抗vonWillebrand因子裂解的蛋白酶(ADAMTS13)抗体的诊断检测

摘要

本发明涉及一种用于检测样品中的抗von Willebrand因子裂解蛋白酶(“抗-vWF-cp”)抗体的测定系统的试剂盒。该试剂盒包括固定于固相上的vWF-cp或者vWF-cp片段。该试剂盒可用于测定患者的抗-vWF-cp抗体的方法中，来诊断与抗-vWF-cp抗体的产生有关的紊乱，并鉴别各种形式的血栓性毛细血管病。

权利要求

1.一种测定样品中的抗vWF-cp抗体的试剂盒，包括固定于固相上的一个或多个vWF-cp片段，所述的vWF-cp片段选自由SEQ NO：1-6组成的组，其特征在于：所述固定的vWF-cp片段的生物学特性没有受到实质损害，即所述vWF-cp片段的功能活性表位或者抗原决定簇没有受到损害，其能与至少一种抗vWF-cp抗体结合，其中所述vWF-cp片段与异源序列融合。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于：异源序列选自由蛋白质以及肽组成的组。

3.根据权利要求2的试剂盒，其特征在于：所述肽包括3-20个连续的组氨酸残基。

4.根据权利要求1至3中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述vWF-cp片段直接固定于固相上。

5.根据权利要求1至3中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述vWF-cp片段通过载体固定于固相上。

6.根据权利要求5的试剂盒，其特征在于：所述载体为抗体。

7.根据权利要求6的试剂盒，其特征在于：所述作为载体的抗体与所述vWF-cp片段融合的异源序列结合。

8.根据权利要求1至3中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述固相是选自由板、膜、纸、片层以及珠组成的组的形式。

9.根据权利要求1至3中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述固相是试条的形式。

10.根据权利要求1至3中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述vWF-cp片段分别设置于固相的不同位点上。

11.一个或多个vWF-cp片段在制备一种测定样品中的抗vWF-cp抗体的试剂盒中的用途，所述试剂盒制备成令所述测定包括下列步骤：(a)提供包含固定的一个或多个vWF-cp片段的固相的步骤，所述的vWF-cp片段选自由SEQ NO：1-6组成的组，其中vWF-cp片段的生物学特性没有受到实质损害，即所述vWF-cp片段的功能活性表位或者抗原决定簇没有受到损害，其能与至少一种抗vWF-cp抗体结合，并且其中所述vWF-cp片段与异源序列融合；

(b)将怀疑患有与抗vWF-cp抗体的发生有关的疾病的患者的生物样品与所述固定的vWF-cp片段接触的步骤；以及(c)检测抗vWF-cp抗体/vWF-cp片段复合物的步骤。

12.根据权利要求11的用途，其特征在于：所述固相是选自由板、膜、纸、片层以及珠组成的组的形式。

13.根据权利要求11的用途，其特征在于：所述固相是试条的形式。

14.根据权利要求11的用途，其特征在于：所述复合物由选自下列组中所包括的方法进行检测：酶测定、色谱测定、光测定、荧光测定以及放射免疫测定。

15.根据权利要求11至14中任意一项的用途，其特征在于：所述疾病为与抗vWF-cp抗体的发生有关的血栓病。

16.一个或多个vWF-cp片段在制备一种对各种形式的血栓性毛细血管病进行诊断和/或区分的试剂盒中的用途，所述试剂盒制备成令所述诊断和/或区分包括下列步骤：(a)提供包含固定的一个或多个vWF-cp片段的固相的步骤，所述的vWF-cp片段选自由SEQ NO：1-6组成的组，其中所述固定的vWF-cp片段的生物学特性没有受到实质损害，即所述vWF-cp片段的功能活性表位或者抗原决定簇没有受到损害，其能与至少一种抗vWF-cp抗体结合，并且其中所述vWF-cp片段与异源序列融合；

(b)将怀疑患有与抗vWF-cp抗体的发生有关的疾病的患者的生物样品与所述固定的vWF-cp片段接触的步骤；以及(c)检测抗vWF-cp抗体/vWF-cp片段复合物形成的步骤。

