用于生物分子递送和高通量实验方法的固体表面

摘要

本发明涉及一种通过在涂覆有转染剂和生物分子的固体表面培养细胞将诸如核酸分子等生物分子引入细胞中的方法。

权利要求

1.一种将生物分子引入体外真核细胞的方法，包括如下步骤：(a)提供至少部分涂覆有转染剂的固体表面，所述转染剂包含用可降解的接头连接的低聚乙烯亚胺(PEI)，(b)将待引入至真核细胞的生物分子加至固体表面，以及(c)在适宜条件下以足够高的密度在固体表面接种细胞以将生物分子引入至真核细胞中，其中生物分子不与转染剂预先混合。

2.权利要求1的方法，其中所述表面选自瓶、皿、多孔板、玻片和植入设备。

3.权利要求1的方法，其中所述转染剂还包括添加剂，所述添加剂选自细胞靶向部分、细胞内靶向部分、膜去稳定成分以及一种或多种转染增强剂。

4.权利要求1的方法，其中所述转染剂通过如下方式附着于表面：即在表面均匀涂布所述转染剂或者在表面的不连续区域滴涂所述转染剂。

5.权利要求1的方法，其中所述转染剂还包括基质剂，所述基质剂选自蛋白质、糖蛋白、肽、多糖、聚合物和其混合物。

6.权利要求5的方法，其中所述蛋白质选自明胶、胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和牛血清白蛋白或其混合物。

7.权利要求5的方法，其中所述聚合物选自水凝胶、可生物降解的聚合物以及生物相容材料。

8.权利要求1的方法，其中所述转染剂还包括细胞培养剂，所述细胞培养剂选自细胞减少剂、细胞结合剂、细胞生长剂、细胞刺激剂以及细胞抑制剂。

9.权利要求1的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物细胞是分裂细胞或非分裂细胞。

11.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物细胞是转化细胞或原代细胞。

12.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物细胞是体细胞或干细胞。

13.权利要求1的方法，其中所述细胞是植物细胞或昆虫细胞。

14.权利要求4的方法，其中所述转染剂通过手动或自动化机械装置的方式附着于表面。

15.权利要求1的方法，其中所述生物分子选自DNA、RNA和DNA/RNA杂合物。

16.权利要求1的方法，其中所述生物分子选自线性寡脱氧核苷酸、质粒和单链寡脱氧核苷酸(ODN)。

17.权利要求1的方法，其中所述生物分子选自单链RNA或双链RNA。

18.一种探测生物分子可否进入细胞的方法，包括如下步骤：(a)通过上述权利要求中任何一项的方法将生物分子引入所述细胞中，并且(b)探测生物分子是否已经递送至细胞中。

19.权利要求18的方法，其中生物分子选自核苷酸、蛋白质、肽、糖、多糖和有机化合物。

20.权利要求18的方法，其中细胞选自植物细胞、昆虫细胞和细菌细胞。

21.权利要求18的方法，其中所述探测通过探测所述生物分子、生物分子产物、生物分子活性、生物分子产物的活性、靶分子、经生物分子催化的产物或经生物分子调控的产物进行。

22.权利要求1的方法，其中可降解接头是1，6-己二醇二丙烯酸酯。

说明书

用于生物分子递送和高通量实验方法的固体表面

[0001] 发明领域

[0002] 本发明涉及将诸如核酸等生物分子引入细胞的方法，所述方法通过在涂覆有转染剂和生物分子的固体表面培养细胞以用于常规转染实验方法和高通量的转染实验方法。本发明还涉及用于所述实验方法的可转染表面的使用方法和生产方法。

[0003] 发明背景

[0004] 基因转染方法可用于将核酸引入细胞中，并可用于研究基因调控和基因功能。可用于筛选大批DNA以识别具有所关注性能的编码产物的高通量的实验方法特别实用。基因转染是将生物功能核酸递送并引入细胞中，如真核细胞中，其递送和引入的方式使得核酸的功能在细胞中得以保留。基因转染广泛应用于涉及基因调控、基因功能、分子疗法、信号转导、药物筛选和基因疗法的研究中。随着高级有机体基因克隆和编目的继续，研究人员试图发现基因的功能并识别具有所需性能的基因产物。上述不断增长的基因序列采集需要发展系统的、高通量的途径以鉴定基因产物和分析基因功能，以及用于细胞和分子生物学研究的其它领域。

[0005] 病毒和非病毒基因载体都已用于基因递送中。病毒载体表现出的转染效率高于非病毒载体，但病毒载体的安全性妨碍了其适用性(Verma I.M和Somia N.Nature389(1997)，239～242页；MarhsallE.Science 286(2000)，2244～2245页)。虽然非病毒转染系统未表现出病毒载体的效率，但前者受到了密切关注，因为其与病毒载体相比在理论上具有安全性。此外，病毒载体的制备是一个复杂昂贵的过程，这就限制了病毒载体的体外应用。非病毒载体的制备与病毒载体的制备相比，比较简单并且成本更低，从而使得合成基因载体成为体外研究中所需的转染剂。

[0006] 大部分非病毒载体模仿病毒进入细胞的重要特征以克服旨在防止外源基因材料渗入的细胞屏障。基于基因载体骨架的非病毒基因载体可分为a)脂复合物(lipoplex)、b)聚复合物(polyplex)和c)脂聚复合物(lipopolyplex)。脂复合物是带有脂成分的核酸集合，所述脂成分通常是阳离子。通过脂复合物的基因转移称为脂转染(lipofection)。聚复合物是带有阳离子聚合物的核酸复合物。脂聚复合物含有脂成分和聚合物成分。通常上述DNA复合物进一步修饰以含有细胞靶向或细胞内靶向部分和/或膜去稳定成分，例如，病毒蛋白或肽或膜裂解(membrane-disruptive)合成肽。近来，细菌和噬菌体也被称作将核酸转移至细胞中的穿梭机制。

[0007] 大部分非病毒转染剂是合成的阳离子分子并且据报道是通过阳离子上阳离子位点和核酸上阴离子位点之间的相互作用“涂覆”核酸的。带正电荷的DNA-阳离子分子复合物与带负电荷的细胞膜相互作用，以促进DNA通过非特异性的胞吞作用穿过细胞膜。(Schofield，Brit.Microencapsulated.Bull，51(1)：56～71(1995))。在大部分常规的基因转染方案中，细胞在转染前在细胞培养设备上接种16～24小时。转染剂(例如阳离子聚合物载体)和DNA通常在单独的管中制备，并且各相应的溶液在培养基(不含胎牛血清或抗生素)中稀释。然后通过下列步骤混合上述两种溶液：将一种溶液仔细缓慢地加至另一种溶液中并同时不断搅拌混合物。混合物在室温下培育15～45分钟以形成转染剂-DNA复合物并除去残留的血清和抗生素。转染前，先除去细胞培养基并用缓冲液洗涤细胞。向细胞中加入含有DNA-转染剂复合物的溶液，并且培育细胞约3～4小时。然后用新鲜的培养基代替含有转染剂的培养基。最后在一个或多个特定的时间点分析细胞。这显然是一个费时的方法，特别是当待转染的样品数量非常大的时候。

