修饰的血红蛋白及其制备方法

摘要

本发明提供了一种具有6±1个PEG链的血红蛋白分子(Hb)，其中所述PEG链中的2个结合到Hb的Cys-93(β)上，其余的PEG链结合到引入到Hb的ε-氨基上的巯基上。本发明还提供了制备修饰的血红蛋白分子(Hb)的方法，包括以下步骤：(a)使Hb与8-15倍过量的亚氨基四氢噻吩反应以形成巯基化Hb；和(b)使巯基化Hb与16-30倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应，以形成修饰的Hb。

权利要求

1.一种分离的具有6±1个PEG链的不致高血压的血红蛋白分子(Hb)，其中所述PEG链中的2个结合到Hb的Cys-93(β)上，其余PEG链结合到引入到Hb的ε-氨基上的巯基上，并且其中所述不致高血压的血红蛋白分子(Hb)不是具有4-5个PEG化位点的马来酰亚胺基-PEG-Hb。

2.权利要求1的血红蛋白分子，其中每个PEG链的分子量为3000-10,000道尔顿。

3.权利要求1的血红蛋白分子，其中每个PEG链的分子量为5000道尔顿。

4.权利要求1的血红蛋白分子，其中每个PEG链通过琥珀酰亚胺基键连接到Hb上。

5.权利要求2的血红蛋白分子，其中每个PEG链通过琥珀酰亚胺基键连接到Hb上。

6.权利要求3的血红蛋白分子，其中每个PEG链通过琥珀酰亚胺基键连接到Hb上。

7.权利要求1-6中任一项的血红蛋白分子，其中巯基与Hb的γ-巯基丁脒化的ε-NH2相关联。

8.一种制备经修饰以具有6±1个PEG链的血红蛋白分子(Hb)的方法，包括以下步骤：(a)使Hb与8-15倍过量的亚氨基四氢噻吩反应以形成巯基化Hb；

(b)使该巯基化Hb与16-30倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应，以形成经修饰的具有6±1个PEG链的Hb；和(c)分离经修饰的具有6±1个PEG链的Hb；

其中所制备的血红蛋白分子(Hb)不是具有4-5个PEG化位点的马来酰亚胺基-PEG-Hb。

9.权利要求8的方法，其中在步骤(a)中使Hb与9-12倍过量的亚氨基四氢噻吩反应。

10.权利要求8的方法，其中在步骤(a)中使Hb与10倍过量的亚氨基四氢噻吩反应。

11.权利要求8的方法，其中在步骤(b)中使巯基化Hb与18-22倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应。

12.权利要求8的方法，其中在步骤(b)中使巯基化Hb与20倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应。

13.权利要求8的方法，其中在步骤(a)中使Hb与9-12倍过量的亚氨基四氢噻吩反应，且在步骤(b)中使该巯基化Hb与18-22倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应。

14.权利要求8的方法，其中在步骤(a)中使Hb与9-12倍过量的亚氨基四氢噻吩反应，且在步骤(b)中使该巯基化Hb与20倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应。

15.权利要求8的方法，其中在步骤(a)中使Hb与10倍过量的亚氨基四氢噻吩反应，且在步骤(b)中使该巯基化Hb与18-22倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应。

16.权利要求8的方法，其中在步骤(a)中使Hb与10倍过量的亚氨基四氢噻吩反应，且在步骤(b)中使该巯基化Hb与20倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应。

17.权利要求8-16中任一项的方法，其中PEG的分子量为3000-10,000道尔顿。

18.权利要求8-16中任一项的方法，其中PEG的分子量为5,000道尔顿。

19.权利要求8-16中任一项的方法，其中该修饰的Hb是不致高血压的。

20.权利要求17的方法，其中该修饰的Hb是不致高血压的。

21.权利要求18的方法，其中该修饰的Hb是不致高血压的。

22.一种通过权利要求8-16中任一项的方法制备的修饰的Hb。

23.一种通过权利要求17的方法制备的修饰的Hb。

24.一种通过权利要求18的方法制备的修饰的Hb。

25.一种通过权利要求19的方法制备的修饰的Hb。

26.一种通过权利要求20的方法制备的修饰的Hb。

27.一种通过权利要求21的方法制备的修饰的Hb。

说明书

修饰的血红蛋白及其制备方法

[0001] 相关申请的交叉参考

[0002] 本申请要求申请日为2002年12月23日的美国临时申请NO.60/436,149的优先权。发明领域

[0003] 本发明涉及一种修饰的血红蛋白及其制备方法。

[0004] 发明背景

[0005] 血红蛋白(Hb)是红细胞的主要组成，红细胞携带氧从肺贯穿全身。当包含在红细胞中时，Hb以两个氧连接的αβ二聚物组成的四聚体结构存在，每个二聚物的分子量大约为32Kd。每个二聚物的每个α和β亚基都具有蛋白链和血红素分子。α和β蛋白链的序列是已知的。Hb是一种用于输血的可能有用的血液代用品，而且已经提出用作感染性休克中捕捉氧化亚氮，以及在癌症的放射治疗中调节组织的氧合作用的试剂。重组DNA技术能生产修饰的Hb，其具有调节用于个别治疗应用的特殊需要的氧亲和力。

[0006] 无细胞Hb的血管活性，即小动脉和毛细血管的收缩作用，当灌输纯化的无细胞Hb溶液，或分子内交联的Hb时，已经成为开发基于Hb的载氧体的主要障碍(Savitzsky等人1978，Sloan等人1999，Saxena等人1999)。该血管活性归因于Hb的NO清除作用(Doharty等人1998)。两种分子方法，二者之间截然不同，企图用于克服Hb的NO清除活性。第一种方法是重组DNA方法，其试图通过远端的血红素袋的位点特异性诱变来修饰Hb的NO结合活性，从而降低Hb的氧化亚氮清除活性(Eich et al，1996)。第二种方法是化学方法，其中通过低聚化作用来增加Hb的分子大小，低聚化作用将降低或可能完全抑制Hb从血管空间外渗到胞间隙(Hess等人1978，Thomas等人1993，Muldoon等人1996，Macdonal等人1994，Furchgott 1984，Kilbourn等人1994)。但是只有当Hb的血管活性主要作为外渗的结果而介导时，增加分子大小的方法才是成功的。虽然低聚化介导的Hb大小增加显示出Hb血管活性有所降低，但是通过重组DNA技术，或通过包括Hb的低聚化作用使用小分子双功能试剂来进行大小增加的方法，都没有产生不致高血压的Hb溶液。一个例外是Hb的低聚化产物(Matheson等人2002)，其分子大小远远超过300kDa，平均分子半径为24nm，发现其是不致高血压的而且不外渗。但是，大多数目前仍处于临床试验中的低聚化产物的分子量范围为200到250kDa。

[0007] 证实Enzon PEG化的Hb是不致高血压的，其携带连接到Hb的α和ε-氨基上的10个拷贝的PEG-5000链，刺激了在血液代用品领域的研究(Rolfs等人1998)。四聚体内交联Hb，低聚化的Hb和PEG化的Hb的NO结合活性(Winslow et al，1998，Vandegriff et al，
1997)，显示与它们的”升压效应”没有直接相关。因此，无细胞Hb“升压活性”的降低似乎不与制品的NO结合活性，或者制品的分子大小直接相关。但是与低聚化的Hb相比，PEG化的Hb显示出显著较低水平的血管活性。Enzon的PEG-Bv-Hb，其携带10个拷贝的PEG-5000，几乎没有显示任何”升压效应”。Vandegriff等(1998)表示，相较于Hb低聚化样品，PEG-Bv-Hb显示高的粘度和胶粒渗透压。从胶粒渗透压计算的Enzon PEG化Bv-Hb的分子半径比低聚化Hb的大得多(15nm)，而且计算的分子半径与它的计算的分子量114,000道尔顿不相符(Vandegriff et.al.1998)。因此，假定Hb的大小应当增加到分子半径为大约15nm，而且同时应伴随粘度和胶粒渗透压的显著增加以产生不致高血压的Hb溶液(Winslow 1999)。