17.根据权利要求16的用途，其特征在于：在步骤(a)中的所述固相还包括固定的抗vWF-cp抗体。

18.根据权利要求17的用途，其特征在于：形成的抗vWF-cp抗体/vWF-cp片段复合物的存在与否指示了血栓性毛细血管病的类型。

说明书

抗von Willebrand因子裂解的 蛋白酶(ADAMTS13)抗体的

诊断检测

[0001] 发明领域

[0002] 本发明涉及一种用于检测怀疑含有抗-vWF-cp抗体的样品中的抗vonWillebrand因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)抗体(“抗-vWF-cp抗体”)的测定系统的试剂盒。该试剂盒可用于诊断与患者的抗-vWF-cp抗体产生相关的紊乱的方法中，并鉴别不同形式的血栓性毛细血管病。

背景技术

[0003] 在止血初期，von Willebrand因子(vWF)是一种重要的蛋白质。血浆vonWillebrand因子(vWF)是一种多聚体蛋白，其间接地附着于位于血管损伤处的血小板上，尤其是较大的vWF多聚体具有较强的止血能力。控制vWF多聚体大小的血浆因子的存在曾长期受到质疑。在人体内在通过von Willebrand因子多聚体的蛋白水解裂解形成血小板血栓的限制过程中涉及von Willebrand因子裂解蛋白酶(vWF-cp)(Furlan et al.，(1996)Blood 87：4223-4234)。近来，von Willebrand因子裂解蛋白酶的分子结构及相应的基因已经被公开(WO02/42441；Zheng et al.，(2001)J.Biol.Chem.276：41059-41063)，而且被确定为ADAMTS家族的一个新成员，并被称为ADAMTS13。vWFcp通过蛋白水解裂解来调控vWF多聚体的大小。

[0004] 较大和超大的vWF多聚体在动脉血栓形成中起核心作用，因此异常大的vWF多聚体可在两种相同形式的血栓性毛细血管病-血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和溶血性尿毒综合症(HUS)中观察到，这两种疾病均引起血小板凝集的形成，导致微循环的弥散性闭塞。TTP患者的vWFcp缺乏，而HUS患者则显示了正常的蛋白酶活性。

[0005] TTP的类型有许多种：急性原发性型或散发型、偶然复发的间歇型，以及慢性复发型。慢性复发型TTP与先天性或获得性vWF-cp缺乏有关，非常少见的遗传型TTP与ADAMTS-13位点中的特定基因突变有关。急性原发性型TTP和获得性TTP通常比慢性复发型TIP更为严重，其中这些患者具有抗vWF-cp的获得性抗体，其抑制了von Willebrand因子裂解蛋白酶(Furtan et al.，(1998)Blood 91：2839-2846；Furtan et al.，(1998)N.Engl.J.Med.339：1578-1584)。在怀孕过程中或者产后阶段也偶尔也会发生获得性TTP。间歇性复发型TTP也与vWF-cp抑制剂的再次出现有关。对其它类型的TTP来说，例如与噻氯吡啶相关的TTP(ticlopidine-associated TTP)，也观察到这些患者具有抗vWF-cp的获得性抗体(Moake，(2002)N.Engl.J.Med.347：589-600)。然而，一些获得性TTP患者的血浆中带有异常大的vWF-cp多聚体，而vWF-cp的水平却没有急剧降低。

[0006] 通常，蛋白质的抑制抗体引起许多严重的问题，例如在凝集级联中，引起血液流失或血栓形成。

[0007] 先天性和获得性TTP的区别在于在至多80％的患有获得性TTP的患者血浆中存在抗vWF-cp抑制性抗体，而在患有遗传性TTP的患者血浆中在总体上缺乏vWF-cp。迄今为止，患者血浆中的抑制性抗体是通过在非生理条件下的静态酶学检测来测定的，并肯定了急性的、抗体介导的TTP诊断。

