使用新型菌种保藏技术制造多不饱和脂肪酸的方法转让专利
申请号 : CN200510089457.5
文献号 : CN1737109B
文献日 : 2010-10-06
发明人 : 东山坚一
申请人 : 日本水产株式会社
摘要 :
本发明提供一种微生物的保藏方法，其特征为利用微生物可产生多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物，其内容包括：(a)在含有由无机盐类和糖类构成营养源且pH为4～7的孢子形成培养基中使孢子形成；(b)把上述(a)中得到的孢子悬浮于灭菌水或表面活性剂及/或含有无机盐类的灭菌水中制成孢子悬浮液，再加入占总溶液5～15％的冷冻保护剂制成冷冻保藏孢子悬浮液；并且(c)将上述(b)中制成的冷冻保藏悬浮液置于-100℃～-20℃保藏。
权利要求 :
1.一种生产多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物的方法，其特征为利用属于被孢霉(Mortierella)属的微生物，该微生物是通过微生物保藏方法保藏的，该方法包括：(a)在含有由无机盐类和糖类构成营养源且pH为4～7的孢子形成培养基中使孢子形成且菌丝增殖；
(b)把上述(a)中得到的孢子悬浮于灭菌水或含有表面活性剂及/或无机盐类的灭菌水中制成孢子悬浮液，再加入占总溶液5～15％体积比的冷冻保护剂制成冷冻保藏孢子悬浮液；以及(c)将上述(b)中制成的冷冻保藏孢子悬浮液置于-100℃～-20℃保藏。
2.根据权利要求1所述的方法，上述无机盐类从硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾及硫酸亚铁中选择，且至少选择一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征为上述孢子形成培养基是pH为4～7的Czapek琼脂培养基或Czapek-dox琼脂培养基。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征为上述孢子形成培养基是pH为4～7的Czapek琼脂培养基或Czapek-dox琼脂培养基。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征为上述冷冻保护剂为甘油。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征为上述多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物指的是，以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的甘油三酯或以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的磷脂。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征为上述多不饱和脂肪酸为ω6系列多不饱和脂肪酸、ω3系列多不饱和脂肪酸或ω9系列多不饱和脂肪酸或这些系列的组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征为上述ω6系列多不饱和脂肪酸为9，12-十八碳二烯酸(亚油酸)18:2ω6、6，9，12-十八碳三烯酸(γ-亚麻酸)18:3ω6、8，11，14-二十碳三烯酸(二同型-γ-亚麻酸)20:3ω6、5，8，11，14-二十碳四烯酸(花生四烯酸)20:4ω6、7，10，13，16-二十二碳四烯酸22:4ω6或4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸22:5ω6。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征为上述ω3系列多不饱和脂肪酸为9，12，15-十八碳三烯酸(α-亚麻酸)18:3ω3、6，9，12，15-十八碳四烯酸(Stearidonie acid)18:4ω3、11，14，17-二十碳三烯酸(二同型-α-亚麻酸)20:3ω3、8，11，14，17-二十碳四烯酸20:4ω3、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸20:5ω3、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸22:5ω3或4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸22:6ω3。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征为上述ω9系列多不饱和脂肪酸为6，9-十八碳二烯酸18:2ω9、8，11-二十碳二烯酸20:2ω9或5，8，11-二十碳三烯酸(M酸)20:3ω9。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征为上述属于被孢霉(Mortierella)属的微生物为高山被孢霉(Mortierella alpina)。
说明书 :
技术领域
本发明涉及以下内容，其包括产生含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物的微生物，且含有上述微生物的微生物生物量，及由其生物量提取粗制油及/或粗磷脂，以及由粗制油及/或粗磷脂精炼提取精制油及/或精制磷脂的制造方法；还包括经添加了该生物量及该油脂(粗制油及/或精制油)及/或该磷脂(粗磷脂及/或精制磷脂)制成的饮料、食品、治疗用营养食品、饲料及医药制品。
背景技术
人体内的多不饱和脂肪酸(以下称“PUFA”)的生物合成有两大代表系列，即ω3系列和ω6系列(ω表示从脂肪酸的甲基末端开始数，第一个双键所处位置的碳原子数)，例如ω6系列是由亚油酸(18:2ω6)反复进行去饱和与碳链延长，而转换为γ-亚麻酸(18:3ω6)、二同型(dihomo)-γ-亚麻酸(20:3ω6)、花生四烯酸(20:4ω6:)及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)的。
同样ω3系列是由α-亚麻酸(18:3ω3)反复进行去饱和与碳链延长，而转换为二十碳五烯酸(20:5ω3)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5ω3)及4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22:6ω3)的。众所周知，ω3系列的PUFA中，二十碳五烯酸(以下称“EPA”)、二十二碳六烯酸(以下称“DHA”)在动脉硬化、血栓等成人病的预防效果上，在抗癌作用以及提高学习能力等方面尤其具有多种生理机能，并在医药、特定保健食品的利用上也多有尝试。但近来ω3系列以外的PUFA(ω6系列及ω9系列)的生理机能也受到关注。
花生四烯酸在构成血液、肝脏等重要器官的脂肪酸中约占10％左右(例如，人体血液的磷脂中脂肪酸的组成比为花生四烯酸占11％、二十碳五烯酸占1％、二十二碳六烯酸占3％)，其作为细胞膜的主要构成成分在参与细胞膜流动性的调节及体内代谢上表现出各种功能，同时，作为前列腺素类的直接前驱物质也起着重要的作用。特别是近来作为婴幼儿营养成份之一的花生四烯酸，还以作为表示神经活性作用的内源性大麻酯(Cannabinoids)(2-四氢大麻酚(Arachidonoyl)单甘油、内源性大麻酯(Anandamide))的结构脂肪酸而引人注目。通常来说，摄取富含亚油酸的食品可转换成花生四烯酸，但由于成人病患者及其易患人群、婴儿、老年人的体内参与生物合成的酶活力低下，易导致花生四烯酸不足，所以应直接摄取以花生四烯酸为结构脂肪酸的油脂(甘油三酯)。
对于ω3系列PUFA的EPA和DHA，其丰富的供给源为鱼油，而ω6系列PUFA的γ-亚麻酸、二同型(dihomo)-γ-亚麻酸、花生四烯酸及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)，从一般的油脂供给源中几乎得不到，目前一般使用由微生物发酵获得的含有以PUFA为结构脂肪酸的油脂(以下称“含有PUFA的油脂”)。例如，推荐使用以下方法，通过培养各种能产生含有以花生四烯酸为结构脂肪酸的油脂的微生物(以下称“含有花生四烯酸的油脂”)，获得含有花生四烯酸的油脂的方法。
其中已知，特别是通过使用被孢霉属微生物，可得到在结构脂肪酸中花生四烯酸占较高比例的油脂(以下称“含有高比例花生四烯酸的油脂”)(特开昭63-44891、特开昭63-12290)。近年来，作为花生四烯酸必不可少的用途，例如在婴幼儿营养领域，具体地说在配方奶粉中已开始使用由发酵获得的含有花生四烯酸的油脂。此外，含有花生四烯酸的油脂的新成果(特开2003-48831：具有预防或改善由脑机能下降引起的症状或疾病作用的合成物)也已渐趋明了，并期待今后有更大的进展。
由培养被孢霉属微生物获得的油脂，其大部分为甘油三酯(约占重量的70％以上)和磷脂。食用油脂的形态为甘油三酯，以该用途为目的时，可从培养微生物时获得的菌体生物量中，提取由菌生成的原始油脂(将从菌体中经提取获得的油脂，称“粗制油”)，再将此粗制油经食用油的精炼工序(脱胶、脱酸、脱臭、脱色)除去磷脂获得精制油。
培养被孢霉属微生物所得的含有PUFA的油脂因在菌丝内蓄积，所以为使该油脂的生产更经济化，需进行更高浓度的培养，以提高培养液中含有PUFA的油脂的产量。培养液中含有PUFA的油脂的产量是由菌体浓度和菌体中含有PUFA的油脂的含量积算而得的，所以需同时提高菌体浓度和菌体中含有PUFA的油脂二者的含量。为提高菌体浓度，一般可提高培养基中可转换成菌体成分的氮源浓度。
为提高菌体中含有PUFA的油脂的含量，须将菌形态控制在良好状态，且需供给充足的氧。已知控制菌形态的方法有使培养基中盐类组成最优化等方法(再公表特许98/029558)，另外，已知有关供给氧的方法有加压培养法、氧富集空气通气法等方法(特开平06-153970)。但由于菌体受培养条件微小变化的影响，所以即使有上述方法，也很难确保培养的重复性，在制造时也不能达到稳定的生产。
专利文献1特开昭63-44891号公报
专利文献2特开昭63-12290号公报
专利文献3特开2003-48831号公报
专利文献4再公表特许98/029558号
专利文献5特开平06-153970号公报
