圆海链藻的检测探针及检测方法

摘要

本发明属于利用分子生物学方法检测环境微生物的技术领域。本发明公开了以圆海链藻核糖体DNA(rDNA)核苷酸序列为基础设计的寡核苷酸探针，以该核酸分子探针为一对引物进行PCR反应，通过判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速地检测圆海链藻。本发明还公开了用这些探针采用荧光定量PCR技术来快速、准确地检测和定量计数圆海链藻的方法。

权利要求

1.一种圆海链藻的检测探针，其特征是该探针来源于如SEQ ID NO.1所示的圆海链藻rDNA核苷酸序列中的两段寡核苷酸序列或其互补序列，其分别如SEQ ID NO.2所示，序列为：5'- ttgtggcttggctccttcatt，或其互补序列：5’- aatgaaggagccaagccacaa；

和如SEQ ID NO.3所示，序列为：5'- ttgttacgacttcaccttcctctaa，或其互补序列：5'- ttagaggaaggtgaagtcgtaacaa。

2.根据权利要求1所述的检测探针，其特征是这两个探针可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

3.一种圆海链藻的分子检测方法，其特征是采用PCR方法，以SEQ ID NO.2和3两个核酸分子探针为一对PCR引物进行PCR反应，通过判断相应大小PCR产物的有无来检测圆海链藻。

4.一种圆海链藻的检测和定量计数方法，其特征是采用荧光定量PCR方法，以SEQ ID NO.2和3两个核酸分子探针为PCR引物，以一条用荧光标记的寡核苷酸序列为TaqMan探针进行实时荧光定量PCR。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：

5'- ggcctgaccgcgagaacttgtccg, 或其互补序列：5’- cggacaagttctcgcggtcaggcc。

6.按照权利要求5所述的用荧光标记的寡核苷酸序列，其特征是其5’端用报告荧光基团标记，3’端用淬灭荧光基团标记。

说明书

圆海链藻的检测探针及检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于利用分子生物学方法检测海洋环境微生物的技术领域。具体地说，它涉及可用于检测圆海链藻的核苷酸序列和以此序列为基础设计的核酸分子探针以及利用该分子探针检测圆海链藻的方法。

背景技术

[0002] 圆海链藻(Thalassiosira rotula)是一种世界范围内广泛存在的广温广盐性浮游植物，也是我国近海常见的硅藻优势种之一，被列为中国沿岸赤潮生物种类名录。圆海链藻增值速度极快，并且能够产生一些短链的醛类物质，这些醛类物质能抑制挠足类卵的发育，当赤潮发生时能够影响桡足类的种群结构，硅藻对桡足类生殖的抑制作用为目前海洋生态学的研究热点之一。因此，准确、快速地检测圆海链藻及其数量，了解其在海区的种群动态，对海洋生态环境及赤潮监测研究具有重要意义。

[0003] 在分类学上，圆海链藻隶属硅藻门，圆心硅藻目，海链藻科，海链藻属。虽然传统的从形态学上区分圆海链藻并不十分困难，但由于这种方法操作烦琐，费时、费力，当样品量多时工作量极大。因此，采用新方法新技术快速识别圆海链藻极具现实意义。但是，国际国内目前并没有针对该藻从这方面进行研究。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供圆海链藻分子生物学检测的遗传标记和方法，它可以从遗传本质上客观、准确地对该藻进行检测。具体包括：1.提供用于圆海链藻检测的基因片段；2.提供基于前述基因片段的圆海链藻的专一性遗传标记，即核酸分子探针；3.提供利用这些遗传标记进行快速检测圆海链藻的方法；4.提供利用这些遗传标记同时进行快速检测和定量计数圆海链藻的方法。