[0008] 用于诊断先天性及获得性TTP的vWF-cp各种检测方法已经被公开。通过将纯化的vWF多聚体与患者的血浆样品一起温育，然后用抗vWF抗体对降解的vWF进行免疫印迹并对进行多聚体分析，测定了vWF-cp的活性及其抑制剂的存在(Furtan et al.，(2002)Sem.Thromb.Haemost.28：167-172)。该方法在较低的蛋白酶活性范围内非常灵敏，然而，在亚正常或者正常的蛋白酶活性范围内其准确性仅仅属于中等。Gerritsen等公开的测定vWF-cp活性及vWF-cp抑制剂的胶原结合检测法[(1999)Thromb.Haemost.82：1386-1389]可在6个小时内完成，但是与降解vWF多聚体的免疫印迹法相比，该方法在较低的蛋白酶活性范围内灵敏度很低(Furtan et al.，(2002)supra)。然而，在现有技术中描述的检测方法非常麻烦、耗时而且需要熟悉该技术的实验室专家来操作。此外，已知的现有检测技术仅仅可测定可损害vWF-cp的催化功能的抑制剂。而损害除催化活性之外的vWF-cp功能的抑制性抗体，例如内皮细胞结合功能等则不能采用这些方法进行测定。

[0009] 因此需要提供一种检测系统，其允许检测并测定患者血浆中的损害vWF-cp的除酶的催化性的蛋白酶活性以外的其它功能的抗vWF-cp抗体。

[0010] 发明概述

[0011] 本发明的一个目的在于提供一种用于测定样品中的抗vWF-cp抗体的试剂盒。该试剂盒包括固定于固相上的vWF-cp和/或一个或多个vWF-cp片段，而没有实质损害vWF-cp或vWF-cp片段的生物学特性。此外，本发明的试剂盒还可包括本领域公知的用于进行抗原/抗体检测(如ELISA、EIA、RIA等)的任何辅助试剂，例如缓冲盐、缓冲封闭溶液、封闭剂、测定试剂等。本发明公开的试剂盒可具有各种形式，例如一种或多种容器的形式或者微滴定板的形式。

[0012] 令人惊讶的是，发明人发现固定于固相上的vWF-cp或vWF-cp片段提供了测定样品中抗vWF-cp抗体存在的简单、高效、快捷及可重复的检测系统。在本发明的系统中，可对vWF-cp抑制剂进行测定，这在现有技术的系统中没有被检测到。本发明的试剂盒提供了在当前检测中比现有检测技术更高的灵敏度，并可用于测定可以低于现有检测系统的检测限的vWF-cp抗体的量。采用本发明的试剂盒进行检测，使人们可基于vWF-cp的不同生物学功能损害来鉴别具有不同特性的抗vWF-cp抗体。采用本发明的试剂盒进行的检测进一步可进行TTP以及其它与vWF-cp抑制剂相关的疾病的快速诊断，还可区分各种形式的血栓性毛细血管病(TM)。

[0013] 附图描述

[0014] 图1显示了用于表达重组vWF-cp、vWF-cp片段或者与组氨酸标记的异源序列(his-tag)融合的vWF-cp、vWF-cp片段的质粒。

[0015] 图2A及2B显示了以人类正常血浆作参照，患者血浆样品中的IgG(图2A)与IgG(图2B)抗体的测定。误差条指示了由多批血浆计算的正常人血浆的标准偏差相加后的两倍。

[0016] 发明详述

[0017] 本发明的一方面涉及一种用于测定样品中的抗vWF-cp抗体的试剂盒，包括固定于固相上的vWF-cp和/或一个或多个vWF-cp片段，而没有充分损害vWF-cp或vWF-cp片段的生物学特性。vWF-cp或vWF-cp片段在试剂盒中用作诊断试剂，其提供了能够结合样品中存在的抗vWF-cp抗体的抗原测定位点。

[0018] 这里所使用的术语“测定”的意思包括检测、定量并绘出样品中抗vWF-cp抗体的vWF-cp抗原结合区。“检测”的意思是指至少一种指示vWF-cp抗体或vWF-cp抗体片段与检测系统形成复合物的阳性反应，如显色测定。采用已知的不含抗vWF-cp抗体的样品用作阴性对照，如正常人血浆。“定量”通常指的是怀疑含有抗vWF-cp抗体的确定稀释液与固定化的vWF-cp抗原或者vWF-cp抗原片段接触，并将检测系统得出的反应强度与用作标准的含有已知的定量抗vWF-cp抗体的样品的确定稀释液所产生的反应强度相比较。抗vWF-cp抗体的vWF-cp抗原结合位点的“绘图”是通过将怀疑含有抗vWF-cp抗体的样品与完整的vWF-cp以及来自vWF-cp不同区域的vWF-cp片段接触完成的。从而可捕获样品中可能存在的抗vWF-cp抗体的完整图谱，并可确定具有特定结合活性的抗vWF-cp抗体在vWF-cp中的结合部位/区域。

