用于光动力治疗的水溶性单-PEG化四吡咯衍生物及其制备方法

摘要

本发明说明书中公开了通式1，2或3的水溶性单PEG化四吡咯衍生物。还公开了制备上述水溶性单PEG化化合物的方法，包括四吡咯与含有功能化末端片段的氨基聚乙二醇的相互作用，以及其作为光动力治疗中的光敏剂的应用。

权利要求

1.水溶性单PEG化四吡咯衍生物，为以下通式(2)：其中B是具有如下结构的环：其中：

1

R ＝-CH＝CH2，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，和-CH2CH2CH(OH)CH3，2

R ＝-CH3，

6

R ＝H，

7 8 9 10 11 9 10R ＝-NR-R-R ，-NH(CH2)m-R -R-R ，8

R ＝H，

9

R ＝-(CH2CH2O)nCH2CH2-，

10 14 14

R ＝-OH，-OMe，-NH2，-COR ，-OCH2COR ，

11 8

R ＝-CH2CONR-，-NHCOO-，和

14

R ＝-OH，-OMe，-NH2，其中：

m＝2-12，

n＝8-500。

2.生产权利要求1的水溶性单-PEG化四吡咯衍生物的方法，包括四吡咯与含有功能化末端片段的氨基聚乙二醇反应的步骤，其中所述四吡咯为以下通式(7)：其中B是具有以下结构的环：其中：

R1＝-CH＝CH2，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，和-CH2CH2CH(OH)CH3，R2＝-CH3，R6＝H，

R15＝-OH，-NH(CH2)m-R16，和R16＝-COOH，-NH2，其中

m＝2-12，

并且其中所述功能化的末端片段选自-OH，-OMe，-NH2，-COR14和-OCH2COR14，其中R14＝-OH，-OMe，-NH2。

3.权利要求2的方法，其中所述含功能化末端片段的氨基聚乙二醇的分子量为

500-30,000。

4.权利要求1的水溶性单-聚乙二醇化四吡咯衍生物在制备用于光动力治疗的药物中的应用。

说明书

用于光动力治疗的水溶性单-PEG化四吡咯衍生物及其制

备方法

[0001] 发明背景

[0002] 1.发明领域

[0003] 本发明涉及生物学活性物质的化学性质，即，涉及一种制备水溶性单-聚乙二醇化四吡咯衍生物的新方法，尤其是二氢卟酚，菌绿素，脱镁叶绿甲酯酸和1，2和3型细菌叶绿甲酯酸衍生物。本发明的化合物可被用作癌症，感染及其他疾病的光动力治疗的光敏剂，以及在其它情况下用于光辐射治疗的光敏剂。

[0004]

[0005] 其中B是具有以下结构的环：

[0006]

[0007] 其中：

[0008] R1＝-CH＝CH2，-CH(OAlk)CH3，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，-CH(Alk)CH(COAlk)2，-CH2CH(COAlk)2，-CH(Alk)CH2COAlk，-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3和-CH2CH2CH(OH)CH3；

[0009] R2＝-CH3，-CHO，-CH(OH)Alk，-CH＝CHAlk，CH2OH和CH2OAlk；

[0010] R3＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，-NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；

[0011] R4＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，-NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；

[0012] R5＝OH，-OAlk，-NH-Alk，-NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；

[0013] R6＝H和-COOAl k；

[0014] R7＝NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；

[0015] R8＝H和-Alk；

[0016] R9＝-(CH2CH2O)nCH2CH2-；

[0017] R10＝-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAcyl，-NAcyl2，-NR12R13，-COR14，-OCH2COR14；

[0018] R11＝-CH2CONR8，-NHCOO-；

[0019] R12＝H和-Alk；

[0020] R13＝H和-Alk；和

[0021] R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；

[0022] 其中

[0023] m＝2-12；

[0024] n＝8-500；和

[0025] Alk＝烷基取代基。

[0026] 2.发明详述

[0027] 光动力治疗(PDT)是目前被探索用于各种医学应用最有希望的新技术之一，具体是用于破坏肿瘤的精确识别治疗(E.D.Sternberg等，“用于光力学的治疗的基于卟啉的光敏剂”，Tetrahedron 54(1998)4151-4202)。