同样ω3系列是由α-亚麻酸(18:3ω3)反复进行去饱和与碳链延长，而转换为二十碳五烯酸(20:5ω3)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5ω3)及4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22:6ω3)的。众所周知，ω3系列的PUFA中，二十碳五烯酸(以下称“EPA”)、二十二碳六烯酸(以下称“DHA”)在动脉硬化、血栓等成人病的预防效果上，在抗癌作用以及提高学习能力等方面尤其具有多种生理机能，并在医药、特定保健食品的利用上也多有尝试。但近来ω3系列以外的PUFA(ω6系列及ω9系列)的生理机能也受到关注。
花生四烯酸在构成血液、肝脏等重要器官的脂肪酸中约占10％左右(例如，人体血液的磷脂中脂肪酸的组成比为花生四烯酸占11％、二十碳五烯酸占1％、二十二碳六烯酸占3％)，其作为细胞膜的主要构成成分在参与细胞膜流动性的调节及体内代谢上表现出各种功能，同时，作为前列腺素类的直接前驱物质也起着重要的作用。特别是近来作为婴幼儿营养成份之一的花生四烯酸，还以作为表示神经活性作用的内源性大麻酯(Cannabinoids)(2-四氢大麻酚(Arachidonoyl)单甘油、内源性大麻酯(Anandamide))的结构脂肪酸而引人注目。通常来说，摄取富含亚油酸的食品可转换成花生四烯酸，但由于成人病患者及其易患人群、婴儿、老年人的体内参与生物合成的酶活力低下，易导致花生四烯酸不足，所以应直接摄取以花生四烯酸为结构脂肪酸的油脂(甘油三酯)。
对于ω3系列PUFA的EPA和DHA，其丰富的供给源为鱼油，而ω6系列PUFA的γ-亚麻酸、二同型(dihomo)-γ-亚麻酸、花生四烯酸及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)，从一般的油脂供给源中几乎得不到，目前一般使用由微生物发酵获得的含有以PUFA为结构脂肪酸的油脂(以下称“含有PUFA的油脂”)。例如，推荐使用以下方法，通过培养各种能产生含有以花生四烯酸为结构脂肪酸的油脂的微生物(以下称“含有花生四烯酸的油脂”)，获得含有花生四烯酸的油脂的方法。
其中已知，特别是通过使用被孢霉属微生物，可得到在结构脂肪酸中花生四烯酸占较高比例的油脂(以下称“含有高比例花生四烯酸的油脂”)(特开昭63-44891、特开昭63-12290)。近年来，作为花生四烯酸必不可少的用途，例如在婴幼儿营养领域，具体地说在配方奶粉中已开始使用由发酵获得的含有花生四烯酸的油脂。此外，含有花生四烯酸的油脂的新成果(特开2003-48831：具有预防或改善由脑机能下降引起的症状或疾病作用的合成物)也已渐趋明了，并期待今后有更大的进展。
由培养被孢霉属微生物获得的油脂，其大部分为甘油三酯(约占重量的70％以上)和磷脂。食用油脂的形态为甘油三酯，以该用途为目的时，可从培养微生物时获得的菌体生物量中，提取由菌生成的原始油脂(将从菌体中经提取获得的油脂，称“粗制油”)，再将此粗制油经食用油的精炼工序(脱胶、脱酸、脱臭、脱色)除去磷脂获得精制油。
培养被孢霉属微生物所得的含有PUFA的油脂因在菌丝内蓄积，所以为使该油脂的生产更经济化，需进行更高浓度的培养，以提高培养液中含有PUFA的油脂的产量。培养液中含有PUFA的油脂的产量是由菌体浓度和菌体中含有PUFA的油脂的含量积算而得的，所以需同时提高菌体浓度和菌体中含有PUFA的油脂二者的含量。为提高菌体浓度，一般可提高培养基中可转换成菌体成分的氮源浓度。
为提高菌体中含有PUFA的油脂的含量，须将菌形态控制在良好状态，且需供给充足的氧。已知控制菌形态的方法有使培养基中盐类组成最优化等方法(再公表特许98/029558)，另外，已知有关供给氧的方法有加压培养法、氧富集空气通气法等方法(特开平06-153970)。但由于菌体受培养条件微小变化的影响，所以即使有上述方法，也很难确保培养的重复性，在制造时也不能达到稳定的生产。
专利文献1特开昭63-44891号公报
专利文献2特开昭63-12290号公报
专利文献3特开2003-48831号公报
专利文献4再公表特许98/029558号
专利文献5特开平06-153970号公报
发明内容
因此，为确保通过微生物进行含有PUFA的油脂的稳定生产，开发确保培养重复性的方法是众望所归的。
本发明者等在通过微生物培养进行含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的生产中，对于影响培养菌体增殖期的培养初始阶段的有关条件进行锐意研究，其结果通过改善从前工程中获得菌丝或孢子的移植条件，提高了培养的重复性，同时找到能稳定生产含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的方法。
因此本发明以改善从前工程中获得菌丝或孢子的移植条件为特征，通过培养重复性的改善及含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的稳定生产，提供一种含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂、及/或含有PUFA的菌体的制造方法。
具体地说，本发明提供一种利用微生物，可产生多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物的微生物的保藏方法，其包括：
(a)在含有由无机盐类和糖类为营养源且pH为4～7的孢子形成培养基上使孢子形成；
(b)把上述(a)中得到的孢子悬浮于灭菌水或表面活性剂及/或含有无机盐类的灭菌水中制成孢子悬浮液，再加入占总溶液5～15％的冷冻保护剂制成冷冻保藏孢子悬浮液；
(c)将上述(b)中制成的冷冻保藏孢子悬浮液置于-100℃～-20℃保藏。
在上述方法中，上述无机盐类从硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸美、氯化钾及硫酸亚铁中优选，且至少选择一种；上述孢子形成培养基优选pH为4～7的Czapek琼脂培养基或Czapek-dox琼脂培养基。
在上述方法中，冷冻保护剂优选甘油。
上述多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物是，例如以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的甘油三酯或以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的磷脂，上述多不饱和脂肪酸优选ω6系列多不饱和脂肪酸、ω3系列多不饱和脂肪酸或ω9系列多不饱和脂肪酸或这些系列的组合。
上述ω6系列多不饱和脂肪酸优选9，12-十八碳二烯酸(亚油酸)18:2ω6、6，9，12-十八碳三烯酸(γ-亚麻酸)18:3ω6、8，11，14-二十碳三烯酸(二同型(dihomo)-γ-亚麻酸)20:3ω6、5，8，11，14-二十碳四烯酸(花生四烯酸)20:4ω6、7，10，13，16-(二十二碳四烯酸)22:4ω6或4，7，10，13，16-(二十二碳五烯酸)22:5ω6。
上述ω3系列多不饱和脂肪酸优选9，12，15-十八碳三烯酸(α-亚麻酸)18:3ω3、6，9，12，15-十八碳四烯酸(Stearidonie acid)18:4ω3、11，14，17-二十碳三烯酸(二同型(dihomo)-α-亚麻酸)20:3ω3、8，11，14，17-二十碳四烯酸20:4ω3、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸20:5ω3、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸22:5ω3或4，7，10，13，16，19-(二十二碳六烯酸)22:6ω3。
上述ω9系列多不饱和脂肪酸优选6，9-十八碳二烯酸18:2ω9、8，11-二十碳二烯酸20:2ω9或5，8，11-二十碳三烯酸(M酸(Meadacid))20:3ω9。
在上述方法中，上述微生物优选被孢霉(Mortierella)属，例如高山被孢霉(Mortierella alpina)。
本发明还涉及多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物的制造方法，其特征为使用由上述方法保藏的微生物。
更详细地说，以液体培养中被孢霉属霉菌的实时变化为特征，首先由菌体增殖引起细胞质增加(菌体增殖期)。从细胞质增加基本停止时，含有PUFA的油脂在菌体内的蓄积开始活跃(油脂蓄积期)，最后在细胞内蓄积了大量含有PUFA的油脂。本发明者曾报导过菌体增殖期约为2日，油脂蓄积期约为6日的培养(J.Biosci.Bioeng.，87：489-494(1999))。
而且有报导认为在菌体增殖期菌形态已基本确定，培养初期的条件设定及管理是非常重要的。尽管培养初期的条件设定及管理的重要性已被指出，但对培养开始时的条件设定，特别是有关菌丝或孢子的移植条件仍没有成文的报导。本发明者就此着眼，锐意研究，发现移植方法对培养结果有很大影响且改善移植方法对提高含有PUFA的油脂的生产率有很大贡献的结论。
为得到含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(含有PUFA的油脂及/或含有PUFA的磷脂)，通过微生物的液体培养，首先将保藏菌种接种在少量培养液中，使其开始增殖(种子培养第一阶段)。之后向大容量培养基中依次接种进行逐级扩大培养，本培养指的是为得到含有PUFA的油脂，将回收微生物生物量作为培养的最后阶段的培养。另外，种子培养是指依次传代培养的同时逐级扩大产量的各阶段培养。
菌株的保藏方法已知的有：将琼脂斜面培养基(斜面slant)中培养的菌置于5℃冷藏冰箱或-20℃冷冻冰箱中保藏的方法，把霉菌孢子悬浮液置于5℃冷藏冰箱内保藏的方法，添加冷冻保护剂置于液氮罐或置于用液氮获得的-150℃～-196℃的超低温中的保藏方法，土壤培养干燥法及将菌株冷冻干燥后冷藏保藏的方法等(《发酵工程学的基础》(発酵工学の基礎)(1988)、石崎文彬译、学会出版中心(学会出版センタ一))。
另外，在《Maintaining Cultures for Biotechnology andIndustry(1996).edited by J.C.Hunter-Cevera & A.Belt，Academic Press》中，对采用斜面-20℃保藏、液氮保藏及冷冻干燥保藏的方法进行了比较，归纳了其对存活率和保持生产率的影响，此报导指出，-20℃斜面保藏法可维持最佳的存活率和保持生产率(同书、P.25)。