[0008] 在不致高血压的Enzon PEG化的Hb中，PEG-5000链通过异肽键连接到牛Hb PEG-链的α和ε氨基上。PEG的共价连接同时伴有衍生的氨基的净正电荷的丢失。在最近的研究中，已经证实用戊二醛进行rHb1.1的单功能修饰，能一定程度地降低Hb的血管活性，而rHb1.1的低聚化作用能更高程度地降低Hb的血管活性。因此，在理解通过PEG化作用中和Hb的血管活性的分子基础中，需要考虑伴随HB的PEG化的Hb表面电荷修饰的可能作用。

[0009] 为了揭露由于PEG化作用而产生的Hb表面电荷微扰与产生不致高血压的Hb之间的相关性，已经开发了新方法，其涉及Hb的保守性PEG化作用，即Hb的PEG修饰而不改变Hb的表面电荷(Acharya等人1996)。在氧条件下，PEG-马来酰亚胺对Hb的Cys-93(β)的高反应性和选择性，已经用于制备每个四聚体携带两个拷贝PEG链的均一性PEG化Hb。已经生产了三种不同的PEG-HbA制品，分别携带两个拷贝的PEG-5K，或PEG-10K或PEG-20K。Hb的分子体积(流体动力学体积)，分子半径，粘度和胶粒渗透压的改变，与共价连接到Hb上的PEG的质量相关；而且所有的这些分子特性都与升压效应相关。尽管(PEG20K)2-Hb的粘度和胶粒渗透压与Enzon PEG-Bv-Hb(一种不致高血压的Hb分子)相当，这种PEG化的Hb是血管活性的。因此，血管活性问题的解决不可能通过简单地赋予分子增加的粘度，胶粒渗透压和分子体积(流体动力学体积)来完成。

[0010] 发明概述

[0011] 本发明提供了一种修饰的Hb，其具有增加的分子体积，高粘度，高胶粒渗透压，高O2亲和力，其是不致高血压的并且还能解决血管活性问题。此外，本发明修饰的Hb可以在简单、灵活而且高效的方法中生产，其使本发明修饰的Hb的制备有成本效益。

[0012] 更特别地，本发明提供了一种具有6±1个PEG链的血红蛋白分子(Hb)，其中所述PEG链中的两个结合到Hb的Cys-93(β)上，而余下的PEG链结合到在Hb的ε-氨基上引入的巯基上。

[0013] 本发明还提供了制备修饰的血红蛋白分子(Hb)的方法，包括以下步骤：(a)使Hb与8-15倍过量的亚氨基四氢噻吩反应以形成巯基化的Hb；和(b)使巯基化的Hb与16-30倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应，来形成修饰的Hb。

[0014] 最后，本发明提供了根据前述方法制备的修饰的Hb分子。

[0015] 附图简述

[0016] 图1提供了亚氨基四氢噻吩依赖的巯基化作用介导的基于马来酰亚胺化学的Hb PEG化的示意图。A：描述了巯基化作用，简化方式的PEG化反应的第一阶段，以及马来酰亚胺官能化的PEG链结合到巯基化蛋白上。连接的PEG链描绘为伸出中心蛋白(Hb)核心的臂。B：亚氨基四氢噻吩与Hb的ε-氨基反应，产生γ-巯基丁脒基部分。

[0017] 图2描述了巯基化作用介导的基于PEG马来酰亚胺的Hb的PEG化。A：亚氨基四氢噻吩对与马来酰亚胺(maleido)苯基PEG-5000孵育的Hb大小增加的影响。溶于PBS pH7.4中的Hb(0.5mm的四聚体)，在存在或缺乏已知浓度的亚氨基四氢噻吩时，与10mM马来酰亚胺苯基PEG-5000于4℃孵育4小时。利用串联连接的两个superose柱，使用FPLC通过大小排阻色谱法对产物进行分析。柱子用PBS以每分钟0.5ml的流速进行洗脱。标记HbA，(PEG5K)2-Hb，(PEG10K)2-Hb和(PEG20K)2-Hb的洗脱位置，作为追踪Hb分子大小增加的指导，其伴随着PEG链结合。1：对照Hb。2：缺乏亚氨基四氢噻吩时，与10mM马来酰亚胺苯基PEG-5000孵育4小时的HbA。3：存在1mM(2倍摩尔过量)亚氨基四氢噻吩时的PEG化。4：存在2.5mM(5倍摩尔过量)亚氨基四氢噻吩时的PEG化。5：存在5mM(10倍摩尔过量)亚氨基四氢噻吩时的PEG化。插图a给出了，存在10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩时(超过Hb)，Hb的巯基化作用的动力学。插图b显示了Hb巯基化作用程度(孵育了4小时之后)，作为亚氨基四氢噻吩相对于Hb摩尔过量的函数。B：温度，PEG-马来酰亚胺中PEG的分子大小和连接化学(PEG与马来酰亚胺部分之间的连接)对Hb大小增加的影响。所有的PEG化反应，都使用10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩与20倍摩尔过量的PEG-马来酰亚胺于室温进行4小时，并于4℃过夜。如A所述通过大小排阻层析法检测大小增加。a：HbA，b：使用Mal-Phe-PEG-5000作为PEG马来酰亚胺于室温进行反应。c：使用Mal-Phe-PEG-10,000如b中所述的进行反应。d：如b所述的进行反应,但是于4℃过夜。e：如d所述的进行反应，但是使用马来酰亚胺乙基PEG-5000作为PEG-马来酰亚胺。

[0018] 图3描述了使用Acta探测器通过大小排阻色谱对(PEG5K)6-Hb进行纯化。用180mg上样进行了制备级实验。如分析级实验(图2)那样使用PBS进行洗脱。使用10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩与20倍摩尔过量的Mal-Phe-PEG-5000于4℃进行PEG化。插图对纯化的(PEG5K)6-Hb的分子大小与其它的PEG化Hb以及使用双马来酰亚胺苯基PEG-600在四聚体之间交联的αα富马酰Hb(一种分子内交联的Hb)的分子大小进行了比较。该样品有助于标记αα-富马酰Hb的四聚体，八聚体，十二聚体和十六聚体(dohexameric)形式的位置。1：四聚体间交联的αα-富马酰Hb。2：在Superose-12制备柱上纯化的(PEG5K)6-Hb。3：Enzon PEG化Hb；(PEG5K)10-Hb；4：APEX Biosciences的PEG化Hb样品，(PEG3K)10-Hb。

[0019] 图4描述了(PEG5K)6-Hb的NMR光谱。

[0020] 图5描述了PEG化Hb的粘度对蛋白浓度的函数。空心圆表示(PEG5K)6-Hb；实心菱形表示Enzon PEG化的Hb，且实心的三角形表示(PEG5K)2-Hb。

[0021] 图6描述了(PEG5K)6-Hb的胶体渗透压对蛋白浓度的函数。空心三角形表示(PEG5K)2-Hb，空心圆表示(PEG5K)6-Hb；实心圆表示(PEG5K)6-Hb，其已经再透析以确保样品中没有任何游离的PEG试剂。实心菱形表示Enzon PEG化的Hb。注意Enzon PEG-Hb与(PEG5K)6-Hb的胶粒渗透压相当。

[0022] 图7描述了(PEG5K)6-Hb的血管活性。A：仓鼠中，动物用4gm％的(PEG5K)6-Hb的10％最大负荷进行灌输后的平均动脉压力。B：动物用(PEG5K)2-Hb和(PEG5K)6-Hb的10％最大负荷灌输后的小动脉直径作为时间的函数。

[0023] 图8描述了对动物用(PEG5K)6-Hb和αα-富马酰Hb进行50％换血后仓鼠中有功能的毛细血管密度与对照的比较。注意用(PEG5K)6-Hb换血后动物的动脉直径与对照样品的相当，而50％换血αα-富马酰Hb的动物的动脉直径比对照的狭窄。还注意到，用两种样品换血的毛细血管密度的差异。

[0024] 发明详述

[0025] 如这里所用的，除非有另外说明，“Hb”包括来自人类和哺乳动物(例如，牛Hb，猪Hb)来源的血红蛋白，重组Hb，以及经修饰以增强或降低氧亲和力和/或自动氧化的Hb(分离的或重组的Hb)。此外，Hb可包括分子内交联桥的Hb(分离的或重组的Hb)，包括例如，利用双马来酰亚胺苯基PEG于Cys-93(β)处交联的Hb(双功能试剂的PEG链的MW为2000到10,000道尔顿)，αα-富马酰Hb，或ββ-富马酰Hb或ββsubaryl HbA。

