祖师麻醇提取物及其制备方法与用途

摘要

公开了祖师麻或其醇提取物的用途，用于制备药物，该药物降低低密度脂蛋白水平和治疗或预防相关的疾病。还公开了制备祖师麻醇提取物的方法，包括步骤：用无水乙醇或30-90％，优选50％的酒精浸泡祖师麻药材12-48小时，优选24小时，过滤得到滤液。还提供了用上述方法制备的祖师麻醇提取物以及该提取物的用途，在体外用作低密度脂蛋白细胞表面受体表达的促进剂。

权利要求

1.一种制备祖师麻醇提取物的方法，其特征在于，该方法包括步骤：(a)用无水乙醇或30-90％的酒精浸泡祖师麻药材12-48小时，过滤得到滤液；重复步骤(a)，合并滤液；干燥；

(b)将(a)得到的产物溶于100％甲醇；

(c)进行高效液相层析，其中：流动相为甲醇和水，梯度：5∶95的甲醇∶水，0---2min；5∶95的甲醇∶水-95∶5的甲醇∶水，2-32min；95∶5的甲醇∶水，32---35min；收集方法为从第3min开始每两分钟收集一次，整个过程收集16份中从第

31min到33min收集的馏分和从第33min到35min收集的馏份。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中用50％乙醇浸泡24小时。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中还包括超声处理溶剂与祖师麻药材的混合物40±20分钟。

4.一种祖师麻醇提取物，其特征在于，它是用权利要求1所述的方法制备的；该醇提取物能够促进细胞表面低密度脂蛋白受体表达和低密度脂蛋白内吞。

5.权利要求4所述的祖师麻醇提取物的用途，其特征在于，在体外用作低密度脂蛋白细胞表面受体表达的促进剂。

6.如权利要求4所述的祖师麻醇提取物的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于降低低密度脂蛋白水平和治疗或预防相关的疾病。

说明书

祖师麻醇提取物及其制备方法与用途

技术领域

[0001] 本发明涉及中药领域，具体地涉及祖师麻的醇提取物及其用途。本发明还涉及含祖师麻醇提取物的组合物。

背景技术

[0002] 祖师麻为瑞香科Thymelaeaceae瑞香属植物黄瑞香Dolphne giradii Nitsche的根皮和茎皮，同属植物唐古特瑞香D.tangutica Maxim、凹叶瑞香D.retusaHemsl、长白瑞香D.koreana Nakai都可入药。祖师麻有祛风除湿、止痛散淤的功效，民间广泛用于治疗疼痛、跌打损伤、风湿性关节炎和支气管炎。

[0003] 中国中药杂志，第27卷第6期，2002年6月的综述描述了祖师麻中的一些化学成分和药理活性研究的进展。其中公开了祖师麻中的化学成分有镇痛消炎、抑菌、抗血栓、抗凝、抗肿瘤、中枢神经抑制作用、降压和抗缺氧作用、抗生育活性。对于祖师麻在降低低密度脂蛋白上的应用国内外均无报道。

[0004] 低密度脂蛋白(LDL)是血浆中胆固醇含量最多的一种脂蛋白，其胆固醇含量在一半以上。LDL是由IDL在肝脏内转化而来，肝脏也可直接合成分泌少量LDL。一般认为，大多数LDL是由肝脏内和肝外的LDL受体(LDL receptor，LDLR)进行代谢，占体内LDL代谢的70％-75％，其余的LDL则经由非特异性、非受体依赖性的途径进行代谢。LDL与受体结合后，LDL颗粒被吞饮，然后进入溶酶体。在溶酶体中，LDL被水解释放出游离胆固醇。游离胆固醇可掺入细胞浆膜中，被细胞膜所利用或转换成其他物质。而LDLR则可回到细胞膜上再循环利用。

[0005] LDLR的活性是决定LDL分解代谢速率的重要因素。细胞内游离胆固醇的含量可调节LDLR的合成和表达。细胞内游离胆固醇含量增加则抑制LDLR的合成和表达，反之亦然。

[0006] 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)升高是促动脉粥样硬化形成的因子之一，动脉粥样硬化又可引发冠心病和中风。现有的有效降低血LDL-c的药物是他汀(statin)类--HMG CoA还原酶抑制剂，已在临床应用中表现出很好的降冠脉疾病和中风的作用。但是有些病人却无法耐受他汀类药物。所以急需新的毒副作用小的降胆固醇药物。然而，他汀类药物副作用较大，价格昂贵，所以急需新的毒副作用小的降胆固醇药物。