另外霉菌在存活状态下很难保持纯种和稳定，且无广泛适用于全部霉菌的方法，但普遍认为在液氮中保藏是最理想的(同书、P.105)。而且纵览各种冷冻保护剂的使用例，冷冻保护剂与液氮保藏或冷冻干燥法的结合使用为传统技术(同书、P.118、Table 4)。因液氮在一个大气压下的沸点为-195.8℃，所以在液氮条件下保藏温度约可达-196℃。
被孢霉属霉菌的保藏方法及用于种子培养的接种方法，使用的是本发明者等(J.Am.Oil Chem.Soc.，75：1501-1505(1998))中所述的，由Czapek琼脂培养基制成斜面的冷藏保藏法。Park等的报告(Biotechnol.Bioprocess Eng.，6：161-166(2001))中采用的是用琼脂培养基斜面配制103spores/mL的孢子悬浮液，之后再用此悬液在培养基中进行接种的方法。
本发明者认为培养初期的条件设定及管理是非常重要的，所以针对影响培养初期的菌株保藏的重要性进行深入研究。其结果找到不属于已报导的斜面保藏、液氮保藏或冷冻干燥等任何一种的新型保藏方法，即添加冷冻保护剂后置于-100℃～-20℃保藏的方法且发现其有效性，并且找到优秀的孢子悬浮液的配制方法。
因此本发明使用通过新型保藏菌株制备法制备及保藏方法保藏的菌株进行接种培养，并以其为特征，通过改善培养重复性和进行稳定的含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的生产，提供一种含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂、及/或PUFA含有菌体的制造方法。
本发明使用通过新型保藏菌株制备法制备及保藏方法保藏的菌株进行接种培养，涉及一种含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的生产及产生该化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的菌体的制造方法。
因此，培养能产生含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物是必须的。此处所提到的微生物是指产生甘油三酯及/或磷脂的微生物，其主要结构脂肪酸为碳数18以上双键为3个以上的ω6系列多不饱和脂肪酸、碳数18以上双键为2个以上的ω9系列多不饱和脂肪酸及碳数18以上双键为3个以上的ω3系列多不饱和脂肪酸中至少一种多不饱和脂肪酸。
并且碳数18以上双键为3个以上的ω6系列多不饱和脂肪酸可为γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)、二同型(dihomo)-γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22:4ω6)及DPAω6(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)，碳数18以上双键为2个以上的ω9系列多不饱和脂肪酸可为6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸及M酸(Mead acid)(5，8，11-二十碳三烯酸)，碳数18以上双键为3个以上的ω3系列多不饱和脂肪酸可为α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)、6，9，12，15-十八碳四烯酸(18:4ω3)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20:4ω3)、EPA(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、DPAω3(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)及DHA(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。
因此，本发明中只要是能产生含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物均可使用。例如具有生产油脂(甘油三酯)能力的微生物，构成此油脂的结构脂肪酸为花生四烯酸，此微生物可为属于被孢霉属(Mortierella)、耳霉属(Conidiobolus)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、青霉属(Penicillium)、枝孢属(Cladosporium)、毛霉属(Mucor)、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)、虫霉属(Entomophthora)、刺孢囊霉属(Echinosporangium)、水霉属(Saprolegnia)的微生物。
被孢霉属(Mortierella)被孢霉亚属(Mortierella)的微生物有例如长孢被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)、高山被孢霉(Mortierella alpina)等。具体地说可以是长孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierellaexigua)IFO8571、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等的菌株。
例如产生DHA的微生物可为属于(Crypthecodenium)、(Thrautochytrium)、(Schizochytrium)、(Ulkenia)、(Japonochytrium)或(Haliphthoros)的微生物。
这些菌株中任一种均可从日本的大阪市发酵研究所(IFO)、美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection.ATCC)及荷兰的霉菌中心保藏所(Centrralbureau voor Schimmelcultures(CBS))中不受限制地得到。另外也可使用本发明研究小组从土壤中分离的菌株高山被孢霉1S-4株和菌株长孢被孢霉SAM0219(微工研菌寄第8703号)(微工研条寄第1239号)。
为培养本发明所使用的菌株，首先需制备获得菌的保藏菌株。作为保藏菌株的制备方法，先要配制孢子形成培养基。孢子形成培养基时由硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸美、氯化钾及硫酸亚铁及糖类的全部或一部分配制的，pH为4～7，优选为5～6.5。在此配制培养基中加入琼脂，经加热灭菌后冷却凝固，把其产物作为孢子形成培养基。只要能使菌丝增殖和孢子形成，对孢子形成培养基无特别要求，其特征为把pH调至适合孢子形成的4～7范围内。
具体举例，如在Czapek琼脂培养基(硝酸钠2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸美·7结晶水0.5g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸亚铁·7结晶水0.01g/L、蔗糖30g/L、琼脂13g/L)中加入盐酸或硫酸，将pH调至6.0的培养基。再举一例，如在Czapek-dox琼脂培养基(硝酸钠2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸美·7结晶水0.5g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸亚铁·7结晶水0.01g/L、葡萄糖30g/L、琼脂13g/L)中加入盐酸或硫酸，将pH调至6.0的培养基。
用此方法在试管内制成斜面培养基(slant培养基)或在培养皿内制成平板培养基(plate培养基)，在此培养基上接种菌丝或孢子，在好气条件下进行固体培养。培养温度保持在0～40℃，优选10～35℃，更优选在15～30℃使其增殖和孢子形成。培养温度可在中途改变，例如可使其在25℃条件下增殖后，在5℃条件下培养。
确认孢子形成后，在固体培养菌丝中添加灭菌水，用常用方法搅拌获得孢子悬浮液。添加于灭菌水中的添加物无特别要求，可为纯水，亦可添加表面活性剂、无机盐类等，还可使用预先调制的生理盐水。搅拌方法可从外部给固体培养容器加力，亦可使用预先灭菌的刷子等直接搅拌菌丝。
将上述得到的孢子悬浮液或将孢子和菌丝的悬浮液作为保藏原液。此保藏原液可用灭菌水或表面活性剂或含有无机盐类的水溶液稀释后再重新作为保藏原液。之后在此保藏原液中添加冷冻保护剂。对冷冻保护剂的使用一般无特别要求，可从琼脂粉、牛血清、DMSO、甘油、肌醇、聚乙烯醇、脱脂牛奶等中选一种或多种添加。具体举例，如为使保藏液中甘油浓度达到10％，可把甘油作为冷冻保护剂添加。
添加冷冻保护剂后，将保藏液分装在保藏容器中。容器宜使用灭菌塑料冻存管等，具体举例，如把保藏液在无菌操作条件下分装于容量1.2mL的冻存管中等。之后将此保藏容器置于超低温冰箱内保藏。超低温冰箱内的温度需控制在-100℃～-20℃范围内，优选在-90℃～-30℃，更优选在-85℃～-50℃。
由此，在超低温冰箱内保藏的菌株可长时间、稳定地保藏。
为将保藏菌株用于培养，首先需解冻保藏液。解冻尽可能快速进行，优选在40℃以下的温水中30分钟之内解冻，更优选在30℃以下30分钟之内解冻，最优选在30℃以下10分钟之内解冻。
把解冻后的保藏液接种于液体培养基中。培养基的碳源一般可使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、糖化淀粉等，但对使用种类此处无特殊要求。
氮源除可使用蛋白胨、酵母膏、麦芽汁、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆、大豆蛋白、脱脂大豆、棉籽饼等的天然氮源之外，还可使用尿素等有机氮源及硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵等无机氮源，特别是从大豆中得到的氮源，具体为大豆、脱脂大豆、大豆饼、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆乳、熟豆面等，尤其是脱脂大豆加热变性后的产物，更优选的是可将脱脂大豆进行70～90℃热处理，除去其乙醇可溶成分后的产物单独或复数或与上述氮源结合使用。
