p4CLp.
毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因表达载体PBI4Clp-4Cl1的构建过程如图1所示，具体过程如下：用HindIII/PstI酶将毛白杨4CL1启动子片段从亚克隆载体p4CLp上切下，与用PstI/BamHI酶将4CL1片段从亚克隆载体p4CL1上切下的片段相连接，连接产物回收后与HindIII/BamHI酶切的pBI121载体进行连接，获得含有毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因的重组质粒PBI4Clp-4Cl1，该重组质粒按常规方法转入大肠杆菌感受态细胞。在含卡那霉素(km)100mg/L的LB平板培养筛选后，提取质粒同时进行HindIII/BamHI酶切鉴定，鉴定结果表明重组质粒PBI4Clp-4Cl1的结构正确。以重组质粒PBI4Clp-4Cl1为模板，利用引物1：CAAGCTTGCAATGGACGC CACAATGAATCC和引物2：CGGATCCCTGTCTTACGTTGGGTACG对4CL1基因进行PCR鉴定，利用引物3：CAAGCTTGACGGTG GCATGAACACAAAGC和引物4：CCTGCAGTGGCGAGTTTTAGGTG CTCT对毛白杨4CL1启动子进行PCR鉴定，结果如图2所示，表明毛白杨4CL1启动子和4CL1基因序列均已在载体PBI4Clp-4Cl1中。按常规方法对质粒PBI4Clp-4Cl1进行测序，结果表明毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，位于PBI4Clp-4Cl1的4951bp-7836bp之间；序列表中的序列1由2893个碱基组成，4CL1基因的开放阅读框架为自5′端第1150位-2772位核苷酸序列。
2、烟草的转化与鉴定分析
按改进的An方法，直接转化农杆菌LBA4404，在链霉素(Sm)125mg/L和Km50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震荡培养到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将烟草无菌苗的叶片剪下，除去叶脉，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡2-3min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在表面铺一张滤纸的MS培养基上，28℃暗培养4天，将外植体转移到含100mg/L Km，500mg/L羧卞霉素(Car)的MS培养基(0.5mg/L IAA，2.0mg/L BA)上28℃继续培养，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。每隔14天换一次培养基。当抗性芽长到1-3cm时切下，转到培养基中长茎。当茎长到3-5cm时，按照文献(王关林，方宏筠，1998，科学出版社)的方法转到生根培养基(100mg/LKm，500mg/L羧卞霉素(Car))中生根，结果得到83株抗性再生苗。取20株按常规方法提取植株总DNA，在引物1：CAAGCTTGCAATGGACGC CACAATGAATCC，引物2：CGGATCCCTG TCTTACGTTGGGTACG的引导下按常规方法进行PCR扩增4CL1基因，结果均为PCR检测阳性(图3)。
3、转基因烟草的southern杂交
按照常规方法提取PCR检测阳性的转基因烟草和非转基因烟草植株的总DNA，以非转基因烟草为对照，使用限制性内切酶XbaI(Takara)在37℃进行酶解3小时，进行1％琼脂糖凝胶电泳，将电泳胶放在10倍体积的变性液(1.5M NaCl，0.5MNaOH)中震荡40min，再在10倍体积的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH 7.0)中震荡40min，使用20×SSC进行DNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。取1ug步骤1中PCR得到的4CL1基因片段，加蒸馏水至16ul。沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGH PRIME，混匀.37℃保温1h，加入0.2MEDTA(PH＝8.0)，混匀.预热杂交液(地高新试剂盒中自带的杂交液)至42℃.预杂交30min.取DNA探针(探针用量为25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中.将变性探针DNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中.除去气泡，封口，42℃过夜.取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml马来酸缓冲液(Maleic acid buffer)(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液(地高新试剂盒中自带)平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果表明在所检测的20株PCR检测阳性的再生苗中，16株的southern杂交结果为阳性。4株southern杂交结果为阳性的杂交图谱如图4所示。图4中，CK为非转基因烟草对照，1-4为PCR检测阳性的转基因烟草。
4、转基因烟草的Northern杂交
按照常规方法提取southern杂交检测阳性的16株转基因烟草植株的总RNA，以非转基因烟草为对照，进行变性琼脂糖凝胶电泳。使用20×SSC进行RNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。用1ug PCR得到的4CL1基因的DNA，加蒸馏水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min，加入2ul DIG-HIGH PRIME，混匀，37℃保温1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混匀。预热杂交液(地高新试剂盒中自带)至42℃。预杂交30min。取RNA探针(探针用量为25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。将变性探针RNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中。除去气泡并封口、42℃过夜。取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml马来酸缓冲液(Maleic acid buffer)(0.1M马来酸0.15M NaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液(地高新试剂盒中自带)平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果表明在所检测的16株southern杂交检测阳性的再生苗中，11株为阳性。部分植株的northern杂交结果如图5所示，图5中，CK为非转基因烟草，1-5为southern杂交检测阳性的转基因烟草植株。
5.转基因烟草4CL1酶活性的测定
northern杂交检测阳性的转基因烟草叶片和茎分别在液氮下粉碎，同时以非转基因烟草为对照，用提取缓冲液(0.2M Tris-HCl pH7.5，8mM MgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃离心15min，上清液用于酶活性分析。同时使用BSA做标准曲线，对蛋白粗提液定量。1ml酶反应液中包括0.2M Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2，0.8mM ATP，0.1mM底物(分别为4-香豆酸，阿魏酸和咖啡酸)，和25-30ul粗提液于24℃反应12分钟，然后测定A333，A346，A350的增加。每个样品做3个平行实验。结果如表1、表2、图6a和图6b所示，表明在转基因烟草的茎中4CL1酶活性有较明显的提高(增加30-40％)，而在叶中无明显增加。说明毛白杨4CL1启动子可以在转基因烟草的形成层部位特异性表达4CL1酶。表1和表2中，1-9表示转基因植株；图6a和图6b中，sample1-sample9为转基因植株。
表1.转基因烟草与非转基因烟草(CK)叶中4CL1酶活性分析(以三组为平行)
4-香豆酸(4-coumaric acid)pKa/mg蛋白 咖啡酸(Caffeic acid)pKa/mg蛋白 阿魏酸(Ferulic acid) pKa/mg蛋白 CK 17.7 8.1 10.3 1 17.6 8.4 10.9 2 18.4 9.2 11.0 3 19.5 9.6 10.8 4 16.7 7.8 9.5 5 17.2 7.7 8.6 6 18.5 8.5 11.2 7 18.3 8.3 14.3 8 17.9 8.6 12.7 9 19.2 9.2 12.5
表2.转基因烟草与非转基因烟草(CK)茎中4CL1酶活性