[0019] 这里使用的术语“样品”指的是生物流体，如血液、血浆或患者的组织。样品可特别由怀疑患有与抗vWF-cp抗体的产生有关的疾病的患者获取。

[0020] 术语“固相”并不暗示任何特定的限制，涉及不溶性聚合材料等，可以是有机聚合物，如聚酰胺或者乙烯基聚合物(如聚(异)丁烯酸、聚苯乙烯以及聚乙烯醇，或者它们的衍生物)，中性聚合物如纤维素、右旋糖苷、琼脂、几丁质以及聚氨基酸，或者无机聚合物，如玻璃或者金属氢氧化物。固相可以是微载体、粒子、膜、试条、纸张、胶片、珠状物或者微滴定板等板的形式。vWF-cp或其片段可通过共价偶联直接固定在固相上，也可通过固定固相上的连接分子或抗体等载体固定在固相上。

[0021] 这里使用的术语“生物学特性”指的是功能活性表位或者vWF-cp或其片段的抗原决定簇，其能与至少一种抗vWF-cp抗体结合。在固相上固定化vWF-cp或其片段以这样一种方式进行，使得免疫特性，尤其是vWF-cp或其片段的功能表位与抗原决定簇的结构受到保护，并有效地呈现而被样品中存在的至少一种抗vWF-cp抗体识别。

[0022] vWF-cp或其片段可全部或部分地由重组技术来生产，并可通过在原核细胞或真核细胞宿主系统中表达而制备。原核宿主可以是细菌细胞，如大肠杆菌或者枯草芽胞杆菌。真核细胞可选自包括酵母细胞(如毕赤酵母菌株)、昆虫细胞(如Sf9，Sf21、High Five、S2)以及哺乳动物细胞，如MRC5、CHO、COS、3T3、HEK293、BHK、SK-Hep、HepG2、CV-1以及Hela，组成的的组。

[0023] 可采用许多种载体来制备vWF-cp或其片段，载体可选自真核表达载体和原核表达载体。原核表达载体的例子包括质粒，如pRSET、ET、pBAD等，其中用于原核表达载体的启动子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。真核表达载体的例子包括：(i)在酵母中表达，以pAO、pPIC、pYES、pMET等为载体，以AXO1、GAP、GAL1、AUG1等为启动子；(ii)在昆虫细胞中表达，以pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAV等为载体，以PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等为启动子；以及(iii)在哺乳动物细胞中表达，以pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等为载体，载体可来自病毒系统，如牛痘病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等；以CMV、SV40、EF-1α、UbC、RSV、ADV、BPV以及β-肌动蛋白为启动子。

[0024] vWF-cp片段可选自由SEQ ID NOs1-6组成的组。

[0025] vWF-cp片段可以是具有vWF-cp中含有的氨基酸序列的肽，优选至少含有6个氨基酸，更优选含有大约6个到大约50个氨基酸。采用所述肽作为本发明的诊断试剂的一个好处是对抗vWF-cp抗体特异性进行选择性的测定。肽可由标准的肽合成技术生产。

[0026] 根据本发明的一个实施方式，将vWF-cp或其片段与异源序列融合。该异源序列可以是异源蛋白质、多肽或者肽，特别是功能肽。该异源序列可以是具有固相结合特性的序列(例如，固相可具有反应位点，可与异源序列共价结合，或者具有对载体的亲和力)。

[0027] 异源蛋白质、多肽或肽可以选自由β-半乳糖苷酶、c-myc-产物、谷胱甘肽、S-转移酶、FLAG-标记物以及这些物质的衍生物组成的组。异源序列还可包括一系列各种相同或不同的氨基酸。优选地，异源序列为可与固相形成共价结合的肽，或者是具有高亲和力的聚组氨酸，特别是抗聚组氨酸的抗体。异源序列可与vWF-cp或其片段的N-末端融合，也可与其C-末端融合。通常异源序列与vWF-cp的C-末端融合。vWF-cp或其片段与异源序列以vWF-cp或其片段的生物学特性不受影响的方式融合。可在异源序列与vWF-cp或其片段之间插入一个短肽，从而在空间上不妨碍vWF-cp或其片段的表位的构象。