其他，必要时除可使用磷酸离子、钾离子、钠离子、镁离子、钙离子以外，还可把铁、铜、锌、锰、镍、钴等的金属离子和维生素等作为微量营养源使用。只要对微生物的生长和发育无害，对培养基成分的浓度均无特殊要求。从实用上，一般碳源的总添加量为0.1～40％(重量)，优选为1～25％(重量)；氮源的总添加量为2～15％(重量)，优选为2～10％(重量)，更优选为初次的碳源添加量为1～5％(重量)，初次的氮源添加量为3～8％(重量)，培养过程中流加碳源及氮源，最优选的是只流加碳源进行培养。
另外，为使含有PUFA的油脂的产量增加，作为不饱和脂肪酸的前躯体，例如十六烷或类十六烷酸的碳氢化物；油酸或类亚油酸的脂肪酸或其盐，或是脂肪酸酯，例如乙酯、甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯；或是类似橄榄油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油的油脂类均可被单独或结合使用。基质的添加量针对培养基为0.001～10％，优选在0.5～10％。并可把这些基质作为唯一的碳源用于培养。
产生含有PUFA的油脂的微生物的培养温度虽因所使用的微生物而异，但一般为5～40℃，优选为20～30℃，亦可先在20～30℃下培养，菌体增殖后再于5～20℃下继续培养使其生产含有PUFA的油脂。此种温度管理还可使含有PUFA的油脂的结构脂肪酸中PUFA的比例上升。种子培养包括通气搅拌培养、振荡培养或静置液体培养，本培养为通气搅拌培养。将本培养开始时(种子培养液接种时)培养基的pH调至5～7，优选为5.5～6.5。在种子培养的各阶段中，培养期间通常为1～10日，优选为1～5日，更优选为1～3日。本培养的培养期间通常为2～30日，优选为5～20日，更优选为5～15日。
属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物是作为产生含有以花生四烯酸为主要结构脂肪酸的化合物(油脂(含有花生四烯酸的甘油三酯)及/或含有花生四烯酸的磷脂)的微生物而被众所周知的，但由于本发明者等对上述菌株施以诱变处理，因而获得了能产生含有以二同型(dihomo)-γ-亚麻酸为主要结构脂肪酸的油脂的微生物(特开平5-91887)和能产生含有以ω9系列多不饱和脂肪酸为主要结构脂肪酸的油脂的微生物(特开平5-91888)。
另外，还获得在高浓度碳源中有耐性的微生物(特开平5-91888、特开平10-57085、特开平5-91886)，这些微生物属于被孢霉属被孢霉亚属，本发明的培养法，具体来说是使用通过新型保藏菌株制备法制备及保藏法保藏的保藏菌株进行培养，可生产出含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂。但本发明不只限于属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物，能产生含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物，本发明的培养法均适用，并依此法可得到所需的微生物生物量、粗制油及/或粗磷脂以及由粗制油及/或粗磷脂精炼的精制油及/或精制磷脂。
从菌体内有油脂蓄积的微生物中提取粗制油及/或粗磷脂的方法，是在培养结束后，把培养液原样或经杀菌、浓缩、氧化等处理后，再经自然沉淀、离心分离及/或过滤等常用的固液分离手段以获得培养菌体的。为加速固液分离，可添加促凝剂或助滤剂。促凝剂可使用例如氯化铝、氯化钙、藻胶、聚氨基葡萄糖等。助滤剂可使用例如硅藻土。培养菌体适宜水洗、破碎、干燥。干燥可进行冷冻干燥、风干、流动层干燥等。
作为从干燥菌体中提取粗制油及/或粗磷脂的方法，可使用有机溶剂提取法或压榨法，优选在氮气中用有机溶剂提取。有机溶剂可使用乙醇、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、三氯甲烷、石油醚、丙酮等，也可使用甲醇和石油醚的交替提取或氯仿-甲醇-水的一层系溶剂提取。但提取粗制油及/或粗磷脂的方法不只限于上述方法，能从菌体内有效提取油脂(甘油三酯)及/或磷脂的方法均可使用。例如可使用超临界CO2流体萃取法等有效手段。
将从有机溶剂或超临界流体中提取的提取物置于减压等条件下，除去有机溶剂或超临界流体成分后，可得到所需的粗制油及/或粗磷脂。另外，取代上述方法，可用湿菌体进行提取。此时虽可用与干燥菌体同样的方法提取粗制油及/或粗磷脂，但如使用甲醇、乙醇、丙酮等与水混溶的溶剂或使用由这些水及/或其他溶剂组成的与水混溶的混合溶剂时，有可能提高提取效率。
可将在本发明中获得的含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的微生物生物量或粗制油及/或粗磷脂直接添加于动物饲料中使用。但用于食品时，一般需使用经过精炼的精制油。油脂精炼工序常用的有脱胶、脱酸、脱臭、脱色、柱层析处理、分子蒸馏、脱蜡等。
有关本发明的微生物生物量、粗制油、精制油(甘油三酯)、粗磷脂、精制磷脂等的用途具有无限的可能性，可作为食品、饮料、化妆品、医药品的原料及添加物使用。并且其使用目的和使用量亦不受限制。
例如，作为食品成分，除一般性食品外，在功能性食品、营养补品、早产儿配方奶粉、成熟儿配方奶粉、婴儿奶粉、婴儿食品、孕产妇或老年人食品等上均可使用。含有油脂的食品例如，肉、鱼或干果等含有天然油脂的天然食品、制汤时需加入油脂的食品、炸面圈等需使用油脂作加热介质的食品、黄油等油脂类食品、曲奇饼等需加入油脂的加工食品或硬饼干等在加工完成时需喷油或涂油的食品等。另外还可添加到不含油脂的农产品、发酵食品、畜产品、水产品或饮料中。还可用于功能性食品、医药品，其形态可为如经肠营养剂、粉剂、颗粒、锭剂、内服液、悬浮液、乳浊液、糖浆等的加工形态。
实施例
以下用实施例对本发明作更具体的说明。但本发明不局限于实施例。
实施例1 孢子悬浮液的冷冻保藏方法
使用作为花生四烯酸生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4株。在试管中配制Czapek琼脂培养基(调整pH到6.0并灭菌)的斜面，25℃下静置培养7日，确认菌丝增殖后，把试管置于冷藏冰箱(4℃)内保藏10日。
在试管中加入灭菌水充分搅拌，制成孢子悬浮液。把孢子悬浮液涂布在已稀释好的马铃薯右旋糖琼脂培养基平板培养基上，使用平皿菌落计数法数孢子悬浮液中孢子的数量，为1×106spores/mL。之后将此孢子悬浮液用灭菌水稀释100倍。且此稀释后的孢子悬浮液、甘油、水三者(水和甘油预先需混合、灭菌)用(稀释后的孢子悬浮液∶甘油∶水＝1∶1∶8)的比例(体积比)混合。将此混合液1mL放入容量1.2mL的灭菌冻存管中，置于-80℃的超低温冰箱内冷冻保藏。
将M. alpina 1S-4株用于液体培养时，把冷冻保藏菌株放在25℃恒温箱内迅速解冻后，接种于液体培养基中。
比较例1. 孢子悬浮液的配制方法
使用作为花生四烯酸生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4株。在试管中配制Czapek琼脂培养基(调整pH到6.0并灭菌)的斜面，25℃下静置培养7日，确认菌丝增殖后，把试管置于冷藏冰箱内保藏。
把高山被孢霉(M. alpina)1S-4株用于液体培养时，在试管内加入灭菌水充分搅拌，配制孢子悬浮液。把此孢子悬浮液接种于液体培养基中。
实施例2. 培养试验、保藏方法的不同造成重复性的差异
使用高山被孢霉(M. alpina)1S-4株，培养用实施例1及比较例1的方法制备的菌种。
把保藏菌株0.1vol.％接种于酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH6.3的培养基上，振荡100rpm，于温度28℃条件下开始种子培养，培养3日。
之后，于容量50L的通气搅拌培养槽内配制含脱脂大豆粉5.0％、KH2PO40.3％、Na2SO40.1％、CaCl2·2H2O 0.05％、MgCl2·6H2O 0.05％、葡萄糖1.8％、大豆油0.1％、pH6.3的培养基25L，在其中接种种子培养液100mL，在搅拌次数92rpm、温度26℃、槽内压200kPa、通气量12.5L/min的条件下开始培养。培养过程中，将葡萄糖如表1的浓度流加，培养10日。
表1葡萄糖的流加时间和浓度(相对于培养液中的浓度)
流加时间 流加浓度 第1日 4.5％ 第2日 4.5％ 第3日 4％ 第4日 3％ 第5日 3％ 第6日 1％
菌种保藏开始后，在不同的保藏日数中用同样的方法进行多次培养。在各培养中，把培养第10天时所得的花生四烯酸生成量用表2表示。
使用实施例1的方法制备保藏菌种时，各培养中花生四烯酸生成量的重复性均表现良好。但使用比较例1的方法制备保藏菌种时，各培养的重复性均表现不良。
表2结果
实施例3. 在培养试验、长期保藏中生产率的变化
使用高山被孢霉(M. alpina)1S-4株，培养用实施例1及比较例1的方法制备的菌种。
把保藏菌株0.1vol.％接种于酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH6.3的培养基中，振荡100rpm，于温度28℃的条件下开始种子培养，培养3日。
之后，于容量50L的通气搅拌培养槽内配制含酵母膏1.0％、葡萄糖1.8％、大豆油0.1％、pH6.3的培养基25L，在其中接种种子培养液100mL，在搅拌次数200rpm、温度28℃、槽内压150kPa、通气量25L/min的条件下开始培养。培养过程中，将葡萄糖如表3的浓度流加，培养7日。
表3葡萄糖的流加时间和浓度(相对于培养液中的浓度)
流加时间 流加浓度 第1日 1.5％ 第2日 1.5％ 第3日 1％ 第4日 1％
菌种保藏开始后，在不同的保藏日数中用同样方法进行了多次培养。在各培养中，把培养第7天时所得的花生四烯酸生成量用表4表示。
使用实施例1的方法制备保藏菌种时，虽经长时间保藏，花生四烯酸仍表现出良好的生产率。但使用比较例1的方法制备保藏菌种时，在长时间保藏过程中，花生四烯酸表现出生产率降低的倾向。
表4结果
实施例4. 孢子形成培养基中pH的影响
花生四烯酸生产菌使用高山被孢霉(M. alpina)1S-4株。在试管中配制2种pH不同且如表5中所示组成的Czapek琼脂培养基。在实测未调整pH的Czapek培养基的pH时，pH为8.5。