4-香豆酸(4-coumaric acid)pKa/mg蛋白 咖啡酸(Caffeic acid) pKa/mg蛋白 阿魏酸(Ferulic acid) pKa/mg蛋白 CK 157.4 46.3 66.3 1 198.4 55.2 77.5 2 189.6 48.9 71.5 3 191.5 50.6 80.6 4 165.4 52.6 78.2
4-香豆酸(4-coumaric acid)pKa/mg蛋白 咖啡酸(Caffeic acid) pKa/mg蛋白 阿魏酸(Ferulic acid) pKa/mg蛋白 5 161.7 51.7 77.6 6 175.8 65.9 89.4 7 200.6 92.1 114.3 8 195.6 63.7 94.8 9 214.8 96.7 104.5
6、转基因烟草中木质素含量的测定
northern杂交检测阳性的转基因烟草苗生根培养30天后，分别取空白对照(非转基因烟草)与转基因植株各6株，液氮冷冻条件下研磨，称取1.00g，加入6mL72％的H2SO4，30-40℃恒温水浴不断搅拌1小时。用蒸馏水稀释到H2SO4浓度为4％，121℃第二次消化1小时。用不同溶剂(丙酮，水，乙醇)溶解转基因烟草中的木质素测定含量，固体经离心，60℃烘干至恒重，计算木质素含量。结果如表3、表4、表5和图7所示，表明木质素含量有一定程度的提高(3.9％-6.0％)。表3、表4和表5中，1-3表示转基因植株；图7中，sample1-sample3为转基因植株。
表3.丙酮溶解提取的木质素含量的变化(每给数据测定三次取平均值)
表4.水溶解提取的木质素含量的变化
表5.乙醇溶解提取的木质素含量的变化
实施例2、培育木质素含量降低的转基因烟草
1、毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因表达载体PBMZFA2的构建
用引物a，b，c，d分别从含有毛白杨4CL1启动子与4CL1基因的克隆载体PBI4Clp-4Cl1中扩增目标基因，用引物a，b扩增应得到一条1100bp的带，用引物c，d扩增应得到一条1700bp的带。
PCR聚合酶链式反应的反应液组成是：1×缓冲液体系；寡聚核苷酸引物，0.2umol/L；DNA模板，1ug/ul；脱氧核苷三磷酸，100umol/L；热稳定的TagDNA聚合酶，2.5U/100ul。反应程序采用94℃变性5分钟，94℃模板变性30秒，65℃引物退火45秒，72℃延伸60秒，30个循环后，72℃延伸10分钟结束反应。然后将二个PCR反应液混合，用上述的PCR程序继续反应20次。结果产物有三条带：分别为2800bp，1700bp，1100bp，用博大科技的玻璃奶回收试剂盒回收2800bp的条带。
引物a 5’-GTCTAGAGACGGTGGCATGAAC-3’
引物b 5’-CCAACGTAAGACAGTAATAACCAGTGTTGCTCAAC-3’
引物c 5’-TACTGTCTTACGTTGGGTAC-3’
引物d 5’-CCCCGGGATGGACGCCACAATG-3’
回收纯化已经连接好的2800bp片断，与PMD-18T载体(Takara)16℃过夜连接，得到重组载体转化大肠杆菌JM109(Frederick 1992)，并由上海申工测序验证，此载体定名为T-mf。将验证过的T-mf载体与pBI101载体质粒用XbaI/SmaI酶切。取纯化回收的经XbaI/SmaI双酶切的PBI101 1ul和纯化的2800bp的插入DNA片断连接反应，获得毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因表达载体PBMZFA2。用质粒PBMZFA2按照常规方法转化大肠杆菌JM109感受态细胞。在含Km 100mg/L(卡那霉素)的LB平板培养筛选后，将经XbaI/SmaI双酶切检测呈阳性和以引物a：GTCTAGAGACGGTGG CATGAAC和引物d：CCCCGGGATGGACGCCACAATG进行的PCR检测呈阳性的菌株，由上海申工测序，结果表明毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，位于PBMZFA2的4975bp-7739bp之间；序列表中的序列2由2770个碱基组成。
2、烟草的转化与鉴定分析
按改进的An方法，PBMZFA2直接转化农杆菌LBA4404，在Sm 125mg/L和Km 50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震荡培养到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将烟草无菌苗的叶片剪下，除去叶脉，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡2-3min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在表面铺一张滤纸的MS培养基上，28℃暗培养4天，将外植体转移到有选择压(Km 100mg/L，Car 250mg/L)的分化培养基-MS培养基+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA上，在25℃，14小时的光照条件下培养，每隔14天换一次培养基，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。待转化苗长到1cm时，按照文献(王关林，方宏筠，1999，科学出版社)的方法转到生根培养基(Km 100mg/L，Car 250mg/L)中生根，一周后生根。未转化的不定芽在选择培养基中枯萎，不能正常生长。经抗菌素培养筛选，分别获得含有毛白杨4CL1启动子-反义4CL1基因的植株20株。
生根后的转基因苗在组织培养条件下培养45天，炼苗、移栽盆中。得到转基因烟草幼苗，与烟草空白对照，生理生长与形态无明显变化。
按常规方法提取转基因烟草的总DNA，用引物c、d按照常规方法进行PCR检测，同时以非转基因烟草作为空白对照。结果在转基因烟草中得到1700bp的扩增条带，表明毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因已经转入到再生苗中。
3、转基因烟草木质素含量分析
按照常规方法分别测定转毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因烟草和空白烟草的木质素含量，结果如表6和图8所示，表明9株被检测的转基因烟草的木质素含量均有所变化，木质素含量降低最大的达到10.5％。转基因植株平均的木质素含量是23.4％，对照植株的平均木质素含量是28.2％，多株转基因植株的木质素平均含量比对照降低了4.8％(表6)。转基因植株木质素含量的降低，说明毛白杨4CL1启动子启动的反义的4CL1基因的转入，干涉了正常的4CL1RNA的转录或表达，降低了4-香豆酸连接酶的活性，从而干扰了木质素的生物合成，降低了转基因植物的木质素含量。表6和图8中，1-9为转基因烟草植株。
表6.转基因烟草木质素平均含量对照表
株系 木质素含量(％) 对照 28.2％ 1 27.5％ 2 27.9％ 3 31.2％ 4 30.5％ 5 19.7％ 6 21.4％ 7 15.6％ 8 14.7％
株系 木质素含量(％) 9 22.6％
实施例3、培育木质素含量升高的毛白杨741
1、毛白杨741的转化
将构建好的毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因植物二元表达载体PBI4Clp-4Cl1，按改进的An方法，直接转化农杆菌LBA4404，在Sm 125mg/L和Km 50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震荡培养到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将毛白杨741无菌苗的叶片剪下，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡10min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在毛白杨741叶片分化培养基上-MS培养基(0.1mg/LNAA，1.0mg/L BA)，28℃暗培养4天，将外植体转移到含100mg/L Km，250mg/L Car(羧卞霉素)的叶片分化培养基MS培养基(0.1mg/L NAA，1.0mg/L BA)，28℃继续培养，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。每隔14天换一次培养基。当茎长到3-5cm时，转到含有卡那霉素和羧苄霉素的生根培养基1/2MS培养基(0.3mg/LNAA，1.0mg/L BA)中生根，结果得到再生苗20株。
2、转基因毛白杨741的southern杂交