[0028] 提供了化合物在某种程度上必须满足的标准以有效用于PDT。(R.Bonnett，“光力学的治疗回顾”，Rev.Contemp.Pharmacother.1999，10，1-17)标准如下：

[0029] 1.活性反应组分的高量子产量，比如单态氧或自由基；

[0030] 2.对受体相对低毒性；

[0031] 3.被高波长照射(优选在光谱的红光或近红外区)作用激活的能力，其与具有较短波长的照射作用相比能更深入渗透进入组织；

[0032] 4.由与给定的病理情况相关的细胞选择性的积累和从未受病理情况影响的组织迅速清除；

[0033] 5.结合到大分子载体的潜力，而保持光致敏作用功效的特征，和

[0034] 6.在合适的溶剂中的溶解性以促进对病人的给药和生理吸收和在病人身体之内的转运。

[0035] 四吡咯是广泛用于PDT的化合物。四吡咯药物应用较重要的问题是它们在生理溶液中的低溶解度。这使得难以制备用于PDT及其他应用的有效的药物等级注射溶液。

[0036] 制备用于PDT的水溶性的四吡咯衍生物的方法是现有技术已知的，Smith等的美国专利5,330,741公开了制备赖氨酰基二氢卟酚p6三钠的方法，包括在吡啶存在的条件下来自甲基脱镁叶绿甲酯酸a转化的红紫素18甲酯和含水赖胺酸的二氯甲烷溶液之间的反应。所述混合物在室温下搅拌12小时，继之以在高真空条件下除去溶剂。如此制备的粗制品通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化并随后冻干。为制备用于癌症PDT的可注射的溶液，所述制剂首先溶于磷酸盐缓冲液然后添加0.1N的氢氧化钠。所述溶液的pH值使用0.1N HCl被调整为pH 7.35，随后通过微孔滤器无菌过滤。上述方法的缺点包括缺少可重复性和逐渐完成(work-up)的困难以及毒性试剂的使用，使得难以适合于药物制造。另外，制备的所需水溶性产物在水溶液中在暗处4℃仅24小时是稳定的，以及以固态在4℃在暗处直至4个月是稳定的[M.W.Leach，R.J.Higgins，J.E.Boggan，S.-.-J.Lee，S.Autry，K.M.Smith，赖氨酰基二氢卟酚p6/二氢卟酚p6混合物在大鼠中皮下9L胶质瘤的光力学的治疗中的功效。Cancer Res.，1992，52，1235-1239；美国专利5,330,741]。

[0037] Nakazato的美国专利5,378,835描述了制备水溶性脱镁叶绿甲酯酸a(4)钠盐的方法。依据该发明，脱镁叶绿甲酯酸a(5)溶于二乙醚，正丙醇、异丙醇或其混合物的很稀的碱性溶液被逐滴和缓慢加入到所述溶液。所述反应持续到完成脱镁叶绿甲酯酸a盐(4)沉淀完成，其通过离心分离并真空干燥。然后所述产品溶于水中得到浓度0.5％和pH9.2-9.5的溶液，其然后用pH 7.4-7.8的磷酸盐缓冲液稀释。Nakazato描述的方法的缺点是通过该技术不能产生浓缩的(＞1％)的可注射的脱镁叶绿甲酯酸a水溶液。另外，本发明的作者注意到这种盐当干燥存储时的化学不稳定性，以及它们在以干燥状态存储之后不能完全溶于水。

[0038]

[0039] G.V.Ponomarev等的Russian专利RU 2144538公开了通过多步骤顺向化学反应制备具有大规模的有机胺包括N甲基-D-葡糖胺的二氢卟酚e6(6)水溶性复合物的方法，包括从螺旋藻属(Platensis)蓝藻细菌生物量制备叶绿素A，进一步根据标准方法转化为二氢卟酚e6[S. ，P.H.Hynninen，用于制备(10R)和(10S)-脱镁叶绿素a和b的改进的方法，Synthesis 1983，705-708；P.H.Hynninen，S. 从叶绿素混合
物利用优选水解原则制备脱镁叶绿环衍生物，Synthesis.1980，539-541；S.
P.H.Hynninen，用于制备湿的二氢卟酚e6和rhodin g7三甲基酯的便利方法，Synthesis，
1980，541-543]，通过逐步添加水到其丙酮溶液中沉淀二氢卟酚e(6)，随后通过离心分离并用水洗涤3次和用2g-eq大规模的有机胺的水溶液处理湿的二氢卟酚e6总回收率超过
50％。使人遗憾的是根据上述方法制备的二氢卟酚e6的水溶性盐样品包含各种非-四吡咯杂质和不能与目标二氢卟酚e6产品使用常规方法分离的四吡咯类型的杂质。