表5
在pH不同的2种琼脂培养基中，取一接种环左右量的菌丝进行接种，在25℃下静置培养7日，确认菌丝增殖后，把试管放入冷藏冰箱(4℃)内保藏10天。
在试管中加入灭菌水充分搅拌，制成孢子悬浮液。把孢子悬浮液涂布在稀释好的马铃薯右旋糖琼脂培养基平板培养基上，使用平皿菌落计数法数孢子悬浮液中孢子的数量，在pH6.0的琼脂培养基中得到1×106spores/mL的孢子，未调整pH(实测pH为8.5)的培养基中只得到5×104spores/mL的孢子。
将以上两方法配制的孢子悬浮液用实施例3的方法培养，比较其花生四烯酸的生成量。其结果从pH6.0的培养基的孢子悬浮液中得到3.5g/L的花生四烯酸生成量，从未调整pH(实测pH为8.5)的培养基中只得到2.9g/L的花生四烯酸生成量。
实施例5. 冷冻保藏方式
实施例1中，把在1.2mL冻存管内配制的孢子悬浮保藏液分别置于条件(5-1)中的-20℃冷冻冰箱、条件(5-2)中的-80℃的超低温冰箱、条件(5-3)中的液氮中(约-196℃)中保藏。3种条件下保藏30日后，与实施例2进行同法培养。其孢子存活率及花生四烯酸生产率均在-80℃的超低温冰箱保藏条件下表现最佳。
表6
实施例6. 大罐培养中冷冻菌株的培养重复性的实际验证
使用高山被孢霉(M. alpina)1S-4株，培养用实施例1的方法制备的菌种。
把保藏菌株0.1vol.％接种于酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH6.3的培养基中，振荡100rpm，于温度28℃的条件下开始种子培养(第一阶段)，培养3日。
之后，于容量50L的通气搅拌培养槽内配制含酵母膏1％、葡萄糖2％、大豆油0.1％、pH6.3的培养基30L，在其中接种种子培养(第一阶段)液，在搅拌次数200rpm、温度28℃、槽内压150kPa的条件下开始种子培养(第二阶段)，培养2日。
之后将4500L培养基(培养基A：大豆粉336kg、KH2PO416.8kg、MgCl2·6H2O 2.8kg、CaCl2·2H2O 2.8kg、大豆油5.6kg)的pH调整为4.5，在121℃、20分钟条件下灭菌。另一培养基为把1000L培养基(培养基B：含水葡萄糖112kg)于140℃、40秒的条件下灭菌后，将其加入上述培养基A中制成培养基C。将培养基C的pH调整到6.3后，接种容量28L的种子培养液(第二阶段)，与初期培养液配成合计5600L的培养液(培养槽容量10kL)。
把种子培养液(第二阶段)接种于本培养的培养基中时，向种子培养槽和本培养槽间连接的配管内输入蒸汽杀菌(121～126℃、30分钟以上)后，再输入灭菌空气冷却，使配管表面温度冷却到60℃以下。冷却后，将所定量的种子培养液(第二阶段)输送到本培养槽内。从种子培养液向本培养培养基内接种完成后，在温度26℃、通气量49Nm3/hr、内压200kPa中开始培养。培养过程中如下表所示进行流加，本培养共进行306小时。培养结束时，由于向培养基内流加时培养液增加及蒸发时培养液减少的影响，培养液的总量变为7750L。培养结束时，培养液中花生四烯酸的生成量为18.2g/L。
培养结束后，在120℃、20分钟条件下灭菌，之后用连续式脱水机回收湿菌体，用振动流动层干燥机将水分含量干燥到1wt％，再用空气输送机将干燥菌体输送到充填场所。将得到的干燥菌体与氮气同时充填入容量约1m3的铝制大包装袋内，将袋口热封后，置于10℃以下的冷藏室保藏。
从大包装袋内取出干燥菌体进行己烷提取，过滤己烷提取液除去固形成分后，减压加热除去己烷，可获得以花生四烯酸为结构脂肪酸的粗制油。
重复3次同样试验。培养结束时花生四烯酸生成量的结果如表7所示。
表7培养结束时的花生四烯酸生成量
次数 1 18.2g/L 2(从第1次开始1年后) 17.8g/L 3(从第1次开始5年后) 17.9g/L
实施例7. 二同型(dihomo)-γ-亚麻酸生产菌中冷冻菌株培养重复性的实际验证
使用高山被孢霉(Mortierella alpina)SAM1860株作为二同型(dihomo)-γ-亚麻酸生产菌。在试管中配制Czapek琼脂培养基(调整pH到6.0并灭菌)的斜面，25℃下静置培养12日，确认菌丝增殖后，把试管置于冷藏冰箱(4℃)内保藏20日。
在试管中加入灭菌水充分搅拌，配制孢子悬浮液。把孢子悬浮液涂布在稀释好的马铃薯右旋糖琼脂培养基平板培养基上，使用平皿菌落计数法数孢子悬浮液中孢子的数量，为5×1055spores/mL。
之后将此孢子悬浮液用灭菌水稀释100倍。把此稀释后的孢子悬浮液、甘油、灭菌水三者按(稀释后的孢子悬浮液∶甘油∶灭菌水＝1∶1∶8)的比例(体积比)混合。将此混合液1mL放入容量1.2mL的灭菌冻存管内，置于-80℃的超低温冰箱内冷冻保藏1个月。
另外作为比较例，将用同样的方法配制的孢子悬浮液放入冰箱(5℃)内保藏1个月。
使用保藏了1个月的2种菌株，与实施例3同法培养。其结果可得到表8所示的DGLA生成量，其结果显示了冷冻保藏法的有效性。
表8结果
实施例8. 使用其他花生四烯酸生产菌冷冻菌株的培养重复性的实际验证
使用作为花生四烯酸生产菌的长孢被孢霉(Mortierellaelongata)IFO8570株、及高山被孢霉(Mortierella alpina)CBS754.68株。
在试管中配制Czapek琼脂培养基(调整pH到6.0并灭菌)的斜面，25℃下静置培养10日，确认菌丝增殖后，把试管置于冷藏冰箱(4℃)内保藏20日。
在试管中加入灭菌水充分搅拌，制成孢子悬浮液后用灭菌水稀释10倍。把此稀释后的孢子悬浮液、甘油、灭菌水三者按(稀释后的孢子悬浮液∶甘油∶灭菌水＝1∶1.5∶7.5)的比例(体积比)混合。将此混合液1mL放入容量1.2mL的灭菌冻存管内置于-80℃的超低温冰箱内冷冻保藏1个月。
另外作为比较例，把用同样方法配制的孢子悬浮液放入冷藏冰箱(5℃)内保藏1个月。
使用保藏了1个月的4种保藏菌株(菌种2种×保藏方法2种)分别在酵母膏1％、葡萄糖2％、pH6.3的培养基中接种，振荡100rpm，于温度28℃的条件下开始种子培养3日。
之后，于容量50L的通气搅拌培养槽内配制(含葡萄糖500g、脱脂大豆粉775g、KH2PO450g、MgCl2·6H2O 7.5g/L、CaCl2·2H2O 7.5g/L、大豆油25g、pH6.0)的培养基25L，在其中接种种子培养液，在搅拌次数200rpm、温度26℃、槽内压150kPa的条件下开始培养。为使葡萄糖浓度达到1～2％，约每24小时需添加一次50％葡萄糖溶液，共培养186小时。其结果，可得到如表9所示的DGLA生成量，其结果显示了冷冻保藏法的有效性。
表9结果
实施例9. 比较使用L干燥法和冷冻保藏法保藏9年的孢子
用实施例1的要领配制孢子悬浮液，用传统的L干燥法(“Maintaining cultures for biotechnology and industry(1996)”edited by J.C.Hunter-Cevera & A.Belt.Academic Press，p-115)制成孢子干燥安瓿管保藏。制成并保藏9年后，开封6支L干燥安瓿管，复原后涂布在琼脂培养基上计算其存活孢子数。与此同时，将用实施例1的方法制成的容量1.2mL的冻存管(9年的冷冻保藏品)6支解冻，计算其存活孢子数。
其结果如下表所示，用实施例1所述保藏方法比用传统的L干燥法的存活率显著增高。因此可以认为本发明的方法在长期进行菌株保藏上是行之有效的。
表10
本发明者等在通过微生物培养进行含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的生产中，对于影响培养菌体增殖期的培养初始阶段的有关条件进行锐意研究，其结果通过改善从前工程中获得菌丝或孢子的移植条件，提高了培养的重复性，同时找到能稳定生产含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的方法。
因此本发明以改善从前工程中获得菌丝或孢子的移植条件为特征，通过培养重复性的改善及含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的稳定生产，提供一种含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂、及/或含有PUFA的菌体的制造方法。
具体地说，本发明提供一种利用微生物，可产生多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物的微生物的保藏方法，其包括：
(a)在含有由无机盐类和糖类为营养源且pH为4～7的孢子形成培养基上使孢子形成；
(b)把上述(a)中得到的孢子悬浮于灭菌水或表面活性剂及/或含有无机盐类的灭菌水中制成孢子悬浮液，再加入占总溶液5～15％的冷冻保护剂制成冷冻保藏孢子悬浮液；
(c)将上述(b)中制成的冷冻保藏孢子悬浮液置于-100℃～-20℃保藏。
在上述方法中，上述无机盐类从硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸美、氯化钾及硫酸亚铁中优选，且至少选择一种；上述孢子形成培养基优选pH为4～7的Czapek琼脂培养基或Czapek-dox琼脂培养基。
在上述方法中，冷冻保护剂优选甘油。
上述多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物是，例如以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的甘油三酯或以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的磷脂，上述多不饱和脂肪酸优选ω6系列多不饱和脂肪酸、ω3系列多不饱和脂肪酸或ω9系列多不饱和脂肪酸或这些系列的组合。
上述ω6系列多不饱和脂肪酸优选9，12-十八碳二烯酸(亚油酸)18:2ω6、6，9，12-十八碳三烯酸(γ-亚麻酸)18:3ω6、8，11，14-二十碳三烯酸(二同型(dihomo)-γ-亚麻酸)20:3ω6、5，8，11，14-二十碳四烯酸(花生四烯酸)20:4ω6、7，10，13，16-(二十二碳四烯酸)22:4ω6或4，7，10，13，16-(二十二碳五烯酸)22:5ω6。