按照常规方法提取转基因毛白杨741和非转基因毛白杨741的总DNA，以非转基因毛白杨741为对照，使用SmaI限制性内切酶在30℃酶解10小时后，1％琼脂糖凝胶电泳，将电泳胶放在10倍体积的变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中震荡40min，再在10倍体积的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH 7.0)中震荡40min，使用20×SSC进行DNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。用1ug由PCR得到的4CL1基因片段作探针，加蒸馏水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGH PRIME，混匀。37℃保温1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混匀。预热杂交液(地高新试剂盒中自带的杂交液)至42℃。预杂交30min。取DNA探针(探针用量为25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。将变性探针DNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中。除去气泡，封口，42℃过夜。取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml马来酸缓冲液(Maleic acid buffer)(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果表明转基因毛白杨741中出现一条1700bp的带，而未转基因毛白杨741则没有这条带，只有一条3350bp的条带，此条带是毛白杨741自身带有的含有内含子的4Cl1基因，证明该4CL1基因已经插入转基因毛白杨741中
3、转基因毛白杨7414CL1酶活性的测定
将一年生的转基因毛白杨741叶片在液氮下粉碎，用提取缓冲液(0.2M Tris-HClpH7.5，8mM MgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃离心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做标准曲线，对蛋白粗提液定量。1ml酶反应液中包括0.2M Tris-HCl，pH7.5，8mM MgCl2，0.8mMATP，0.1mM底物(4-香豆酸)和25-30ul粗提液，于24℃反应12分钟，然后测定A333的增加。每个样品做3个平行实验。结果如表7所示，表明转基因的杨树的叶片的酶活性有所降低。
表7.转基因毛白杨741叶片中4CL1酶活性分析
OD终 OD初 OD 蛋白量ug 活力OD/mg 比活力 OD/mg/min CK 0.794 0.742 0.052 31.6 2.45 0.485 转毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融 合基因的毛白杨741 0.864 0.824 0.04 51.85 0.77 0.15
4、转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因毛白杨741叶片的木质素、纤维素含量分析
按照文献(willis.A.lignin.Methods in Enzymology，1988，161；13-30)描述的方法测定了一年生转基因毛白杨741与野生毛白杨741植株叶片的硫酸木质素及纤维素含量，结果如表8所示，表明4CL1启动子启动的4CL1基因可以在一定程度上改变毛白杨741的叶片的木质素和纤维素含量。
表8.转基因毛白杨741叶片中木质素、纤维素含量分析
木质素含量％ 纤维素含量％ CK 14.07 34.29 转毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因的毛白杨741 15.83 69.18
序列表
<160>2
<210>1
<211>2893
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gaagcttgac ggtggcatga acacaaagca aagagaagtt aggtcactcc tcctttttat 60
atatatattt atatatatat atatatatat agatatgcat gaggaccatg gctatgatga 120
aggttaatag ggtagttgtg atagagatat gtccagcact agttttttgt tggtgtgatc 180
tctcatgatg acgggaaaat tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 240
tataattaat tattctctct aattttgtaa aataaattta aaaggtcaat gtgaggtgac 300
cagttgtcaa atgaccactc gacttggggg catgatgatt tttcgaatca caactcaatt 360
tgaaaactaa aattaaaaaa gatttagatt attaaattat taggttaatt cacgggttgg 420
ctaatcaatt attgttaatt aaaatgatag tatttttgat aatttaatta aaatttaatt 480
ggatttgaat gaatcaatta cattacaaaa cctaatcaaa ttaatatctt atgtgatata 540
attagaaata taaatgatta acatttaaat ctcgagtttc tcttataaaa aacttgtgta 600
attgggctgg atttaacagc tattattcaa actggccaag acaactatta aaattaataa 660
ttaatttttt tcaaataaag cacttcctaa ttgttaaaat atatgtctaa acactaacaa 720
taaaatttat ttgtgtatat taggcagtag gtgagaggag agacacaggt gctgacaaat 780
aaattagtgc ataaaatata atggattggt ggtctgtgaa aagcaagtgg aggacaagcc 840
acctctctca agtcaaaagg ccactttcac aaccaaccca aatgggaacc caccaccgtt 900
cctcgccatt aaaatcccta atctcaccaa cccaactcca cagattcttc accaaacgca 960
actgattttt caatcaatgt tttccctata ttacccccca acaactcata ataccccatt 1020
tgtcctttca ccaacccccg tcctccgtgc cagccatttc tatatcagca tggatgctct 1080
gcactctgct ttctcaggtc tcctaccatt gaaaaacaga gagcacctaa aactcgccac 1140
tgcagcgcaa tggacgccac aatgaatcca caagaagaat tcatctttcg ctcaaaatta 1200
ccagacatct acatcccgaa aaaccttccc ctgcattcat acgttcttga aaacttgtct 1260
aaccattcat caaaaccttg cctgataaat ggcgcgaatg gagatgtcta cacctatgct 1320
gacgttgagc tcacagcaag aagagttgct tctggtctga acaagattgg tattcaacaa 1380
ggtgacgtga tcatgctctt cctaccaagt tcacctgaat tcgtgcttgc tttcctaggc 1440
gcttcacaca gaggtgccat tatcactgct gccaatcctt tctccacccc tgcagagcta 1500
gcaaaacatg ccaaggcctc gagagcaaag cttctgataa cacaggcttg ttactacgag 1560
aaggttaaag attttgcccg agaaagtgat gttaaggtca tgtgcgtgga ctctgccccg 1620
gatggatgct tgcacttttc agagctaaca caggcagacg aaaatgaagc gcctcaggtc 1680
gacattagtc ccgatgatgt cgtagcattg ccttattcat cagggactac agggttgcca 1740
aaaggggtca tgttaacgca caaagggcta ataaccagtg ttgctcaaca ggtagatgga 1800
gacaatccta acctgtattt tcacagtgaa gatgtgattc tgtgtgtgct gcctatgttc 1860
catatctatg ctctgaattc aataatgctc tgcgggctga gagtcggtgc cccgattttg 1920
ataatgccaa agtttgagat tggttcttta ctgggattga ttgagaagta caaggtatct 1980
atagcaccgg ttgttccacc tgtgatgatg tcaattgcta agtcacctga tcttgacaag 2040
catgacttgt cttctttgag gatgataaaa tctggagggg ctccattggg caaggaactt 2100