[0008] 在常规的转染方法中存在几个主要问题。首先，常规方法费时，特别是当在转染实验中待使用的细胞或基因样品很多时。并且，由于普通转染方法所需的步骤较多，因此得到的结果难以重复。例如，在生产DNA-转染剂复合物中，核酸和试剂的浓度和体积、pH、温度、所使用的缓冲剂类型、搅拌的长度和速度、培育时间以及其它因素都将影响复合物的形成。虽然可以使用相同的试剂并遵照相同的方法，但仍可能得到不同的结果。多步骤方法得到的结果通常受到人类或机械误差或各步骤中其它变化的影响。此外，转染后更新细胞培养基将扰乱细胞并可能使其从培养它们的表面上分离，从而导致最终结果变化并且不可预测。由于上述所有原因，常规的转染方法需要非常熟练的技术人员进行转染实验或实验方法。

[0009] 研究人员需要更简单的、成本更低的细胞转染方法，并且需要高通量的细胞转染方法以有效转染大量样品。

发明内容

[0010] 本发明提供一种将生物分子引入真核细胞的方法，包括如下步骤：(a)用生物分子递送剂(delivery reagent)涂覆固体表面，(b)将待引入到真核细胞中的生物分子加至固体表面，(c)在适宜条件下以足够高的密度在固体表面接种细胞以将生物分子引入真核细胞中。根据本发明的实施方案，表面可选自瓶(flask)、皿、多孔板、玻片和植入设备。生物分子递送剂或转染剂可选自聚合物、脂质、脂质-聚合物和/或其组合和/或其衍生物，上述物质含有细胞靶向或细胞内靶向部分和/或膜去稳定成分以及一种或多种递送增强剂(enhancer)。

[0011] 根据本发明的实施方案，生物分子递送剂可通过下列途径附着于表面：即在表面均匀涂布所述试剂或在表面的不连续区域滴涂(spot)所述生物分子递送剂。涂覆有生物分子递送剂的固体表面还可含有基质剂(matrix reagent)，所述基质剂选自蛋白质、肽、多糖和聚合物。蛋白质可选自明胶、牛血清白蛋白和细胞外基质成分，例如但不限于胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白。聚合物可选自水凝胶、可生物降解的聚合物以及生物相容材料。

[0012] 根据本发明的实施方案，涂覆到固体表面的生物分子递送剂还可含有细胞培养剂，所述细胞培养剂选自细胞减少剂(cytoreductivereagent)、细胞结合/粘附剂、细胞生长剂、细胞刺激剂和细胞抑制剂。

[0013] 生物分子可选自核苷酸、蛋白质、肽、糖、多糖和有机化合物。优选的生物分子选自DNA、RNA和DNA/RNA杂合物。核苷酸可为环形(质粒)、线型或单链寡脱氧核苷酸。RNA可为单链(核酶)或双链(siRNA)RNA。

[0014] 根据本发明方法使用的固体表面可选自，但不限于玻片或多孔板。

[0015] 根据本发明实施方案使用的真核细胞可为，但不限于，哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可为分裂细胞或非分裂细胞。哺乳动物细胞可为转化细胞或原代细胞。哺乳动物细胞可为体细胞或干细胞。真核细胞可为植物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

[0016] 本发明提供一种高通量的药物筛选实验方法，包括如下步骤：(a)使递送剂附着于固体表面，(b)使待引入至真核细胞中的生物分子附着于所述递送剂，(c)在适宜条件下以足够高的密度在含有递送剂和生物分子的表面接种细胞以将生物分子引入真核细胞中，以及(d)探测已递送有生物分子的真核细胞。

[0017] 生物分子可选自，但不限于，核苷酸、蛋白质、肽、糖、多糖和有机化合物，核苷酸可选自，但不限于，DNA、RNA和DNA/RNA杂合物。DNA可为环形(质粒)、线型或单链寡脱氧核苷酸(ODN)。RNA可为单链(核酶)或双链(siRNA)RNA。

[0018] 真核细胞优选哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可为分裂细胞或非分裂细胞，并且细胞可为转化细胞或原代细胞。哺乳动物细胞可为体细胞或干细胞。真核细胞可选自，但不限于植物细胞、细菌细胞和昆虫细胞。探测已递送有生物分子的细胞可通过探测生物分子本身、其产物、其靶分子、由所述生物分子催化或调控的产物进行。

附图说明

[0019] 图1是采用可转染细胞培养设备或玻片的转染实验方法的示意图。

[0020] 图2说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有各种阳离子聚合物-明胶转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。线性PEI、NDT-CP-B-1和NDT-CP-1的量示于图中。Superfect的量分别为15、7.5和3.75μg/孔。GFP基因的转染效率为约30～35％，并且NDT-CP-1表现出的效率最高。

[0021] 图3说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有各种阳离子聚合物-明胶转染混合物的可转染表面对923细胞中荧光素酶报道基因转染的影响。线性PEI、NDT-CP-B-1和NDT-CP-1的量分别为8、4、2和1μg/孔。Superfect的量为15、7.5和7
3.75μg/孔。所有样品荧光素酶的活性均高于5×10RLU/mg蛋白质。

[0022] 图4说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有各种阳离子脂质-聚合物-明胶转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。示出的脂质-聚合物的量为8、4和2μg/孔。在受试的脂质-聚合物转染剂中，GFP的转染效率可达20～25％。

[0023] 图5说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有各种阳离子脂质-聚合物-明胶转染混合物的可转染表面对923细胞中荧光素酶报道基因转染的影响。在脂6
质-聚合物-明胶转染混合物体系中，NDT-LP-2的荧光素酶活性可高于10RLU/mg蛋白质。

[0024] 图6说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-明胶转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。在96孔板系统中，由脂转染胺试剂2000-明胶转染混合物介导的转染效率最高可达30％。

[0025] 图7说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-明胶转染混合物的可转染表面对923细胞中荧光素酶报道基因转染的影响。在脂质-明胶转染混合物7
体系中，脂转染胺试剂2000的荧光素酶活性最高可达近10RLU/mg蛋白质。

[0026] 图8说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子聚合物-层粘连蛋白转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。NDT-CP-1和NDT-CP-B-1的量示于图中。Superfect的量分别为15和7.5μg/孔。由阳离子聚合物-层粘连蛋白体系介导的GFP转染的效率最高可达50％。

[0027] 图9说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子聚合物-层粘连蛋白转染混合物的可转染表面对923细胞中荧光素酶报道基因转染的影响。NDT-CP-1和NDT-CP-B-1的量示于图中。Superfect的量分别为15、7.5和3.75μg/孔。阳离子聚合8
物-层粘连蛋白体系的荧光素酶的活性最高可达10RLU/mg蛋白质。

[0028] 图10说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-聚合物-层粘连蛋白转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。示出的脂质-聚合物的量为8、4和2μg/孔。由脂质-聚合物-层粘连蛋白转染混合物体系介导的GFP转染的效率最高可达45％。