上述ω3系列多不饱和脂肪酸优选9，12，15-十八碳三烯酸(α-亚麻酸)18:3ω3、6，9，12，15-十八碳四烯酸(Stearidonie acid)18:4ω3、11，14，17-二十碳三烯酸(二同型(dihomo)-α-亚麻酸)20:3ω3、8，11，14，17-二十碳四烯酸20:4ω3、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸20:5ω3、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸22:5ω3或4，7，10，13，16，19-(二十二碳六烯酸)22:6ω3。
上述ω9系列多不饱和脂肪酸优选6，9-十八碳二烯酸18:2ω9、8，11-二十碳二烯酸20:2ω9或5，8，11-二十碳三烯酸(M酸(Meadacid))20:3ω9。
在上述方法中，上述微生物优选被孢霉(Mortierella)属，例如高山被孢霉(Mortierella alpina)。
本发明还涉及多不饱和脂肪酸或含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物的制造方法，其特征为使用由上述方法保藏的微生物。
更详细地说，以液体培养中被孢霉属霉菌的实时变化为特征，首先由菌体增殖引起细胞质增加(菌体增殖期)。从细胞质增加基本停止时，含有PUFA的油脂在菌体内的蓄积开始活跃(油脂蓄积期)，最后在细胞内蓄积了大量含有PUFA的油脂。本发明者曾报导过菌体增殖期约为2日，油脂蓄积期约为6日的培养(J.Biosci.Bioeng.，87：489-494(1999))。
而且有报导认为在菌体增殖期菌形态已基本确定，培养初期的条件设定及管理是非常重要的。尽管培养初期的条件设定及管理的重要性已被指出，但对培养开始时的条件设定，特别是有关菌丝或孢子的移植条件仍没有成文的报导。本发明者就此着眼，锐意研究，发现移植方法对培养结果有很大影响且改善移植方法对提高含有PUFA的油脂的生产率有很大贡献的结论。
为得到含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(含有PUFA的油脂及/或含有PUFA的磷脂)，通过微生物的液体培养，首先将保藏菌种接种在少量培养液中，使其开始增殖(种子培养第一阶段)。之后向大容量培养基中依次接种进行逐级扩大培养，本培养指的是为得到含有PUFA的油脂，将回收微生物生物量作为培养的最后阶段的培养。另外，种子培养是指依次传代培养的同时逐级扩大产量的各阶段培养。
菌株的保藏方法已知的有：将琼脂斜面培养基(斜面slant)中培养的菌置于5℃冷藏冰箱或-20℃冷冻冰箱中保藏的方法，把霉菌孢子悬浮液置于5℃冷藏冰箱内保藏的方法，添加冷冻保护剂置于液氮罐或置于用液氮获得的-150℃～-196℃的超低温中的保藏方法，土壤培养干燥法及将菌株冷冻干燥后冷藏保藏的方法等(《发酵工程学的基础》(発酵工学の基礎)(1988)、石崎文彬译、学会出版中心(学会出版センタ一))。
另外，在《Maintaining Cultures for Biotechnology andIndustry(1996).edited by J.C.Hunter-Cevera & A.Belt，Academic Press》中，对采用斜面-20℃保藏、液氮保藏及冷冻干燥保藏的方法进行了比较，归纳了其对存活率和保持生产率的影响，此报导指出，-20℃斜面保藏法可维持最佳的存活率和保持生产率(同书、P.25)。
另外霉菌在存活状态下很难保持纯种和稳定，且无广泛适用于全部霉菌的方法，但普遍认为在液氮中保藏是最理想的(同书、P.105)。而且纵览各种冷冻保护剂的使用例，冷冻保护剂与液氮保藏或冷冻干燥法的结合使用为传统技术(同书、P.118、Table 4)。因液氮在一个大气压下的沸点为-195.8℃，所以在液氮条件下保藏温度约可达-196℃。
被孢霉属霉菌的保藏方法及用于种子培养的接种方法，使用的是本发明者等(J.Am.Oil Chem.Soc.，75：1501-1505(1998))中所述的，由Czapek琼脂培养基制成斜面的冷藏保藏法。Park等的报告(Biotechnol.Bioprocess Eng.，6：161-166(2001))中采用的是用琼脂培养基斜面配制103spores/mL的孢子悬浮液，之后再用此悬液在培养基中进行接种的方法。
本发明者认为培养初期的条件设定及管理是非常重要的，所以针对影响培养初期的菌株保藏的重要性进行深入研究。其结果找到不属于已报导的斜面保藏、液氮保藏或冷冻干燥等任何一种的新型保藏方法，即添加冷冻保护剂后置于-100℃～-20℃保藏的方法且发现其有效性，并且找到优秀的孢子悬浮液的配制方法。
因此本发明使用通过新型保藏菌株制备法制备及保藏方法保藏的菌株进行接种培养，并以其为特征，通过改善培养重复性和进行稳定的含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂的生产，提供一种含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂、及/或PUFA含有菌体的制造方法。
本发明使用通过新型保藏菌株制备法制备及保藏方法保藏的菌株进行接种培养，涉及一种含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的生产及产生该化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的菌体的制造方法。
因此，培养能产生含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物是必须的。此处所提到的微生物是指产生甘油三酯及/或磷脂的微生物，其主要结构脂肪酸为碳数18以上双键为3个以上的ω6系列多不饱和脂肪酸、碳数18以上双键为2个以上的ω9系列多不饱和脂肪酸及碳数18以上双键为3个以上的ω3系列多不饱和脂肪酸中至少一种多不饱和脂肪酸。
并且碳数18以上双键为3个以上的ω6系列多不饱和脂肪酸可为γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)、二同型(dihomo)-γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22:4ω6)及DPAω6(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)，碳数18以上双键为2个以上的ω9系列多不饱和脂肪酸可为6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸及M酸(Mead acid)(5，8，11-二十碳三烯酸)，碳数18以上双键为3个以上的ω3系列多不饱和脂肪酸可为α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)、6，9，12，15-十八碳四烯酸(18:4ω3)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20:4ω3)、EPA(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、DPAω3(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)及DHA(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。
因此，本发明中只要是能产生含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物均可使用。例如具有生产油脂(甘油三酯)能力的微生物，构成此油脂的结构脂肪酸为花生四烯酸，此微生物可为属于被孢霉属(Mortierella)、耳霉属(Conidiobolus)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、青霉属(Penicillium)、枝孢属(Cladosporium)、毛霉属(Mucor)、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)、虫霉属(Entomophthora)、刺孢囊霉属(Echinosporangium)、水霉属(Saprolegnia)的微生物。
被孢霉属(Mortierella)被孢霉亚属(Mortierella)的微生物有例如长孢被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)、高山被孢霉(Mortierella alpina)等。具体地说可以是长孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierellaexigua)IFO8571、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等的菌株。
例如产生DHA的微生物可为属于(Crypthecodenium)、(Thrautochytrium)、(Schizochytrium)、(Ulkenia)、(Japonochytrium)或(Haliphthoros)的微生物。
这些菌株中任一种均可从日本的大阪市发酵研究所(IFO)、美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection.ATCC)及荷兰的霉菌中心保藏所(Centrralbureau voor Schimmelcultures(CBS))中不受限制地得到。另外也可使用本发明研究小组从土壤中分离的菌株高山被孢霉1S-4株和菌株长孢被孢霉SAM0219(微工研菌寄第8703号)(微工研条寄第1239号)。
为培养本发明所使用的菌株，首先需制备获得菌的保藏菌株。作为保藏菌株的制备方法，先要配制孢子形成培养基。孢子形成培养基时由硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸美、氯化钾及硫酸亚铁及糖类的全部或一部分配制的，pH为4～7，优选为5～6.5。在此配制培养基中加入琼脂，经加热灭菌后冷却凝固，把其产物作为孢子形成培养基。只要能使菌丝增殖和孢子形成，对孢子形成培养基无特别要求，其特征为把pH调至适合孢子形成的4～7范围内。