[0007] 因此，本领域技术人员迫切需要开发能够有效降低胆固醇的新中药提取物。

发明内容

[0008] 因此，本发明的一个方面提供了祖师麻或其醇提取物的用途，用于制备药物，该药物降低低密度脂蛋白水平和治疗或预防相关的疾病，优选选自糖尿病和动脉粥样硬化、冠心病、中风、高胆固醇血症、和高脂蛋白血症。

[0009] 在本发明的另一个方面，提供了一种制备祖师麻醇提取物的方法，包括步骤：

[0010] (a)用无水乙醇或30-90％，优选50％的酒精浸泡祖师麻药材12-48小时，优选24小时，过滤得到滤液。

[0011] 在该方面的一个具体实施方式中，重复步骤(a)，合并滤液。优选还包括一个干燥步骤。

[0012] 在该方面的一个优选例中，步骤(a)中还包括超声处理溶剂与祖师麻药材的混合物40±20分钟，优选40分钟。

[0013] 在该方面的另一个优选例中，该方法还包括步骤：

[0014] (b)将(a)得到的产物溶于50-100％甲醇；

[0015] (c)用5∶95-95∶5的甲醇∶水梯度进行高效液相层析，收集254nm下的峰组分。

[0016] 在该优选例中，更优选的还包括一个干燥步骤。

[0017] 在本发明的另一个方面，提供了用上述方法制备的祖师麻醇提取物，并且在5∶95-95∶5的甲醇∶水梯度下高效液相层析，在254nm下具有峰；该醇提取物能够促进细胞表面低密度脂蛋白受体表达和低密度脂蛋白内吞。

[0018] 在本发明的还有一个方面，提供了一种药物组合物，含有0.01-99.9wt％的上述祖师麻醇提取物和药物学上可接受的载体。

[0019] 在本发明的另一个方面，提供了上述祖师麻醇提取物的用途，在体外用作低密度脂蛋白细胞表面受体表达的促进剂。

附图说明

[0020] 图1显示了制备祖师麻醇提取物的流程图。

[0021] 图2显示了祖师麻醇提取物HPLC分离的图谱。

[0022] 图3显示了在稳定细胞系pLDLR270-luc/293 OM的剂量试验结果

[0023] 图4显示了天然化合物库初步筛选的结果。

[0024] 图5A-C显示了祖师麻醇提取物和其中的两个有效组分在稳定细胞系pLDLR270-luc/293上的剂量试验结果。

[0025] 图6A-C显示了活性组分的内吞试验结果。

[0026] 图7A-C显示了祖师麻醇提取物对细胞的毒性检测结果。

具体实施方式

[0027] 本发明经过研究发现，祖师麻的提取物有降低低密度脂蛋白的作用。在此基础上进行了进一步研究，发现其中的醇提取物是其主要的降低低密度脂蛋白的有效成分，在此基础上开发了有效提取祖师麻醇提取物的方法，从而完成了本发明。

[0028] 祖师麻是常规的中药材，可用于治疗疼痛、跌打损伤、风湿性关节炎和支气管炎。该药材可从各大药材批发中心购得，例如上海同仁堂大药房等。

[0029] 低密度脂蛋白是所有血脂蛋白中首要的致动脉粥样硬化性脂蛋白。已经证明粥样硬化斑块中的胆固醇来自血液循环中的LDL。没有足够的LDLR结合LDL时，过量的LDL留在血中，被巨噬细胞吞噬后，形成泡沫细胞，最终形成动脉粥样硬化斑块。LDL的致动脉粥样硬化作用与其本身的一些特点有关，即LDL相对较小，能很快穿过动脉内膜层。近来的研究发现，经过氧化或其他化学修饰后的LDL，具有更强的致动脉粥样硬化作用。因此根据本发明，降低血液中的低密度脂蛋白水平即减少了动脉粥样硬化的危险性。如背景技术中所述，动脉粥样硬化能够引发引发冠心病和中风，因此降低血液中的低密度脂蛋白水平对这两种疾病也有预防作用。

[0030] 糖尿病常常伴随有低密度脂蛋白的代谢紊乱或者是高脂蛋白血症。因此，降低血液中的低密度脂蛋白可以治疗糖尿病的相关症状。

[0031] 本发明的发明人还发现，由于祖师麻具有降低血液中的低密度脂蛋白水平的功能，因此它还可以用于治疗高脂蛋白血症。同时，由于含有胆固醇的低密度脂蛋白的减少，祖师麻对于高胆固醇血症也有疗效。