[0029] 图11说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-聚合物-层粘连蛋白转染混合物的可转染表面对923细胞中荧光素酶报道基因转染的影响。脂质-聚合物的量示于图中。脂质聚合物-层粘连蛋白转染混合物体系的荧光素酶的活性最高可达7
8×10RLU/mg蛋白质。

[0030] 图12说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-层粘连蛋白转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。由脂转染胺试剂-层粘连蛋白转染混合物体系介导的转染的效率最高可达45％。

[0031] 图13说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-层粘连蛋白转染混合物的可转染表面对923细胞中荧光素酶报道基因转染的影响。脂转染胺试剂7
2000-层粘连蛋白转染混合物体系的荧光素酶的活性最高可达1.5×10RLU/mg蛋白质。

[0032] 图14说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子聚合物-胶原转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。NDT-CP-1和NDT-CP-B-1的量示于图中。Superfect的量分别为15和7.5μg/孔。由阳离子聚合物-胶原转染混合物体系介导的GFP转染的效率最高可达40％。

[0033] 图15说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-聚合物-胶原转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。示出的脂质-聚合物的量为8、4和2μg/孔。由阳离子脂质-聚合物-胶原转染混合物体系介导的转染的效率最高可达35％。

[0034] 图16说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-胶原转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。由阳离子脂质-胶原转染混合物体系介导的转染的效率最高可达35％，与由脂转染胺试剂2000-明胶转染混合物体系介导的转染的效率相似。

[0035] 图17说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子聚合物-明胶-层粘连蛋白转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。NDT-CP-1和NDT-CP-B-1的量示于图中。Superfect的量分别为15和7.5μg/孔。由阳离子聚合物-明胶-层粘连蛋白转染混合物体系介导的GFP转染的效率最高可达42％。

[0036] 图18说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-聚合物-明胶-层粘连蛋白转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。示出的脂质-聚合物的量为8、4和2μg/孔。由阳离子脂质-聚合物-明胶-层粘连蛋白转染混合物体系介导的GFP转染的效率最高可达40％。

[0037] 图19说明了在96孔板细胞培养设备系统中，使用涂覆有阳离子脂质-明胶-层粘连蛋白转染混合物的可转染表面对923细胞中GFP报道基因转染的影响。由阳离子脂质-明胶-层粘连蛋白转染混合物体系介导的转染效率最高可达30％。

[0038] 图20说明了在923细胞中采用滴涂有阳离子聚合物(NDT-CP-1)-明胶或阳离子脂质(脂转染胺试剂2000)-明胶转染混合物的可转染玻片系统的GFP报道基因转染实验方法。可转染玻片浸于GFP质粒溶液中。虽然整个玻片都覆盖有GFP质粒溶液，但是仅有涂覆了转染混合物的滴涂处的细胞显示出GFP信号。这表明转染剂充分附着于玻片上而没有扩散。上述结果表明本技术可用于转染阵列(array)应用中，该技术可在基因组功能研究或基因药物开发(反义ODN或siRNA)的基于细胞的转染实验方法中筛选数千个靶基因或基因药物。

[0039] 图21说明了在923细胞中采用涂覆有阳离子聚合物(NDT-CP-1)-明胶或阳离子脂质(脂转染胺试剂2000)-明胶转染混合物的可转染玻片系统的GFP报道基因转染实验方法。可转染玻片通过滴涂1～4μl的GFP质粒(20μg/ml)溶液装载GFP质粒DNA，并且使玻片风干(airdry)。然后将玻片置于六孔板的底部，接着接种293细胞。通过荧光显微镜分析GFP信号。仅有滴涂了GFP质粒DNA的区域显示出绿色荧光信号，这表明质粒DNA充分附着于玻璃表面上有转染混合物的滴涂区域。本技术可用于转染阵列应用中，该技术可在基因组功能研究(cDNA文库筛选)或基因药物开发(反义ODN或siRNA)的基于细胞的转染实验方法中筛选数千个靶基因或基因药物。

[0040] 图22说明了在923细胞中采用滴涂有阳离子聚合物(NDT-CP-1)-层粘连蛋白或阳离子脂质(脂转染胺试剂2000)-层粘连蛋白转染混合物的可转染玻片系统的GFP报道基因转染实验方法。可转染玻片浸于GFP质粒溶液中。虽然整个玻片都覆盖有GFP质粒溶液，但是仅有涂覆了转染混合物的滴涂处的细胞显示出GFP信号。这表明转染剂充分附着于玻片上而没有扩散。上述结果表明本技术可用于转染阵列应用中，该技术可在基因组功能研究或基因药物开发(反义ODN或siRNA)的基于细胞的转染实验方法中筛选数千个靶基因或基因药物。

[0041] 图23说明了在923细胞中采用涂覆有阳离子聚合物(NDT-CP-1)-层粘连蛋白或阳离子脂质(脂转染胺试剂2000)-层粘连蛋白转染混合物的可转染玻片系统的GFP报道基因转染实验方法。可转染玻片通过滴涂1～4μl的GFP质粒(20μg/ml)溶液装载GFP质粒DNA，并且使玻片风干。然后将玻片置于六孔板的底部，接着接种293细胞。通过荧光显微镜分析GFP信号。仅有滴涂了GFP质粒DNA的区域显示出绿色荧光信号，这表明质粒DNA充分附着于玻璃表面滴涂有转染混合物的区域。本技术可用于转染阵列应用中，该技术可在基因组功能研究(cDNA文库筛选)或基因药物开发(反义ODN或siRNA)的基于细胞的转染实验方法中筛选数千个靶基因或基因药物。

[0042] 图24说明了在96孔细胞培养设备中使用转染剂-层粘连蛋白混合物对反义ODN转染至Hela 705Luc细胞的影响。结果表明由阳离子聚合物-层粘连蛋白转染混合物、脂质-聚合物-层粘连蛋白混合物或脂质-层粘连蛋白转染混合物组成的可转染表面表现出显著的靶RNA阻断，这表明质粒和寡核苷酸都可通过上述方案成功递送至哺乳动物的细胞中。

[0043] 图25说明了在96孔细胞培养设备中使用转染剂-层粘连蛋白混合物对siRNA递送至293细胞的影响。与非siRNA对照组相比，由阳离子聚合物-层粘连蛋白转染混合物、脂质-聚合物-层粘连蛋白混合物或脂质-层粘连蛋白转染混合物组成的可转染表面表现出显著的靶RNA阻断，这表明质粒和siRNA都可通过上述方案成功递送至哺乳动物的细胞中。

[0044] 图26说明了Hela细胞中Tat肽信号的典型结果。在图26A中，Tat用明胶基质涂覆在固体表面。图26B显示的是非Tat对照。在Tat涂覆组中，约60～80％的细胞表现出FITC信号。这表明根据本发明的实施方案，核酸和肽都可递送至细胞中。

[0045] 图27说明了在96孔细胞培养设备系统中，采用可转染表面技术时，靶向分子(转移)对HepG2细胞中由阳离子聚合物(PLL)-层粘连蛋白转染混合物介导的基因转移的影响。结果表明在基于PLL-层粘连蛋白的可转染表面系统中引入靶向分子(转移)可显著提高转染效率。