具体举例，如在Czapek琼脂培养基(硝酸钠2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸美·7结晶水0.5g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸亚铁·7结晶水0.01g/L、蔗糖30g/L、琼脂13g/L)中加入盐酸或硫酸，将pH调至6.0的培养基。再举一例，如在Czapek-dox琼脂培养基(硝酸钠2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸美·7结晶水0.5g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸亚铁·7结晶水0.01g/L、葡萄糖30g/L、琼脂13g/L)中加入盐酸或硫酸，将pH调至6.0的培养基。
用此方法在试管内制成斜面培养基(slant培养基)或在培养皿内制成平板培养基(plate培养基)，在此培养基上接种菌丝或孢子，在好气条件下进行固体培养。培养温度保持在0～40℃，优选10～35℃，更优选在15～30℃使其增殖和孢子形成。培养温度可在中途改变，例如可使其在25℃条件下增殖后，在5℃条件下培养。
确认孢子形成后，在固体培养菌丝中添加灭菌水，用常用方法搅拌获得孢子悬浮液。添加于灭菌水中的添加物无特别要求，可为纯水，亦可添加表面活性剂、无机盐类等，还可使用预先调制的生理盐水。搅拌方法可从外部给固体培养容器加力，亦可使用预先灭菌的刷子等直接搅拌菌丝。
将上述得到的孢子悬浮液或将孢子和菌丝的悬浮液作为保藏原液。此保藏原液可用灭菌水或表面活性剂或含有无机盐类的水溶液稀释后再重新作为保藏原液。之后在此保藏原液中添加冷冻保护剂。对冷冻保护剂的使用一般无特别要求，可从琼脂粉、牛血清、DMSO、甘油、肌醇、聚乙烯醇、脱脂牛奶等中选一种或多种添加。具体举例，如为使保藏液中甘油浓度达到10％，可把甘油作为冷冻保护剂添加。
添加冷冻保护剂后，将保藏液分装在保藏容器中。容器宜使用灭菌塑料冻存管等，具体举例，如把保藏液在无菌操作条件下分装于容量1.2mL的冻存管中等。之后将此保藏容器置于超低温冰箱内保藏。超低温冰箱内的温度需控制在-100℃～-20℃范围内，优选在-90℃～-30℃，更优选在-85℃～-50℃。
由此，在超低温冰箱内保藏的菌株可长时间、稳定地保藏。
为将保藏菌株用于培养，首先需解冻保藏液。解冻尽可能快速进行，优选在40℃以下的温水中30分钟之内解冻，更优选在30℃以下30分钟之内解冻，最优选在30℃以下10分钟之内解冻。
把解冻后的保藏液接种于液体培养基中。培养基的碳源一般可使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、糖化淀粉等，但对使用种类此处无特殊要求。
氮源除可使用蛋白胨、酵母膏、麦芽汁、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆、大豆蛋白、脱脂大豆、棉籽饼等的天然氮源之外，还可使用尿素等有机氮源及硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵等无机氮源，特别是从大豆中得到的氮源，具体为大豆、脱脂大豆、大豆饼、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆乳、熟豆面等，尤其是脱脂大豆加热变性后的产物，更优选的是可将脱脂大豆进行70～90℃热处理，除去其乙醇可溶成分后的产物单独或复数或与上述氮源结合使用。
其他，必要时除可使用磷酸离子、钾离子、钠离子、镁离子、钙离子以外，还可把铁、铜、锌、锰、镍、钴等的金属离子和维生素等作为微量营养源使用。只要对微生物的生长和发育无害，对培养基成分的浓度均无特殊要求。从实用上，一般碳源的总添加量为0.1～40％(重量)，优选为1～25％(重量)；氮源的总添加量为2～15％(重量)，优选为2～10％(重量)，更优选为初次的碳源添加量为1～5％(重量)，初次的氮源添加量为3～8％(重量)，培养过程中流加碳源及氮源，最优选的是只流加碳源进行培养。
另外，为使含有PUFA的油脂的产量增加，作为不饱和脂肪酸的前躯体，例如十六烷或类十六烷酸的碳氢化物；油酸或类亚油酸的脂肪酸或其盐，或是脂肪酸酯，例如乙酯、甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯；或是类似橄榄油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油的油脂类均可被单独或结合使用。基质的添加量针对培养基为0.001～10％，优选在0.5～10％。并可把这些基质作为唯一的碳源用于培养。
产生含有PUFA的油脂的微生物的培养温度虽因所使用的微生物而异，但一般为5～40℃，优选为20～30℃，亦可先在20～30℃下培养，菌体增殖后再于5～20℃下继续培养使其生产含有PUFA的油脂。此种温度管理还可使含有PUFA的油脂的结构脂肪酸中PUFA的比例上升。种子培养包括通气搅拌培养、振荡培养或静置液体培养，本培养为通气搅拌培养。将本培养开始时(种子培养液接种时)培养基的pH调至5～7，优选为5.5～6.5。在种子培养的各阶段中，培养期间通常为1～10日，优选为1～5日，更优选为1～3日。本培养的培养期间通常为2～30日，优选为5～20日，更优选为5～15日。
属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物是作为产生含有以花生四烯酸为主要结构脂肪酸的化合物(油脂(含有花生四烯酸的甘油三酯)及/或含有花生四烯酸的磷脂)的微生物而被众所周知的，但由于本发明者等对上述菌株施以诱变处理，因而获得了能产生含有以二同型(dihomo)-γ-亚麻酸为主要结构脂肪酸的油脂的微生物(特开平5-91887)和能产生含有以ω9系列多不饱和脂肪酸为主要结构脂肪酸的油脂的微生物(特开平5-91888)。
另外，还获得在高浓度碳源中有耐性的微生物(特开平5-91888、特开平10-57085、特开平5-91886)，这些微生物属于被孢霉属被孢霉亚属，本发明的培养法，具体来说是使用通过新型保藏菌株制备法制备及保藏法保藏的保藏菌株进行培养，可生产出含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂。但本发明不只限于属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物，能产生含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物，本发明的培养法均适用，并依此法可得到所需的微生物生物量、粗制油及/或粗磷脂以及由粗制油及/或粗磷脂精炼的精制油及/或精制磷脂。
从菌体内有油脂蓄积的微生物中提取粗制油及/或粗磷脂的方法，是在培养结束后，把培养液原样或经杀菌、浓缩、氧化等处理后，再经自然沉淀、离心分离及/或过滤等常用的固液分离手段以获得培养菌体的。为加速固液分离，可添加促凝剂或助滤剂。促凝剂可使用例如氯化铝、氯化钙、藻胶、聚氨基葡萄糖等。助滤剂可使用例如硅藻土。培养菌体适宜水洗、破碎、干燥。干燥可进行冷冻干燥、风干、流动层干燥等。
作为从干燥菌体中提取粗制油及/或粗磷脂的方法，可使用有机溶剂提取法或压榨法，优选在氮气中用有机溶剂提取。有机溶剂可使用乙醇、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、三氯甲烷、石油醚、丙酮等，也可使用甲醇和石油醚的交替提取或氯仿-甲醇-水的一层系溶剂提取。但提取粗制油及/或粗磷脂的方法不只限于上述方法，能从菌体内有效提取油脂(甘油三酯)及/或磷脂的方法均可使用。例如可使用超临界CO2流体萃取法等有效手段。
将从有机溶剂或超临界流体中提取的提取物置于减压等条件下，除去有机溶剂或超临界流体成分后，可得到所需的粗制油及/或粗磷脂。另外，取代上述方法，可用湿菌体进行提取。此时虽可用与干燥菌体同样的方法提取粗制油及/或粗磷脂，但如使用甲醇、乙醇、丙酮等与水混溶的溶剂或使用由这些水及/或其他溶剂组成的与水混溶的混合溶剂时，有可能提高提取效率。
可将在本发明中获得的含有以多不饱和脂肪酸为结构脂肪酸的微生物生物量或粗制油及/或粗磷脂直接添加于动物饲料中使用。但用于食品时，一般需使用经过精炼的精制油。油脂精炼工序常用的有脱胶、脱酸、脱臭、脱色、柱层析处理、分子蒸馏、脱蜡等。
有关本发明的微生物生物量、粗制油、精制油(甘油三酯)、粗磷脂、精制磷脂等的用途具有无限的可能性，可作为食品、饮料、化妆品、医药品的原料及添加物使用。并且其使用目的和使用量亦不受限制。
例如，作为食品成分，除一般性食品外，在功能性食品、营养补品、早产儿配方奶粉、成熟儿配方奶粉、婴儿奶粉、婴儿食品、孕产妇或老年人食品等上均可使用。含有油脂的食品例如，肉、鱼或干果等含有天然油脂的天然食品、制汤时需加入油脂的食品、炸面圈等需使用油脂作加热介质的食品、黄油等油脂类食品、曲奇饼等需加入油脂的加工食品或硬饼干等在加工完成时需喷油或涂油的食品等。另外还可添加到不含油脂的农产品、发酵食品、畜产品、水产品或饮料中。还可用于功能性食品、医药品，其形态可为如经肠营养剂、粉剂、颗粒、锭剂、内服液、悬浮液、乳浊液、糖浆等的加工形态。
实施例
以下用实施例对本发明作更具体的说明。但本发明不局限于实施例。
实施例1 孢子悬浮液的冷冻保藏方法
使用作为花生四烯酸生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4株。在试管中配制Czapek琼脂培养基(调整pH到6.0并灭菌)的斜面，25℃下静置培养7日，确认菌丝增殖后，把试管置于冷藏冰箱(4℃)内保藏10日。
在试管中加入灭菌水充分搅拌，制成孢子悬浮液。把孢子悬浮液涂布在已稀释好的马铃薯右旋糖琼脂培养基平板培养基上，使用平皿菌落计数法数孢子悬浮液中孢子的数量，为1×106spores/mL。之后将此孢子悬浮液用灭菌水稀释100倍。且此稀释后的孢子悬浮液、甘油、水三者(水和甘油预先需混合、灭菌)用(稀释后的孢子悬浮液∶甘油∶水＝1∶1∶8)的比例(体积比)混合。将此混合液1mL放入容量1.2mL的灭菌冻存管中，置于-80℃的超低温冰箱内冷冻保藏。
将M. alpina 1S-4株用于液体培养时，把冷冻保藏菌株放在25℃恒温箱内迅速解冻后，接种于液体培养基中。
比较例1. 孢子悬浮液的配制方法
使用作为花生四烯酸生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4株。在试管中配制Czapek琼脂培养基(调整pH到6.0并灭菌)的斜面，25℃下静置培养7日，确认菌丝增殖后，把试管置于冷藏冰箱内保藏。