[0005] 本发明的最主要理论基础是核糖体基因及其转录间隔区的序列多态性以及5’核酸酶检测法。本发明的发明人首先测定了一株分离自胶州湾的圆海链藻的rDNA及ITS区总长约3000个碱基对的序列，通过与国际互联网(Genbank)中所有已经公开的rDNA区序列比较发现，如序列表中SEQ ID NO.1所示的圆海链藻rDNA序列与其它生物的相应区域的序列有很大差别。为此发明人以该序列为基础设计出如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的总共三个核酸分子探针。用这三个探针，发明人建立了快速、准确检测和定量计数圆海链藻的分子生物学方法。

[0006] 本发明所提供的用于圆海链藻检测的核苷酸序列(T.rotula Seq1.)涵盖了如图1所示的18s rDNA部分区域。其序列及结构特征如序列表SEQ ID NO.1所示。该序列(T.rotula Seq1)可用如实施例1的方法得到；或者按该序列的核苷酸组成和顺序，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成得到。

[0007] 本发明所述的其中两个圆海链藻专一性核酸分子探针是以上述序列(T.rotulaSeq1)为基础，通过Internet(因特网)与国际分子生物学数据库中的其它所有藻类的相应序列比较后，用常规的引物设计软件设计而成的。它们的序列组成及其结构特征分别如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，它们在序列(T.rotula Seq1)中的位置如图2所示。序列表中SEQ ID NO.2所示的核酸探针(T.rotula primer1)是序列(T.rotula Seq1)的18s rDNA区域中的一段由21个核苷酸组成的寡核苷酸序列或其互补序列，或者是由其再经修饰、变化，且核苷酸变化量不超过总核苷酸数的20％的序列。序列表中SEQ ID NO.3所示的核酸探针(T.rotula primer2)是序列(T.rotula Seq1)的18s rDNA区域中的一段由25个核苷酸组成的寡核苷酸序列或其互补序列，或者是由其再经修饰、变化，且核苷酸变化量不超过总核苷酸数的20％的序列。

[0008] 本发明所述的两个圆海链藻专一性核酸分子探针(T.rotula primer1和T.rotulaprimer2)可按照本发明已描述过的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得(例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成)。这两个探针可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

[0009] 本发明所述的两个圆海链藻专一性核酸分子探针具有较好的种特异性。以它们为一对引物进行常规PCR反应，结果只能从含有圆海链藻的材料的DNA提取物中扩增出大小为83bp的PCR产物。因此，以这两个核酸分子探针为引物进行常规PCR反应，通过判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速地检测圆海链藻，而且所需的样品量很少。 [0010] 以T.rotula Seq1的序列为基础，通过Internet(因特网)与国际分子生物学数据库中的其它所有藻类的相应序列比较后，本发明的发明人还设计出了另一个圆海链藻专一性核酸分子探针，其序列组成和结构特征如序列表中SEQ ID NO.4所示(名称 为T.rotula TaqMan Probe)；其在序列(T.rotula Seq1)中的位置如图2所示。它是序列(T.rotula Seq1)的18s rDNA区域中的一段由24个核苷酸组成的寡核苷酸序列或其互补序列，或者是由其再经修饰、变化，且核苷酸变化量不超过总核苷酸数的20％的序列。该探针可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。将该序列的5’端用报告荧光基团如羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)等标记，3’端用淬灭荧光基团如TAMRA或Dabcyl等标记后即可用于对圆海链藻进行定性和定量分析的实时荧光定量PCR(RQ-PCR)反应。

[0011] 以T.rotula primer1和T.rotula primer2两个圆海链藻专一性核酸分子探针作为引物，以标记好的T.rotula TaqMan Probe(5’端用报告荧光基团如FAM等标记，3’端用淬灭荧光基团如TAMRA或Dabcyl等标记)为TaqMan探针，本发明的发明人发明了一种可同时对圆海链藻进行检测和定量计数分析方法，即RQ-PCR反应。这种分析方法不仅克服了常规定量PCR方法中的误差，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。 附图说明

[0012] 图1为圆海链藻核糖体DNA(rDNA)及转录单元间隔区(ITS)在染色体上的排列顺序。其中18s rDNA区域为本发明所涉及的核苷酸序列存在的区域。图中，SSU为小亚基，LSU为大亚基，ITS为转录单元间隔区。