[0026] 本发明中，Hb具有或者携带6±1个PEG链，其中2个PEG链结合到Hb的Cys-93(β)上，剩余的PEG链结合到引入到Hb的ε-氨基上的巯基上。巯基优选与Hb的γ-巯基丁脒化的ε-氨基相关联。在优选的实施方案中，每个PEG链的分子量为
3000-10,000道尔顿，更优选分子量为大约5000道尔顿。PEG链也优选通过琥珀酰亚胺键连接到Hb上。在优选的实施方案中，本发明的Hb分子也是不致高血压的。

[0027] 本发明的Hb分子可通过如下所述制备，使Hb与8-15倍过量的亚氨基四氢噻吩反应以形成巯基化的Hb；然后使巯基化的Hb与16-30倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应，来形成修饰的Hb。在优选的实施方案中，步骤(a)中使Hb与9-12倍过量的亚氨基四氢噻吩反应，而且巯基化Hb优选与18-22倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应。在更优选的实施方案中，步骤(a)中使Hb与大约10倍过量的亚氨基四氢噻吩反应，而且步骤(b)中巯基化Hb与大约20倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应。Hb的巯基化作用与巯基化Hb的PEG-修饰可以同时进行，或者在两步法中进行，这也在本发明的范围内。至于该方法中使用的PEG的分子量，PEG的分子量优选3000-10,000道尔顿，更优选分子量为大约5,000道尔顿。在最优选的实施方案中，从该方法获得的修饰Hb是不致高血压的。

[0028] 本发明的方法中，可以从携带多个氧构象特异性反应巯基的哺乳动物Hb(狗Hb，猫Hb，鸡Hb，鼠Hb)，或在α和β-链的所需位置带有另外的反应性半胱氨酸的重组人Hb，来直接制备修饰的Hb，其用经马来酰亚胺部分官能化的过量PEG处理以获得修饰的Hb。

[0029] 该方法中的化学简明地表示在图1A和1B中。亚氨基四氢噻吩，不携带游离的巯基，一旦与ε-氨基反应就原位产生巯基。衍生的ε-氨基(一种脒)保持了该官能团的原始正电荷(图1B)。因此，Hb可以与PEG-马来酰亚胺以及巯基化试剂一起孵育，以产生PEG化的Hb，而没有巯基化试剂消耗PEG-马来酰亚胺试剂的危险。PEG化作用的水平可通过巯基化(亚氨基四氢噻吩与Hb反应)水平来测定。后者主要是由亚氨基四氢噻吩浓度，以及在给定构象状态中Hb的ε-氨基对亚氨基四氢噻吩脒化作用的反应性来决定。

[0030] PEG化反应是灵活可变的，因为该反应不依赖马来酰亚胺中PEG的分子大小，以及PEG-马来酰亚胺中马来酰亚胺与PEG-链之间的连接化学。该方法可用于增加Hb的分子体积(大小)到任何所需的水平，通过调节Hb的巯基化水平和/或PEG-马来酰亚胺中PEG的分子量。保守的PEG化技术已优化用于生产具有高氧亲和力的多重、大小增加的PEG化Hb。本发明修饰的Hb在净电荷和流体动力学体积方面都显示了高度的分子均一性，其流体动力学体积相当于分子量～250,000道尔顿的球状蛋白的流体动力学体积。相信对不致高血压的PEG化的Hb的任何设计都应当试图利用很多较小的PEG链来掩蔽保护Hb的较大分子表面。

[0031] 参考下述的非限制性实施例可以更好地理解本发明。下述实施例的目的是为了更充分全面地解释本发明的优选实施方案，而绝不能解释为对本发明范围的限制。

[0032] 实施例1

[0033] 1、材料和方法

[0034] 血红蛋白.如前所述从红细胞溶解产物纯化人HbA(Acharya等人1983)。

[0035] 合成马来酰亚胺苯基聚乙二醇(MalPhePEG)试剂.根据Acharya，等人1996的程序合成PEG 5000和PEG 10000的单功能马来酰亚胺苯基衍生物。马来酰亚胺乙基PEG-5000购自Shaerwaters，Huntsville，Alabama。

[0036] HbA与MalPhe-PEG试剂反应.血红蛋白A(0.5mM)溶于PBS，pH 7.4，与10倍摩尔过量的Mal Phe PEG-5000于4℃反应。PEG对HbA的修饰可通过反相高压液相色谱(RPHPLC)和大小排阻色谱(SEC)进行监控。反应产物用50mM Tris-醋酸盐缓冲液pH8.5进行透析，并通过离子交换色谱进行纯化。使用AKTA Explorer 10蛋白纯化系统，在Amersham Biosciences Q-Sepharose高性能树脂上，通过离子交换色谱对PEG化的Hb进行纯化。Q-Sepharose高性能柱(2.6cmx62cm)用50mM Tris-醋酸盐缓冲液，pH 8.5进行平衡，蛋白用8倍柱体积的50mM Tris-醋酸盐，pH 8.5和50mM Tris-醋酸盐，pH 7.0组成的的线性降低pH梯度进行洗脱。柱流出液在240和540nm处监控。

[0037] 氧亲和力测定.使用PBS pH 7.4中的Hem-O-Scan(Aminco)，以血红蛋白四聚体浓度1mM，于37℃测定氧平衡曲线。

[0038] 粘度测定.在流变仪中，以蛋白浓度4g/dl，在PBS缓冲液pH 7.4中并于37℃测定PEG化Hb的粘度。在测定Hb样品的粘度之前，仪器用去离子水校准。

[0039] 胶体渗透压测定.PEG化血红蛋白的胶体渗透压使用Wescor 4420胶体渗压计进行测定。所有的测定都使用溶于PBS pH7.4的2g/dl血红蛋白样品于室温进行。使用30kDa的截断膜。样品测定之前，仪器用O smocoll参考标准进行测试。

[0040] PEG化Hb的RPHPLC分析.各种PEG化Hb的球蛋白链通过RPHPLC，通过前面所述的方法进行分析。简单而言，在Vydac C4(4.6x250mm)柱上，使用100分钟内含有0.1％TFA的35-50％乙腈的线性梯度进行分离。柱流出液在210nm处监控。

[0041] PEG化Hb的血管活性.在仓鼠皮褶窗微循环模型中进行研究，基本上根据先前所述的程序(Mirhashemi等人1988，Tsai等人1996)。对体重55-70g的雄性Golden Syrian仓鼠(Charles Rivers，USA)进行研究。所有的动物研究由圣地亚哥的加利福尼亚大学动物项目委员会批准，并根据用于实验室动物的护理和使用的NIH指南来进行(NIH出版物#85-23Rev.1985)。

[0042] 每只动物都用作其自己的基线。10％的超容量灌输使用微灌输泵(CMA 100 Microinjection Pump：CMA，Sweden)，通过颈静脉导管，以0.20ml/min的速率灌输到动物中。灌输后立即以及灌输后30min测定血压，小动脉直径和功能性毛细血管密度。

[0043] 通过亚氨基四氢噻吩进行Hb巯基化的动力学.可通过估计巯基化作用的程度来追踪亚氨基四氢噻吩对Hb的脒化作用。与一定量的亚氨基四氢噻吩一起孵育给定长度的时间后，使用二硫代吡啶如Ampuslki(1969)所述评估Hb样品中的巯基数。4，4′二硫代吡啶(4-PDS，MW＝220.32，Aldrich Chemical Co.)的母液，通过把该试剂溶解在PBS中达到3mM的终浓度(或者如果需要的话更高)来制备。与亚氨基四氢噻吩一起孵育的Hb的等分试样，与二硫代吡啶一起孵育，并通过可于324nm处监控的4-PDS转化成4-硫代吡啶-4 -1酮(4-TP)来评估蛋白上的反应性巯基数(ε324＝1.98x10 M-1cm )。