[0046] 图28说明了在96孔细胞培养设备系统中，采用可转染表面技术时，膜干扰肽(membrane disturbing peptide)(VSVG肽)对293细胞中由阳离子聚合物(PLL)-层粘连蛋白转染混合物介导的基因转移的影响。结果表明在基于PLL-层粘连蛋白的可转染表面系统中引入膜干扰肽(VSVG肽)可显著提高转染效率。

[0047] 图29说明了在96孔细胞培养设备中，使用转染剂-层粘连蛋白混合物将GFP报道基因递送至HUV-EC细胞的效果。NDT-CP-1的GFP转染效率为约20％，而Superfect的效率为约15％。脂转染胺试剂表现出非常低的转染效率(＜1.0％)。这表明不仅转化细胞系，如293、Hela、HepG2可被转染，原代细胞也可被阳离子聚合物-层粘连蛋白转染混合物体系转染。

[0048] 图30说明了在96孔细胞培养设备中转染剂-层粘连蛋白混合物对荧光素酶报道7
基因递送至HUV-EC细胞的影响。NDT-CP-1和Superfect的转染效率分别为1.26×10 和
6
8.26×10RLU/mg蛋白质。与阳离子聚合物-层粘连蛋白混合物体系相比，脂转染胺试剂
2000表现出的效率较低。这进一步证实根据本发明的实施方案，原代细胞可用不同的基因转染。

[0049] 图31说明了转染后293细胞在涂覆有转染剂-明胶的96孔板中的细胞存活分数。所有样品均表现出高的存活分数(＞65％)。这表明根据本发明方法使用的转染剂的细胞毒性是可接受的。

[0050] 图32说明了在基于转染剂-层粘连蛋白的可转染表面引入细胞减少剂(谷氨酰胺)对293细胞中细胞毒性增强的影响。“无”表示样品中无谷氨酰胺，“G”表示样品中有谷氨酰胺。结果表明与无谷氨酰胺的组相比，谷氨酰胺(细胞减少剂)显著提高了转染细胞毒性，这表明细胞减少剂是降低由转染剂和转染方法引起的细胞毒性的优良候选试剂。

[0051] 图33说明了在基于转染剂-明胶的可转染表面引入细胞粘附剂和细胞刺激剂(层粘连蛋白)对293细胞中细胞毒性增强的影响。“L”表示样品中有层粘连蛋白，“无”表示样品中无层粘连蛋白。结果表明细胞粘附剂，如层粘连蛋白显著提高了可转染表面技术系统中由转染剂和转染方法引起的细胞毒性。

[0052] 图34说明了在稳定性研究中对可转染表面保存期(shelf-life)的评估。结果显示刚制造(flash-made)的可转染表面与在37℃处理9天后的可转染表面相比，转染性能没有显著差异，这表明可转染表面在4℃下保存时，保存期可为1.5年。

[0053] 图35是一张说明NDT合成聚合物和脂质-聚合物结构的表格。

具体实施方式

[0054] 本发明描述了一种新颖的转染设备和转染方法，与常规的转染实验方法相比，本发明简单、方便有效。根据本发明方法，通过将转染剂附着于细胞培养设备的固体表面制造转染设备。通过使用上述设备，研究人员仅需要将核酸或其它生物分子载体系统加至所述细胞培养设备的表面，而不需要将DNA或生物分子与转染剂预先混合。这就消除了常规转染方法所需的关键费时步骤。科学家仅需要大约40分钟即可完成10个样品的全部转染过程，相比之下现有方法需要2～5个小时或更长时间。这特别利于同时测试数百个样品的高通量的转染实验方法。

[0055] 与常规转染相比，本发明所述的新方法具有几个优势。本发明提供的转染设备非常易于存储，并且在本发明提供的简单的生物分子递送或基因转染方法中不需要生物材料/转染剂混合步骤。本发明所述的转染方法可在短时间内完成，例如约40分钟，并且在提供的高通量的转染或药物递送方法中，大量样品可同时转染。

[0056] 本发明描述了一种新颖的用于基因递送的方法和设备，本发明克服了上述常规实验方法中的常见问题。转染剂简单地涂覆于细胞培养设备的表面，从而可简单地商业化并进行大规模生产。顾客，如研究人员仅需要将生物分子，如所关注的核酸直接加至细胞培养设备的表面以在转染前准备好设备。然后在细胞培养设备的表面接种细胞并在不更换培养基的情况下培育，然后分析细胞。在转染过程中更换培养基是不必要的。本发明所述的方法通过减少所涉及的步骤的数量显著降低了误差的风险，从而提高了系统的一致性和准确性。

[0057] 根据本发明所述的方法，转染剂附着于玻片、多孔板的表面或其它表面以形成转染设备。通过使用上述设备，人们仅需要将DNA或其它生物分子加至表面，并使转染剂与DNA或生物分子形成复合物。上述反应发生约30分钟，然后在适宜于将生物分子引入细胞的条件下，在表面接种并培育细胞。

[0058] 可使用任何适宜于将含有核酸/生物分子的混合物附着于其表面的表面。例如，表面可为玻璃、塑料(如聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙稀)、硅、金属(如金)、膜(如硝化纤维、甲基硝化纤维、PTFE或纤维素)、纸、生物材料(如蛋白质、明胶、琼脂)、组织(如皮肤、内皮组织、骨骼、软骨)、矿物(如羟磷灰石、石墨)。根据优选实施方案，表面可为玻片(玻璃或聚-L-赖氨酸涂覆的玻片)或多孔板的孔。

[0059] 对于玻片，例如涂覆有聚-L-赖氨酸(例如Sigma，Inc.)的玻片，将转染剂附着于表面并干燥，然后引入所关注的核酸或待引入至细胞的核酸、蛋白质、肽或小分子药物。室温下培育玻片30分钟以在转染设备的表面形成生物分子/转染剂复合物。生物分子/转染剂复合物产生一种可用于高通量微阵列的培养基，该培养基可用于同时研究数百个到数千个核酸、蛋白质、肽和其它小分子药物。在另一个实施方案中，转染剂或药物递送剂可附着于转染设备表面不连续的限定区域，以形成转染剂或药物递送剂的微阵列。在上述实施方案中，待引入至细胞中的分子，如核酸与转染剂或递送剂一起涂覆于转染设备的表面。所述方法可用于从数千种化合物中筛选转染剂或其它递送剂。所述筛选方法的结果可通过计算机分析检验。

[0060] 在本发明的另一个实施方案中，多孔板的一个或多个孔可用转染剂或药物递送剂涂覆。转染和药物筛选中常用的板有96孔和384孔板。转染剂或生物分子递送剂可均匀涂覆于板的底部。然后通过，例如多道移液管或自动化机器向孔中加入数百种核酸、蛋白质、肽或其它生物分子。接着通过使用微板读出装置测定转染结果。这是一种非常方便的分析转染细胞的方法，因为微板读出装置常用于大多数生物医学实验室中。涂覆有转染剂或生物分子递送剂的多孔板可广泛用于大多数实验室中以研究基因调控、基因功能、分子疗法和信号转导以及药物筛选。并且，如果在多孔板的不同孔上涂覆不同种类的转染剂，板可较有效地用于筛选多种转染剂或递送剂。近来，1,536和3,456孔板已研制出来，所述板也可根据本发明所述方法使用。