[0040] 一种制备高纯度药物等级水溶性四吡咯衍生物的方法包含步骤：一个或两个直接酸式醇解生物原料产生结晶性的烷基脱镁叶绿甲酯酸的步骤，转化获得的烷基脱镁叶绿甲酯酸为脱镁叶绿甲酯酸，并将后者与亲水性的有机胺在选自水和含水有机溶液的介质中反应(Nifantiev等的美国专利申请10/151,764)。所述亲水性有机胺选自N-甲基-D-葡萄糖胺，氨基烷基葡萄糖苷，三(羟甲基)氨基甲烷(“TRIS”)和其衍生物，氨基酸和寡肽。

[0041] 通过聚乙二醇化获得用于药物应用的水溶性化合物，即通过直接的或间接的(通过接头)连接聚乙二醇链(PEG)，是本领域公知的技术。PEG是非毒性的，增加药物分子的水溶性，并改变生物分散度，其可以导致有利的药物动力学特性(Bradley等的国际申请WO01/66550)。

[0042] 用于PDT的水溶性聚乙二醇化化合物公开在Sinn等的美国专利5,622,685中，其中所述化合物具有至少两个酚式羟基和/或氨基，至少一个脂族氨基，或至少一个酚式羟基和/或氨基和至少一个脂族氨基，并且这些基团被聚乙二醇链取代，聚乙二醇聚合度n是5到250并且其末端羟基被C1-C12烷基酯或醚取代，各物质被至少两个这种聚乙二醇链取代。美国专利5,622,685也描述含有通过接头连接的PEG链的化合物，其中所述聚乙二醇链通过生物学非可水解的或不良水解的接头连接。

[0043] 与本发明最接近的是Sinn等的U.S.专利6,147,207公开的方法，题为“用于生产含有聚醚的二氢卟酚和菌绿素的方法”。所述方法包括聚醚与卟啉的结合和含有聚醚的卟啉通过还原剂的转化。在本发明优选实施方案中，所述聚醚是聚乙二醇(PEG)。所述方法主要的缺点是由于所述方法的化学物质只可以获得很有限数量的化合物。此外，所述申请(以及Sinn等其它的申请)公开了二-，三或四-聚乙二醇化化合物，而不是单聚乙二醇化化合物。在实践中有可能只得到含PEG残基的化合物的异构体和寡聚体的复杂混合物。这个事实使得药物产品的制备所必须的可靠的定量分析和质量控制几乎不可能。此外，美国专利6,147,207公开了带有只可以用OH和OMe基终止的PEG链的产品的制备，因此限制了获得的化合物的实际用途。

[0044] 因此需要提供用于光动力治疗新的水溶性单聚乙二醇化四吡咯衍生物，和提供生产这种水溶性单聚乙二醇化化合物的容易的和有效的方法。本发明满足这些需要。

[0045] 发明目的和发明简述

[0046] 本发明的一个目的是提供用于癌症，感染及其他疾病光动力学治疗(PDT)的改进的光敏剂。

[0047] 本发明的另一个目的是提供水溶性四吡咯衍生物，其能被用作PDT的光敏剂并经延长的时间期限而仍然稳定。

[0048] 本发明的又一个目的是提供用于制造用于PDT的改进的水溶性四吡咯衍生物的可重复的有效方法。

[0049] 简单地说，此处提供的是生产水溶性单聚乙二醇化四吡咯衍生物(1)-(3)的方法，包括化合物(7)-(10)之一与含有功能化的末端片段的氨基聚乙二醇的反应。化合物(7)-(10)提供如下：

[0050]

[0051] 其中B是具有以下结构的环：

[0052]