gaagatactg tcagagctaa gtttcctcag gctagacttg gtcagggata tggaatgacc 2160
gaggcaggac ctgttctagc aatgtgcttg gcatttgcca aggaaccatt cgacataaaa 2220
ccaggtgcat gtgggactgt agtcaggaat gcagagatga agattgttga cccagaaaca 2280
ggggcctctc taccgaggaa ccagcctggt gagatctgca tccggggtga tcagatcatg 2340
aaaggatatc ttaatgaccc tgaggcaacc tcaagaacaa tagacaaaga aggatggctg 2400
cacacaggcg atatcggcta cattgatgat gatgatgagc ttttcatcgt tgacagattg 2460
aaggaattga tcaagtataa agggtttcag gttgctcctg ctgaactcga agctttgtta 2520
atagcccatc cagagatatc cgatgctgct gtagtaggat tgaaagatga ggatgcggga 2580
gaagttcctg ttgcatttgt agtgaaatca gaaaagtctc aggccaccga agatgaaatt 2640
aagcagtata tttcaaaaca ggtgatattc tacaagagaa taaaacgagt tttcttcatt 2700
gaagctattc ccaaggcacc atctggcaag atcctgagga agaatctgaa agaaaagttg 2760
gcaggcatat aactgaagat gttactgaac atttaatcct ctgtcttatt tctttaatac 2820
ttgagaatca ttgtagtgtt gaaccaagca tgcttggaaa agacacgtac ccaacgtaag 2880
acagtaggat ccg 2893
<210>2
<211>2770
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gtctagagac ggtggcatga acacaaagca aagagaagtt aggtcactcc tcctttttat 60
atatatattt atatatatat atatatatat agatatgcat gaggaccatg gctatgatga 120
aggttaatag ggtagttgtg atagagatat gtccagcact agttttttgt tggtgtgatc 180
tctcatgatg acgggaaaat tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 240
tataattaat tattctctct aattttgtaa aataaattta aaaggtcaat gtgaggtgac 300
cagttgtcaa atgaccactc gacttggggg catgatgatt tttcgaatca caactcaatt 360
tgaaaactaa aattaaaaaa gatttagatt attaaattat taggttaatt cacgggttgg 420
ctaatcaatt attgttaatt aaaatgatag tatttttgat aatttaatta aaatttaatt 480
ggatttgaat gaatcaatta cattacaaaa cctaatcaaa ttaatatctt atgtgatata 540
attagaaata taaatgatta acatttaaat ctcgagtttc tcttataaaa aacttgtgta 600
attgggctgg atttaacagc tattattcaa actggccaag acaactatta aaattaataa 660
ttaatttttt tcaaataaag cacttcctaa ttgttaaaat atatgtctaa acactaacaa 720
taaaatttat ttgtgtatat taggcagtag gtgagaggag agacacaggt gctgacaaat 780
aaattagtgc ataaaatata atggattggt ggtctgtgaa aagcaagtgg aggacaagcc 840
acctctctca agtcaaaagg ccactttcac aaccaaccca aatgggaacc caccaccgtt 900
cctcgccatt aaaatcccta atctcaccaa cccaactcca cagattcttc accaaacgca 960
actgattttt caatcaatgt tttccctata ttacccccca acaactcata ataccccatt 1020
tgtcctttca ccaacccccg tcctccgtgc cagccatttc tatatcagca tggatgctct 1080
gcactctgct ttctcaggtc tcctaccatt gaaaaacaga gagcacctaa aactcgccat 1140
ttatatgcct gccaactttt ctttcagatt cttcctcagg atcttgccag atggtgcctt 1200
gggaatagct tcaatgaaga aaactcgttt tattctcttg tagaatatca cctgttttga 1260
aatatactgc ttaatttcat cttcggtggc ctgagacttt tctgatttca ctacaaatgc 1320
aacaggaact tctcccgcat cctcatcttt caatcctact acagcagcat cggatatctc 1380
tggatgggct attaacaaag cttcgagttc agcaggagca acctgaaacc ctttatactt 1440
gatcaattcc ttcaatctgt caacgatgaa aagctcatca tcatcatcaa tgtagccgat 1500
atcgcctgtg tgcagccatc cttctttgtc tattgttctt gaggttgcct cagggtcatt 1560
aagatatcct ttcatgatct gatcaccccg gatgcagatc tcaccaggct ggttcctcgg 1620
tagagaggcc cctgtttctg ggtcaacaat cttcatctct gcattcctga ctacagtccc 1680
acatgcacct ggttttatgt cgaatggttc cttggcaaat gccaagcaca ttgctagaac 1740
aggtcctgcc tcggtcattc catatccctg accaagtcta gcctgaggaa acttagctct 1800
gacagtatct tcaagttcct tgcccaatgg agcccctcca gattttatca tcctcaaaga 1860
agacaagtca tgcttgtcaa gatcaggtga cttagcaatt gacatcatca caggtggaac 1920
aaccggtgct atagatacct tgtacttctc aatcaatccc agtaaagaac caatctcaaa 1980
ctttggcatt atcaaaatcg gggcaccgac tctcagcccg cagagcatta ttgaattcag 2040
agcatagata tggaacatag gcagcacaca cagaatcaca tcttcactgt gaaaatacag 2100
gttaggattg tctccatcta cctgttgagc aacactggtt attagccctt tgtgcgttaa 2160
catgacccct tttggcaacc ctgtagtccc tgatgaataa ggcaatgcta cgacatcatc 2220
gggactaatg tcgacctgag gcgcttcatt ttcgtctgcc tgtgttagct ctgaaaagtg 2280
caagcatcca tccggggcag agtccacgca catgacctta acatcacttt ctcgggcaaa 2340
atctttaacc ttctcgtagt aacaagcctg tgttatcaga agctttgctc tcgaggcctt 2400
ggcatgtttt gctagctctg caggggtgga gaaaggattg gcagcagtga taatggcacc 2460
tctgtgtgaa gcgcctagga aagcaagcac gaattcaggt gaacttggta ggaagagcat 2520
gatcacgtca ccttgttgaa taccaatctt gttcagacca gaagcaactc ttcttgctgt 2580
gagctcaacg tcagcatagg tgtagacatc tccattcgcg ccatttatca ggcaaggttt 2640