[0044] 亚氨基四氢噻吩依赖的巯基化作用介导的基于PEG-马来酰亚胺的HbA的保守性PEG化作用.磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的HbA(0.5mM四聚体)，在存在对亚氨基四氢噻吩而言2倍摩尔过量的PEG-5000的马来酰亚胺(马来酰亚胺)苯基氨基甲酸酯(BioAffinity System)或马来酰亚胺乙基PEG-5000(Shearwaters)或PEG-1000的马来酰亚胺苯基氨基甲酸酯时，与所需水平的摩尔过量的亚氨基四氢噻吩(BioAffinity systems)于4°(或室温)反应所需的一段时间。在4℃反应比在室温优选，因为室温时巯基化Hb的巯基发生一定量的氧化，甚至在存在PEG-马来酰亚胺时，而这在4℃显著降低。PEG化反应通常在蛋白浓度0.5mM时发生，但是它也可使用Hb浓度为0.25mM或者1mM Hb进行。

[0045] 巯基化作用介导的PEG化作用也以两步反应研究，首先使Hb与所需过量的亚氨基四氢噻吩一起孵育来进行Hb巯基化作用，然后添加所需摩尔过量(相对于亚氨基四氢噻吩)的PEG-马来酰亚胺来完成巯基化Hb的PEG修饰。

[0046] 为了生产不致高血压的Hb，使用对Hb(表达为四聚体)10倍摩尔过量进行巯基化作用，以及用20倍摩尔过量的所需PEG-马来酰亚胺进行巯基化蛋白的PEG化作用。这通常以一步反应进行，以减少巯基的氧化。如果在室温进行反应，一般需要4到6小时的反应时间来获得所需的分子。当在4℃进行反应时，通常进行过夜反应(～16小时)。

[0047] 使用Mal-Phe-PEG-10,000，通过巯基化作用介导的基于PEG-马来酰亚胺的PEG化作用，以0.25mM的蛋白浓度进行Hb的表面装饰，因为以更高浓度的Hb进行反应导致不完全反应，可能是由于当使用20倍摩尔过量的Mal-PEG-2000时，反应混合物的粘度较高。

[0048] 使用截断值为12到14,000道尔顿的透析袋，对反应产物用PBS进行广泛地透析。未反应的(过量PEG-马来酰亚胺)透析出去；PEG化产物使用连接到Pharmacia Acta上的Superose 12柱通过大小排阻色谱进行纯化。从而分离PEG化的Hb，(PEG5K)6-Hb贮存于-80°直到进一步需要。

[0049] 对巯基化作用介导的基于PEG-马来酰亚胺的PEG化作用的大小增加的测定。使用Pharmacia FPLC系统，分析Hb的大小增加与各种巯基化作用介导的基于PEG-马来酰亚胺的保守性PEG化作用的关系。使用串联连接的2个Superose柱进行大小排阻色谱。使用PBS pH7.4，以0.5ml/min的流速于室温以300.15MHZ于29℃，使用5mm探针对样品进行洗脱。Hb样品为在0.1M中4到7％浓度。

[0050] II.结果

[0051] A)保守性PEG化作用技术的开发

[0052] (i)HbA的流体动力学体积增加作为巯基化作用介导的基于马来酰亚胺化学的Hb的PEG化作用的结果.缺乏和存在亚氨基四氢噻吩时，当Hb与20倍摩尔过量的Mal-Phe-PEG5K一起于室温孵育4.5小时时，Hb的大小排阻色谱模式显示于图2A中。在缺乏亚氨基四氢噻吩本身时，Hb用PEG-Phe-PEG-5000进行完全修饰(图2A，b)。未修饰的Hb于大约57分钟洗脱(图2A，a)，而与PEG-Phe-PEG 5K一起孵育的HbA于大约50分钟洗脱。该产物的洗脱位置对应于在它的两个Cys-93(β)处用Mal-Phe-PEG5K修饰的Hb。具有在Cys-93(β)处连接的各相应PEG-链的(SP-PEG10K)2-HbA以及(SP-PEG20K)2-HbA的洗脱位置为该柱上大约47和44分钟，并标记作为参考。

[0053] 在Hb与Ma l-Phe-PEG 5K的反应混合物中包括亚氨基四氢噻吩，该修饰的Hb比(PEG5K)2-HbA的位置从大小排阻色谱柱中较早洗脱。新的PEG-马来酰亚胺位点已经明显产生，从而在Hb上提供了新PEG-马来酰亚胺反应位点。以亚氨基四氢噻吩浓度依赖性方式，该修饰的Hb(PEG化的Hb)在大小排阻色谱中较早洗脱。亚氨基四氢噻吩的浓度越高，修饰的Hb洗脱的位置越早，表明Hb巯基化作用的水平增加，其作为反应混合物中亚氨基四氢噻吩浓度增加的函数，负责Hb表观分子大小的增加。存在2.5mM的亚氨基四氢噻吩(每个四聚体5倍摩尔过量)时产生的PEG化Hb，在靠近(SP-PEG10K)2-HbA的位置洗脱(图2A，d)。存在5mM亚氨基四氢噻吩时形成的样品，洗脱非常接近(SP-PEG20K)2-HbA的位置，但其流体动力学体积比(SP-PEG20K)2-HbA的稍小(图2A，e)。不过该物质在峰的上升侧有小的平缓区域(shoulder)。

[0054] 进一步增加亚氨基四氢噻吩的浓度到7.5mM，而不改变Mal-Phe-PEG的浓度为同样的(10mM)，PEG化Hb峰的洗脱模式变得稍宽，但是作为平缓区域洗脱的产物产量只有较小的增加(数据未显示)。甚至增加亚氨基四氢噻吩的浓度到10mM，洗脱模式也没有显著改变，除了在上升侧的平缓区域物质的浓度有较小改变之外。

[0055] PEG的浓度对上升侧平缓区域的影响已经研究作为PEG-马来酰亚胺浓度增加的函数。当Mal-Phe-PEG的浓度增加到接近图2e中使用的浓度的两倍时，该平缓区域显著减小(几乎消失)，对主峰的洗脱位置的影响极小。

[0056] 10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩对Hb进行巯基化作用的动力学显示于图2A中(插图a)。用10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩巯基化的Hb平均每个四聚体携带～7个反应-SH基(针对二硫代吡啶基)，其中两个为Cys-93(β)固有的-SH基，剩余的为通过使亚氨基四氢噻吩与Hb的反应性表面ε-氨基(Hb的γ-巯基丁脒化)反应引入的内在巯基。由于已经使用了10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩，巯基化作用的效率接近50％。PEG化Hb具有大约每个四聚体0.5摩尔的反应巯基(在非变性条件下)，其表明，平均而言，在产生该PEG化Hb中接近～6.5个拷贝的PEG链被引入到Hb上。

[0057] 蛋白浓度为0.5mM时Hb的巯基化作用也已经作为亚氨基四氢噻吩浓度的函数研究(图2A，插图b)。增加亚氨基四氢噻吩的浓度，从平均每个四聚体引入5个外在巯基的10倍摩尔过量到30倍，其几乎倍增巯基化Hb上的外在巯基数。然而，PEG化作用中看到的大小增加仅是很小的，其表明PEG化Hb不能在巯基化Hb的所有外在巯基上反应。这些结果解释为表明在存在10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩和20倍摩尔过量的Mal-Phe-PEG5K时，Hb的PEG化显著覆盖了Hb分子表面，产生“拥挤状况”，其中巯基化Hb处于通过该巯基化作用介导的PEG-5000马来酰亚胺依赖的PEG化作用的PEG增加Hb分子大小的该阶段，变得更抵抗对PEG化Hb的附加外在巯基的修饰。因此，对于所有的后续研究，利用PEG对Hb进行表面装饰而产生的PEG化Hb，使用10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩(相对于四聚体蛋白)，存在20倍摩尔过量的Mal-Phe-5000PEG。

[0058] (ii)巯基化作用介导的基于马来酰亚胺-PEG的Hb PEG修饰中的灵活可变性.使用10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩和20倍摩尔过量的PEG-马来酰亚胺，在Superose 12柱上进行大小排阻色谱作为检测系统，研究了温度，pH，连接化学，以及PEG-马来酰亚胺中PEG的分子大小对(PEG-5K)6-HbA形成的影响。当温度降低至4℃时，PEG-链与巯基化蛋白连接的速度似乎减缓，但是Hb的巯基化速度在很大程度上没有受到影响，进行该反应达9小时以确保反应完全，但是方便地通常选择过夜反应(14到16小时)(图2B，曲线c)。两步法进行PEG化作用，首先巯基化，然后PEG化，也没有表现出影响大小增加(数据未显示)。在三种pH值，pH 6.5，7.4和8.5用PEG进行表面装饰。把使用10mM磷酸缓冲液在pH 6.5，
7.5和8.5时形成的PEG化产物，与在PBS中于pH 7.4时形成的产物进行了比较。所有的产物在通过表面装饰获得的大小增加方面是相当的。