[0061] 转染剂或递送剂优选阳离子化合物，所述阳离子化合物可将生物分子，如核酸、蛋白质、肽、糖、多糖、有机化合物和其它生物分子引入细胞中。优选的实施方案采用阳离子低聚物，如低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)、低分子量的聚(L赖氨酸)(PLL)、低分子量的脱乙酰壳多糖或低分子量的树状聚体(dendrimer)。根据其模块组成(modularcomposition)，试剂可分为：脂质、聚合物、脂质-聚合物和/或其组合和/或其衍生物，所述试剂含有细胞靶向或细胞内靶向部分和/或膜去稳定成分以及递送增强剂。

[0062] 根据一个实施方案，递送剂可与基质，如蛋白质、肽、多糖或其它聚合物混合。蛋白质可为明胶、胶原、牛血清白蛋白或可用于将蛋白质附着于表面的任何其它蛋白质。聚合物可为水凝胶、共聚物、不可降解的或可生物降解的聚合物和生物相容材料。多糖可为任何能形成膜并涂覆递送剂的化合物，如脱乙酰壳多糖。其它试剂，如细胞毒性减少剂、细胞结合剂、细胞生长剂、细胞刺激剂或细胞抑制剂以及培养特定细胞的化合物也可与转染剂或递送剂一起涂覆至转染设备。

[0063] 根据另一个实施方案，存在于适宜溶剂，如水或二次去离子水中的含有转染剂(例如，脂质、聚合物、脂质-聚合物或膜去稳定肽)和明胶的明胶-转染剂混合物可附着于转染设备。在另一个实施方案中，细胞培养剂也可存在于明胶-转染剂混合物中。混合物均匀涂布至诸如玻片和多孔板表面，从而产生含有明胶-转染剂混合物的转染表面。在另一个实施方案中，不同的转染剂-明胶混合物也可滴涂在转染设备表面的不连续区域。得到的产物在适宜条件下完全干燥，使得明胶-转染剂混合物附着于涂覆混合物的部位。例如，得到的产物可在特定的温度或湿度或在真空干燥器中干燥。

[0064] 混合物中转染剂的浓度取决于转染效率和试剂的细胞毒性。通常在转染效率和细胞毒性之间存在平衡。使转染剂最有效并同时保持细胞毒性在可接受水平的浓度即为转染剂浓度的最佳水平。转染剂的浓度通常为约1.0μg/ml～约1000μg/ml。在优选实施方案中，浓度为约40μg/ml～约600μg/ml。类似地，明胶或其它基质的浓度取决于待进行的实验或实验方法，但是浓度通常为转染剂的0.01％～0.5％。根据实施例中所示的实施方案，明胶浓度为转染剂的约0.2％。

[0065] 待引入至细胞中的分子可为核酸、蛋白质、肽、肽核酸(PNA)和其它生物分子。核酸可为DNA、RNA和DNA/杂合物等。如果所用的DNA存在于载体中，则载体可为任何类型，如质粒(例如，pCMV-GFP、pCMV-luc)或基于病毒的载体(如pLXSN)。DNA还可为线性片段，并在待表达的cDNA的5’末端有启动子序列(promoter sequence)(如CMV启动子)，在3’末端有聚腺苷酸位点。上述基因表达元件使得所研究的cDNA可在哺乳动物细胞中瞬时表达。如果DNA是单链寡脱氧核苷酸(ODN)，如反义ODN，则可将其引入至细胞中以调控靶基因表达。在使用RNA的实施方案中，核酸可为单链(反义RNA和核酶)或双链(RNA干扰，SiRNA)RNA。在大多数情况中，对RNA进行修饰以提高RNA的稳定性并增强其在基因表达下调中的作用。在肽核酸(PNA)中，核酸骨架被肽取代，使得分子更稳定。在具体的实施方案中，本发明所述的方法可出于诸如分子疗法、蛋白质功能研究或分子机能研究等多种目的将蛋白质、肽和其它分子引入细胞中。

[0066] 在适宜条件下，将生物分子加至涂覆有转染剂或递送剂的转染设备，以形成生物分子/递送剂复合物。生物分子优选溶于无胎牛血清和抗生素的细胞培养基中，例如Dulbecco改进的Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagles Medium，DMEM)。如果转染剂或递送剂均匀附着于玻片上，则生物分子可滴涂至玻片上的不连续位置。或者，转染剂或递送剂可滴涂至玻片上的不连续位置，而生物分子可简单加入以覆盖转染设备的整个表面。如果转染剂或递送剂附着在多孔板的底部，则可通过多道移液管、自动化设备或其它方法将生物分子简单加至不同孔中。得到的产物(涂覆有转染剂或递送剂和生物分子的转染设备)在室温下培育约25分钟以形成生物分子/转染剂(递送剂)复合物。在某些情况下，例如，不同种类的生物分子滴涂在玻片的不连续位置，DNA溶液将被除去以生产含有与转染剂复合的生物分子的表面。在其它情况中，生物分子溶液可保留在表面上。然后将适宜培养基中密度适中的细胞涂覆至表面上。得到的产物(含有生物分子和涂覆细胞的表面)保持在使生物分子进入涂覆细胞的条件下。

[0067] 根据本发明方法，适宜使用的细胞包括原核生物、酵母或高等真核细胞，所述高等真核细胞包括植物细胞和动物细胞，特别是哺乳动物细胞。将真核细胞，如哺乳动物细胞(例如，人类、猴、狗、猫、牛或鼠细胞)、细菌、昆虫或植物细胞在适宜条件下以足够高的密度涂布到涂覆有转染剂或递送剂和生物分子的转染设备上，以将生物分子引入/引进至真核细胞中并表达DNA或使生物分子与细胞成分相互作用。在具体的实施方案中，细胞可选自造血细胞、神经元细胞、胰腺细胞、肝细胞、软骨细胞、骨细胞或肌细胞。细胞可为完全分化的细胞或祖/干细胞。

[0068] 在优选的实施方案中，真核细胞在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中生长，所述培养基含有10％的热失活胎牛血清(FBS)以及L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(pen/strep)。本领域的技术人员将领会某些细胞应在专门的培养基中培养，因为某些细胞需要特殊的营养，如生长因子和氨基酸。细胞的最佳密度取决于细胞的类型和实验目的。例如，对于基因转染，优选的群体为70～80％的汇合细胞(confluent cell)，但是对于寡核苷4
酸递送，最佳的状况是30～50％的汇合细胞。在示例性实施方案中，如果以5×10 个293细胞/孔将其接种至96孔板上，细胞将在细胞接种后的18～24小时达到90％的汇合度
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(confluency)。对于Hela705细胞，仅需要1×10 个细胞/孔即可在96孔板中达到相似的汇合百分比。