tgatgaatgg ttagacaagt tttcaagaac gtatgaatgc aggggaaggt ttttcgggat 2700
gtagatgtct ggtaattttg agcgaaagat gaattcttct tgtggattca ttgtggcgtc 2760
catcccgggg 2770
限制性内切酶、dNTP和Tag DNA聚合酶购自上海生工公司(美国Premega产品，进口分装)。DNA回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒购自重庆博大科技公司(美国Premega产品，进口分装)。PCR引物合成和DNA测序由DNA测序仪377型测定完成(北京赛百盛公司)。
pBI121质粒(购自Clontech)，pUC18-T载体购自上海生工公司(美国BBI公司产品)。
实施例1、培育木质素含量提高的转基因烟草
本实施例所用的地高新试剂盒的货号为92445820，31 Oct 2003，Boehringer公司。
按常规方法提取毛白杨的总RNA，分离mRNA，反转录合成cDNA，在引物1：5-CGCAATGGACGCACAATGAAT-3和引物2：5-ANTGTCTTACGTTGGGTACG-3的引导下，以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化回收目的片段，与pUC18-T载体相连后转化大肠杆菌JM109，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到含有杨树4CL1基因的载体pt4CL。
以按照常规方法提取的毛白杨总DNA为模板，在引物1：5-ATGACGGTGGCATGAACAC-3和引物2：5-TGGCGAGTTTTAGGTGCTC-3的引导下常规PCR扩增，扩增产物纯化回收后与pUC18-T载体相连后转化大肠杆菌JM109，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到含有毛白杨4CL启动子的载体p4CL1p。
以pt4CL为模板，在引物1：CAAGCTT GCAATGGACGCCACAATGAATCC，引物2：CGGATCCCTGTCTTACGTTGGGTACG的引导下，按照如下循环程序：94℃5min；94℃30sec，55℃45sec，72℃90sec，30个循环；72℃10min进行PCR扩增，回收、纯化PCR扩增产物，得到4CL1基因片段，分别利用PstI和BamH I酶切纯化的PCR扩增产物和PUC18，然后进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到亚克隆载体p4CL1。
用同样方法，以p4CL1p为模板，在引物3：CAAGCTTGA CGGTGGCATGAACACAAAGC，引物4：CCTGCAGTGGCGAGTTTTAG GTGCTCT的引导下进行PCR扩增，回收、纯化PCR扩增产物，得到毛白杨4CL启动子基因片段，分别利用PstI和Hind III酶切纯化的PCR扩增产物和PUC18，然后进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到亚克隆载体p4CLp.
毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因表达载体PBI4Clp-4Cl1的构建过程如图1所示，具体过程如下：用HindIII/PstI酶将毛白杨4CL1启动子片段从亚克隆载体p4CLp上切下，与用PstI/BamHI酶将4CL1片段从亚克隆载体p4CL1上切下的片段相连接，连接产物回收后与HindIII/BamHI酶切的pBI121载体进行连接，获得含有毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因的重组质粒PBI4Clp-4Cl1，该重组质粒按常规方法转入大肠杆菌感受态细胞。在含卡那霉素(km)100mg/L的LB平板培养筛选后，提取质粒同时进行HindIII/BamHI酶切鉴定，鉴定结果表明重组质粒PBI4Clp-4Cl1的结构正确。以重组质粒PBI4Clp-4Cl1为模板，利用引物1：CAAGCTTGCAATGGACGC CACAATGAATCC和引物2：CGGATCCCTGTCTTACGTTGGGTACG对4CL1基因进行PCR鉴定，利用引物3：CAAGCTTGACGGTG GCATGAACACAAAGC和引物4：CCTGCAGTGGCGAGTTTTAGGTG CTCT对毛白杨4CL1启动子进行PCR鉴定，结果如图2所示，表明毛白杨4CL1启动子和4CL1基因序列均已在载体PBI4Clp-4Cl1中。按常规方法对质粒PBI4Clp-4Cl1进行测序，结果表明毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，位于PBI4Clp-4Cl1的4951bp-7836bp之间；序列表中的序列1由2893个碱基组成，4CL1基因的开放阅读框架为自5′端第1150位-2772位核苷酸序列。
2、烟草的转化与鉴定分析
按改进的An方法，直接转化农杆菌LBA4404，在链霉素(Sm)125mg/L和Km50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震荡培养到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将烟草无菌苗的叶片剪下，除去叶脉，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡2-3min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在表面铺一张滤纸的MS培养基上，28℃暗培养4天，将外植体转移到含100mg/L Km，500mg/L羧卞霉素(Car)的MS培养基(0.5mg/L IAA，2.0mg/L BA)上28℃继续培养，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。每隔14天换一次培养基。当抗性芽长到1-3cm时切下，转到培养基中长茎。当茎长到3-5cm时，按照文献(王关林，方宏筠，1998，科学出版社)的方法转到生根培养基(100mg/LKm，500mg/L羧卞霉素(Car))中生根，结果得到83株抗性再生苗。取20株按常规方法提取植株总DNA，在引物1：CAAGCTTGCAATGGACGC CACAATGAATCC，引物2：CGGATCCCTG TCTTACGTTGGGTACG的引导下按常规方法进行PCR扩增4CL1基因，结果均为PCR检测阳性(图3)。
3、转基因烟草的southern杂交
按照常规方法提取PCR检测阳性的转基因烟草和非转基因烟草植株的总DNA，以非转基因烟草为对照，使用限制性内切酶XbaI(Takara)在37℃进行酶解3小时，进行1％琼脂糖凝胶电泳，将电泳胶放在10倍体积的变性液(1.5M NaCl，0.5MNaOH)中震荡40min，再在10倍体积的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH 7.0)中震荡40min，使用20×SSC进行DNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。取1ug步骤1中PCR得到的4CL1基因片段，加蒸馏水至16ul。沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGH PRIME，混匀.37℃保温1h，加入0.2MEDTA(PH＝8.0)，混匀.预热杂交液(地高新试剂盒中自带的杂交液)至42℃.预杂交30min.取DNA探针(探针用量为25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中.将变性探针DNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中.除去气泡，封口，42℃过夜.取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml马来酸缓冲液(Maleic acid buffer)(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液(地高新试剂盒中自带)平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果表明在所检测的20株PCR检测阳性的再生苗中，16株的southern杂交结果为阳性。4株southern杂交结果为阳性的杂交图谱如图4所示。图4中，CK为非转基因烟草对照，1-4为PCR检测阳性的转基因烟草。
4、转基因烟草的Northern杂交