[0032] 可用分光光度计通过紫外分光光度法或比色法在254nm波长处检测祖师麻醇提取物的浓度。该方法是本领域技术人员熟知的常用方法。

[0033] 本发明的分离方法由于操作步骤简单，可用于大批量工业生产。分离得到的产物可进一步干燥，干燥方法是本领域常用的，例如真空干燥，旋转蒸发法等等。

[0034] 本发明的祖师麻或醇提取物可直接使用，或与药物学上可接受的载体和添加剂一起，制成药物组合物。例如添加甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，制备口服给药的片剂、锭剂、水或油悬液、可分散性粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。片剂含有与适用于制造片剂的无毒的可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂及崩解剂，例如褐藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可无糖衣或用已知技术包衣，来延迟在胃肠道内的解体和吸收，从而在较长时间内提供持续作用。例如，可施用延时物质，如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。口服使用的制剂还可制成硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固态稀释剂，如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或制成软明胶胶囊，其中活性成分和水或油性介质，例如花生油、液态石蜡或橄榄油混合。

[0035] 本发明的药物组合物还可含有其他降低密度脂蛋白成分，例如目前可得的降低密度脂蛋白的药物他汀等或其它中药制剂。

[0036] 本发明的药物组合物可以用各种途径施用，例如口服、注射、透皮吸收，优选是口服或静脉滴注。

[0037] 本发明的祖师麻醇提取物及其药物组合物具有显著的刺激LDLR表达增加的作用，因此能够促进低密度脂蛋白被细胞内吞，从而使得血液中的低密度脂蛋白浓度下降，减少动脉粥样硬化的可能性。

[0038] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0039] 实施例

[0040] 实施例1祖师麻醇提取物的制备

[0041] 1.实验器材和试剂：

[0042] 粉碎机(北京光明仪器厂FZ-102) 同位素瓶

[0043] 旋转蒸发仪(上海申胜仪器公司) 四孔水浴锅(北京仪器厂)

[0044] 95％乙醇(分析纯，上海试剂一厂) 大烧杯

[0045] 电子天平(精确0.1g，北京医用天平厂DT-500)实验滤纸

[0046] TP300超声清洗仪(北京天鹏电子技术有限公司)

[0047] (以下提到的相关仪器型号不再注明)

[0048] 2.实验药材来源：

[0049] 于2001年11月购于安徽安国，由北京中医药大学阎玉凝教授鉴定并编号入库。

[0050] 鉴定结果：祖师麻(Daphne giraldii Nitsche、瑞香科，黄瑞香)的茎皮和根皮[0051] 3.提取方法见图1。

[0052] 4.实验步骤：

[0053] (1)取一定数量的祖师麻药材，用粉碎机粉碎。

[0054] (2)药材粉末装入纸上，电子天平(精确0.1g，北京医用天平厂DT-500)，称得净重86.7g

[0055] (3)将粉末转入1000ml的平底烧瓶中，并加500ml 50％乙醇/水溶液浸泡24小时(室温)，浸泡24小时后超声40min，过滤得到滤渣和滤液A

[0056] (4)滤渣继续转入饿另1000ml的平底烧瓶中，并加500ml95％乙醇/水溶液浸泡24小时(室温)，浸泡24小时后超声40min，过滤得到滤渣和滤液B

[0057] (5)将滤液A和滤液B合并，旋转蒸发仪蒸干，得到膏状祖师麻醇提取物约12.1g，所得到的提取物转入到放在同位素瓶(15ml)中，并放置在-20℃保存。

[0058] 实施例2祖师麻醇提取物的液相分离

[0059] 1.实验仪器

[0060] HPLC制备系统(Shimadazu Class_vp HPLC、日本岛津仪器分析所)[0061] 甲醇(HPLC级、4L、Fisher)

[0062] H2O(Millipore 0.22um过滤)

[0063] 色谱柱(YWG C18 10u 250×10、Beijing shuntu biotech.co.，LTD)[0064] 2.实验步骤：

[0065] (1)实施例1获得的祖师麻(近似液体状)醇提取物摇匀后，分别取200ul于四个eppendorf(1.5ml、国产)中。并分别取800ul的纯甲醇于此四个eppendorf管。充分震荡、使其充分溶解。离心、过滤。取上清液于4ml进样瓶中。从中取出1ml的上清液、离心浓缩，弄干后计算此次上清液的浓度(为保证重现性，这样的配置方法和第一次制备时候几乎一样的处理方式，最后的浓度大致都在31.5mg/ml左右)