[0013] 图2为PCR结果。其中，所用引物为T.rotula primer1和T.rotula primer2。各电泳道所对应的藻种为Lane2.尖刺伪菱形藻；Lane3，14.圆海链藻；Lane4.旋链角毛藻；Lane5.柔弱角毛藻；Lane6.纤细角毛藻；Lane7.微型角毛藻；Lane8米氏裸甲藻；Lane9.裸甲藻；Lane11.赤潮异湾藻；Lane12.塔玛亚历山大藻；Lane13.新月菱形藻；Lane15.中肋骨条藻；Lane16.微小原甲藻；Lane17.直链藻；Lane18.膜质周形藻；Lane19.H2O；Lane1，
10.DNA标记DL2,000(从上到下各条带大小依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，
100bp)。

[0014] 图3为各稀释度DNA溶液荧光信号曲线。图中横座标为循环数，纵座标为荧光强度，与横座标平行的双箭头粗线为Threshold.从左至右各曲线对应的圆海链藻细胞浓度6 5 4 3 2
(个细胞/μlDNA)依次为1.1×10、1.1×10、1.1×10、1.1×10、1.1×10，每个浓度上样三次。

[0015] 图4为定量计数圆海链藻的标准曲线。

具体实施方式

[0016] 以下通过具体实施例进一步说明本发明：

[0017] 实施例1.用于检测圆海链藻的核苷酸序列的制备

[0018] 本发明所用的圆海链藻分离自胶州湾天然海水样品。通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物。所用的培养基是常规的F/2培养基，培养条件为：光照/黑暗周期为12h/12h，光照强度为4000Lx，培养温度为22℃～25℃。

[0019] 用0.45μm的微孔滤膜或10000r/min离心收集处于对数生长期的圆海链藻藻细胞，用TE buffer(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)洗下藻体，加入2倍体积的预热至55℃的抽提缓冲液(3％(w/v)CTAB，1％(w/v)sarkosyl，20mmol/LEDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl pH 8.0，1％(v/v)2-mercaptoethanol)，55℃处理1小时，其间每10分钟颠倒混匀一次；取出于4℃冰箱静置3分钟，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，颠倒混匀至呈乳浊状，10000r/min，4℃离心10分钟，取上相；向上相中加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，重复上步一次；之后的操作同常规的DNA提取。最后提取的DNA用50μl TE buffer溶解。

[0020] 取提取的DNA溶液1μl加入49μl的PCR反应液中(在50μl的反应体系中包括50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.5U polymerase，正反向引物各3μM)进行第一轮PCR。其中正向引物的序列是5’-GCTCGNMWYWARGRTTAAGCCATGC-3’，反向引物的序列为5’-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3’。混匀后，放入有热盖的PCR仪中。PCR程序为：94℃3分钟；94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，共30个循环；72℃5分钟。将所得的PCR产物用Watson公司的PCR产物纯化试剂盒纯化后，取1μl加入如上所述的PCR反应体系中进行第二轮PCR。此轮PCR所用的引物分别是：5’-CCTTTGTACACACCGCCC-3’(正向)，5’-CACGGTACTTGTWYRCTATCGGT-3’(反向)。PCR程序为：94℃3分钟；94℃30秒，
55℃30秒，72℃1分钟，共30个循环；72℃5分钟。第二轮的PCR产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳后，割胶切下最亮的条带克隆入pMD18-T载体，于XL1-Blue大肠杆菌中无性繁殖后，用M13/pUC(-20和M13/pUC(-48)引物对在商用的自动测序仪上测序，从测出的序列中即可获得如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成和排列。

[0021] 实施例2.T.rotula primer1和T.rotula primer2的设计和合成

[0022] 通过与Genbank中所有已知的其它真核生物、原核生物的相应区域的序列做比较，发现如序列表中SEQ ID NO.1所示的序列与其他生物的相应序列有很大差别，为此发明人以该序列为基础设计出如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的两个核酸分子探针。根据这两个探针或其互补序列的核苷酸组成和排列，在商业化的DNA合成仪上即可获上述的核苷酸序列。