[0028] 根据本发明的一个实施方式，vWF-cp或其片段与功能性亲和肽融合，特别是与具有多个组氨酸残基的肽融合，在一些例子中组氨酸残基为3到20个，而在另一些例子中组胺酸残基为6到15个。在EP0282042中描述了使用C-末端与蛋白质融合的聚组氨酸(所谓的“组氨酸标记”)形式的亲和肽来纯化蛋白质。

[0029] 在固相上的固定可以经由固相的反应基团以及异源序列来实现(例如直接或通过共价结合)，或者由对异源序列具有亲和力的载体来实现。

[0030] 在本发明的一个优选实施方式中，异源序列对载体具有很高的亲和力，并且vWF-cp或其片段通过其异源部分与载体的结合而被固定在固相上。相应地，异源序列具有专一结合性或者很高的载体亲和力。根据本发明的一个实施例，载体是一种对vWF-cp融合蛋白的异源部分具有亲和力的抗体。

[0031] 在本发明的一个实施方式中，vWF-cp或其片段与作为异源序列的聚组氨酸-标记融合，并采用抗-组氨酸-标记抗体作为载体将VWF-cp或其片段固定于固相上。也可采用本领域技术人员公知的其它异源亲和肽及其各自的抗-亲和肽抗体来固定vWF-cp或其片段融合蛋白。

[0032] 将vWF-cp或其片段或者它们的融合蛋白分别固定于固相上的不同位点，例如，固定在微滴定板的不同孔中，其中一个点上通常含有一种给定的抗原，例如vWF-cp或特定vWF-cp片段。使用这种检测系统，可捕获抗vWF-cp抗体的整个图谱，并确定具有特定结合活性的抗vWF-cp抗体在vWF-cp中的结合部位/区域。当通过确定抗vWF-cp的抗体专一性并确定在vWF-cp分子中的抗原结合位点来确定抗体的全部范围，并分别针对患有与抗vWF-cp抗体有关的疾病患者的专门治疗时，这一点是最重要的。例如，通过将患者的血浆进行亲和层析，如这里所描述的用于吸附检测中的并具有抗体亲和性的特定vWF-cp片段的亲和层析，可以将抗vWF-cp抗体从确诊带有特定抗vWF-Cp抗体的患者血浆中选择性除去。与现有方法相比，改进了患有与特定的抗vWF-cp抗体相关疾病的患者的治疗。

[0033] 根据本发明的一个实施方式，上述试剂盒进一步包括作为诊断剂的固定于固相上的抗vWF-cp抗体。抗vWF-cp抗体可以是由传统的杂交瘤技术生产的多克隆抗体、单克隆抗体，也可以是通过重组技术获得的抗体或抗体片段，例如噬菌体展示技术或核糖体展示技术。在本发明中构建的试剂盒，可用于血栓性毛细血管病的分型诊断。特别地，通过提供含有固定于固相上的vWF-cp、vWF-cp片段以及抗vWF-cp抗体，可在一个简单的检测系统中确定样品中抗vWF-cp抗体以及vWF-cp的存在与否。

[0034] 在一种可供选择的实施方式中，本发明涉及一种用于测定vWF-cp或其片段的检测系统中的试剂盒，包括一种上述的抗vWF-cp抗体，其固定于这里所限定的固相上。

[0035] 本发明还涉及一种测定样品中抗vWF-cp抗体的方法，包括提供固定于固相上的vWF-cp和/或一个或多个vWF-cp片段，而不实质损害vWF-cp或vWF-cp片段的生物学特性的步骤；将来自怀疑患有与抗vWF-cp抗体的发生有关的患者的生物样品与固定的一个或多个vWF-cp片段接触的步骤；以及检测抗vWF-cp抗体/vWF-cp和/或抗vWF-cp抗体/vWF-cp片段复合物的步骤。

[0036] 可采用本领域公知的方法，例如，通过用标记的抗体进行检测来检测抗vWF-cp抗体/vWF-cp或抗vWF-cp抗体/vWF-cp片段复合物。检测方法可选自酶测定、色谱测定、光测定、荧光测定以及放射免疫测定。检测抗原/抗体复合物形成的反应条件取决于所选的检测方法。对于每种待使用的检测系统，选择最佳参数，如缓冲系统、温度以及pH等是本领域技术人员所具备的知识。