[0066] (2)HPLC分离条件：

[0067] 流动相：甲醇和水

[0068] 梯度：5∶95(甲醇∶水) 0---2min

[0069] 5∶95(甲醇∶水)——95∶5(甲醇∶水) 2---32min

[0070] 95∶5(甲醇∶水) 32---35min

[0071] 收集方法：从第3min开始每两分钟收集一次，整个过程收集16份

[0072] (3)F15、F16(F15表示从第31min到33min收集馏分、F16表示从第33min到35min收集的馏分)经筛选发现有活性，以上为例富集多次后，离心浓缩，溶解、转入4ml的进样瓶中，进行半制备分离。

[0073] (4)在436nm-254nm连续波长下检测，得到如图2所示的分离图像。

[0074] 实施例3祖师麻醇提取物降低密度脂蛋白活性试验

[0075] 1.材料和方法

[0076] 受试药物：实施例1得到的祖师麻醇提物、实施例2得到的F15、F16组分样本。

[0077] 质粒：pLDLR270-luc由上海华大天源生物技术有限公司自行构建，克隆自基因组的LDLR启动子区插入pGL3-basic载体(美国Promega公司)。

[0078] 细胞：pLDLR270-luc稳定转染的人胚肾细胞(HEK 293)(CRL-1573)，人肝癌细胞HepG2(ATCC HB-8065)。

[0079] 试剂：KpnI、BglII(NewEngland Biolab公司)，pGL3-basic载体(美国Promega公司)，T4连接酶(美国Promega公司)，Lipofeetamine2000(美国Invitrogen公司)，DMEM培养基(GIBCO公司产品)，链霉素，L-谷氨酰胺(美国Invitrogen公司)，潮霉素(德国Roche公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，肝素(Hepes)，Luciferase Assay System和Bright-Glo Luciferase Assay System(美国Promega公司)，重组人制瘤素因子M(OM，美国R&D Systems公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓，内盐MTS(美国Promega公司)，青霉素(Sigma公司)，碳酸氢钠(购自京科化学试剂公司进口分装)，25-羟基胆固醇(美国Sigma公司)，洛伐他丁(美国Sigma公司)，DiI-LDL(美国BiomedicalTechnologies公司)。

[0080] 细胞培养液及试剂配制：DMEM培养液：含10％胎牛血清、3％L-谷氨酰胺、1％青霉素、链霉素、7.5％碳酸氢钠，10mM Hepes；

[0081] MTS染色液：按Promega公司的操作指南配制。

[0082] 2.试验方法：

[0083] (1)报告质粒的构建及稳定细胞系的建立

[0084] 以 人 基 因 组 DNA 为 模 板， 用 GGGGTACCTTGCAGTGAGGTGAAGAC 和GACTGCAGGCTTGAGATCTTC为引物，PCR扩增出LDLR基因启动子区的-86到+184的DNA片断。PCR产物和pGL3-basic载体分别用KpnI和BglII酶切过夜，两酶切产物用T4连接酶连接。
连接产物转化DH5αE.coli，在氨苄青霉素LB平板上长出数十个菌落，做菌落PCR找出阳性克隆。扩大培养，以碱裂解法提取质粒，质粒(pLDLR270-luc)测序验证。pLDLR270-luc与pcDNA3.1-hygro(+)用Lipofectamine2000共转染HEK 293细胞，以潮霉素筛选2周后，挑出有抗性的细胞克隆，用OM刺激细胞12-24小时后，加入Luciferase Assay Reagent，用AnalystHT读板机读数。得到刺激后RLU升高倍数最大的细胞克隆，即是所要的稳定pLDLR270-luc/293细胞株。

[0085] (2)天然化合物库筛选

[0086] 以20,000细胞/孔密度将pLDLR270-luc/293接种96孔细胞培养板，每孔培养液100ul，37℃，5％CO2孵育细胞过夜，加入受试药物，以OM作为阳性对照，两孔未加刺激剂的细胞作空白对照。37℃，5％CO2孵育细胞24小时后，每孔加入100ul Luciferase Assay Reagent或Bright-Glo Luciferase Assay Reagent，将孔中的所有溶液转到一干净的全白不透明检测96孔板中，用Analyst HT读板机读RLU数值。