[0053] 其中：

[0054] R1＝-CH＝CH2，-CH(OAlk)CH3，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，-CH(Alk)CH(COAlk)2，-CH2CH(COAlk)2，-CH(Alk)CH2COAlk，-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3，和-CH2CH2CH(OH)CH3；

[0055] R2＝-CH3，-CHO，-CH(OH)Alk，-CH＝CHAlk，CH2OH，和CH2OAlk；

[0056] R3＝-OH，-OAlk，-NH-Alk；

[0057] R4＝-OH，-OAlk，-NH-Alk；

[0058] R5＝-OH，-OAlk，-NH-Alk；

[0059] R6＝H和-COOAlk；

[0060] R15＝OH，-NH(CH2)m-R16；

[0061] R16＝-COOH，-NH2；

[0062] 其中：

[0063] M＝2-12；和

[0064] Alk＝烷基取代基。

[0065] 所述功能化的末端片段(指R10(参见通式(1)-(3))优选选自以下基团：

[0066] R10＝-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAcyl，-NAcyl2，-NR12R13，-COR14，-OCH2COR14，其中

[0067] R12＝H和-Alk；

[0068] R13＝H和-Alk；

[0069] R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；和

[0070] Alk＝烷基取代基。OAlk优选为OMe。含有功能化的末端片段的氨基聚乙二醇分子量为500-30000。

[0071] 还提供水溶性单聚乙二醇化四吡咯衍化物，选自以下：

[0072]

[0073] 其中B是具有下列结构的环：

[0074]

[0075] 其中：

[0076] R1＝-CH＝CH2，-CH(OAlk)CH3，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，-CH(Alk)CH(COAlk)2，-CH2CH(COAlk)2，-CH(Alk)CH2COAlk，-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3，和-CH2CH2CH(OH)CH3；

[0077] R2＝-CH3，-CHO，-CH(OH)Alk，-CH＝CHAlk，CH2OH，和CH2OAlk；

[0078] R3＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；

[0079] R4＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；

[0080] R5＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；

[0081] R6＝H和-COOAlk；

[0082] R7＝-NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；

[0083] R8＝H和-Al k；

[0084] R9＝-(CH2CH2O)nCH2CH2-；

[0085] R10＝-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAcyl，-NAcyl2，-NR 12R13，-COR14，-OCH2COR14；

[0086] R11＝-CH2CONR8-，-NHCOO-；

[0087] R12＝H和-Alk；

[0088] R13＝H和-Alk；

[0089] R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；

[0090] 其中：

[0091] m＝2-12；

[0092] n＝8-500；和

[0093] Alk＝烷基取代基，通过上述的方法获得。

[0094] 根据本发明的另一方面，公开了上述水溶性单聚乙二醇化四吡咯衍生物作为光敏剂在光动力治疗中的运用。

[0095] 本发明上述及其他目的，特征和优点将通过以下说明书和附图变得更加清楚。

[0096] 优选实施方式

[0097] 除非另外说明，这里使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域一般技术人员通常理解的意思一致。

[0098] 四吡咯是具有一个碳原子桥的大环化合物，连接四个吡咯单位和其改性的衍生物。有许多不同种类的四吡咯，包括那些含有二氢吡咯单元的四吡咯。这里使用的术语四吡咯指适合用于光动力治疗(PDT)和药物制剂的脱镁叶绿甲酯酸，细菌脱镁叶绿甲酯酸，二氢卟酚，菌绿素及其衍生物。

[0099] 这里使用的PEG指聚乙二醇链。本发明单PEG化的四吡咯衍生物是含聚乙二醇链的化合物，并通过四吡咯与含功能化的末端片段(FTF)的氨基聚乙二醇反应而获得(11-13)。该氨基聚乙二醇被称为PEG胺衍生物。

[0100]

[0101] 其中：

[0102] R10＝-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAcyl，-NAcyl2，-NR12R13，-COR14，-OCH2COR14；