[0037] 本发明还涉及采用上述试剂盒对血栓性毛细血管病进行分型诊断的方法，其中试剂盒既可包括固定在固相上的vWF-cp和/或一个或多个vWF-cp片段作为诊断剂，也可包括固定在固相上的vWF-cp和/或vWF-cp片段和抗vWF-cp抗体作为诊断剂。优选每种诊断剂定位于固相上的独立位点上，例如定位于微滴定板的独立的孔中。这使人们可通过一次检测来区分含有vWF-cp或抗vWF-cp抗体的样品或两者都含的样品，并可对血栓性毛细血管病分型，例如TTP或HUS的不同类型。

[0038] 本发明的试剂盒与方法可用于诊断与抗vWF-cp抗体发生有关的疾病。

[0039] 本发明的试剂盒与方法还可用于诊断血栓性毛细血管病的不同类型。血栓性毛细血管病(TM)可以是血栓性血小板紫癜(TTP)、新生儿血小板减少症、Henoch-Sch nlein紫癜、preclampsia、或者溶血性尿毒综合症(HUS)、HELLP综合症、ARDS、末梢指端缺血综合症、非闭塞性系膜局部缺血、急性胰腺炎、急性肝炎、风湿性紫癜、药物性血小板减少症、手术后TM、肿瘤相关性TM、弥散性血管内凝集(DIC)、系统性红斑狼疮、肝硬化、尿毒症或者急性炎性病变。

[0040] 这里提供的实施例清楚地显示了抗vWF-cp抗体在获得性TTP患者体内的存在，其在标准vWF-cp活性检测中中和vWF-cp活性，而最可能通过与简单地阻断底物裂解活性不同的机制损害vWF-cp的活性，可以使用本发明的试剂盒和方法来测定它。这允许快速并灵敏地诊断TTP以及急需的挽救生命的临床介入，即血浆治疗。本发明的试剂盒与方法可用于各种类型的TTP的分型诊断。

[0041] 使用本发明的试剂盒与方法，所有的IgG类以及IgM类抗体均可被检测，而现有技术仅能测定IgG类的抗vWF-cp抗体。

[0042] 将在下面的实施例中进一步解释本发明，这些实施例不作为对本发明的任何限制。

[0043] 实施例1

[0044] vWF-cp以及vWF-cp片段/组氨酸(6x)标记的构建

[0045] 为了表达vWF-cp蛋白，采用在WO02/42442中所述的vWF-cp cDNA克隆。

[0046] 为了构建vWF-cp组氨酸融合蛋白，进行了两次连续的PCR，来添加3个甘氨酸的密码子、6个组氨酸的密码子、终止密码子以及Xhol限制位点。

[0047] PCR1：采用如在WO0242441中描述的野生型全长pcDNA3.1(+)/vWF-cp(ADAMTS13)作为模板，使用引物7189(5’GTG ATG GTG ATG GTG TCCACC TCC GGT TCC TTC CTT TCC CTT CCA3’)和6526(5’CTG CCT CGCCCG GAA CCC CA3’)扩增带有来自pcDNA3.1(+)的C-末端片段SgrAl/Xhol的1.3kb片段。采用该片段以及引物7190(5’CTG TCT AGA CTC GAG TCAATG GTG ATG GTG ATG GTG TCC ACC3’)和6256进行第二次PCR扩增。将所得的产物纯化，用SgrAl及Xhol消化，并用其替代构建的野生型pcDNA3.1(+)/vWF-cp(ADAMTS13)中相应的SgrAl/Xhol片段。

[0048] 采用在WO0242442中公开的全长vWF-cp cDNA作为模板，通过PCR方法，采用下列引物组(也见表4中的引物及各自的vWF-cp区域序列)来产生含有成熟蛋白的不同片段的基因的vWF-cp片段构建体。

[0049] 大肠杆菌表达系统：pBAD/Topo Thiofusion(Invitrogen)

[0050] 融合：硫氧还蛋白(N-端)，6个组氨酸尾巴(C-端)DNA片段(bp) 蛋白质片段(aa) ADAMTS13中的区域
88-222 30(P)-74(R) Propetid
223-1317 75(A)-439(E) 催化性的/解联蛋白/tsp1#1
1156-1317 386(R)-439(E) Tsp1#1
1318-2055 440(K)-685(A) Cys丰富区/间隔区
2056-3393 686(W)-1131(V) tsp2#8
3394-4281 1132(G)-1427(T) Cub1+2