[0087] (3)活性检测：

[0088] 筛选后，得到的阳性化合物—祖师麻HPLC的15、16部分(F15、F16)，及祖师麻的-1醇提取物按照下述浓度梯度进行活性测试：醇提取物按照药物终浓度0.1、0.3、0.1×10 、-1 -2 -2 -3
0.3×10 、0.1×10 、0.3×10 、0.1×10 mg/ml的浓度梯度加入，共7个浓度，F15和-1 -1 -2 -2 -3 -3
F16按药物终浓度0.1×10 、0.3×10 、0.1×10 、0.3×10 、0.1×10 mg/ml、0.3×10 、-4 -6
0.1×10 、0.1×10 mg/ml的浓度梯度加入，共8个浓度，每个浓度加2孔。

[0089] (4)LDL内吞试验

[0090] 以20,000细胞/孔密度将HepG2接种到96孔细胞培养板，37℃，5％CO2孵育细胞至完全帖壁后，加入受试化合物、OM和25-羟基胆固醇，37℃，5％CO2孵育14小时后加入荧光标记的LDL(DiI-LDL)，37℃，5％CO2再孵育4小时，用DMEM洗细胞2次后，在荧光显微镜下观察细胞发红色荧光的情况，并拍照。

[0091] (5)药物对细胞毒性试验

[0092] 按20,000细胞/孔密度将pLDLR270-luc/293接种到96孔细胞培养板，37℃，5％CO2孵育细胞24小时后加入受试药物。祖师麻醇提取物以细胞培养液稀释后最终浓度分别为200、2、0.6、0.2、0.06、0.02、0.006、0.002、0.0006mg/ml，共10个浓度；F15和F16以细胞培养液稀释后最终浓度分别为40、0.4、0.13、0.04、0.013、0.004、0.0013、0.0004、
0.00013mg/ml，共10个浓度，每个浓度加2孔。设正常细胞对照。37℃5％CO2孵育细胞96小时后，显微镜下观察细胞病变，加MTS/PMS，每孔20ul，37℃下5％CO2孵育3小时，然后加
50ul 10％SDS终止反应，紫外分光光度仪检测O.D(490nm)值，以样品读数不小于细胞对照的90％作为无毒性指标。

[0093] 3.实验结果

[0094] 3.1检测模型的构建

[0095] 图3显示了在稳定细胞系pLDLR270-luc/293上做重组人制瘤素因子OM的剂量试验结果。由图可见，随着OM浓度的升高，RLU(相对荧光素单位)的数值也不断升高，呈一典型S形剂量曲线。

[0096] 3.2天然化合物库初步筛选结果

[0097] 图4显示了天然化合物组分的初步筛选结果。纵坐标显示不同化合物刺激细胞后RLU对空细胞对照RLU的倍数，由图可见，升高1.6倍以上的化合物组分可视为阳性化合物，共有4个这样的化合物组分筛出。

[0098] 3.3图5A-C显示了祖师麻醇提取物及其有效成分F15和F16在稳定细胞系pLDLR270-luc/293上的剂量试验结果。由图5可见，祖师麻粗提物EC50值为0.008273，祖师麻有效组分F15的EC50值为7.3900e-005，F16的EC50值为4.7760e-005。

[0099] 3.4LDL内吞试验-活性组分的功能试验结果

[0100] 图6A-C显示了细胞的内吞结果。其中可以看出祖师麻醇提物的组分可以使HepG2细胞表面的LDL受体表达增加，从而使荧光标记的LDL被大量内吞至细胞内部。

[0101] 3.5祖师麻醇提取物对细胞的毒性检测结果

[0102] 其中，细胞对照的OD值为0.7465。图7A-C显示了结果。

[0103] 祖师麻醇提物及其有效组分在体外具有一定的增加LDLR表达的作用，且其毒性较小，降胆固醇活性强。祖师麻粗提物IC50为0.6593mg/ml，EC50值为0.008273，祖师麻有效组分F15的IC50为0.1624mg/ml，EC50值为7.3900e-005，F16的IC50为0.1933mg/ml，EC50值为4.7760e-005有效浓度范围广，均可作为降胆固醇候选药物进一步开发。

[0104] 如上描述了本发明所公开的祖师麻醇提取物、祖师麻总醇的制备方法，制得的产品及其用途。但需理解其中包含了本领域技术人员所理解的变化和改变。这些变化和改变也包含在权利要求所限定的本发明的范围内。