[0059] 用PEG-5000进行表面装饰时观察到的大小增加也是独立于连接化学的，使用马来酰亚胺-苯基-PEG-5000获得的反应产物具有与用PEG-乙基-PEG-5000所产生的产物基本相同的流体动力学体积(图2B，曲线d)。在给定的巯基化作用条件下，Hb的大小增加对PEG-马来酰亚胺中PEG的分子大小是敏感的。增加PEG-链的质量从5000到10,000，观察到的大小增加高于用PEG-5000马来酰亚胺所观察到的(图2B，曲线e)。

[0060] (iii)(PEG5)6-HbA的纯化.为了产生达1gm的(PEG)6-HbA的物质，开发了凝胶过滤方案。常规地将HbA(0.5mm)与10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩以及20倍摩尔过量的马来酰亚胺PEG在磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)中一起孵育4到6小时，然后反应混合物用100倍过量的PBS进行透析更换3次，以除去过剩的(未反应的)亚氨基四氢噻吩和马来酰亚胺PEG。透析过的样品浓缩到大约1mm，并利用连接到Pharmacia Acta Explorer 10上的制备Superose 12柱进行凝胶过滤。在上面所讨论的条件下PEG化的HbA样品的典型色谱模式显示于图6A中。于3种波长监控洗脱，以便于监控任何没有与Hb反应的PEG-马来酰亚胺的洗脱。PEG化Hb洗脱比存在于样品中的未反应PEG-马来酰亚胺更前得多。凝胶过滤的PEG化样品浓缩到大约6gms/dL。在巯基化作用介导的基于马来酰亚胺化学的PEG化反应过程中，或者在后续的纯化步骤过程中，HbA不经历任何可检测到的自动氧化而产生met-Hb型产物。PEG化Hb样品可贮存于-80℃长达至少1年而不经历任何自动氧化。

[0061] (iv)对由于Hb保守性PEG化作用而致的Hb大小增加进行定量.把纯化的(PEG-5K)6-Hb的洗脱模式与使用双马来酰亚胺苯基PEG-600在四聚体间交联桥的αα-富马酰Hb的洗脱模式进行了比较。(图3，插图，b和a)。如前面所述的，保守性PEG化Hb-(PEG-5K)6-Hb，稍小于(PEG20K)2-HbA，但高于(PEG10K)2-HbA。它的流体动力学体积对应于分子量大约250,000道尔顿的球状蛋白的流体动力学体积。由于其上的PEG质量为～
30,000，因此计算的分子量只有95,000道尔顿。但它的流体动力学体积对应于分子量为
250,000的蛋白的流体动力学体积。因此，以6个拷贝的PEG-5000链引入30,000质量到Hb上，等同于整合近180,00质量的球状蛋白到Hb上。从而，PEG显示出增加Hb流体动力学体积的潜能，其大约为紧密包装的球状蛋白的6倍。该结论与Manjula et al(2002)最近从他们的PEG化作用研究中得到的相似，其中PEG化作用位点限于Cys-93(β)，获得大小增加作为使用的PEG-马来酰亚胺中PEG分子大小的函数。从而作为PEG化作用的结果发生的大小增加显示与连接到Hb上的总PEG-质量直接相关，而且当PEG质量以不同拷贝数呈现时是累加的。

[0062] 通过新的巯基化作用介导的基于马来酰亚胺化学的PEG化作用方案产生的(PEG5K)6-HbA的大小排阻色谱模式，与Enzon(PEG5K)10-Bv-Hb(一种非血管活性的PEG化的Hb)的大小排阻色谱模式进行了比较(图3插图，曲线c)。该物质在分子大小分布方面也相当均一，正如(PEG-5K)6-Hb那样。该PEG化的Hb具有每个四聚体10个拷贝的PEG-5000(总PEG-质量为50,000)，并因此预期具有比(PEG-5K)6-Hb更高的大小增加。然而，对该Hb观察到的大小增加不如对(PEG-5K)6-Hb观察到的那么多。这种异常的分子基础现阶段不是很显而易见的。另一方面，鉴于每个四聚体的PEG质量与(PEG-5K)6-Hb中的相当这一事实，PHP，每个四聚体携带10个拷贝的PEG-3000的另一种PEG化Hb，将期望具有与(PEG-5K)6-Hb相当的流体动力学体积。PHP是非常不均一的(图3，插图，曲线d)。它携带一些量的大小增加小于(PEG-5K)6-Hb的物质，和一些大小增加与(PEG-5K)6-Hb相当的物质，以及一些大于(PEG-5K)6-Hb的物质。双功能PEG-3000用于表面装饰，以及该样品中存在四聚体内和或四聚体间的交联，可能促成了PHP中高水平的不均匀性。

[0063] B)(PEG5)6-HbA的分子，依数和功能表征.

[0064] (i)(PEG5)6-HbA的1H-NMR光谱学.Hb的质子核磁共振光谱学是监控HbA的三级和四级结构改变的极好的工具，其中该变化在任何给定情景中伴随着化学修饰或突变。Cys-93(β)位于分子的构象敏感区域，Cys-93(β)对巯基特异性试剂的反应性是分子氧构象的独特特征，在脱氧结构中它是非反应性的。图4A对一氧化碳和脱氧形式的(PEG20)2-HbA和(PEG5)6-HbA与HbA于pH 7.0，29℃在0.1M磷酸缓冲液中的质子NMR光谱进行了比较。这两个样品每个四聚体中几乎相同量的PEG质量[(PEG20)2-HbA中40,000对(PEG5)6-HbA中30,000]。除了对PEG化样品由于Hb的PEG化作用的结果而致的分子大小的增加而观察到了较宽的共振外，在光谱范围10到14ppm的化学位移上没有显著差异，表明利用PEG-20,000仅仅在Cys-93(β)处或者利用PEG-5000在Cys-93(β)和Hb的至少4个其它的ε-氨基处进行Hb的PEG化的结果，蛋白的α1β1界面没有改变。图4B对两种PEG化Hb的环流-位移(ring-current-shifted)质子共振，与一氧化碳形式的HbA的环流-位移质子共振进行了比较。环流位移质子共振中有某些改变，反映了在PEG化Hb样品的血红素的微环境中的某些扰动。图4C显示了脱氧形式的PEG化Hb的α和β-链的
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近端组氨酸残基的超精细位移的NδHH共振。在-75ppm处的化学位移，其归于β-链的近端组氨酸的NδH，向前场位移了-2到-3ppm，其反映PEG化样品中β-血红素环境的扰动。
这种向前场位移在(PEG20)2-HbA中稍微比(PEG5)6-HbA更显著。图5D对两种HbA的PEG化样品与脱氧形式的HbA的超精细位移和可交换质子共振进行了比较。超精细位移的共振比HbA的更宽。此外，在16到24ppm的光谱范围内有一些共振改变，其反映了作为分子PEG化作用的结果，Hb的β-血红素的微环境的改变。14ppm处的共振，其归于α1β2亚基界面中α-Tyr(42)与β-Asp(99)之间重要的H-键，在PEG化样品中没有改变。因此，在PEG化Hb的α1β2亚基界面没有改变。