把高山被孢霉(M. alpina)1S-4株用于液体培养时，在试管内加入灭菌水充分搅拌，配制孢子悬浮液。把此孢子悬浮液接种于液体培养基中。
实施例2. 培养试验、保藏方法的不同造成重复性的差异
使用高山被孢霉(M. alpina)1S-4株，培养用实施例1及比较例1的方法制备的菌种。
把保藏菌株0.1vol.％接种于酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH6.3的培养基上，振荡100rpm，于温度28℃条件下开始种子培养，培养3日。
之后，于容量50L的通气搅拌培养槽内配制含脱脂大豆粉5.0％、KH2PO40.3％、Na2SO40.1％、CaCl2·2H2O 0.05％、MgCl2·6H2O 0.05％、葡萄糖1.8％、大豆油0.1％、pH6.3的培养基25L，在其中接种种子培养液100mL，在搅拌次数92rpm、温度26℃、槽内压200kPa、通气量12.5L/min的条件下开始培养。培养过程中，将葡萄糖如表1的浓度流加，培养10日。
表1葡萄糖的流加时间和浓度(相对于培养液中的浓度)
流加时间 流加浓度 第1日 4.5％ 第2日 4.5％ 第3日 4％ 第4日 3％ 第5日 3％ 第6日 1％
菌种保藏开始后，在不同的保藏日数中用同样的方法进行多次培养。在各培养中，把培养第10天时所得的花生四烯酸生成量用表2表示。
使用实施例1的方法制备保藏菌种时，各培养中花生四烯酸生成量的重复性均表现良好。但使用比较例1的方法制备保藏菌种时，各培养的重复性均表现不良。
表2结果
实施例3. 在培养试验、长期保藏中生产率的变化
使用高山被孢霉(M. alpina)1S-4株，培养用实施例1及比较例1的方法制备的菌种。
把保藏菌株0.1vol.％接种于酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH6.3的培养基中，振荡100rpm，于温度28℃的条件下开始种子培养，培养3日。
之后，于容量50L的通气搅拌培养槽内配制含酵母膏1.0％、葡萄糖1.8％、大豆油0.1％、pH6.3的培养基25L，在其中接种种子培养液100mL，在搅拌次数200rpm、温度28℃、槽内压150kPa、通气量25L/min的条件下开始培养。培养过程中，将葡萄糖如表3的浓度流加，培养7日。
表3葡萄糖的流加时间和浓度(相对于培养液中的浓度)
流加时间 流加浓度 第1日 1.5％ 第2日 1.5％ 第3日 1％ 第4日 1％
菌种保藏开始后，在不同的保藏日数中用同样方法进行了多次培养。在各培养中，把培养第7天时所得的花生四烯酸生成量用表4表示。
使用实施例1的方法制备保藏菌种时，虽经长时间保藏，花生四烯酸仍表现出良好的生产率。但使用比较例1的方法制备保藏菌种时，在长时间保藏过程中，花生四烯酸表现出生产率降低的倾向。
表4结果
实施例4. 孢子形成培养基中pH的影响
花生四烯酸生产菌使用高山被孢霉(M. alpina)1S-4株。在试管中配制2种pH不同且如表5中所示组成的Czapek琼脂培养基。在实测未调整pH的Czapek培养基的pH时，pH为8.5。
表5
在pH不同的2种琼脂培养基中，取一接种环左右量的菌丝进行接种，在25℃下静置培养7日，确认菌丝增殖后，把试管放入冷藏冰箱(4℃)内保藏10天。
在试管中加入灭菌水充分搅拌，制成孢子悬浮液。把孢子悬浮液涂布在稀释好的马铃薯右旋糖琼脂培养基平板培养基上，使用平皿菌落计数法数孢子悬浮液中孢子的数量，在pH6.0的琼脂培养基中得到1×106spores/mL的孢子，未调整pH(实测pH为8.5)的培养基中只得到5×104spores/mL的孢子。
将以上两方法配制的孢子悬浮液用实施例3的方法培养，比较其花生四烯酸的生成量。其结果从pH6.0的培养基的孢子悬浮液中得到3.5g/L的花生四烯酸生成量，从未调整pH(实测pH为8.5)的培养基中只得到2.9g/L的花生四烯酸生成量。
实施例5. 冷冻保藏方式
实施例1中，把在1.2mL冻存管内配制的孢子悬浮保藏液分别置于条件(5-1)中的-20℃冷冻冰箱、条件(5-2)中的-80℃的超低温冰箱、条件(5-3)中的液氮中(约-196℃)中保藏。3种条件下保藏30日后，与实施例2进行同法培养。其孢子存活率及花生四烯酸生产率均在-80℃的超低温冰箱保藏条件下表现最佳。
表6
实施例6. 大罐培养中冷冻菌株的培养重复性的实际验证
使用高山被孢霉(M. alpina)1S-4株，培养用实施例1的方法制备的菌种。
把保藏菌株0.1vol.％接种于酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH6.3的培养基中，振荡100rpm，于温度28℃的条件下开始种子培养(第一阶段)，培养3日。
之后，于容量50L的通气搅拌培养槽内配制含酵母膏1％、葡萄糖2％、大豆油0.1％、pH6.3的培养基30L，在其中接种种子培养(第一阶段)液，在搅拌次数200rpm、温度28℃、槽内压150kPa的条件下开始种子培养(第二阶段)，培养2日。
之后将4500L培养基(培养基A：大豆粉336kg、KH2PO416.8kg、MgCl2·6H2O 2.8kg、CaCl2·2H2O 2.8kg、大豆油5.6kg)的pH调整为4.5，在121℃、20分钟条件下灭菌。另一培养基为把1000L培养基(培养基B：含水葡萄糖112kg)于140℃、40秒的条件下灭菌后，将其加入上述培养基A中制成培养基C。将培养基C的pH调整到6.3后，接种容量28L的种子培养液(第二阶段)，与初期培养液配成合计5600L的培养液(培养槽容量10kL)。
把种子培养液(第二阶段)接种于本培养的培养基中时，向种子培养槽和本培养槽间连接的配管内输入蒸汽杀菌(121～126℃、30分钟以上)后，再输入灭菌空气冷却，使配管表面温度冷却到60℃以下。冷却后，将所定量的种子培养液(第二阶段)输送到本培养槽内。从种子培养液向本培养培养基内接种完成后，在温度26℃、通气量49Nm3/hr、内压200kPa中开始培养。培养过程中如下表所示进行流加，本培养共进行306小时。培养结束时，由于向培养基内流加时培养液增加及蒸发时培养液减少的影响，培养液的总量变为7750L。培养结束时，培养液中花生四烯酸的生成量为18.2g/L。
培养结束后，在120℃、20分钟条件下灭菌，之后用连续式脱水机回收湿菌体，用振动流动层干燥机将水分含量干燥到1wt％，再用空气输送机将干燥菌体输送到充填场所。将得到的干燥菌体与氮气同时充填入容量约1m3的铝制大包装袋内，将袋口热封后，置于10℃以下的冷藏室保藏。
从大包装袋内取出干燥菌体进行己烷提取，过滤己烷提取液除去固形成分后，减压加热除去己烷，可获得以花生四烯酸为结构脂肪酸的粗制油。
重复3次同样试验。培养结束时花生四烯酸生成量的结果如表7所示。
表7培养结束时的花生四烯酸生成量
次数 1 18.2g/L 2(从第1次开始1年后) 17.8g/L 3(从第1次开始5年后) 17.9g/L
实施例7. 二同型(dihomo)-γ-亚麻酸生产菌中冷冻菌株培养重复性的实际验证
使用高山被孢霉(Mortierella alpina)SAM1860株作为二同型(dihomo)-γ-亚麻酸生产菌。在试管中配制Czapek琼脂培养基(调整pH到6.0并灭菌)的斜面，25℃下静置培养12日，确认菌丝增殖后，把试管置于冷藏冰箱(4℃)内保藏20日。
在试管中加入灭菌水充分搅拌，配制孢子悬浮液。把孢子悬浮液涂布在稀释好的马铃薯右旋糖琼脂培养基平板培养基上，使用平皿菌落计数法数孢子悬浮液中孢子的数量，为5×1055spores/mL。
之后将此孢子悬浮液用灭菌水稀释100倍。把此稀释后的孢子悬浮液、甘油、灭菌水三者按(稀释后的孢子悬浮液∶甘油∶灭菌水＝1∶1∶8)的比例(体积比)混合。将此混合液1mL放入容量1.2mL的灭菌冻存管内，置于-80℃的超低温冰箱内冷冻保藏1个月。
另外作为比较例，将用同样的方法配制的孢子悬浮液放入冰箱(5℃)内保藏1个月。
使用保藏了1个月的2种菌株，与实施例3同法培养。其结果可得到表8所示的DGLA生成量，其结果显示了冷冻保藏法的有效性。
表8结果
实施例8. 使用其他花生四烯酸生产菌冷冻菌株的培养重复性的实际验证
使用作为花生四烯酸生产菌的长孢被孢霉(Mortierellaelongata)IFO8570株、及高山被孢霉(Mortierella alpina)CBS754.68株。
在试管中配制Czapek琼脂培养基(调整pH到6.0并灭菌)的斜面，25℃下静置培养10日，确认菌丝增殖后，把试管置于冷藏冰箱(4℃)内保藏20日。
在试管中加入灭菌水充分搅拌，制成孢子悬浮液后用灭菌水稀释10倍。把此稀释后的孢子悬浮液、甘油、灭菌水三者按(稀释后的孢子悬浮液∶甘油∶灭菌水＝1∶1.5∶7.5)的比例(体积比)混合。将此混合液1mL放入容量1.2mL的灭菌冻存管内置于-80℃的超低温冰箱内冷冻保藏1个月。
另外作为比较例，把用同样方法配制的孢子悬浮液放入冷藏冰箱(5℃)内保藏1个月。
使用保藏了1个月的4种保藏菌株(菌种2种×保藏方法2种)分别在酵母膏1％、葡萄糖2％、pH6.3的培养基中接种，振荡100rpm，于温度28℃的条件下开始种子培养3日。
之后，于容量50L的通气搅拌培养槽内配制(含葡萄糖500g、脱脂大豆粉775g、KH2PO450g、MgCl2·6H2O 7.5g/L、CaCl2·2H2O 7.5g/L、大豆油25g、pH6.0)的培养基25L，在其中接种种子培养液，在搅拌次数200rpm、温度26℃、槽内压150kPa的条件下开始培养。为使葡萄糖浓度达到1～2％，约每24小时需添加一次50％葡萄糖溶液，共培养186小时。其结果，可得到如表9所示的DGLA生成量，其结果显示了冷冻保藏法的有效性。
表9结果
实施例9. 比较使用L干燥法和冷冻保藏法保藏9年的孢子
用实施例1的要领配制孢子悬浮液，用传统的L干燥法(“Maintaining cultures for biotechnology and industry(1996)”edited by J.C.Hunter-Cevera & A.Belt.Academic Press，p-115)制成孢子干燥安瓿管保藏。制成并保藏9年后，开封6支L干燥安瓿管，复原后涂布在琼脂培养基上计算其存活孢子数。与此同时，将用实施例1的方法制成的容量1.2mL的冻存管(9年的冷冻保藏品)6支解冻，计算其存活孢子数。
其结果如下表所示，用实施例1所述保藏方法比用传统的L干燥法的存活率显著增高。因此可以认为本发明的方法在长期进行菌株保藏上是行之有效的。
表10