[0069] 在含有生物分子/递送剂的表面上接种细胞后，针对细胞类型在最适宜的条件下(例如，37℃，5～10％的CO2)培育细胞。培养时间取决于实验目的。通常，在基因转染实验中，对于表达靶基因的细胞，培育细胞24～48小时。在分析细胞中生物分子的细胞内运输时，可能需要培育数分钟到数小时，并且可在规定的时间点观察细胞。

[0070] 生物分子递送的结果可通过不同方法分析。在基因转染和反义核酸递送的情况下，靶基因的表达水平可通过报道基因探测，例如绿色荧光蛋白(GFP)基因、荧光素酶基因或β-半乳糖苷酶基因表达。GFP信号可直接在显微镜下观察，荧光素酶的活性可通过光度计探测，而β-半乳糖苷酶催化的蓝色产物可在显微镜下观察或通过微板读出装置测定。本领域的技术人员熟悉上述报道基因是怎样发挥作用的以及怎样被引入基因递送系统中。
根据本发明所述方法递送的核酸及其产物、蛋白质、肽或其它生物分子以及由上述生物分子调控的靶可通过多种方法测定，例如探测免疫荧光或酶免疫细胞化学、放射自显影法或原位杂交。如果采用免疫荧光探测编码蛋白质的表达，则使用与靶蛋白质相结合的荧光标记的抗体(例如，在适宜于抗体与蛋白质结合的条件下加至玻片)。然后通过探测荧光信号识别含有蛋白质的细胞。如果递送的分子可调控基因表达，那么靶基因的表达水平也可通过下列方法测定，例如放射自显影法、原位杂交以及原位PCR。然而，识别方法取决于所递送的生物分子的性能、所述生物分子的表达产物、由所述产物调控的靶和/或由生物分子递送产生的最终产物。

[0071] 实施例

[0072] 转染剂

[0073] 支链PEI25k(Mw为25KDa的聚乙烯亚胺)和线性PEI25k(Mw为25KDa)从Polysciences (TM)Inc.(美国宾夕法尼亚州沃灵顿)购得。Superfect (加利福尼亚州巴伦西亚，Qiagen)溶TM
液如制造商提供的使用。转染剂LipofectAMINE 从Life Techonologies(马里兰州盖瑟斯堡)购得并如制造商提供的使用。NDT-CP-B-1(可降解的)和NDT-CP-1(不可降解的)是由PEI600(Mw为600Da)合成的接头不同的聚合转染剂。NDT-LP-1是在同一个分子上含有聚合物和脂质结构的脂质-聚合物。NDT聚合转染剂的结构如图35所示。

[0074] 可转染表面的制备

[0075] 由基于明胶的转染混合物制备的转染表面

[0076] 0.2％明胶的制备

[0077] 通过在60℃的水浴中轻微搅拌溶液15分钟将B型明胶粉末即225Bloom(Sigma，目录号G-9391)溶于无菌的MiliQ水中。然后在室温下冷却0.2％的明胶溶液，并在仍然温热(～37-40℃)的情况下，使溶液穿过0.45μm的多孔乙酸酯膜(CA)过滤。制备得100ml的溶液并将该过滤的明胶溶液以50ml的等分试样储存在4℃。

[0078] 用明胶制备转染混合物

[0079] 在0.2％的明胶溶液中稀释全部转染剂。线性PEI25k和专门合成的聚合物样品的浓度为320.0μg/ml～40.0μg/ml，而支链PEI25k的浓度为160.0μg/ml～20.0μg/ml。Superfect的浓度为600.0～75.0μg/ml，而脂转染胺试剂的浓度为200.0μg/ml～25.0μg/ml。合成的聚合物和脂质-聚合物(NDT)的浓度为320.0μg/ml～40.0μg/ml。

[0080] 用96孔板和转染剂-明胶混合物制造可转染表面

[0081] 向96孔板的各个孔中加入25μl的转染剂/明胶溶液。振荡板数秒以确保整个底部表面都覆盖有转染剂/明胶溶液。然后在组织培养罩中风干板数小时(约5～6小时)。干燥的板储存在4℃待用(图2～7)。

[0082] 通过滴涂转染剂-明胶混合物制造可转染的玻片表面

[0083] 在PLL涂覆的玻片上滴涂1～4μl的转染剂/明胶溶液。玻片置于干净的罩中约1小时直至完全干燥。干燥的玻片储存在4℃待用(图20，21)。

[0084] 由基于层粘连蛋白的转染混合物制备的转染表面

[0085] 在PBS中稀释层粘连蛋白(Sigma，目录号L2020)直至最终浓度为40.0μg/ml并储存在4℃。

[0086] 用层粘连蛋白制备转染混合物

[0087] 在40.0μg/ml的层粘连蛋白溶液中稀释全部转染剂。线性PEI25k和专门合成的聚合物样品的浓度为320.0μg/ml～40.0μg/ml，而支链PEI25k的浓度为160.0μg/ml～20.0μg/ml。Superfect的浓度为600.0～75.0μg/ml，而脂转染胺试剂的浓度为200.0μg/ml～25.0μg/ml。合成的聚合物和脂质-聚合物(NDT)的浓度为320.0μg/ml～40.0μg/ml。

[0088] 用96孔板和转染剂-层粘连蛋白混合物制造可转染表面

[0089] 向96孔板的各个孔中加入25μl的转染剂/层粘连蛋白溶液。振荡板数秒以确保整个底部表面都覆盖有转染剂/明胶溶液。然后在组织培养罩中风干板数小时(约5～6小时)。干燥的板储存在4℃待用(图8～13)。

[0090] 通过滴涂转染剂-层粘连蛋白混合物制造可转染的玻片表面

[0091] 在PLL涂覆的玻片上滴涂1～4μl的转染剂/明胶溶液。玻片置于干净的罩中约1小时并使其完全干燥。干燥的玻片储存在4℃待用(图22～23)。

[0092] 由基于胶原的转染混合物制备的转染表面

[0093] 在PBS中稀释胶原(Sigma，目录号C8919)直至最终浓度为120.0μg/ml并在4℃储存。

[0094] 用层粘连蛋白制备转染混合物

[0095] 在120.0μg/ml的胶原溶液中稀释全部转染剂。线性PEI25k和专门合成的聚合物样品的浓度为320.0μg/ml～40.0μg/ml，而支链PEI25k的浓度为160.0μg/ml～20.0μg/ml。Superfect的浓度为600.0～75.0μg/ml，而脂转染胺试剂的浓度为200.0μg/ml～25.0μg/ml。合成的聚合物和脂质-聚合物(NDT)的浓度为320.0μg/ml～40.0μg/ml。

[0096] 用96孔板和转染剂-胶原混合物制造可转染表面

[0097] 向96孔板的各孔中加入25μl的转染剂/胶原溶液。振荡板数秒以确保整个底部表面都覆盖有转染剂/明胶溶液。然后在组织培养罩中干燥板数小时(约5～6小时)。干燥的板储存在4℃待用(图14～16)。