[0103] R12＝H和-Alk；

[0104] R13＝H和-Alk；

[0105] R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；

[0106] m＝2-12；

[0107] n＝8-500；和

[0108] Alk＝烷基取代基

[0109] 作为本发明主题的产品的制备通过将(11)-(13)类型的PEG胺衍生物与各自的母四吡咯偶联而完成。为此，可以使用传统的将有机伯胺和仲胺连接到带有自由和激活的羧基基团的化合物上的方法，以及其他形成酰胺键的方便方法。当母四吡咯是脱镁叶绿甲酯酸的情况下，也可以使用通过打开环戊酮的环从而连接胺(11)-(13)的方法，如实施例3和6所示。

[0110] 这里使用的氨基聚乙二醇(11)-(13)可以包含在母聚乙二醇中存在的一个母OH基团，或其他位于氨基聚乙二醇链末端的功能化的末端片段(FTF，R10)。优选的FTFs选自OAlk，NH2，NAlk2，COOH，OCH2COOH，NHAcyl，NAcyl2(包括苯二酰亚氨基，马来酰(maleido)和其他环酰亚胺基团)。OAlk优选为OMe。

[0111] 当R10是能够在将四吡咯与氨基聚乙二醇偶联的条件下反应的基团时，选择合适选择改性的化合物(11)-(13)的类似物以在R10部分携带暂时的封闭基团，阻止四吡咯单位偶联到一起。尤其是，(11)-(13)(R10＝NH2)类二胺的使用需要使用过量二胺以避免将两个四吡咯单位连接到二胺上。由于将过量二胺与其和四吡咯的结合物目标产物层析分析的难度，这是不方便的。因此，在R10包含伯氨基或仲氨基基团的情况下，使用带有叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、三氯乙酰和其他合适的暂时N-封闭基团暂时N-取代的衍生物是优选的。

[0112] 相似的，从在取代基R10上带有羧基的PEG胺衍生物(11)-(13)制备本发明的化合物可以通过使用带有游离羧基，处于盐状态的羧基基团，或烷基酯状态的临时保护的羧基的衍生物(11)-(13)来进行，所述烷基比如甲基，乙基，叔丁基及其他惯用于保护羧基功能的烷基。

[0113] 本发明的单-聚乙二醇化化合物不仅具有高度水溶性，它们还具有在典型有机溶剂中良好的溶解性。这使得用柱及其他类型层析的可靠的纯化和用HPLC和TLC的分析成为可能。用于本发明产品层析的优选的有机溶剂包括惯例被用来纯化和分析有机化合物尤其是药物产品的氯化烃，醚，酯，乙腈，甲苯，丙酮，醇和其组合。

[0114] 适合的连接于聚乙二醇链的FTF的存在容许进一步化学修饰，包括通过各个带有标记，载体，蛋白质，分子载体及其他分子的FTF容易的结合作用。尤其是，实施例6描述了水溶性单-聚乙二醇化酯化合物的合成及其进一步通过皂化反应转化为各自的酸衍生物。

[0115] 本发明还提供了根据本发明生产的水溶性单-聚乙二醇化四吡咯衍生物在癌症及其他增殖异常疾病和感染的光动力治疗(PDT)中的应用。PDT通过将衍生物引入到药物可接受的用于递送到特定治疗位置的介质中实现。在一个实施方案中，尤其是用于治疗皮肤癌及其他皮肤学疾病的实施方案中，所述介质可以是乳膏剂，凝胶或在某些情况下气溶胶液体分散剂的形式。在将介质中的衍生物递送到治疗区域之后，经过足够的时间使得所述四吡咯衍生物优先积累在疾病组织中。最后治疗区域用充足动力和特定波长的光照射使四吡咯衍生物活化以杀死疾病组织的细胞。暗毒性(描述于实施例7)和光毒性(描述于实施例8)的测定显示本发明的化合物供PDT应用的优良性质。

[0116] 本发明通过以下实施例更进一步说明，而不是限制于此。以下实施例是仅仅用于例证性目的，不是用于限制本发明的范围。所有获得的化合物具有正确的MS谱(CI-MS)，并且是按照反相HPLC均一纯化的。

[0117] 实施例1

[0118] 细菌脱镁叶绿甲酯酸a (14)的制备

[0119]