[0065] (ii)(PEG5)6-HbA的分子半径.通过动态光散射测定(PEG5)6-HbA的分子半径，并与我们前面测定的(PEG5)2-HbA和(PEG20)-HbA的分子半径进行比较(参见表I)。(PEG5)6-HbA的分子半径为大约6.8nm。该分子半径稍小于(PEG20)2-HbA的，(PEG20)2-HbA的分子半径先前估计为7.04。(PEG5)2-HbA和HbA的值分别为4.2和3.1。因此，当用大约
6个拷贝的PEG-5K链进行表面装饰时，HbA的分子半径超过加倍，即使加到该蛋白上的质量为仅仅大约30,000。从而(PEG5)6-Hb显示了增加的分子大小，其为对分子量为94,000的球状蛋白所预期的，而且在该Hb的大小增加区域的PEG的包装不象在蛋白核心一样致密。Enzon PEG Bv-Hb(其分子量为114,000)的分子半径小于(PEG5)6-Hb，为5.53nm，接近(PEG-10K)2-HbA和(PEG-5K)4-狗Hb的分子半径。还可注意到利用Mal乙基PEG-5000产生的(PEG5)6-Hb的分子半径差不多比利用Mal-Phe-5000产生的小10％。(PEG-10K)6-Hb的分子半径为大约9.8，因此需要使用更高分子大小的PEG来获得分子半径大于用(PEG-5K)6-HbA获得的7nm的PEG化Hb。

[0066] (iii)通过保守和非保守PEG化作用方案产生的PEG化Hb的分子密度比较.由于通过PEG化作用获得的大小增加(流体动力学体积增加)，几乎比在球状蛋白中的有效6倍(在同等质量的基础上)，意味着在增加体积的PEG化Hb中原子的分子密度低于紧密的球状蛋白中。在表I中也给出了增加分子体积的不同PEG化Hb中PEG的分子密度。随着连接到Cys-93(β)上的PEG的分子量从5000增加到了20,000，增加分子体积的Hb中PEG的分子密度几乎降低了50％。分子密度的降低意味着PEG-链间的相互作用降低，以及给定的PEG化Hb的PEG-壳内的溶剂分子的占据增加。当PEG壳内的PEG密度低时，可认为位于“蘑菇构象”中，而当PEG-壳中的密度高时，它可以被认为是处于“刷状缘构象”中，而且(PEG5)6-Hb中，PEG-壳的分子密度甚至小于(PEG20)2-Hb中的分子密度。另一方面，Enzon PEG Bv-Hb的PEG-壳的分子密度很高，表明其PEG-壳内的PEG-链之间的相互作用比(PEG5)6-Hb的PEG-壳中的PEG-链之间的相互作用强。该研究清楚地反映了，Enzon PEG化Hb与通过保守的PEG化技术产生的新PEG化Hb之间在PEG-链的包装上的差异。由保守的PEG化作用产生的样品可以被认为处于“蘑菇构象”，而Enzon PEG化样品处于“刷状缘样构象”。

[0067] (iv)(PEG5)6-HbA的依数性.图5比较了(PEG5)2-HbA与(PEG5)6-HbA的粘度作为蛋白质浓度的函数，其范围为1到10gm/dl。随着蛋白质的浓度从1gm/dl增加到10gm/dl，(PEG5)2-HbA的粘度只显示小的粘度增加，并且PEG化溶液的粘度显示与蛋白质浓度成正比。另一方面，即使(PEG5)6-HbA溶液的粘度与(PEG5)2-HbA的高度稀释溶液的粘度相当(1gm/dl)，前者的粘度随蛋白质浓度呈指数级增加。还显示了浓度为1到5gm/dl的携带10当量的PEG-5K链(通过异肽键连接到牛Hb的α和ε-氨基)的Enzon PEG牛Hb的粘度来进行比较。在所有研究的浓度，Enzon PEG牛Hb的粘度与(PEG5)6-HbA的粘度相当。该结果表明键的化学性质和PEG化作用的位点强烈影响PEG化作用，或者在存在每个四聚体6个拷贝的PEG-5K链时PEG化Hb溶液的粘度达到饱和值。

[0068] 图6显示了PEG化Hb样品的胶体血液渗透压，作为蛋白质浓度的函数。样品的胶粒渗透压增加，作为蛋白质浓度的函数。(PEG5)2-HbA的这种增加是小的，并且看起来随蛋白质的浓度(在1至6.8gm/dl范围内)线性增加。另一方面，(PEG5)6-HbA溶液的胶粒渗透压随增加的蛋白质浓度而指数级增加。同样，当浓度匹配时，Enzon(PEG5)10-Bv-Hb的胶粒渗透压与(PEG5)6-HbA的胶粒渗透压相当。该结果表明，PEG化Hb样品的胶粒渗透压与样品的粘度直接相关。

[0069] (v)(PEG5)6-HbA的功能特性.表I显示了50mM Bis-Tris/50mM Tris醋酸盐中，pH7.4以及37℃时，(PEG5)6-HbA的氧亲和力，以及在存在变构效应物时它的调节。随着HbA的PEG化作用，Hb的P50降低(增加的氧亲和力)，从对照值的8.0到6.5。存在5倍过量的DPG时，通过结合于ββ-裂缝而降低HbA的氧亲和力的效应物对其氧亲和力没有显著影响。另一方面，存在1M氯化钠会稍微降低PEG化Hb的氧亲和力(P50从6.5增加到8.5)，并与缺乏氯化物时未修饰的HbA相当。另一方面，未修饰的Hb的氧亲和力，在存在1.0M的氯化物时显著地降低。在存在L-35(通过结合于分子的αα-末端降低Hb的氧亲和力的变构效应物)时，增加的(PEG5)6-HbA的P50具有一定的氧亲和力降低影响，但是显著低于对未修饰的HbA观察到的。因此，巯基化作用介导的基于马来酰亚胺化学的PEG化HbA几乎完全抑制了HbA对DPG存在应答的倾向，并且强烈降低该分子对氯化物和L-35应答的倾向。

[0070] 还在PBS中测定了(PEG5)6-HbA的氧亲和力，因为处于循环中的样品的值应该与在PBS中的相当。与对照HbA(P50＝15mm Hg)相比，甚至在PBS中，(PEG5)6-HbA显示较高的氧亲和力(P50＝9.5mm Hg)。(PEG5)6-HbA的氧亲和力仅仅稍微高于(PEG5)2-HbA(P50＝11.8)的氧亲和力。因为(PEG5)6-HbA具有如(PEG5)2-HbA中一样修饰的Cys-93(β)，此外在HbA的赖氨酸残基的ε-氨基上进行了另外的修饰，氧亲和力结果表明HbA的ε-氨基的巯基化作用介导的PEG化作用本身不显著地影响Hb的氧亲和力。利用马来酰亚胺-乙基-PEG5K对HbA进行巯基化作用介导的表面装饰：商业可获得的马来酰亚胺PEG-试剂在马来酰亚胺部分与PEG-链之间具有烷基间隔连接。为了建立这里开发的新PEG化方法对马来酰亚胺烷基PEG试剂的一般原则，我们在巯基化作用介导的基于马来酰亚胺化学的反应中用Mal-乙基-PEG5K代替Mal-Phe-PEG5K。HbA与该PEG的反应也象期望的那样进行，除了反应效率稍微降低外。产生的并期待携带平均6个PEG-链的产物[(SE-PEG5K)6-HbA]，产生类似于(SP-PEG5K)6-HbA的凝胶过滤模式，除了在凝胶过滤上有点延迟洗脱外。此外如表2中所示，(SE-PEG5K)6-HbA的分子半径稍微小于(SP-PEG5K)6-HbA的分子半径。

[0071] B.(PEG5K)6-HbA的高血压活性

[0072] (i)在仓鼠中通过10％最大负荷实验进行研究.通过在仓鼠皮褶窗模型中进行10％最大负荷实验中，测量平均动脉压以及测量小动脉的直径(A2)，研究了以2个和6个拷贝的PEG5K链进行PEG化作用后Hb的血管收缩活性的改变。如图7A所示，(PEG5K)2-HbA灌输引起在几分钟内消退的血压的立即增加。另一方面，(PEG5K)6-HbA的样品在相同的期限内没有引起血压的改变。图7B比较了用10％的最大负荷的(PEG5K)2-HbA与(PEG5K)6-HbA溶液灌输仓鼠不同时间期限之后的动脉直径。(PEG5K)6-HbA样品保留了比(PEG5K)2-HbA样品更接近起始值的肺泡直径。这些分析证实了无细胞Hb PEG化到6个拷贝PEG5K链的水平抑制了无细胞Hb的内在血管活性至显著水平。