[0051] 采用合适的限制酶酶切PCR片段，并克隆到载体如pRSET中(图1)，然后采用相同的酶裂解产生需要的质粒。

[0052] 为了构建vWF-cp组氨酸标记融合蛋白，根据如上所述构建vWF-cp/组氨酸标记的方法对vWF-cp进行修饰。采用合成的寡聚核苷酸o.pRET-FPdHIS(1)-6929以及o.pRET-FPdHIS(2)-6930，通过将将HIS-6标记替代Ndel-Xhol来克隆上述构建物。

[0053] 将vWF-cp、vWF-cp或者各自的组氨酸标记的融合蛋白在大肠杆菌JM 109中重组表达，纯化并用于在固相上的固定中，如下所述。

[0054] HEK 293细胞克隆稳定表达vWF-cp/C-His

[0055] 用pcDNA3.1(+)/vWF-cp/C-His共转染HEK 293(ATCC)细胞，采用磷酸钙沉淀法选择含有潮霉素盒的质粒。在添加了100μg/ml潮霉素以及100μg/ml G418(pcDNA上编码的新霉素磷酸转移酶)的培养基中选择初始克隆以及随后的亚克隆。将重组表达的vWF-cp/组氨酸标记纯化并用于在固相上的固定中，如下所述。

[0056] 实施例2

[0057] vWF-cp和/或vWF-cp片段与载体的偶联

[0058] 重组的vWF-cp、vWF-cp既可直接与固相偶联，也可以经由抗vWF-cp的单克隆抗体作为载体来偶联到固相上。将vWF-cp-His-标记或者vWF-cp片段-His-标记通过抗-组氨酸标记的抗体固定于ELISA板的表面上。在与患者的血浆一起温育后，通过的识别人抗体的恒定区的第二抗体磷酸酶轭合物来检测与vWF-cp或者vWF-cp片段结合的抗vWF-cp抗体。磷酸酶与合适的底物反应产生显色反应并产生黄色。测定颜色的深度，并将其与含有已知量的抗vWF-cp抗体的标准曲线相比较，来确定样品中的抗体量。

[0059] ELISA的建立

[0060] 将从市场上购买的不含BSA的抗-组氨酸标记抗体(“载体-抗体”；Qiagen，Germany)在每孔100μl pH7.4的PBS缓冲液中稀释到终浓度为2μg/ml，在96孔板中在室温下温育4小时。采用pH7.4的PBST(含0.1％Tween 20(v/v)PBS缓冲液)洗涤三次后，加入250μl含pH7.4的PBS及2％(w/v)的牛血清蛋白的封闭液并在4℃下温育过夜，以封闭所有的结合位点。用100μl组氨酸标记的重组的vWF-cp制剂替代上述溶液。vWF-cp的浓度为1.5μg/ml，相应于10U/ml的蛋白酶活性。将vWF-cp样品在PBS中稀释到BSA的终浓度为2％。由于包被了抗组氨酸抗体，重组vWF-cp/组氨酸标记被捕获并经由载体抗体固定。在室温下两小时后，接着洗涤10次。洗涤缓冲液含有pH7.4的PBS以及0.1％Tween 20。将患者的血浆样品用含有0.2％BSA的pH7.4的PBS按1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1200稀释，将每种稀释液100μl在含重组vWF-cp的孔中在室温下温育3小时。抑制性抗体与固定化的vWF-cp表面结合，采用pH7.4的PBST洗涤10次，将未结合的抗体洗去。用轭合了碱性磷酸酶的鼠抗-人IgG Fc专一性抗体或者鼠抗-人IgM抗体对人抗体进行检测。将抗体用含2％BSA的pH7.4的PBS按1∶60000稀释成最终的工作液(100)μl/孔，并在室温下温育2小时，接着用pH7.4的PBST洗涤10次。加入碱性磷酸酶底物产生黄色，颜色的深度反映了结合的抗体的量(抗体/vWF-cp)。在ELISA阅读仪中测定颜色的深度，并参照通过系列稀释得出的NP标准曲线计算血浆样品中抗体的量。作为阴性对照，对正常人血清(NHP)的稀释液进行相应的处理，结果显示于图2A及2B中。结果表明，至少在血浆中按1∶600稀释时，患者体内的人抗vWF-cp抗体可以被明显地检测出来。