[0023] 实施例3.用常规PCR法检测圆海链藻

[0024] 本实施例选用了本实验室藻种库的几株优势浮游植物作为参照藻，它们是：分离自胶州湾的旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(C.debilis)、纤细角毛藻(C.gracile)、微型角毛藻(C.minimum)、裸甲藻(Gymnodinium sp.)、米氏裸甲藻(G.mikimotoi)、尖刺伪菱形藻(Pseudonitzschia pungens)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、膜质舟形藻(Navicula membranacea)、直链藻(Melosirasp.)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、分离自渤海湾的微小原甲藻(Prorocentrem minimun)，分离自大鹏湾的塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarens)，分离自大连湾的赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)，它们均通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物。按实施例1所述的方法培养这些藻和提取这些藻及圆海链藻的DNA。

[0025] 取各种藻的DNA提取物1μl，按实施例1所述的PCR反应体系进行PCR，以序列表2(T.rotula primer1)和序列表3(T.rotula primer2)所述的核苷酸序列作为正反向引物。
PCR程序为：94℃3分钟；94℃30秒，59℃30秒，72℃30秒，共30个循环；72℃5分钟。PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳后拍照，得到如图3所示的结果。从图3中可知，从圆海链藻DNA模板中扩增出一条大小为83bp的PCR产物；从其它藻的DNA模板基本未见到特异性扩增。

[0026] 因此，对于某待检样品，以其DNA提取物为模板，以T.rotula primer1和T.rotulaprimer2为引物，以本实施例所述的PCR程序进行PCR反应，如果PCR产物中有大小为83bp的条带，即可判定该样品中有圆海链藻的存在；如果该样品为纯培养物，则可判定该纯培养物为圆海链藻。

[0027] 本方法的优点：由于本方法使用的是圆海链藻的专一性引物并通过PCR反应对待测样品进行了扩增，因此该方法能非常准确地检测样品中是否存在圆海链藻，只要 有相应大小的PCR产物出现，即可判定待检样品中有圆海链藻存在，而且根据PCR产物量的多少，还可初步估计样品中圆海链藻的多少。同时本方法灵敏度很高，只要有很少的待检材料即可进行准确检测。

[0028] 实施例4.RQ-PCR中所用的TaqMan探针的制备

[0029] 根据序列表中SEQ ID NO.4所示序列，用FAM荧光物质标记其5’端，用TAMRA标记其3’端。整个合成和标记过程可在商用的探针合成和标记仪上即可一次性完成。 [0030] 实施例5.圆海链藻的RQ-PCR检测和定量计数

[0031] 取处于对数生长期(培养了1周)的圆海链藻培养物计数，其细胞浓度为2.2×105 个/ml，收集200ml培养物，于4℃10000r/min离心10分钟，小心吸弃上清，沉淀用TE buffer溶解，再加入400μl预热至55℃的抽提缓冲液(配方见实施例1)，55℃处理1小时，其间每10分钟颠倒混匀一次；取出于4℃冰箱静置3分钟，加入800μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，颠倒混匀至呈乳浊状，10000r/min，4℃离心10分钟；取550μl上相，向其中加入550μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，颠倒混匀至呈乳浊状，10000r/min，4℃离心10分钟；之后的操作完全按照Watson公司的植物叶DNA提取试剂盒的有关操作进行，只是最后一步用6
40μl TE液从吸附柱上洗下DNA(每1μl DNA溶液对应1.1×10 个细胞。