按照常规方法提取southern杂交检测阳性的16株转基因烟草植株的总RNA，以非转基因烟草为对照，进行变性琼脂糖凝胶电泳。使用20×SSC进行RNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。用1ug PCR得到的4CL1基因的DNA，加蒸馏水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min，加入2ul DIG-HIGH PRIME，混匀，37℃保温1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混匀。预热杂交液(地高新试剂盒中自带)至42℃。预杂交30min。取RNA探针(探针用量为25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。将变性探针RNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中。除去气泡并封口、42℃过夜。取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml马来酸缓冲液(Maleic acid buffer)(0.1M马来酸0.15M NaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液(地高新试剂盒中自带)平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果表明在所检测的16株southern杂交检测阳性的再生苗中，11株为阳性。部分植株的northern杂交结果如图5所示，图5中，CK为非转基因烟草，1-5为southern杂交检测阳性的转基因烟草植株。
5.转基因烟草4CL1酶活性的测定
northern杂交检测阳性的转基因烟草叶片和茎分别在液氮下粉碎，同时以非转基因烟草为对照，用提取缓冲液(0.2M Tris-HCl pH7.5，8mM MgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃离心15min，上清液用于酶活性分析。同时使用BSA做标准曲线，对蛋白粗提液定量。1ml酶反应液中包括0.2M Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2，0.8mM ATP，0.1mM底物(分别为4-香豆酸，阿魏酸和咖啡酸)，和25-30ul粗提液于24℃反应12分钟，然后测定A333，A346，A350的增加。每个样品做3个平行实验。结果如表1、表2、图6a和图6b所示，表明在转基因烟草的茎中4CL1酶活性有较明显的提高(增加30-40％)，而在叶中无明显增加。说明毛白杨4CL1启动子可以在转基因烟草的形成层部位特异性表达4CL1酶。表1和表2中，1-9表示转基因植株；图6a和图6b中，sample1-sample9为转基因植株。
表1.转基因烟草与非转基因烟草(CK)叶中4CL1酶活性分析(以三组为平行)
4-香豆酸(4-coumaric acid)pKa/mg蛋白 咖啡酸(Caffeic acid)pKa/mg蛋白 阿魏酸(Ferulic acid) pKa/mg蛋白 CK 17.7 8.1 10.3 1 17.6 8.4 10.9 2 18.4 9.2 11.0 3 19.5 9.6 10.8 4 16.7 7.8 9.5 5 17.2 7.7 8.6 6 18.5 8.5 11.2 7 18.3 8.3 14.3 8 17.9 8.6 12.7 9 19.2 9.2 12.5
表2.转基因烟草与非转基因烟草(CK)茎中4CL1酶活性
4-香豆酸(4-coumaric acid)pKa/mg蛋白 咖啡酸(Caffeic acid) pKa/mg蛋白 阿魏酸(Ferulic acid) pKa/mg蛋白 CK 157.4 46.3 66.3 1 198.4 55.2 77.5 2 189.6 48.9 71.5 3 191.5 50.6 80.6 4 165.4 52.6 78.2
4-香豆酸(4-coumaric acid)pKa/mg蛋白 咖啡酸(Caffeic acid) pKa/mg蛋白 阿魏酸(Ferulic acid) pKa/mg蛋白 5 161.7 51.7 77.6 6 175.8 65.9 89.4 7 200.6 92.1 114.3 8 195.6 63.7 94.8 9 214.8 96.7 104.5
6、转基因烟草中木质素含量的测定
northern杂交检测阳性的转基因烟草苗生根培养30天后，分别取空白对照(非转基因烟草)与转基因植株各6株，液氮冷冻条件下研磨，称取1.00g，加入6mL72％的H2SO4，30-40℃恒温水浴不断搅拌1小时。用蒸馏水稀释到H2SO4浓度为4％，121℃第二次消化1小时。用不同溶剂(丙酮，水，乙醇)溶解转基因烟草中的木质素测定含量，固体经离心，60℃烘干至恒重，计算木质素含量。结果如表3、表4、表5和图7所示，表明木质素含量有一定程度的提高(3.9％-6.0％)。表3、表4和表5中，1-3表示转基因植株；图7中，sample1-sample3为转基因植株。
表3.丙酮溶解提取的木质素含量的变化(每给数据测定三次取平均值)
表4.水溶解提取的木质素含量的变化
表5.乙醇溶解提取的木质素含量的变化
实施例2、培育木质素含量降低的转基因烟草
1、毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因表达载体PBMZFA2的构建
用引物a，b，c，d分别从含有毛白杨4CL1启动子与4CL1基因的克隆载体PBI4Clp-4Cl1中扩增目标基因，用引物a，b扩增应得到一条1100bp的带，用引物c，d扩增应得到一条1700bp的带。
PCR聚合酶链式反应的反应液组成是：1×缓冲液体系；寡聚核苷酸引物，0.2umol/L；DNA模板，1ug/ul；脱氧核苷三磷酸，100umol/L；热稳定的TagDNA聚合酶，2.5U/100ul。反应程序采用94℃变性5分钟，94℃模板变性30秒，65℃引物退火45秒，72℃延伸60秒，30个循环后，72℃延伸10分钟结束反应。然后将二个PCR反应液混合，用上述的PCR程序继续反应20次。结果产物有三条带：分别为2800bp，1700bp，1100bp，用博大科技的玻璃奶回收试剂盒回收2800bp的条带。
引物a 5’-GTCTAGAGACGGTGGCATGAAC-3’
引物b 5’-CCAACGTAAGACAGTAATAACCAGTGTTGCTCAAC-3’
引物c 5’-TACTGTCTTACGTTGGGTAC-3’
引物d 5’-CCCCGGGATGGACGCCACAATG-3’
回收纯化已经连接好的2800bp片断，与PMD-18T载体(Takara)16℃过夜连接，得到重组载体转化大肠杆菌JM109(Frederick 1992)，并由上海申工测序验证，此载体定名为T-mf。将验证过的T-mf载体与pBI101载体质粒用XbaI/SmaI酶切。取纯化回收的经XbaI/SmaI双酶切的PBI101 1ul和纯化的2800bp的插入DNA片断连接反应，获得毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因表达载体PBMZFA2。用质粒PBMZFA2按照常规方法转化大肠杆菌JM109感受态细胞。在含Km 100mg/L(卡那霉素)的LB平板培养筛选后，将经XbaI/SmaI双酶切检测呈阳性和以引物a：GTCTAGAGACGGTGG CATGAAC和引物d：CCCCGGGATGGACGCCACAATG进行的PCR检测呈阳性的菌株，由上海申工测序，结果表明毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，位于PBMZFA2的4975bp-7739bp之间；序列表中的序列2由2770个碱基组成。
2、烟草的转化与鉴定分析
按改进的An方法，PBMZFA2直接转化农杆菌LBA4404，在Sm 125mg/L和Km 50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震荡培养到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将烟草无菌苗的叶片剪下，除去叶脉，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡2-3min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在表面铺一张滤纸的MS培养基上，28℃暗培养4天，将外植体转移到有选择压(Km 100mg/L，Car 250mg/L)的分化培养基-MS培养基+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA上，在25℃，14小时的光照条件下培养，每隔14天换一次培养基，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。待转化苗长到1cm时，按照文献(王关林，方宏筠，1999，科学出版社)的方法转到生根培养基(Km 100mg/L，Car 250mg/L)中生根，一周后生根。未转化的不定芽在选择培养基中枯萎，不能正常生长。经抗菌素培养筛选，分别获得含有毛白杨4CL1启动子-反义4CL1基因的植株20株。
生根后的转基因苗在组织培养条件下培养45天，炼苗、移栽盆中。得到转基因烟草幼苗，与烟草空白对照，生理生长与形态无明显变化。
按常规方法提取转基因烟草的总DNA，用引物c、d按照常规方法进行PCR检测，同时以非转基因烟草作为空白对照。结果在转基因烟草中得到1700bp的扩增条带，表明毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因已经转入到再生苗中。
3、转基因烟草木质素含量分析