[0073] (ii)用(PEG5K)6-HbA进行50％换血对仓鼠中功能性毛细血管密度的影响.图8描绘了在用(PEG5K)6-HbA进行50％换血的仓鼠中毛细血管血流，并与用对照(无换血)以及用αα-富马酰HbA进行50％换血的毛细血管血流进行比较。由此，显然用(PEG5K)6-HbA进行50％换血的仓鼠保持了高的毛细血管密度，而αα-富马酰HbA显著地降低了功能性毛细血管密度。因此，用PEG-5000链对Hb进行表面装饰可以中和无细胞Hb的内在血管收缩活性。

[0074] III.讨论

[0075] 已经开发了一种通过PEG化作用增强Hb的分子大小而不改变该蛋白质的表面电荷的新的，简单并灵活的方案。这包括在氧或脱氧条件下通过与亚氨基四氢噻吩反应活化Hb的一组ε-氨基作为PEG马来酰亚胺反应性位点(巯基化作用)，然后用所需的PEG-马来酰亚胺修饰巯基化Hb。该方法已经最佳化以产生携带6个拷贝的PEG-5000的PEG化Hb，而且已经发现这是不致高血压的。

[0076] 缺乏亚氨基四氢噻吩时，利用PEG-马来酰亚胺在氧条件下进行Hb的PEG化作用限于对Cys-93(β)的修饰，也即，每个四聚体2个拷贝。该PEG化的Hb显示与分子量为128KDa的球状蛋白质相当的流体动力学体积。其他的4个半胱氨酸残基被掩盖，并且不能在使用的反应条件下与PEG马来酰亚胺反应。Cys-93(β)也不能用于与PEG-马来酰亚胺反应。

[0077] 以亚氨基四氢噻吩浓度依赖性方式，亚氨基四氢噻吩激活Hb的一些ε-氨基作为PEG-马来酰亚胺的反应位点。亚氨基四氢噻吩，γ-巯基butyrimidate的环化形式，不携带游离的巯基，并且一旦它与ε-氨基反应就原位产生巯基。经其与Hb反应，衍生一组酰胺化物反应性ε-氨基作为γ-巯基butyrimidinyl部分，在远端具有游离的-SH基团。ε-氨基的内在正电荷在该衍生的ε-氨基中得以保存。这些新的外在巯基为官能化作为马来酰亚胺的所需分子大小的PEG-链附着所靶向的位点。然而，利用PEG与马来酰亚胺之间的烷基接头或烷基酰胺接头把PEG官能化作为马来酰亚胺的其他方法是同样有效的PEG化剂，也即，该PEG化反应是基于马来酰亚胺化学作用的。这种PEG化作用的方法因此具有保留PEG化Hb中的Hb的净电荷的优点。

[0078] 与10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩一起孵育的氧Hb几乎激活Hb的5个ε-氨基作为PEG-马来酰亚胺反应位点。当20倍摩尔过量的PEG-马来酰亚胺与10倍摩尔过量的亚氨基四氢噻吩一起存在时，产生具有平均6个PEG5K-链的PEG化产物[(PEG5)6-Hb]。引入的6个PEG-链中的2个位于Cys-93(β)的巯基上，其余的位于Hb的巯基化Lys残基上。携带6个PEG-5000链的Hb看起来产生了一定程度的对引入另外的PEG-5000链的抗性。是否这反映了Hb上一定程度的均一表面覆盖，遮蔽了通过亚氨基四氢噻吩激活的Hb的其他表面α-氨基的巯基使其不能与PEG马来酰亚胺反应，暂时还不清楚。

[0079] 计算的(PEG5)6-Hb的质量为～94Kda。然而，在大小排阻色谱法中，(PEG5)6-Hb的行为如同它的分子大小为250kDa数量级，即(PEG5)6-Hb显示了相当于分子量为～250KDa的球状蛋白质的流体动力学体积。因此，在球状蛋白质的分子尺度上，PEG链增加了Hb的流体动力学体积，分子体积几乎为球状蛋白质的6倍。

[0080] 早先利用PEG-马来酰亚胺产生的PEG化Hb的分子体积的增加，与在目前研究中用赋予这种大小增加的PEG质量所产生的PEG化Hb的分子体积的对比表明，在每种产物内PEG-链的包装是不同的。在以前的位点特异性PEG化产物研究中，PEG-链的分子量增加降低了增加大小的Hb分子的PEG-壳中的PEG的分子密度。这可以解释为PEG链的分子大小锚定于2个Cys-93(β)，它们之间可以彼此相互作用，从而增加其中PEG-链存在于分子运动中的分子体积(蛋白质周围的PEG壳)。当由6个PEG-5000链产生Hb周围的PEG-壳时(2个位于Cys-93(β)上，其它的4个位于亚氨基四氢噻吩激活的α-氨基上)，仿佛达到用于它们的分子运动的最大空间。对(PEG10)6-Hb进行初步计算，表明在其内PEG-链弯曲的分子空间具有与(PEG5)6-Hb的PEG-壳相当的分子密度，或可能甚至比(PEG5)6-Hb更低的密度。

[0081] 一个惊奇观察是Enzon PEG Hb的PEG-壳的分子密度显著高于(PEG5)6-Hb的PEG-壳的分子密度的事实。这2种PEG化Hb利用两种非常不同的化学作用组装。本发明的PEG化作用利用保守的方案进行，因此Hb分子的净电荷保留在PEG化产物中，即在PEG化Hb中蛋白质的水化层应当经历有限的微扰。Enzon PEG化作用利用非保守性方法进行，其中衍生的α与a氨基的原始正电荷不保留在最终产品中。因此，该方法预期会扰乱蛋白质的水化壳。无论分子基础是什么，这两种方法看起来已经产生了Hb周围的PEG-壳，其具有在禁闭Hb分子的PEG-壳内的非常不同的PEG-链结构(分子密度)。

[0082] 利用马来酰亚胺-乙基-PEG 5000产生的(PEG5)6-Hb的PEG-壳的分子密度高于利用马来酰亚胺-苯基-PEG 5000产生的(PEG5)6-Hb的PEG-壳中的分子密度，但是不象Enzon PEG-Hb的PEG-壳中的分子密度一样高。描述PEG与官能化基团之间的缀合连接与间隔键的锚定位点处PEG-链的化学作用位于三种产物中，下面用图解法比较了琥珀酰亚胺基苯基PEG化Hb，琥珀酰亚胺基乙基PEG化Hb和乙酰氨基PEG化Hb。马来酰亚胺苯基PEG化Hb和马来酰亚胺乙基PEG化Hb都具有作为共同的分子实体的活化臂(γ-巯基丁酰亚胺基)，缀合基团(琥珀酰亚胺基)。Mal-Phe-PEG试剂具有作为PEG链与缀合臂之间的接头的苯基乙基氨基甲酸酯，而Mal-乙基-PEG试剂具有乙基接头。因此，在前者的情况下，利用较长的接头链，而且在该接头中存在苯基，使链在该锚定部分较刚性，而在后面的使PEG链连接到Hb上的情况中，缺乏苯基环产生更高程度的旋转自由。另一方面，Enzon PEG-Hb没有活化臂，由此其PEG-链更接近蛋白质表面。它具有作为缀合基团的乙酰胺基部分，没有缀合单元与PEG-链之间的连接基团。因为缀合臂的异肽键期望具有部分双键特性，还可以预期该PEG化作用的化学方法内在的一定程度的刚性。因此，在Enzon策略中(保守的PEG化方法)，使PEG很接近蛋白质表面(离ε-氨基的原始正电荷2到 内)，而巯基化作用介导的基于PEG马来酰亚胺的PEG化作用使PEG-链位于离蛋白质表面有一段距离处(在延伸构象中远离ε-氨基的原始正电荷大约15到 )。因此，保守的PEG化作用产生的PEG-壳可以具有蛋白质核心与PEG-壳之间有明显边界的Hb水合球面。这表明PEG化Hb的PEG-壳内的PEG的分子密度与连接化学作用(PEG与马来酰亚胺之间的连接)和偶联化学作用-PEG与Hb侧链之间的连接均相关。