[0120] 细菌叶绿素a(15)(45mg，0.05mmol，Sigma-Aldrich公司产品)的三氯乙酸(1.2mL)和水(0.3mL)混合物的溶液置于室温3小时，在室温下真空(～20mmHg)浓缩，用水稀释并且用二氯甲烷提取。提取物用水洗涤，干燥，浓缩，并在硅胶上用5％MeOH-CHCl3的混合物纯化以产生31mg(98％)的细菌脱镁叶绿甲酯酸a(14)。

[0121] 实施例2

[0122] 焦-细菌脱镁叶绿甲酯酸a(16)的制备。

[0123]

[0124] 细菌脱镁叶绿甲酯酸a(14)(65mg，0.11mmol)和吡啶(4mL)的混合物被回流12小时，冷却，蒸发至干燥，用水稀释并用二氯甲烷提取。提取物用1N盐酸和水洗涤，干燥，浓缩，并在硅胶上用5％MeOH-CHCl3的混合物纯化以产生59mg(94％)的焦-细菌脱镁叶绿甲酯酸a(16)。

[0125] 实施例3

[0126] 水溶性单-聚乙二醇化二氢卟酚e6衍生物的制备(17和18)。

[0127]

[0128] (17)R＝NH-PEG750-OMe (19)

[0129] (18)R＝NH-PEG2000-OMe

[0130] 甲 基 脱 镁 叶 绿 甲 酯 酸 a(19)(10mg，0.017mmol) 和 MeO-PEG750-NH2 或MeO-PEG2000-NH2(0.068mmol，4eq.)(RAPP Polymere GmbH产品)的混合物的四氢呋喃(0.5mL)溶液在室温放置3天，用二氯甲烷稀释，用0.5N HCl水溶液，水洗涤，干燥，浓缩，并在硅胶上用5％MeOH-CHCl3的混合物纯化。得到的(17)或(18)的溶液被蒸发至干燥，重新溶解于水(2mL)，通过45μm滤膜过滤并冷冻干燥以分别产生60-70％的水溶性化合物(17)和(18)。

[0131] 实施例4

[0132] 用于制备水溶性单-聚乙二醇化中-焦-脱镁叶绿甲酯酸a衍生物(20)-(25)，脱镁叶绿甲酯酸a(26)和(27)，细菌脱镁叶绿甲酯酸a(28)和焦-细菌脱镁叶绿甲酯酸a(29)的通用方法。

[0133]

[0134] (20)R＝NH-PEG750-Ome (26)R＝NH-PEG750-OMe

[0135] (21)R＝NH-PEG2000-OMe (27)R＝NH-PEG2000-OMe

[0136] (22)R＝NH-PEG5000-OMe (32)R＝五氟苯氧基

[0137] (23)R＝NH-PEG10000-OMe

[0138] (24)R＝NH-PEG20000-OMe

[0139] (25)R＝H-PEG3000-OCH2COOH

[0140] (30)R＝OH

[0141] (31)R＝五氟苯氧基

[0142]

[0143] 中-焦-脱镁叶绿甲酯酸a(30)，脱镁叶绿甲酯酸a(5)，细菌脱镁叶绿甲酯酸a(14)或焦-细菌脱镁叶绿甲酯酸(16)(0.03mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，然后添加0.05mL三乙胺继之以添加0.01mL(0.058mmol，1.9eq.)的五氟苯基三氟乙酸酯。混合物在室温下搅拌10分钟，以分别产生化合物(31)，(32)，(33)或(34)，用二氯甲烷稀释，用水洗涤，干燥，然后得到的溶液被添加到MW750，2000，5000，10000，20000的合适的MeO-PEG-NH2(RAPP GmbH产品)，或HOOCCH2O-PEG3000-NH2(GlycoSense AG产品)的二氯甲烷(1.0mL)溶液中。混合物在室温下搅拌0.5-10小时，用二氯甲烷稀释，然后用0.5NHCl水溶液洗涤。所述混合物然后用水洗涤，干燥，浓缩，在硅胶上用5％MeOH-CHCl3的混合物纯化。得到的对应的PEG酰胺溶液蒸发至干燥，重新溶解在水中(2-5mL)，通过45μm滤膜过滤并冷冻干燥以产生总得率70-99％的纯的水溶性化合物(20)-(29)。

[0144] 实施例5

[0145] 制备在四吡咯和PEG2000部分之间带有庚亚甲基二氨基间隔物的水溶性单-聚乙二醇化的中-焦-脱镁叶绿甲酯酸a衍生物(35)。

[0146]