[0061] 以正常人血浆作为对照，并根据多批血浆来计算标准偏差(SD)。以上述正常人血浆的抗体滴度+2SD的估计值作为阳性对照。

[0062] TTP患者样品的分析

[0063] 对来自患有TTP的患者的样品以及正常血浆样品进行包括固定化的vWF-cp的ELISA检测，结果显示于表1中。患者1的IgG滴度为1∶600，IgM滴度为1∶400。。患者2的IgG滴度更高(1∶1200)，而IgM滴度仅仅为1∶100。患者1患有急性TTP，而患者2处于TTP后的症状缓解阶段。患者1显示没有抑制滴度，而患者2的抑制滴度大约为60U/ml。正常人血浆没有显示反应。

[0064] 表1：抗vWF-cp抗体检测ELISA，显示两名患者的IgG与IgM滴度1∶20 1∶50 1∶100 1∶200 1∶300 1∶400 1∶600 1∶800 1∶1200
IgG#1 ++++ ++++ +++ +++ ++ ++ + - -
IgM#1 +++ +++ +++ ++ + - - - -
NP - - - - - - - - -
IgG#2 ++++ ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ ++ +
IgM#2 ++ ++ + - - - - - -
NP - - - - - - - - -

[0065] 对患有TTP的患者样品以及正常血浆样品进行包括固定化的来自vWF-cp的不同区域的vWF-cp片段的ELISA检测。结果显示于表2中。患者#1的IgG与IgM(没有抑制滴度)显示抗体在区域trombospondin 2-8以及Cub区域上的结合。患者#2的IgG与IgM显示结合于催化区域上，这与其抑制滴度一致。正常人血浆不与任何区域发生反应。在两个不同的血浆稀释度(1∶50与1∶100)下重复检测患者的血浆。

[0066] 表2：对在患者抗体的不同ADAMTS-13片段上的结合分析催化 催化 催化解联 催化解联 Cys丰富 Cys丰富 Tsp2-8 Tsp2-8 CUB CUB
区域 区域 蛋白，tsp1 蛋白，tsp1 区，间隔 区，间隔 1∶50 1∶100 1+2 1+2
1∶50 1∶1001∶50 1∶100 区1∶50 区1∶100 1∶50 1∶100
IgG#1 - - - - - - ++ + + -
IgM#1 - - - - - - ++ + + -
NP - - - - - - - - -
IgG#2 ++++ +++ ++ ++ - - - - -
IgM#2 ++ ++ + - - - - - -
NP - - - - - - - - -

[0067] 让患有TTP的患者样品以及正常血浆样品接受包括固定化的抗vWF-cp的抗体的ELISA检测。结果显示于表3中。患者#1及患者#2的ADAMTS-13的水平可以被清楚地检测出来。正常人血浆显示了相同的水平。患者#3的特征是在一个等位基因上带有遗传缺陷，导致活性下降50％，在我们的检测系统中也观察到其蛋白的量减少了50％。患者#4的特征是由于一个纯合的无义突变，导致完全缺乏ADAMTS-13蛋白。因此，没有能够检测到蛋白质。

[0068] 表3：使用抗vWF-cp抗体进行捕获来检测血浆中的ADAMTS-13水平00
21
∶
1 - - - - -
008
∶
1 + + - - +

006
∶1 ++ ++ - - ++

00
4
∶ ++ ++ ++
1 + + + - +
003
∶1 +++ +++ ++ - +++

00
2
∶ ++ ++ + ++
1 + + + - +
001
∶1 ++++ ++++ +++ - ++++

0
5∶ +++ +++ ++ +++
1 + + + - +
02∶1 ++++ ++++ +++ - ++++
1#3 2#3 3#3 4#3
1-TM 1-TM 1-TM 1-TM
ADA ADA ADA ADA PN

[0069] 应当理解，这里描述的例子及实施例仅仅用于解释的目的，本领域技术人员根据其进行的各种改变和变化都包含在由所附的权利要求书所限定的本发明的精神和范围内。在本发明中为所有目的全部引作参考的所有出版物、专利以及专利申请，如同对每个出版物、专利以及专利申请具体并单独指出其通过参考文献而包含于本申请中一样。

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