按照常规方法分别测定转毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因烟草和空白烟草的木质素含量，结果如表6和图8所示，表明9株被检测的转基因烟草的木质素含量均有所变化，木质素含量降低最大的达到10.5％。转基因植株平均的木质素含量是23.4％，对照植株的平均木质素含量是28.2％，多株转基因植株的木质素平均含量比对照降低了4.8％(表6)。转基因植株木质素含量的降低，说明毛白杨4CL1启动子启动的反义的4CL1基因的转入，干涉了正常的4CL1RNA的转录或表达，降低了4-香豆酸连接酶的活性，从而干扰了木质素的生物合成，降低了转基因植物的木质素含量。表6和图8中，1-9为转基因烟草植株。
表6.转基因烟草木质素平均含量对照表
株系 木质素含量(％) 对照 28.2％ 1 27.5％ 2 27.9％ 3 31.2％ 4 30.5％ 5 19.7％ 6 21.4％ 7 15.6％ 8 14.7％
株系 木质素含量(％) 9 22.6％
实施例3、培育木质素含量升高的毛白杨741
1、毛白杨741的转化
将构建好的毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因植物二元表达载体PBI4Clp-4Cl1，按改进的An方法，直接转化农杆菌LBA4404，在Sm 125mg/L和Km 50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震荡培养到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将毛白杨741无菌苗的叶片剪下，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡10min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在毛白杨741叶片分化培养基上-MS培养基(0.1mg/LNAA，1.0mg/L BA)，28℃暗培养4天，将外植体转移到含100mg/L Km，250mg/L Car(羧卞霉素)的叶片分化培养基MS培养基(0.1mg/L NAA，1.0mg/L BA)，28℃继续培养，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。每隔14天换一次培养基。当茎长到3-5cm时，转到含有卡那霉素和羧苄霉素的生根培养基1/2MS培养基(0.3mg/LNAA，1.0mg/L BA)中生根，结果得到再生苗20株。
2、转基因毛白杨741的southern杂交
按照常规方法提取转基因毛白杨741和非转基因毛白杨741的总DNA，以非转基因毛白杨741为对照，使用SmaI限制性内切酶在30℃酶解10小时后，1％琼脂糖凝胶电泳，将电泳胶放在10倍体积的变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中震荡40min，再在10倍体积的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH 7.0)中震荡40min，使用20×SSC进行DNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。用1ug由PCR得到的4CL1基因片段作探针，加蒸馏水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGH PRIME，混匀。37℃保温1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混匀。预热杂交液(地高新试剂盒中自带的杂交液)至42℃。预杂交30min。取DNA探针(探针用量为25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。将变性探针DNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中。除去气泡，封口，42℃过夜。取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml马来酸缓冲液(Maleic acid buffer)(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果表明转基因毛白杨741中出现一条1700bp的带，而未转基因毛白杨741则没有这条带，只有一条3350bp的条带，此条带是毛白杨741自身带有的含有内含子的4Cl1基因，证明该4CL1基因已经插入转基因毛白杨741中
3、转基因毛白杨7414CL1酶活性的测定
将一年生的转基因毛白杨741叶片在液氮下粉碎，用提取缓冲液(0.2M Tris-HClpH7.5，8mM MgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃离心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做标准曲线，对蛋白粗提液定量。1ml酶反应液中包括0.2M Tris-HCl，pH7.5，8mM MgCl2，0.8mMATP，0.1mM底物(4-香豆酸)和25-30ul粗提液，于24℃反应12分钟，然后测定A333的增加。每个样品做3个平行实验。结果如表7所示，表明转基因的杨树的叶片的酶活性有所降低。
表7.转基因毛白杨741叶片中4CL1酶活性分析
OD终 OD初 OD 蛋白量ug 活力OD/mg 比活力 OD/mg/min CK 0.794 0.742 0.052 31.6 2.45 0.485 转毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融 合基因的毛白杨741 0.864 0.824 0.04 51.85 0.77 0.15
4、转毛白杨4CL1启动子-4CL1融合基因毛白杨741叶片的木质素、纤维素含量分析
按照文献(willis.A.lignin.Methods in Enzymology，1988，161；13-30)描述的方法测定了一年生转基因毛白杨741与野生毛白杨741植株叶片的硫酸木质素及纤维素含量，结果如表8所示，表明4CL1启动子启动的4CL1基因可以在一定程度上改变毛白杨741的叶片的木质素和纤维素含量。
表8.转基因毛白杨741叶片中木质素、纤维素含量分析
木质素含量％ 纤维素含量％ CK 14.07 34.29 转毛白杨4CL1启动子-反义4CL1融合基因的毛白杨741 15.83 69.18
序列表
<160>2
<210>1
<211>2893
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gaagcttgac ggtggcatga acacaaagca aagagaagtt aggtcactcc tcctttttat 60
atatatattt atatatatat atatatatat agatatgcat gaggaccatg gctatgatga 120
aggttaatag ggtagttgtg atagagatat gtccagcact agttttttgt tggtgtgatc 180
tctcatgatg acgggaaaat tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 240
tataattaat tattctctct aattttgtaa aataaattta aaaggtcaat gtgaggtgac 300
cagttgtcaa atgaccactc gacttggggg catgatgatt tttcgaatca caactcaatt 360
tgaaaactaa aattaaaaaa gatttagatt attaaattat taggttaatt cacgggttgg 420
ctaatcaatt attgttaatt aaaatgatag tatttttgat aatttaatta aaatttaatt 480
ggatttgaat gaatcaatta cattacaaaa cctaatcaaa ttaatatctt atgtgatata 540
attagaaata taaatgatta acatttaaat ctcgagtttc tcttataaaa aacttgtgta 600
attgggctgg atttaacagc tattattcaa actggccaag acaactatta aaattaataa 660
ttaatttttt tcaaataaag cacttcctaa ttgttaaaat atatgtctaa acactaacaa 720
taaaatttat ttgtgtatat taggcagtag gtgagaggag agacacaggt gctgacaaat 780
aaattagtgc ataaaatata atggattggt ggtctgtgaa aagcaagtgg aggacaagcc 840
acctctctca agtcaaaagg ccactttcac aaccaaccca aatgggaacc caccaccgtt 900
cctcgccatt aaaatcccta atctcaccaa cccaactcca cagattcttc accaaacgca 960