[0147] 1，1’-碳酰二咪唑(25mg，0.15mmol，3eq.)被添加到MeO-PEG2000-OH(100mg，0.05mmol，(RAPP Polymere GmbH产品)的四氢呋喃N(2.0mL)溶液中。室温下10分钟后添加1，7-二氨基庚烷(33mg，0.25mmol，5eq.)的四氢呋喃(1.0mL)溶液。混合物在室温放置
30分钟，产物通过添加醚而沉淀。后一产物溶解在二氯甲烷中(2mL)，得到的容易被添加到(31)[按照实施例6的描述从15mg(0.026mmol)中-焦-脱镁叶绿甲酯酸a制备的(30)]的二氯甲烷(2mL)溶液中。混合物在室温放置30分钟，用二氯甲烷稀释并用0.5N HCl水溶液洗涤。混合物然后用水洗涤，干燥，浓缩和在硅胶上用5％MeOH-CHCl3的混合物纯化。
得到的溶液(35)蒸发至干燥，重新溶解于水(2.0mL)中，通过45μm滤膜过滤并冷冻干燥以产生60mg(85％)的水溶性化合物(35)。

[0148] 实施例6

[0149] 水溶性单-聚乙二醇化二氢卟酚e6衍生物(36)和(37)的制备

[0150]

[0151] 甲基脱镁叶绿甲酯酸a(20)(10mg，0.017mmol)和MeOOCCH2O-PEG3000-NH2(215mg，0.068mmol，4eq.)(GlycoSense AG产品)混合物的四氢呋喃(0.5mL)溶液在室温放置3天，用二氯甲烷稀释，用0.5N HCl水溶液洗涤，然后用水洗涤，干燥，浓缩，和在硅胶上用5％MeOH-CHCl3的混合物纯化。得到的溶液(36)蒸发至干燥，然后重新溶解于二 烷中(2mL)，将6N氢氧化钠水溶液(0.01mL)添加到反应混合物并回流10分钟。然后冷却混合物，用二氯甲烷稀释，用0.5N HCl水溶液洗涤，用水洗涤，干燥，浓缩到干燥，重新溶解于水(2mL)，然后通过45μm滤膜过滤并冷冻干燥以产生42mg(70％)的水溶性化合物(37)。

[0152] 实施例7

[0153] HeLa细胞中水溶性单-聚乙二醇化脱镁叶绿甲酯酸a(35)和具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脱镁叶绿甲酯酸a(5)的盐的暗毒性(细胞毒性)的测定

[0154] 为测定HeLa细胞(人宫颈癌细胞)中水溶性衍生物(35)和具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脱镁叶绿甲酯酸a(5)的盐(根据US专利申请10/151,764制备)的暗毒性，在96孔培养板中以2到500μg/mL范围内增加的光敏剂浓度培养细胞单层(接种密度：含10％胎牛血清的Dulbeco修饰的基本培养基(DMEM)每孔7,000个细胞)，培养48小时。

[0155] 细胞用纯DMEM洗涤并用10％福尔马林在室温处理15分钟。细胞用水洗涤两次，用0.1％结晶紫溶液(50μl/孔)温育15分钟，然后用水洗涤和用乙醇处理(100μl/孔)。形成的乙醇溶液的光学密度用Specord 100(Analytik Jena AG，德国)分光光度计在594nm测定以监测细胞存活率。

[0156] 数值表示为未温育的对照的百分数。对各温育浓度进行8次实验。实验数据见表1，其显示了IC50和IC80值。

[0157] 表1

[0158] HeLa细胞中水溶性聚乙二醇化脱镁叶绿甲酯酸a(35)和具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脱镁叶绿甲酯酸a(5)的盐的暗毒性(细胞毒性)数据(实施例7)

[0159]

[0160] 实施例8

[0161] HeLa细胞中水溶性单-聚乙二醇化脱镁叶绿甲酯酸a衍生物(35)和具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脱镁叶绿甲酯酸a(5)的盐在662nm照射下的光毒性的测定

[0162] 为测定光毒性，水溶性衍生物(35)或具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脱镁叶