[0098] 由基于明胶/层粘连蛋白的转染混合物制备的转染表面

[0099] 在0.2％的明胶中稀释层粘连蛋白(Sigma，目录号L2020)直至最终浓度为40.0μg/ml并储存在4℃。

[0100] 用明胶和层粘连蛋白制备转染混合物

[0101] 在40.0μg/ml层粘连蛋白/0.2％明胶溶液中稀释全部转染剂。线性PEI25k和专门合成的聚合物样品的浓度为320.0μg/ml～40.0μg/ml，而支链PEI25k的浓度为160.0μg/ml～20.0μg/ml。Superfect的浓度为600.0～75.0μg/ml，而脂转染胺试剂的浓度为200.0μg/ml～25.0μg/ml。合成的聚合物和脂质-聚合物(NDT)的浓度为320.0μg/ml～40.0μg/ml。

[0102] 用96孔板和转染剂-明胶-层粘连蛋白混合物制造可转染表面

[0103] 向96孔板的各个孔中加入25μl的转染剂/明胶/层粘连蛋白溶液。振荡板数秒以确保整个底部表面都覆盖有转染剂/明胶溶液。然后在组织培养罩中干燥板数小时(约5～6小时)。干燥的板储存在4℃待用(图17～19)。

[0104] 质粒DNA的制备

[0105] 根据标准DNA重组方案构建质粒pCMV-GFP和pCMV-luc。绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶基因cDNA的表达由人类巨细胞病毒(CMV)启动子控制，并且转录物由基因表达增强子即小鸡β-珠蛋白内含子稳定。质粒在DH5α大肠杆菌中扩增并依照制造商的说明用Qiagen质粒最大制备试剂盒(Qiagen Plasmid Max Preparation Kit)纯化。在260和280nm通过分光光度分析，以及在0.8％的琼脂糖凝胶中通过电泳检测纯化的质粒DNA的数量和质量。纯化的质粒DNA溶于无菌双蒸水中并储存在-20℃。

[0106] 用DMEM制备DNA溶液

[0107] 在DMEM中稀释pCMV-GFP或pCMV-luc质粒直至最终浓度为10μg/ml。将三十(30)μl的DNA溶液加至96孔板或玻片的可转染表面，并在室温下培育20～30分钟。

[0108] 反义寡核苷酸的制备

[0109] 荧光素酶705报道基因系统由University of Northern Carolina的Dr.Kole开发(Kang SH等，Biochemistry 1998；37(18)：6235-9)。在上述系统中，将在705处有突变的人类β-珠蛋白插入荧光素酶cDNA之间的序列中。将质粒引入Hela细胞中获得稳定基因表达；细胞系称为Hela luc705。通常细胞表现出低荧光素酶活性，因为具有错误剪接的基因产物(荧光素酶)不表现活性。然而，与705序列结合的反义寡核苷酸将阻断错误的剪接位点并产生具有生物活性的荧光素酶蛋白。荧光素酶705用作评价反义寡核苷酸递送效率的功能模型。荧光素酶活性越高表明反义递送的效率越高。

[0110] 在本研究中，合成了与luc705序列相结合的18核苷酸的2’-O-硫代磷酸甲酯寡核苷酸。其序列为CCUCUUACCUCAGUUACA。在最优的MEM中稀释反义寡核苷酸，最终浓度为0.6μmol/L。将30μl的反义寡核苷酸加至前述各孔的可转染表面并在室温下培育25分钟(图24)。

[0111] siRNA的制备

[0112] siRNA是含有21～25个碱基对(bp)的双链RNA片断，可结合并破坏靶mRNA并且导致基因表达水平下调。在所述实验中，荧光素酶质粒和靶向荧光素酶基因的siRNA合成盒(cassette)在最优的MEM中制备，并加至上述可转染的板中培育25分钟。荧光素酶质粒的量为0.5μg/孔，而siRNA合成盒为约0.5μg/孔(图25)。

[0113] Tat肽递送

[0114] 用0.2％的明胶溶液制备各种浓度(50、25、12.5和6.3μg/孔)的生物素标记的4
Tat肽并分别涂覆在96孔板上。板通过置于细胞培养罩中数小时干燥。以1.5×10/孔在涂覆有肽的板上接种Hela细胞并在37℃培育4小时。细胞用0.2％的戊二醛/PBS固定5分钟后再用10％的甲醇处理。细胞用10％的血清在37℃阻断30分钟后，用链亲和素-FIFC在37℃培育30分钟。用PBS洗涤细胞并在荧光显微镜下观察荧光信号。如果肽成功递送至细胞中，则生物素共轭的肽可特异性结合链亲和素-FIFC并使肽能产生荧光信号。细胞中FITC信号越强表明转运至细胞中的肽越多(图26)。

[0115] 转染混合物中靶向部分对可转染表面系统介导的基因转移的影响

[0116] 转铁蛋白共轭的聚-L-赖氨酸的制备

[0117] 转铁蛋白可在转铁蛋白报道基因介导的胞吞途径中被肝细胞吸收。转铁蛋白据报道已成功用作可提高肝细胞中基因递送效率的细胞靶向分子(Wagner E，Ogris M，Zauner W.Adv Drug Deliv Rev 1998；30(1-3)：97～113)。

[0118] 在基于层粘连蛋白的转染混合物体系中靶向分子(转铁蛋白)对阳离子聚合转染剂介导的基因转移的影响

[0119] 在所述试验中，将25μL与转铁蛋白(PLL-T)共轭的聚-L-赖氨酸和40.0μg/ml的层粘连蛋白涂覆于96孔板上。聚-L-赖氨酸(PLL)用作对照。PLL-T和PLL的浓度为320.0μg/ml～40.0μg/ml。风干后，将25μl的荧光素酶质粒溶液(20.0μg/ml，聚合物/DNA的比为16∶1～2∶1)加至板中并在室温下培育25分钟。干燥的板待用于相关实验中(图27)。

[0120] 转染混合物中膜去稳定成分对可转染表面系统介导的基因转移的影响[0121] VSVG是一种具有导致膜融合并破坏细胞膜的膜去稳定性能的病毒包膜蛋白。VSVG已用作基因转染增强剂，它可显著提高阳离子聚合物(PLL)介导的基因转染。已经合成出来自VSVG蛋白的细胞融合区的肽。上述肽的序列为RRRQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDARRR，其在C端和N端的末端分别具有氨基酸精氨酸以提高肽的溶解性。

[0122] 在40.0μg/ml的层粘连蛋白中稀释VSVG肽和聚-L-赖氨酸。VSVG肽的浓度为1.0mg/ml，而PLL的浓度为640μg/ml～160.0μg/ml。在对照组中，仅有PLL以相同浓度稀释于层粘连蛋白溶液中。将25μl的PLL或PLL+VSVG肽溶液加至96孔板中并风干。PLL的量分别为16.0、8.0和4.0μg/孔(图28)。