actgattttt caatcaatgt tttccctata ttacccccca acaactcata ataccccatt 1020
tgtcctttca ccaacccccg tcctccgtgc cagccatttc tatatcagca tggatgctct 1080
gcactctgct ttctcaggtc tcctaccatt gaaaaacaga gagcacctaa aactcgccac 1140
tgcagcgcaa tggacgccac aatgaatcca caagaagaat tcatctttcg ctcaaaatta 1200
ccagacatct acatcccgaa aaaccttccc ctgcattcat acgttcttga aaacttgtct 1260
aaccattcat caaaaccttg cctgataaat ggcgcgaatg gagatgtcta cacctatgct 1320
gacgttgagc tcacagcaag aagagttgct tctggtctga acaagattgg tattcaacaa 1380
ggtgacgtga tcatgctctt cctaccaagt tcacctgaat tcgtgcttgc tttcctaggc 1440
gcttcacaca gaggtgccat tatcactgct gccaatcctt tctccacccc tgcagagcta 1500
gcaaaacatg ccaaggcctc gagagcaaag cttctgataa cacaggcttg ttactacgag 1560
aaggttaaag attttgcccg agaaagtgat gttaaggtca tgtgcgtgga ctctgccccg 1620
gatggatgct tgcacttttc agagctaaca caggcagacg aaaatgaagc gcctcaggtc 1680
gacattagtc ccgatgatgt cgtagcattg ccttattcat cagggactac agggttgcca 1740
aaaggggtca tgttaacgca caaagggcta ataaccagtg ttgctcaaca ggtagatgga 1800
gacaatccta acctgtattt tcacagtgaa gatgtgattc tgtgtgtgct gcctatgttc 1860
catatctatg ctctgaattc aataatgctc tgcgggctga gagtcggtgc cccgattttg 1920
ataatgccaa agtttgagat tggttcttta ctgggattga ttgagaagta caaggtatct 1980
atagcaccgg ttgttccacc tgtgatgatg tcaattgcta agtcacctga tcttgacaag 2040
catgacttgt cttctttgag gatgataaaa tctggagggg ctccattggg caaggaactt 2100
gaagatactg tcagagctaa gtttcctcag gctagacttg gtcagggata tggaatgacc 2160
gaggcaggac ctgttctagc aatgtgcttg gcatttgcca aggaaccatt cgacataaaa 2220
ccaggtgcat gtgggactgt agtcaggaat gcagagatga agattgttga cccagaaaca 2280
ggggcctctc taccgaggaa ccagcctggt gagatctgca tccggggtga tcagatcatg 2340
aaaggatatc ttaatgaccc tgaggcaacc tcaagaacaa tagacaaaga aggatggctg 2400
cacacaggcg atatcggcta cattgatgat gatgatgagc ttttcatcgt tgacagattg 2460
aaggaattga tcaagtataa agggtttcag gttgctcctg ctgaactcga agctttgtta 2520
atagcccatc cagagatatc cgatgctgct gtagtaggat tgaaagatga ggatgcggga 2580
gaagttcctg ttgcatttgt agtgaaatca gaaaagtctc aggccaccga agatgaaatt 2640
aagcagtata tttcaaaaca ggtgatattc tacaagagaa taaaacgagt tttcttcatt 2700
gaagctattc ccaaggcacc atctggcaag atcctgagga agaatctgaa agaaaagttg 2760
gcaggcatat aactgaagat gttactgaac atttaatcct ctgtcttatt tctttaatac 2820
ttgagaatca ttgtagtgtt gaaccaagca tgcttggaaa agacacgtac ccaacgtaag 2880
acagtaggat ccg 2893
<210>2
<211>2770
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gtctagagac ggtggcatga acacaaagca aagagaagtt aggtcactcc tcctttttat 60
atatatattt atatatatat atatatatat agatatgcat gaggaccatg gctatgatga 120
aggttaatag ggtagttgtg atagagatat gtccagcact agttttttgt tggtgtgatc 180
tctcatgatg acgggaaaat tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 240
tataattaat tattctctct aattttgtaa aataaattta aaaggtcaat gtgaggtgac 300
cagttgtcaa atgaccactc gacttggggg catgatgatt tttcgaatca caactcaatt 360
tgaaaactaa aattaaaaaa gatttagatt attaaattat taggttaatt cacgggttgg 420
ctaatcaatt attgttaatt aaaatgatag tatttttgat aatttaatta aaatttaatt 480
ggatttgaat gaatcaatta cattacaaaa cctaatcaaa ttaatatctt atgtgatata 540
attagaaata taaatgatta acatttaaat ctcgagtttc tcttataaaa aacttgtgta 600
attgggctgg atttaacagc tattattcaa actggccaag acaactatta aaattaataa 660
ttaatttttt tcaaataaag cacttcctaa ttgttaaaat atatgtctaa acactaacaa 720
taaaatttat ttgtgtatat taggcagtag gtgagaggag agacacaggt gctgacaaat 780
aaattagtgc ataaaatata atggattggt ggtctgtgaa aagcaagtgg aggacaagcc 840
acctctctca agtcaaaagg ccactttcac aaccaaccca aatgggaacc caccaccgtt 900
cctcgccatt aaaatcccta atctcaccaa cccaactcca cagattcttc accaaacgca 960
actgattttt caatcaatgt tttccctata ttacccccca acaactcata ataccccatt 1020
tgtcctttca ccaacccccg tcctccgtgc cagccatttc tatatcagca tggatgctct 1080
gcactctgct ttctcaggtc tcctaccatt gaaaaacaga gagcacctaa aactcgccat 1140
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catgacccct tttggcaacc ctgtagtccc tgatgaataa ggcaatgcta cgacatcatc 2220
gggactaatg tcgacctgag gcgcttcatt ttcgtctgcc tgtgttagct ctgaaaagtg 2280
caagcatcca tccggggcag agtccacgca catgacctta acatcacttt ctcgggcaaa 2340
atctttaacc ttctcgtagt aacaagcctg tgttatcaga agctttgctc tcgaggcctt 2400
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catcccgggg 2770