[0083] 本发明重要发现是(PEG5K)6-Hb是不致高血压的。(PEG5K)6-Hb的物理/化学特性导致中和了无细胞Hb的内在致高血压活性。(PEG5K)6-HbA无疑是一种大小增加的Hb分子。增加Hb的分子大小是发展用于克服Hb的高血压活性的早期设计策略之一，其基于Hb外渗到胞间隙中的观念，并且因此将在捕获NO方面比在血浆中循环的Hb更有效。这种观念似乎得到250KDa范围内的分子大小的低聚化Hb较少血管活性的观察结果的支持。有趣的是注意到，Matheson等最近已经生产了分子大小远远超过300kDa，并且平均分子半径24nm(半径分布在12-33nm之间的不均一产品)的低聚化产物，其不出现在肾门淋巴中，指示缺乏外渗。该产物也完全抑制了升压反应。Sakai的观察证明分子大小与升压效应度之间的相关性，升压反应的程与分子大小成反比。直径接近1000nm的包囊的Hb不产生血管收缩。然而，(PEG5K)6-Hb的分子大小仅仅为大约7nm，与处于临床试验的许多目前的低聚化Hb的分子大小相当。因为这些中的大多数显示不同程度的血管收缩，大小增加本身不会是使(PEG5K)6-Hb不致高血压的主要因素。

[0084] 然而，本发明的保守PEG化Hb，携带平均6个拷贝的PEG-5000链，是不致高血压的，并且显示出接近Enzon PEG-Hb的粘度与胶粒渗透压的事实，揭示了本发明的新的保守的PEG化技术的一些潜在的优点。(i)具有每一四聚体6个拷贝的PEG-5000链的Hb的保守PEG化作用，产生的大小增加(增加流体动力学体积)优于以10个拷贝的PEG-5000链对牛Hb的非保守PEG化作用所产生的大小增加。(ii)保守的PEG化作用增加流体动力学体积的较高效率表明，PEG-链在Hb的分子表面上的包装密度较低。这与Hb分子周围的PEG-链产生的新水化壳(充水的外壳)中PEG的计算分子密度一致。(iii)保守的PEG化作用技术比非保守PEG化作用更高效地增加了粘度和胶粒渗透压；当对共价结合到Hb上的PEG-5000链标准化比较时这显而易见。这表明在测定与用PEG进行表面装饰有关的粘度变化中，在通过PEG化作用在Hb周围产生的新PEG壳中PEG的分子密度的可能作用，以及它们产生不致高血压的Hb分子的倾向。

[0085] 基于Hb的载氧体的早期设计企图模仿红细胞的氧亲和力，以具有低的氧亲和力。Enzon选择牛Hb产生PEG化Hb，将赋予最终产物低氧亲和力。虽然牛Hb的氧亲和力径非保守性PEG化作用增加，本发明保守地PEG化Hb的氧亲和力显著高于Enzon PEG化Hb的氧亲和力。自动调节理论显示，当灌输低氧的基于Hb的载氧体时，发生血管收缩作为循环的动脉侧过量供氧的结果。预计通过增加基于Hb的载氧体的氧亲和力可以减少血管收缩。
(PEG5K)6-HbA的氧亲和力高于Enzon PEG-Hb的氧亲和力，而且本发明仅具有6个拷贝的PEG-5000链的保守PEG化Hb的不致高血压的方面(与具有稍微低于本发明保守PEG化Hb的氧亲和力的Enzon PEG-Hb中10个拷贝的PEG-5000相比)可能是本制品的较高的氧亲和力的贡献的反映。因此我们推测(PEG5K)6-Hb的不致高血压的特性是多因素事件，而且要求设计多种Hb，其模仿Hb的仅仅一个物理或功能特性，并建立这些分子的血管活性。

[0086] (PEG5K)6-Hb-保守地PEG化Hb具有许多这些年来已经发展的最小化无细胞Hb的血管活性所需要的属性：(i)Hb氧亲和力增加以限制无细胞Hb在血管活性小动脉中的氧卸载；(ii)保留协同结合以确保毛细血管床中的氧卸载；(iii)增加的分子大小(流体动力学体积)以减少外渗；(iv)Hb溶液的粘度增加以在小动脉壁上产生适当的剪切应力，并降低对于氧Hb，和氧，二氧化碳和/或一氧化氮的扩散常数；和(v)比传统修饰的Hb增加的胶体渗透压，其增加了血液代用品的有效性，作为一种在许多血浆扩容剂的制剂中特色设计的血浆扩容剂。因此，(PEG5K)5-Hb的观察结果是不惊奇的。

[0087] 虽然赋予(PEG5K)6-Hb的多种物理参数和功能特性的本性现阶段是不明确的，该新的保守地PEG化Hb应该被认为是一类新的基于Hb的载氧体的成员，其远离开发基于Hb的载氧体的常规设计策略。这里也应该注意，赋予一组依数性质和氧亲和力本身不足以使Hb分子不致高血压。如同Manjula等最近所示的，增加高氧亲和力(其氧亲和力与(PEG5K)6-Hb的氧亲和力相当)PEG化Hb[在Cys-93(β)处位点特异性地PEG化]的分子体积，其粘度和胶粒渗透压增加，但是在Hb的血管活性方面没有任何显著的变化。另一方面，每一四聚体低于(PEG20)2-Hb的PEG-链净重的(PEG5K)6-Hb是不致高血压的。相对于2个拷贝的PEG-20K所提供的，6个拷贝的PEG-5K链对Hb的分子表面的更好的保护可能是对该观察结果最好的解释。这提出了一个重要的问题，即PEG-5K链在Hb的分子表面上的位置是否在实现对Hb分子表面的保护中起任何作用，倘若如此这可能是由亚氨基四氢噻吩介导的Hb的巯基化作用提供的。鉴定通过亚氨基四氢噻吩巯基化的Hb的位点，并制备具有明确限定PEG-5000链拷贝数的位点特异性PEG化Hb对于洞察PEG化反应的这一方面是关键性的。因为Enzon PEG化Hb-不致高血压的Hb的第一个实例属于携带10个PEG-链的PEG化类别，当非保守性的方法用于产生PEG化Hb时，是否需要较高水平的Hb的PEG化作用来产生不致高血压的Hb，以及产生不致高血压的Hb所需的PEG化作用、氧亲和力的最佳水平是什么，都还是不清楚的。

[0088] 具有PEG-5000链的分子的亚氨基四氢噻吩依赖性巯基化作用介导的基于PEG-马来酰亚胺的以PEG-5000链对分子进行表面装饰克服了在发展基于Hb的载氧体方面目前主要的障碍，即无细胞Hb的致高血压活性。这里开发的PEG化作用技术很简单，可以在氧条件下进行，而且不包括麻烦的色谱分析提纯方法来分离PEG化的Hb。在该设计中，保守的PEG化作用技术，专门考虑了用于最小化副反应的问题，尤其是与酰化反应-用于开发Enzon PEG化Hb的非保守性PEG化反应相比。亚氨基四氢噻吩对Hb的ε-氨基的脒化作用的选择性，高效率的衍生作用，显著高于利用活性酯或者酐对α和ε-氨基的酰化，是这种新PEG化方法的一些有利的方面。亚氨基四氢噻吩以及PEG-马来酰亚胺的稳定性显著高于PEG-酸的琥珀酰亚胺基活性酯和酸酐。因此，通过亚氨基四氢噻吩介导的保守性巯基化作用引入给定数目的PEG-链所需的过量PEG-马来酰亚胺，将显著低于在用于产生早期类型的不致高血压的PEG化Hb的非保守性PEG化方法中所需的过量PEG-马来酰亚胺。通过该技术生产不致高血压的Hb分子不需要复杂的脱氧作用装置。因此，该新PEG化技术用于产生不致高血压的Hb是很经济合算的。

[0089] 表I：用Mal-Phe-PEG进行PEG化的HbA的分子大小

[0090]

[0091] 表II：(PEG5K)6-HbA的氧亲和力及其通过变构效应物的调节

[0092]

[0093] 样品的氧亲和力利用Hem-O-scan在50mM Bis-tris/50mM tris醋酸盐，pH 7.4中于37℃测定。蛋白质浓度保持在大约0.6mM。

[0094] 分析的样品具有低于2％的met Hb。

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[0128] 这里上述提到的所有出版物，无论是授权的专利，待审申请，出版论文，或者其它的，在此以其全部引入作为参考。为了清楚和理解的目的，对上述发明已经进行详细描述，本领域的技术人员应当理解，通过阅读公开内容，可在形式和细节上进行各种改变，而不背离所附权利要求中本发明的真实范围。