[0032] 取上述提取的DNA，按1∶10倍比稀释，共5个稀释度(各稀释度对应的细胞浓6 5 4 3 2
度依次为1.1×10 个/μl、1.1×10 个/μl、1.1×10 个/μl、1.1×10 个/μl、1.1×10 个/μl。然后分别取1μl DNA溶液加入49μlRQ-PCR反应体系(10×Ex TaqBuffer10μl；
25mmol/L MgCl28μl；dNTP mixture( 各 2.5mmol/L)6μl；20mmol/LTh.rotula primer1
1μl；20mmol/L Th.rotula primer2 1μl；20mmol/L Th.rotulaProbe 0.4μl，0.5U/μl Ex Taq 0.5μl，于Bioer Line-gene FQD-33A仪中，按PCR程序(94℃5分钟(94℃15秒
60℃50秒)40个循环)反应，并实时记录荧光信号，得到如图4示结果。该图显示了各DNA溶液在PCR过程中的荧光信号随着循环数增加的变化曲线。根据RQ-PCR的原理，临界线(Threshold)与各DNA溶液荧光信号曲线的交点所对应的循环数即为该DNA溶液的CT值。
从图4获得各稀释度DNA溶液的CT值。结合各DNA溶液的稀释度、各向稀释度对应的细胞浓度和CT值，得到如表1所示的数据。

[0033] 表1.各DNA溶液的稀释度及其对应的细胞浓度和CT值、实际用于RQ-PCR的细胞数

[0034]

[0035] 以用于RQ-PCR的实际细胞数的对数值为横座标，以相应的CT值为纵座标，即可绘2
制出如图4示的标准曲线。该曲线的方程式为：y＝-3.4857x+40.174；其回归系数为：R ＝
0.9962。

[0036] 对于某一待测样品，先按上述方法提取其DNA并做RQ-PCR，测出其CT值。以其CT值即可在图4标准曲线上算出该待测样品的细胞数，进而推算出其中圆海链藻的细胞浓度。 [0037] 本方法最大的优点是能同时进行定量和定性检测，通过该方法既可知道待检样品中是否有圆海链藻存在，还可同时知道有多少该藻种存在。

[0038] 本方法另一个明显的优点是定量准确，这是由实时荧光定量PCR方法本身以及本方法扩增的针对的靶片段所决定的。对于某一物种来说，核糖体基因在染色体上的拷贝数是恒定的，不会随着细胞的生理状态、生活环境的不同而改变，也就是说样品中细胞的数量与样品中染色体DNA上核糖体基因的数量是呈线性相关的，由于本方法扩增的靶片段是染色体DNA上的核糖体基因，因此扩增信号的强弱直接反映了待检样品中细胞数量的多少。 [0039] 另外本方法操作过程简单、省时，整个过程4个小时内即可全部完成，可以实现海区中圆海链藻动态的跟踪监测。

[0040] 序列表

[0041] <110>中国海洋大学

[0042] <120>圆海链藻的检测探针及检测方法

[0043] <160>4

[0044] <210>1

[0045] <211>200

[0046] <212>DNA

[0047] <213>圆海链藻(Thalassiosira rotula)

[0048] <400>1

[0049] accctttgta cacaccgccc gtcgcaccta ccgattgaat ggtccggtga 50 [0050] ggactcggga ttgtggcttg gctccttcat tggggcctga ccgcgagaac 100 [0051] ttgtccgaac cttatcattt agaggaaggt gaagtcgtaa caaggtttcc 150 [0052] gtaggtgaaa tctctagagg atccccgggt accgagctcg aattcgtaat 200 [0053] <210>2

[0054] <211>21

[0055] <212>DNA

[0056] <213>人工序列

[0057] <220>

[0058] <223>寡核苷酸

[0059] <400>2

[0060] ttgtggcttg gctccttcat t 21 [0061] <210>3

[0062] <211>25

[0063] <212>DNA

[0064] <213>人工序列

[0065] <220>

[0066] <223>寡核苷酸

[0067] <400>3

[0068] ttgttacgac ttcaccttcc tctaa 25 [0069] <210>4

[0070] <211>24

[0071] <212>DNA

[0072] <213>人工序列

[0073] <220>

[0074] <223>寡核苷酸

[0075] <400>4

[0076] ggcctgaccg cgagaacttg tccg 24