[0123] 转染混合物中细胞减少剂对可转染表面系统介导的基因转移的影响[0124] 谷氨酰胺是一种细胞减少剂，可保护细胞免遭氨诱导的细胞毒性(Nakamura E和Hagen S J.Am J Physiol Gastointest liver Physiol283 G1264～1275，(2002))。由于几乎所有的阳离子聚合物或阳离子脂质都含有氨基团，因此在制备可转染表面时向转染混合物中加入谷氨酰胺在保护细胞免遭转染细胞毒性方面有一定作用。在0.2％的明胶溶液中稀释谷氨酰胺(100mmol/L)和不同的转染剂(NDT-CP-B-1、NDT-CP-1、Superfect和脂转染胺试剂2000)，将25μl含有谷氨酰胺/转染剂/明胶的溶液加至96孔板中并使其风干。然后将25μl于最优MEM(20.0μg/ml)中的GFP质粒溶液加至各孔中并在室温下培育25分钟。干燥的板待用(图32)。

[0125] 转染混合物中细胞粘附剂对可转染表面系统介导的基因转移的影响[0126] 层粘连蛋白是一种支持细胞生长和分化的基质。层粘连蛋白是一种常用的细胞粘附剂。在本实验中，采用0.2％的明胶或0.2％的明胶和40.0μg/ml的层粘连蛋白的混合物稀释转染剂NDT-CP-B-1、NDT-CP-1、NDT-LP-1、NDT-LP-2、Superfect和脂转染胺试剂2000，并将25μl的溶液加至96孔板中。各孔中使用的NDT聚合物的量分别为8、4或2μg，Superfect的量分别为15、7.5和3.8μg/孔，而脂转染胺试剂2000的量分别为2.5、1.25和0.63μg/孔。风干后，将25μl于最优MEM(20μg/ml)中的GFP质粒加至各孔中并在室
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温下培育25分钟，然后以5×10 个/孔将293细胞接种至板上。细胞再在37℃培育24小时。转染效率和细胞毒性通过荧光显微镜和MTT实验方法分析(图33)。

[0127] 细胞培养

[0128] 将HEK 293T细胞保持在含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM(Gibco)中。在上述介质中，细胞的倍增时间为约20小时，细胞每3～4天分离一次以避免汇合度过大。

[0129] Hela705细胞系取自引入带有突变β-珠蛋白内含子(突变在705位置)的萤火虫荧光素酶基因后的人类宫颈癌Hela细胞，由于不正确的剪接，突变β-珠蛋白内含子导致荧光素酶蛋白突变。然而，突变的内含子可通过特异性反义寡核苷酸在其阻断错误剪接位点后校正(Kang SH等，Biochemistry 1998；37(18)：6235-9)。细胞系保持在含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM(Gibco)中。将200μg/ml的潮霉素加入到培养基中以保持luc-705质粒。在该介质中，细胞的倍增时间为约20小时，细胞每3～4天分离一次以避免汇合度过大。

[0130] 人类肝肿瘤细胞系HepG2保持在含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的α-MEM培养基(Gibco)中。在上述介质中，细胞的倍增时间为约20小时，细胞每3～4天分离一次以避免汇合度过大。

[0131] 在EBM培养基(Cambrex Corp.)中生长并保持人类原代内皮细胞HUV-EC细胞系，所述培养基根据制造商的说明含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素以及不同类型的生长因子(图29～30)。

[0132] 细胞制备并接种至可转染表面上

[0133] 转染前即刻在组织培养罩中，从10cm的皿中收获细胞，方法如下：

[0134] a.除去介质，细胞用2ml的PBS漂洗，将溶液涂布至板上，然后立刻除去溶液。

[0135] b.将0.5ml的胰蛋白酶-EDTA加入细胞中并均匀涂布在板上，然后立刻除去胰蛋白酶-EDTA。

[0136] c.将细胞置于罩中3～5分钟。然后搅拌板使细胞从板的表面脱离。

[0137] d.将六(6)毫升37℃的全培养基加至细胞板，用10ml的移液管上下吸取溶液12～15次直至获得单细胞悬浊液，同时避免产生过多的泡沫。另外加入14ml的培养基，并使细胞完全悬浮于溶液中。

[0138] e.在血细胞计数器中确定细胞的数量。

[0139] f.在无菌盆中将HEK 293T、HepG2细胞稀释至最终浓度为4～5×105细胞/孔，4
并在96孔板的各孔中接种100μl(4～5×10 细胞)。Hela705和HUV-EC细胞的最佳浓
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度为1～2×10 细胞/ml。

[0140] GFP报道基因转染实验方法

[0141] 绿色荧光蛋白(GFP)基因用于最初的筛选。转染后，在荧光显微镜(奥林巴斯，滤光镜520nm)下观察细胞中的GFP信号。用10X物镜为细胞照相。转染培养物中具有GFP信号的细胞的百分比根据三个视野的计数确定以获得最佳阳离子聚合物量。

[0142] 荧光素酶实验方法

[0143] 根据制造商(Luciferase Assay System；美国威斯康星州麦迪逊，Promega)的说明采用化学发光实验方法进行荧光素酶活性的测量。简单地说，基因转移后30小时，用PBS漂洗细胞两次，然后在室温下用裂解缓冲液(1％Triton X-100、100mM的K3PO4、2mM的二硫苏糖醇、10％的甘油和2mM的EDTA，pH7.8)裂解15分钟。然后在光度计中于室温下用注射器使10μl的细胞裂解液的等分试样与50μl的荧光素酶实验方法试剂混合。在10秒时间测量光发射三次并表示为RLU(相对光单位)。相对光单位(RLU)由BSA蛋白质实验方法(pierce，Rockford，Illinois)测定并归一化为各样品的蛋白质含量。所有实验进行三次。

[0144] 细胞毒性实验方法-MTT实验方法

[0145] 转染剂对哺乳动物细胞的细胞毒性采用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)法评估。转染后四十(40)小时，将10μl的MTT溶液(5.0mg/ml，Sigma)加至各孔并培育3小时。然后除去培养基并加入200μl的DMSO以溶解甲 晶体(formazancrystal)。在570nm测量溶液的吸光度。采用如下方程式计算细胞的生存能力：生存能力(％)＝{吸光度570(样品)/吸光度570(对照)}×100(图31)。

[0146] 稳定性研究

[0147] 如上所述，将于0.2％明胶中的LPEI、BPEI、NDT-CP-B-1、NDT-CP-1、Superfect和脂转染胺试剂涂覆于96孔板中。风干后，在37℃下培育板9天。待用。以25μl/孔将荧光素酶质粒(20.0μg/ml，于最优MEM中)加至板中(此前此后37℃培育)并培育25分钟。4
在板中接种5×10 个293细胞并在37℃培育48小时。对刚制造的板的可转染表面的基因转染效率与在37℃下培育9天的基因转染效率进行比较(图34)。

[0148] 虽然参照优选实施方案具体说明并描述了本发明，但本领域的技术人员将理解在不偏离本发明范围的情况下，可对其形式和细节进行多种改变。本发明引用的所有参考文献在此通过援引的方式纳入。